專利名稱：應用室溫玻化技生產室溫穩定的免疫層析試條的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學和電子自動控濕技術，特別涉及一種應用室溫玻化技術生產室溫穩定的能快速篩選寄生蟲病的免疫層析試條。
當代臨床診斷學界，把按免疫層析原理制造的、能在3~5分鐘內獲得結果的、非專業人員亦能操作的、可實現家庭自測的各種免疫層析法診斷試條，視為繼酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、點印漬法(俗稱滲濾法或膜法)之后的第三代產品。從理論上講，目前上市的數百種第一、二代產品都能改進為第三代產品。為此，世界各國正在競相研制。迄今為止，國外有30余種免疫層析診斷試條產品已經上市銷售。在我國雖有不少相關論文報道，但已獲藥證、準予上市的僅為數種。究其原因，正如該領域著名的秦曉光教授最近撰文所述，此在于生產條件和制造工藝不合理所造成的試條不穩定性所致(詳見中華醫學檢驗雜志，1999，22(6)325-326)。
組成免疫層析診斷試條的主要成分是抗體，屬蛋白質類。通常認為，蛋白質是生物活性物質，需存于冰箱始能保持其活性。為使蛋白質類產品能在室溫下穩定，發明人范培昌教授于1997年發明了被上海市科委鑒定為“國際先進、國內首刨”的蛋白質類室溫玻化技術(鑒定證書號為滬科鑒(98)ZR4277)，并同時申請了“室溫玻化機”發明專利(中國發明專利公開號CN1216677A)。
在我國，現已把各種免疫層析診斷試條的研制均歸屬于生物高科技重點發展項目，并規定必須具有10萬級以上凈化室的生產條件始準生產。發明人范培昌教授在預備實驗中發現，凈化室內無菌、無塵的環境對試條的質量穩定性固然重要，但凈化室內的相對濕度也是影響試條穩定性的重要因素，最好能控制在25％~30％。然而，縱觀國內外現在使用的凈化室，大多只能把凈化室的相對濕度控制在45％~50％以內。少數使用大功率去濕機組的凈化室，雖說能把凈化室的相對濕度控制到30％，但此濕度對于在室內的工作人員而言已感不適，因此迫使廠方采取每2小時換班一次的非常措施。
鑒于如此，本發明的目的是提供一種應用室溫玻化技術生產室溫穩定的免疫層析試條，它通過室溫玻化技術使包被于試條上的抗體玻璃化，以保證試條能在室溫下穩定。
本發明的技術方案如下一種應用室溫玻化技術生產室溫穩定的免疫層析試條，其生產工藝包括下列步驟第一步，檢出區帶的包被把針對引發某種疾病，或因患某種疾病始產生或增或減的特有抗原的單克隆抗體，如針對引發瘧疾的瘧原蟲富組蛋白II的單克隆抗體，或者針對因患肝癌而大量產生的甲胎蛋白的單克隆抗體，或者針對懷孕而增量的絨毛膜激素的單克隆抗體等，作為包被抗體；把包被抗體灌入點樣機1號噴針所連容器；啟動點樣機，使包被抗體以區帶形式噴于硝酸纖維素(NC)膜條上，作為檢測其相關抗原的檢出區帶；第二步，質控區帶的包被把上述硝酸纖維素膜返回原點，并向上調距，啟動點樣機上已灌裝有抗標記抗體(又名二抗)的2號噴針，使噴成又一區帶，作為檢測免疫層析試條成品有否發生因室溫存放而導致試條上活性分子失活的質控區帶；第三步，封阻與玻化把第一、二步同時噴有檢出區帶和質控區帶的硝酸纖維素膜，于室溫干燥1小時后放入加有玻化液和防腐劑的封阻劑中封阻3小時，再換用只有玻化液和防腐劑的混合物漂洗硝酸纖維素膜兩次以上，每次15分鐘；置于室溫玻化機內，于45℃玻化20分鐘；第四步，可動金標抗體區帶群的噴涂把上述玻化好的硝酸纖維素膜再放在點樣機平臺上，并把硝酸纖維素膜調整在上述第一步的原有位置，再向下調距1cm，并在其后涂覆0.25cm寬的釉料，空氣干燥；取具有針對同種抗原第二表位的單克隆抗體，經事先純化和用金溶膠予以標記后，添加玻化液、防腐劑和輸送加速液；經混勻后灌裝于連接3號噴針的容器中；啟動點樣機，在釉料表面噴涂成區帶；噴畢，把硝酸纖維素膜返回到原點，并向下調距0.05cm后，如前述噴涂成又一區帶；如此重復共4次，使成區帶間有0.05cm間距的4條金標抗體區帶群；點畢，再把硝酸纖維素膜置于室溫玻化機中，于45℃玻化20分鐘；第五步，試條在局部去濕柜中的裝配把第四步玻化好的硝酸纖維素膜，放入設置于10萬級凈化室(相對濕度為45％)中的局部去濕柜內，其相對濕度已預先自動恒定；然后在該局部去濕柜內進行操作，此時，工作人員實際上是處于相對濕度為45％的凈化室中，只有已噴有潤膚消毒液并戴有手套的雙手插放在相對濕度只有25％的局部去濕柜中；操作時，先用雙面膠把硝酸纖維素膜粘貼于長20cm、寬7cm的塑料襯墊中央，在硝酸纖維素膜的上、下兩端分別覆上一片強吸水濾紙，并務使兩片濾紙皆有0.3cm平整地重疊在硝酸纖維素膜的兩端；然后，將上、下二片濾紙表面再分別覆蓋一片略大于濾紙的彩色單面膠紙，位于下端的彩色單面膠紙印有此試條插入試樣的深度線，用條狀壓實器壓實，務使彩色單面膠紙長出部分平整地粘貼于硝酸纖維素膜表面；最后，把裝配好的免疫層析片放入斬切機中斬切成寬0.4cm條，裝入附有干燥劑袋的鋁箔袋后，用鋁箔封口機封口即為成品。
本發明解決了免疫層析試條在室溫存儲下穩定性差的問題，通過室溫玻化技術使包被于試條上的抗體玻璃化，以保證試條能在室溫下穩定。本發明的免疫層析試條用于診斷檢測，使用簡便、靈敏、直觀、快速且實用，其特點可歸納為1、方法簡易，非專業人員亦可操作，適于家庭自測。
2、只需微量血樣，如指血。
3、用肉眼即可直觀結果，無需儀器設備，適于野外或現場大規模普查。
4、全過程僅需3分鐘，確屬快速診斷法。
下面結合附圖
和實施例對本發明作詳細說明。
附圖是一種應用室溫玻化技術生產室溫穩定的免疫層析試條的結構示意圖。
參看附圖，本發明的免疫層析試條上設有檢出區帶1和質控區帶2，在免疫層析試條的下端噴涂有金標抗體區帶群3。
本發明應用室溫玻化技術生產室溫穩定的免疫層析試條，其生產工藝包括下列步驟第一步，檢出區帶的包被把針對引發某種疾病，或因患某種疾病始產生或增、減的特有抗原的單克隆抗體，例如，針對引發瘧疾的瘧原蟲富組蛋白II的單克隆抗體；針對因患肝癌而大量產生的甲胎蛋白的單克隆抗體；針對懷孕而增量的絨毛膜激素的單克隆抗體等等，作為包被抗體。把包被抗體灌入XYZ 3000型點樣機(購自美國Bio-Dot公司)1號噴針所連容器內。啟動點樣機，使包被抗體以區帶形式噴于長25cm、寬3cm的硝酸纖維素(NC)膜條距底部2cm處，噴量為2μl/cm。此即后述免疫層析試條成品上作為檢測其相關抗原的檢出區帶。
第二步，質控區帶的包被在完成第一步后，把上述硝酸纖維素膜返回原點，并向上調距0.5cm，啟動點樣機上已灌裝有抗標記抗體(又名二抗)的2號噴針，使噴成又一區帶。此帶即是后述免疫層析試條成品上作為檢測免疫層析試條成品有否發生因室溫存放而導致試條上活性分子失活的質控區帶。
第三步，封阻與玻化把第一、二步同時噴有檢出區帶和質控區帶的硝酸纖維素膜，于室溫干燥1小時后放入加有玻化液和防腐劑的封阻劑中封阻3小時，再換用只有玻化液和防腐劑的混合物漂洗硝酸纖維素膜兩次以上，每次5分鐘。置于室溫玻化機內，于45℃玻化20分鐘。
第四步，可動金標抗體區帶群的噴涂把上述玻化好的硝酸纖維素膜再放在點樣機平臺上，并把硝酸纖維素膜調整在上述第一步的原有位置，再向下調距1cm，并在其后涂覆0.25cm寬的釉料，空氣干燥。取具有針對同種抗原第二表位的單克隆抗體，經事先純化和用金溶膠予以標記后，添加玻化液、防腐劑和輸送加速液。經混勻后灌裝于連接3號噴針的容器中。啟動點樣機，在釉料表面噴涂成區帶。噴畢，把硝酸纖維素膜返回到原點，并向下調距0.05cm后，如前述噴涂成又一區帶。如此重復共4次，使成區帶間有0.05cm間距的4條金標抗體區帶群。點畢，再把硝酸纖維素膜置于室溫玻化機中，于45℃玻化20分鐘。
第五步，試條在局部去濕柜中的裝配
把第四步玻化好的硝酸纖維素膜，放入設置于10萬級凈化室(相對濕度為45％)中的局部去濕柜內，其相對濕度已預先自動恒定在25％。以下操作皆在該局部去濕柜內進行。此時，工作人員實際上是處于相對濕度為45％凈化室中，只有已噴有潤膚消毒液并戴有手套的雙手插放在相對濕度只有25％的局部去濕柜中。局部去濕柜內設置有CM 4000型層析試條斬切機(購自美國Bio-Dot公司)、壓實器和小型鋁箔封口機。操作時，先用雙面膠把硝酸纖維素膜粘貼在長20cm、寬7cm的塑料襯墊中央，在硝酸纖維素膜的上、下兩端分別覆上一片強吸水濾紙，并務使兩片濾紙皆有0.3cm平整地重疊在硝酸纖維素膜的兩端。然后，將上、下二片濾紙表面再分別覆蓋一片略大于濾紙的彩色單面膠紙。位于下端的彩色單面膠紙印有此試條插入試樣的深度線，用條狀壓實器壓實，務使彩色單面膠紙長出部分平整地粘于硝酸纖維素膜表面。最后，把裝配好的免疫層析片放入斬切機中斬切成寬0.4cm條，裝入附有干燥劑袋的鋁箔袋后，用鋁箔封口機封口即為成品。
本發明現以生產能快速篩選瘧疾的免疫層析試條為例各單克隆抗體是采用針對惡性瘧原蟲特有抗原一富組蛋白II(HistidineRich Protein II；HRPII)作為免疫原制取的。其中，用細胞株M2A10C9生產的單克隆抗體具有針對HRPII中30KD片段的表位，現作為包被抗體；用細胞株M1D7D4生產的單克隆抗體具有針對HRPII中18和30KD片段的兩段表位，現作為金標抗體。因這兩株單抗皆屬IgG亞類，故二抗選用兔抗鼠IgG，以此作為質控區帶。此外，經預備實驗選取的各最適條件如下1、單抗最適包被量為11.6μg蛋白質/10μl/cm硝酸纖維素膜。
2、單抗結合的最佳緩沖系統為pH值7.5、0.2mol/L磷酸緩沖液。
3、封阻劑以采用上海保康公司出品的新型封阻劑為最有效。
4、所選硝酸纖維素膜，以平均孔徑為8μm、展層速度為2cm/min者最好。
5、所涂覆的釉料主成份含40％蔗糖。
根據以上各實驗參數，以及按照上述第一至五步驟操作，即可裝配成用于檢測瘧疾的免疫層析試條成品。鑒于HRP II抗原存在于瘧疾患者紅細胞膜中，血樣需先加入溶胞液后始插入試條。展層約3min即能顯現紅色區帶。能同時顯現質控區帶和檢出區帶者為陽性，只顯現質控區帶者為陰性。
最后步驟，質檢為了驗證本試條質量，特把采自云南的已用經典鏡檢法確證過的惡性瘧(Plasmodium falciparum)患者血樣(PF)57份、間日瘧(Plasmodium vivax)患者血樣(PV)5份，以及46位健康人滴血，共108人份，分別經隨機編號后，用上述生產例子所得試條，在中國預防醫學科學院上海寄生蟲病研究所專家們監察下進行雙盲法檢測。其結果是57份PF血樣被檢出53份，準確率為93％；5份PV血樣被檢出5份，準確率為100％。換言之，已用經典鏡檢法確證過的62名瘧疾患者中，被本試條檢出58名呈陽性，總準確率為93.54％。此外，用經典鏡檢法測得僅1個原蟲/200鏡檢視野的血樣(原編號05-11)，試條也顯陽性。由此證明，本試條的檢出限至少可達1個原蟲/200鏡檢視野，靈敏度極高。46份健康人血樣中有8份呈陽性，可惜這些血樣是滴血，編號時未記供血者姓名，因此難以追取同種血樣鏡檢確證。盡管如此，就算把此8份計入出錯值計算在內，試條特異性也達82.6％。此外，將此試條成品置于37℃恒溫箱內達38天后，再測上述陽性血樣，結果檢出值未變，充分顯示了本試條成品的高度穩定性。
權利要求
1.一種應用室溫玻化技術生產室溫穩定的免疫層析試條，其生產工藝包括下列步驟第一步，檢出區帶的包被把針對引發某種疾病，或因患某種疾病始產生或增或減的特有抗原的單克隆抗體，如針對引發瘧疾的瘧原蟲富組蛋白II的單克隆抗體，或者針對因患肝癌而大量產生的甲胎蛋白的單克隆抗體，或者針對懷孕而增量的絨毛膜激素的單克隆抗體等，作為包被抗體；把包被抗體灌入點樣機1號噴針所連容器；啟動點樣機，使包被抗體以區帶形式噴于硝酸纖維素(NC)膜條上，作為檢測其相關抗原的檢出區帶；第二步，質控區帶的包被把上述硝酸纖維素膜返回原點，并向上調距，啟動點樣機上已灌裝有抗標記抗體(又名二抗)的2號噴針，使噴成又一區帶，作為檢測免疫層析試條成品有否發生因室溫存放而導致試條上活性分子失活的質控區帶；其特征在于，采取第三步，封阻與玻化把第一、二步同時噴有檢出區帶和質控區帶的硝酸纖維素膜，于室溫干燥1小時后放入加有玻化液和防腐劑的封阻劑中封阻3小時，再換用只有玻化液和防腐劑的混合物漂洗硝酸纖維素膜兩次以上，每次15分鐘；置于室溫玻化機內，于45℃玻化20分鐘；第四步，可動金標抗體區帶群的噴涂把上述玻化好的硝酸纖維素膜再放在點樣機平臺上，并把硝酸纖維素膜調整在上述第一步的原有位置，再向下調距1cm，并在其后涂覆0.25cm寬的釉料，空氣干燥；取具有針對同種抗原第二表位的單克隆抗體，經事先純化和用金溶膠予以標記后，添加玻化液、防腐劑和輸送加速液；經混勻后灌裝于連接3號噴針的容器中；啟動點樣機，在釉料表面噴涂成區帶；噴畢，把硝酸纖維素膜返回到原點，并向下調距0.05cm后，如前述噴涂成又一區帶；如此重復共4次，使成區帶間有0.05cm間距的4條金標抗體區帶群；點畢，再把硝酸纖維素膜置于室溫玻化機中，于45℃玻化20分鐘；第五步，試條在局部去濕柜中的裝配把第四步玻化好的硝酸纖維素膜，放入設置于10萬級凈化室(相對濕度為45％)中的局部去濕柜內，其相對濕度已預先自動恒定；然后在該局部去濕柜內進行操作，此時，工作人員實際上是處于相對濕度為45％的凈化室中，只有已噴有潤膚消毒液并戴有手套的雙手插放在相對濕度只有25％的局部去濕柜中；操作時，先用雙面膠把硝酸纖維素膜粘貼于長20cm、寬7cm的塑料襯墊中央，在硝酸纖維素膜的上、下兩端分別覆上一片強吸水濾紙，并務使兩片濾紙皆有0.3cm平整地重疊在硝酸纖維素膜的兩端；然后，將上、下二片濾紙表面再分別覆蓋一片略大于濾紙的彩色單面膠紙，位于下端的彩色單面膠紙印有此試條插入試樣的深度線，用條狀壓實器壓實，務使彩色單面膠紙長出部分平整地粘貼于硝酸纖維素膜表面；最后，把裝配好的免疫層析片放入斬切機中斬切成寬0.4cm條，裝入附有干燥劑袋的鋁箔袋后，用鋁箔封口機封口即為成品。
2.根據權利要求1所述的應用室溫玻化技術生產室溫穩定的免疫層析試條，其特征在于，所述第四步中涂覆的釉料主成份含40％蔗糖。
全文摘要
本發明涉及一種應用室溫玻化技術生產室溫穩定的免疫層析試條,其生產工藝包括第一步,檢出區帶的包被;第二步,質控區帶的包被;第三步,封阻與玻化,把噴有檢出區帶和質控區帶的硝酸纖維素膜,于室溫干燥1小時后放入加有玻化液和防腐劑的封阻劑中封阻3小時,再置于室溫玻化機內進行玻化;第四步,可動金標抗體區帶群的噴涂;第五步,試條在局部去濕柜中的裝配。本發明通過室溫玻化技術使包被于試條上的抗體玻璃化,以保證試條能在室溫下穩定。本發明的試條用于診斷檢測,使用簡便、靈敏、直觀、快速且實用。
文檔編號G01N33/543GK1340710SQ0011979
公開日2002年3月20日 申請日期2000年8月29日 優先權日2000年8月29日
發明者范培昌, 石鋒 申請人:上海正源生命技術有限公司