專利名稱：多種常見性病快速檢測試紙條及其制備方法
技術領域：
本發明涉及醫學技術領域，具體地說是多種常見性病快速檢測試紙條及其制備方法。
淋病、非淋菌性尿道炎、尖銳濕疣和生殖器皰疹的發病率占我國性病傳播疾病發病率的前四位。這四種性病也是全球性的主要性傳播疾性之一，發病率在逐年增加。臨床實驗的檢測通常是淋病患者尿道生殖道分泌物涂片、淋球菌培養和免疫熒光抗體檢測；沙眼衣原體的分泌物涂片檢查、直接熒光抗體檢測和酶免疫法；尖銳濕疣的細胞學檢查、免疫組織化學檢查及分子雜交技術檢查；生殖器皰疹的細胞學檢查、組織培養檢查和抗體血清學檢查等等。目前發現除淋病和非淋菌性道炎患者的尿道生殖道分泌物可查出病原體外，尖銳濕疣患者的尿沉渣中有被病原體感染的細胞，生殖器皰疹侵入尿道因而在尿中可查見病原體。例如淋病的常規檢測是采用尿道生殖道究泌物的涂片檢查，在多形核白細胞內查見革蘭氏雙球菌即可診斷，在男性淋病的診斷中，棉拭子要進入尿道2厘米處取樣，但女性分泌物應取宮頸管內的，并且陰道分泌物有50％假陽性和50％的假陰性，因而不能用于診斷，應用新的培養基對分泌物培養可增加陽性的檢出率。目前采用DNA擴增技術的聚合酶鏈反應(PCR)和連接酶鏈反應(LCR)快速檢測這些性病的方法已逐步在臨床上推廣應用。這些常規檢測必需在具備顯微鏡、細菌培養箱和PCR儀等條件的化驗室中進行。這些檢查不僅需要特定的儀器設備，而且檢查費時，需要較長的時間才能觀察結果，所需費用較高。眾所周知，早期、快速的診斷是早期治療和切斷性病傳播途徑的關鍵步驟。由于性病的特殊性，檢查常在門診進行，迫切需要一種特異、快速、簡便、經濟的檢測試紙條。
本發明的目的是提供一種能夠快速定性診斷出淋病、非淋菌性尿道炎、尖銳濕疣和生殖器皰疹中的一種或合并存在的多種性病的多種常見性病的快速檢測試紙條及其制備方法。
本發明是這樣實現的利用抗淋病、非淋菌性尿道炎、尖銳濕疣和生殖器皰疹病原體的單克隆抗體膠體金免疫吸附(GCISA)實驗原理制成，它能定性診斷出淋病、非淋菌性尿道炎、尖銳濕疣和生殖器皰疹中的一種或合并存在的多種性病。
上述檢測試紙條的制備方法按以下步驟進行1)制備檢測用免疫原及抗原采用淋球菌的標準菌株制備淋球菌外膜蛋白pIA、pIB的粗制品，將非淋球菌性尿道炎的主要病原體沙眼衣原體血清型D-K的基本顆粒作為其抗原，將尖銳濕疣的病原體人乳頭瘤病毒(HPV-6,11型)顆粒作為其抗原，將生殖器皰疹的病原單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)作為抗原；2)單克隆抗體的制備與篩選將1)中四種性病的抗原分別用雜交瘤技術將免疫小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞進行融合得到一種可以產生抗體的雜交瘤，具體是免疫6周齡雌性Bab/c小鼠，免疫5次。取小鼠脾臟與小鼠骨髓瘤細胞按常規方法進行融合，融合后的細胞接種于甲基纖維素半固體培養基上，用間接ELISA法篩選并克隆化，經擴大培養將雜交細胞注入經產數胎的雌性Bab/c小鼠腹腔中，收集腹水，-20℃保存，抗體純化，最終獲得18株分別抗各種性病病原體的單克隆抗體細胞株，經鑒定，這18株單克隆抗體均為IgG1類，親和常數在2×108-1×109之間；3)制備兔抗性病病原體抗原的免疫血清，用大耳白兔，雄性，體重2千克左右，將含不同抗原的性病病原體分別用生理鹽水稀釋進行免疫，經試血清抗體滴度后頸動脈放血，4℃存放過夜后分離血清凍存，進行抗體純化；4)制備膠體金標記抗體采用枸櫞酸三鈉法制備膠體金顆粒，按比例與不同性病病原體的單克隆抗體混合進行標記，膠體金標記抗體的制備是用終濃度為0.05％PEG穩定標記后的膠體金顆粒，于4℃下濃縮純化離心1至3次，沉淀物保存于原體積3-10％的保存液中于4℃保存；5)檢測試紙條的制備選擇適當的濃度將免疫血清抗體和金標記抗體分別固定于不同的載體上，經粘合、切割等步驟制備成檢測試紙。
具體將兔抗性病病原體血清IgG等量混合后，以不同含量抗體打點在硝酸纖維素膜上，超凈臺內室溫風干，將膜置于1-5％牛血清白8蛋白內37℃封閉1-3小時，取出后用緩沖液沖洗后，室溫涼干，4℃密封保存。
或者是①將兔抗多種性病的血清IgG等量混合后，以不同含量抗體打點在硝酸纖維素膜上，超凈臺內室溫風干，將膜置于1-5％牛血清白蛋白內37℃封閉1-3小時，取出后用緩沖液沖洗數次，室溫涼干，4℃密封保存，②在另一硝酸纖維素膜免疫條帶上加入TBST(150mmol/L NaCl,25mmol/L Tris,pH7.5，含1％BSA,0.02％Tween-20)20-50μl，加入抗多種性病的單克隆抗體標記的膠體金溶液20-60μl，室溫涼干，4℃密封保存，③分別取大小適合的上述兩種硝酸纖維素膜免疫條帶和大小適合的空白硝酸纖維素膜條帶，按空白、膠體金單抗和血清抗體的順序粘接在大小適合的硬紙片上，其中空白端為樣品加入端。
其檢測方法是膠體金酶聯免疫吸附試驗(GCISA)在聚苯乙烯塑料板每槽內加入硝酸纖維素膜免疫條帶一條，加入TBST(150mmol/L NaCl,25mmol/L Tris,PH7.5，含1％BSA,0.02％Tween-20)20-50μl，侵濕后加入經室溫靜置后的標本上清液50μl在槽內混勻，立即加入抗性病單克隆抗體標記的膠體金溶液20-60μl，室溫下反應時間為3-5分鐘，后用洗液(上液中Tween-20為50ul，無BSA)漂洗后觀察結果，或者將樣品直接加入已剪切粘接的試紙條的空白端，15分鐘后判讀結果。陽性對照條內呈紅色圓點，陰性對照條內則不出現紅色圓點。試紙的靈敏度為250ng/ml，可在常溫下存儲一年。
本發明的檢測試紙條是一種能定性診斷多種常見性病的快速檢測試紙條，使用該試紙條能夠定性診斷出淋病、非淋菌性尿道炎，尖銳濕疣和生殖器皰疹中的一種或合并存在的多種性病。這種方式試紙條具有高度的特異性和靈敏度，還具有穩定性好，重復性好，并且不用特殊儀器，費用較低廉，操作簡便易學，短時間內(15分鐘)就能判讀結果，適合于基層醫療單位和大規模體檢查使用，也適合于患者的自查。從而達到早期、快速的診斷出多種常見的性病，使患者得到早期、及時和有效的治療，并切斷性病傳播的可能途徑。這對人民身體健康和社會的安定團結都重要意義，具有良好的市場前景的經濟效益。
實施例1、制備檢測用免疫原及抗原采用常規試驗方法，淋球菌的標準菌株制備淋球菌外膜蛋白pIA、pIB的粗制品，將非淋球菌性尿道炎的主要病原體沙眼衣原體血清型D-K的基本顆粒作為其抗原，將尖銳濕疣的病原體人乳頭瘤病毒(HPV-6,11型)顆粒作為其抗原，將生殖器皰疹的病原單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)作為抗原；
2、單克隆抗體的制備與篩選1)免疫小鼠及制備脾淋巴細胞將上述四種性病抗原，分別加0.4mlPBS(PH7.4)，與0.4ml完全弗氏佐劑充分混合，并將0.2ml所得乳化液注射到6周齡雌Bab/c小鼠皮下。初次免疫兩周后，再將0.2ml如上法制得的乳化液注入小鼠皮下。再過兩周后，同法制得乳化液0.5ml注入小鼠腹腔。又兩周后在小鼠尾靜脈注入0.2ml含上述性病抗原的PBS溶液。三天后從已免疫小鼠的體內分離脾臟并將其擠壓使細胞分散。將如此得到的淋巴細胞懸浮于淋巴細胞培養液MEM中，離心洗滌兩次(1400rpm,6min,37℃)，將淋巴細胞重新懸浮于培養液中，即可分別獲得不同抗原的細胞融合的小鼠淋巴細胞。2)細胞融合收獲處于生長期小鼠骨髓瘤細胞SP2/0懸浮于MEM中，并離心洗滌兩次(1400rpm,6min,37℃)，然后將細胞重新懸浮于培養液中，即獲得細胞融合的小鼠骨髓瘤細胞。
將3.5×108個上述淋巴細胞和2.71×108個上述骨髓瘤細胞置于50ml離心管內混合后離心(1400rpm,6min,37℃)，去上清，緩慢加入MEM至10ml，離心(800rpm,6min,37C)去上清，將細胞重新懸浮于14mlHA T培養基中，并在培養板上加樣后，放入二氧化碳培養箱中培養(5％二氧化碳，95％空氣，濕度100％)。
3)雜交瘤細胞的篩選；按上述方法培養2至4周后，用ELISA方法檢測已證實有細胞生長的培養板中的培養物上清液中是否含有抗上述抗原的抗體，結果在960個培養板上的小井中有26個產生了抗體。在這些小井中加入上述抗原后，有18個能被抗原所抑制，進而證實這18個培養小井中有產生上述抗原的雜交瘤細胞，選擇出4株針對上述四種性病抗原的雜交瘤細胞株。
4)雜交瘤細胞克隆采用有限稀釋法即連續稀釋至培養小井的最終細胞濃度為10個/ml，再接種于96孔培養板中，每孔0.1ml內含1個細胞，對所選的4株細胞進行再克隆，并對每個小井的培養物上清液進行抗體ELISA檢測。
5)培養產生單克隆抗體將在含有15％FCS的RPMI培養基中培養所得的4株細胞株的培養細胞移入不含FCS的RPMI培養基中培養至幾乎所有細胞死亡，對其培養液進行離心得到含有單克隆抗體的上清液，并對抗體進行純化鑒定。經鑒定，可以產生抗體的雜交瘤經篩選純化后可得18株分別抗各種性病病體的單克隆抗體細胞株。
6)在小鼠腹腔內大量產生單克隆抗體分別將懸浮有2×106不同抗原細胞株的PBS溶液0.5ml注入6周齡雌性Bab/c小鼠的腹腔內。約一周后小鼠體重顯著增加，于注射細胞后的第7、9、11天用注射器收集腹水，離心得到腹水的上清液，并對腹水上清液進行抗體含量檢測。
3、制備兔抗性病病原體抗原的免疫血清將含上述不同的抗原用生理鹽水混合稀釋至總量2ml，注射進體重2千克左右的雄性耳白兔腹腔，兩周后再次免疫一次。檢測兔血清中針對不同抗原的抗體滴度后，采用頸動脈放血收集血液，4℃存放過夜后分離血清凍存，對抗體進行純化。
4、制備膠體金標記抗體采用枸櫞酸三鈉法制備膠體金顆粒，即取1％HauCl4水溶液1ml，加重蒸餾水至100ml，迅速加入枸櫞酸三鈉水溶液2ml，5分鐘后出現橙紅色，制得膠體金16nm。按1∶1比例與多種性病的單克隆抗體溶液在磁性攪拌下混合，10分鐘后再加入50g/l牛血清白蛋白水溶液至終濃度為10g/l。用終濃度為0.05％PEG穩定標記后的膠體金顆粒，于4℃下1500r/min1小時。濃縮純化離心兩次，沉淀物保存于原體積6％的保存液(0.01mol/l,PH7.2PBS溶液，含0.5mg/ml PEG和1/10000NaN3)中于4℃保存。
5、檢測試紙條的制備將兔抗淋球菌血清IgG等量混合后，以不同含量抗體以0.5ul/點打點在硝酸纖維素膜上，超凈臺內室溫風干。將膜置于4％牛血清白蛋白內37℃封閉3小時，取出后用緩沖液沖洗3次，室溫涼干，4℃密封保存；或者①將兔抗多種性病的血清IgG等量混合后，以不同含量抗體以0.5ul打點在硝酸纖維素膜上，超凈臺內室溫風干，將膜置于4％牛血清白蛋白內37℃封閉3小時，取出后用緩沖液沖洗3次，室溫涼干，4℃密封保存；②在另一硝酸纖維素膜免疫條帶上加入TBST(150mmol/L NaCl,25mmol/L Tris,pH7.5，含1％BSA,0.02％Tween-20)20μl，加入抗多種性病的單克隆抗體標記的體金溶液60μl，室溫涼干，4℃密封保存，③分別取0.5×2.5厘米大小的上述兩種硝酸纖維素膜免疫條帶和0.5×3厘米大小的空白硝酸纖維素膜條帶，按空白、膠體金單抗和血清抗體的順序粘接在0.5×8厘米的硬紙片上，其中空白端為樣品加入端。
取患者的尿道生殖道的分泌物、或尿液、或皰疹內液等樣品，浸濕試紙條的樣品端，陽性者試紙條內膠體金單抗區域呈紅色圓點，陰性者試紙條內膠體金單抗體區域則不出現紅色圓點。
權利要求
1.一種多種常見性病快速檢測試紙條，其特征在于利用抗淋病、非淋菌性尿道炎、尖銳濕疣和生殖器皰疹原體的單克隆抗體膠體金免疫吸附(GCISA)實驗原理制成，它能定性診斷出淋病、非淋菌性尿道炎、尖銳濕疣和生殖器皰疹中的一種或合并存在的多種性病。
2.按權利要求1所述的檢測試紙條的制備方法，其特征在于按以下步驟進行1)制備檢測用免疫原及抗原采用淋球菌的標準菌株制備淋球菌外膜蛋白pLA、pIB的粗制品，將非淋球菌性尿道炎的主要病原體沙眼衣原體血清型D-K的基本顆粒作為其抗原，將尖銳濕疣的病原體人乳頭瘤病毒(HPV-6,11型)顆粒作為其抗原，將生殖器皰疹的病原單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)作為抗原；2)單克隆抗體的制備與篩選將1)中四種性病的抗原分別用雜交瘤技術將免疫小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞進行融合得到一種可以產生抗體的雜交瘤；3)制備兔抗性病病原體抗原的免疫血清；4)制備膠體金標記抗體采用枸櫞酸三鈉法制備膠體金顆粒，按比例與不同性病病原體的單克隆抗體混合進行標記；5)檢測試紙條的制備選擇適當的濃度將免疫血清抗體和金標記抗體分別固定于不同的載體上，經粘合、切割等步驟制備成檢測試紙。
3.按權利要求2所述的制備方法，其特征在于制備兔抗性病病原體抗原和免疫血清是用大耳白兔，雄性，體重2千克左右，將含不同抗原的性病病原體分別用生理鹽水稀釋進行免疫，經試血清抗體滴度后頸動脈放血，4℃存放過夜后分離血清凍存，進行抗體純化。
4.按權利要求2所述的制備方法，其特征在于膠體金標記抗體的制備是用終濃度為0.05％PEG穩定標記后的膠體金顆粒，干4℃下濃縮純化離心1-3次，沉淀物保存于原體積3-10％的保存液中于4℃保存。
5.按權利要求2所述的制備方法，其特征在于2)中所得可以產生抗體的雜交瘤經篩選純化后可得18株分別抗各種性病病體的單克隆抗體細胞株。
6.按權利要求2所述的制備方法，其特征在于檢測試紙條的制備是將兔抗性病病原體血清IgG等量混合后，以不同含量抗體打點在硝酸纖維素膜上，超凈臺內室溫風干，將膜置于1-5％牛血清白8蛋白內37℃封閉1-3小時，取出后用緩沖液沖洗后，室溫涼干，4℃密封保存。
7.按權利要求2所述的制備方法，其特征在于檢測試紙條的制備也可是①將兔抗多種性病的血清IgG等量混合后，以不同含量抗體打點在硝酸纖維素膜上，超凈臺內室溫風干，將膜置于1-5％牛血清白蛋白內37℃封閉1-3小時，取出后用緩沖液沖洗數次，室溫涼干，4℃密封保存，②在另一硝酸纖維素膜免疫條帶上加入TBST(150mmol/L NaCl,25mmol/L Tris,pH7.5，含1％BSA,0.02％Tween-20)20-50μl，加入抗多種性病的單克隆抗體標記的膠體金溶液20-60μl，室溫涼干，4℃密封保存，③分別取大小適合的上述兩種硝酸纖維素膜免疫條帶和大小適合的空白硝酸纖維素膜條帶，按空白、膠體金單抗和血清抗體的順序粘接在大小適合的硬紙片上，其中空白端為樣品加入端。
全文摘要
本發明是一種多種常見性病快速檢測試紙條,其特征在于利用抗淋病、非淋菌性尿道炎、尖銳濕疣和生殖器皰疹原體的單克隆抗體膠體金免疫吸附(GCISA)實驗原理制成,它能定性診斷出淋病、非淋菌性尿道炎、尖銳濕疣和生殖器皰疹中的一種或合并存在的多種性病。這種方式試紙條具有高度的特異性和靈敏度,還具有穩定性好,重復性好,并且不用特殊儀器,費用較低廉,操作簡便易學,短時間內(15分鐘)就能判讀結果,適合于基層醫療單位和大規模體檢查使用,也適合于患者的自查。
文檔編號G01N33/571GK1307238SQ0011268
公開日2001年8月8日 申請日期2000年2月2日 優先權日2000年2月2日
發明者謝伯林, 徐林, 楊上川, 郭仁, 彭小忠, 張翔 申請人:昆明廣博科技有限公司