采用共線電場的微流控裝置的制作方法

專利名稱：采用共線電場的微流控裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于在微容器特別是微通道中操縱小包的裝置。
背景技術：
這里所用的“小包”(packet)是指被分區(compartmentalized)的物質，而且可以指流體包、密封(encapsulated)包和/或固體包。
流體包是指液體或氣體的一個或多個小包。流體包可以指液體的微滴或氣體的氣泡。流體包也可以指一滴水、一滴試劑或樣品、一滴溶劑、一滴溶液、一粒懸浮液或細胞懸浮液，一滴中間產物、一滴最終反應產物或一滴任何材料。流體包的一實例是一滴懸浮在油中的水性溶液。在一優選實施方式中，流體包指一滴水或一滴溶液。
密封包指由一層材料密封的包。密封包的表面可以涂以試劑、樣品、顆粒或細胞、中間產物、最終反應產物、或任何材料。密封包的一實例是懸浮在水中的含有試劑水溶液的脂囊泡(lipid vesicle)。
密封包可以含有例如囊泡或其他液體或氣體的微囊體(microcapsule)，所述囊泡或微囊體可以含有試劑、樣品、顆粒、死細胞或活細胞、中間產物、最終反應產物、或任何材料。
固體包指固體材料，例如生物材料，所述固體材料可以含有或覆蓋有試劑、樣品、顆粒或細胞、中間產物、最終反應產物、或任何材料。固體包的一實例為懸浮在水性溶液中的、表面結合有試劑的膠乳微球(latex microsphere)。固體包可以含有晶體、多晶材料或玻璃質(vitreous)材料。
所述小包可以在尺寸和形狀上有很大變化，而且最大尺寸可以約在100nm-1cm之間。
微滴系統可以存在于油或氟化溶劑中的水基微滴中，或者存在于水性溶劑的“油性”(水不混溶)微滴中。本發明微滴系統涉及的流體可以是任何水性、有機、無機、親水或疏水的流體，包括水基緩沖劑、生物流體、水-有機溶劑(hydroorganic solvents)、由具有碳-碳主鏈(backbone)、Si-Si主鏈(硅酮)、雜原子(heteroatom)主鏈(例如聚乙烯二醇)的分子形成的液體、或離子液體。微滴系統在微流控技術中已經受到廣泛重視，其作為生產精確乳液(emulsion)的方法、作為聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)的離散微反應器、用于測量快速動力學(fast kinetics)、和用于等分試樣(samplealiquot)的無分散傳輸和操縱。因此近年開發了大量成果以制造和/或操作微滴系統。一些裝置在結合有一些親水部分和一些疏水部分的微通道中使用疏水力移動微滴。例如，美國專利613008公開了一種用于移動微滴的方法，其包括-提供具有一個或多個疏水區且與氣源連通的微滴輸送通道，-在例如所述液體在所述疏水區中的一個區處停止的條件下，將液體引入到所述通道中，-通過使氣源供給的壓力增加以分離微滴，以使微滴移動穿過所述疏水區。
這種方法強迫不同的微滴與相同的固體表面接觸，并由此易于導致污染。
通過電潤濕法操縱平面電極陣列上的微滴已經非常流行，因為其允許使微滴尋址(address)到不同的位置而且是沿著復雜且可編程的路徑。例如，美國專利6294063公開了一種用于程序化操縱多個小包的設備，這些小包任選為微滴，所述設備包括反應表面，構造成提供小包相互作用的場所(site)；進口；在所述小包上產生操縱力的裝置，所述力能程序化地相對于(about)反應面沿著任意選擇地路徑移動所述小包；以及位置傳感器。
美國專利6565727也公開了一種用于操縱極性液體的微滴的裝置，其包括上表面和下表面，所述上表面和下表面限定了它們之間的縫隙，所述上表面包括多個相互交叉(interdigitated)的電極，且所述下表面包括公共(common)反電極。該裝置還包括在所述電極和所述縫隙之間的絕緣層以及定位于所述縫隙中的非極性液體。在該裝置中，通過在第一電極和所述下表面上的該反電極之間施加電勢，使得所述上表面對于所述第一電極附近的微滴潤濕，從而微滴可保持在所述上表面上的所述第一電極的頂部。然后，通過抑制所述第一電極和所述反電極間的電勢差，并通過在所述第二電極和所述反電極之間施加電勢差以第二電極對于所述流體潤濕，從而微滴能被移動至所述上表面上的、與所述第一電極相互交叉的所述第二電極。
電潤濕還可以用于混合兩種不同的微滴，如M.Washizu在IEEE Trans.Ind.Appl.，34，732-737(1998)中所述。混合含有例如兩種試劑或一種樣品和一種試劑的微滴是發展微流控集成系統或“lab-on-chips”的關鍵技術步驟。
然而電潤濕所需的電極平面陣列的形式具有嚴重的缺陷。電極陣列的制造是復雜的，且對于超過幾平方厘米表面而言，技術要求很高且非常昂貴。因此，長距離例如大于10cm傳輸微滴是不現實的。而且對于液體微滴，表面應該保持水平且相對無震動，以避免液滴在重力或聲波的作用下產生不必要的運動。在平行形式中操縱微滴還會因微滴蒸發而受限，微滴蒸發嚴重阻礙了定量生化的應用，因為反應產率對濃度非常敏感。電潤濕可以進一步導致表面污染。另一個限制是電潤濕僅可以利用液體工作，因此不能用于傳輸固體對象。
介電泳是另一種傳輸和混合微滴或固體對象例如細胞或膠乳顆粒的方法。例如Schwartz等人在Lab Chip，4，11-17(2004)中公開了一種可程序化的流體處理器，在該流體處理器中，通過使陣列中的電極順序通電，微滴可以在電極陣列的頂部移動并混合。然而，該方法也需要在平面上的復雜電極陣列，因此該方法共有電潤濕的很多缺點。在另一個例子中，Velev等人在Nature，426，515-516(2003)中公開了一種用于將浮在氟化油層上的微滴移動和混合的方法，其中油與電極圖案接觸。這消除了電潤濕中的內在污染問題，但是還需要制造復雜的電極陣列。
在細長的微通道或已連接的微通道的網絡中傳輸和混合微滴對上述問題更有效。例如，避免了蒸發且通過圍繞微滴的載流體的簡單的水力流動作用使得能長距離運輸。從而可以在幾米長的毛細管中運輸微滴，并作為微反應器，如Curcio和Roeraade在Anal.Chem.，75，1-7(2003)所描述的那樣。當與壁的相互作用被良好地控制時，所有微滴以相同速度移動，且可得到非常穩定的串(trains)。然而，這種系統造成微滴之間的污染，這已歸因于在流動中形成小的伴生(satellite)微滴。Park等人在Anal.Chem.2003，75，6029-6033中提出一種系統，其中大量水性樣品虹吸(plug)通過空氣虹吸(air plug)隔離。然而，壁的處理不足以完全避免污染，因此有時需要包括“清洗”樣品之間的微滴。另外，流束中的氣泡會引起微滴的熱過程中的不均勻性，這使得該技術對于定量應用沒有吸引力。
還提出通過介電泳操縱微通道中的固體顆粒或細胞。介電泳利用了在電場梯度中施加在顆粒上的力，所述顆粒的介電常數不同于周圍介質的介電常數。不同種類的配置用于注明介電泳應用在微通道中的日期。在第一個中，緊密間隔的相互交叉的電極陣列局部地形成吸引顆粒的高場梯度線。任選地，這些線可以通過交替地使不同系列電極通電而及時移動，這樣的方法被成為“行波介電泳”。例如，Schnelle等人在Electrophoresis，21，66-73(2000)中公開了一種用于分選顆粒的方法，其中通過在相互交叉配置的多個電極之間的行波介電泳來使所述顆粒偏轉(deflect)，并用四相交替的電信號連續激發所述顆粒。通過使用穿過微通道的、不同形狀的相互面對的一對電極，并在所述電極之間施加電勢差，可以產生不同種類的介電泳陷阱、介電泳籠或介電泳偏轉電極，如Durr等人在Electrophoresis，24，722-731(2003)中所述。
這些介電泳裝置與平面系統相比具有一些優點。尤其是，它們對于傾斜和震動更有效(robust)。然而這些裝置仍需復雜的微制造且造價昂貴。
在微通道微滴系統的發展中、尤其是在用于微反應器應用的發展中，另一個關鍵障礙對來自不同源的樣品或試劑的混合。為此，需要合并(coalesce)兩個微滴，但是拉普拉斯(Laplace)力和流體動力學的力使得所述合并變得困難。當同時到達T型交叉處時，一微滴簡單地跟著另一微滴進入T型交叉處而沒有進行合并。合并可以通過使所述微滴接觸帶電而強迫進行，但是這會成為PCR系統和其他生物系統的主要污染源。一旦所述微滴引入到通道中，尾隨大微滴的小微滴最終與大微滴合并，因為小微滴具有更大的平均速度。然而，這在微流控技術中不是合理的策略，因此微滴之間的膜排泄非常慢，這導致合并距離在30-100倍管直徑之間(Olbricht和Kung，J.Colloid Interface ScL，120，229-244(1987))。此外，在一定條件下(相對微滴的大小、粘度等)，不會發生合并，且合并時間和位置極其不可重復。
因此，強烈需要一種用于在微通道或封閉的微流系統中提供可重復的且無污染的微滴操縱、尤其是合并的裝置和方法。

發明內容
本發明的目的尤其是提供這樣的裝置和方法。
根據本發明的一個方面，本發明涉及一種微流控裝置，其用于使至少一個小包變形尤其是分裂，或者使至少兩個小包相向移動特別是用于破壞小包時，所述裝置包括-具有軸線的微通道；-小包操縱裝置，包括以下中的至少一個·發生單元和電極組件，該電極組件連接于該發生單元并構造成用于在所述微通道的至少一部分內產生與該微通道的所述軸線(X)基本共線的電場，其中該發生單元能產生具有這樣的振幅和頻率的電場，即所述電場引起至少一個小包變形或至少兩個小包在所述微通道中相向移動，·至少一個側通道，該側通道的第一端與所述微通道的一部分連接且該側通道的第二端與輸送系統連接，所述輸送系統適于輸送溶液、尤其是具有表面活性劑的溶液，所述溶液能改變所述至少兩個小包之間或所述至少一個小包和其環境之間的界面張力，所述輸送系統構造成至少在所述小包經過所述微通道的所述部分時將所述溶液輸送到所述微通道中。
換句話說，采用根據本發明的所述裝置操縱小包可以通過產生合適的電場或者通過改變液體小包的表面張力或者通過將這兩種技術結合來進行。
所述界面張力可以改變，優選降低至少20％，更優選降低50％。
當兩小包被引入到施加有所述電場以使所述兩小包破壞(collapse)的、所述微通道的所述部分中時，通過所述電場在所述小包中生成偶極子，所述偶極子基本沿著所述微通道的所述軸線被定向，以使得所述小包彼此吸引并破壞。
“基本共線”的表述指的是所述電場方向的平均與所述微通道的所述軸線的夾角小于45°，例如小于30°，優選小于20°，且最優選小于10°或5°。
本發明可以用于使兩小包破壞和用于例如使兩微滴在所述微通道中合并。
普通的物理現象“電合并(electrocoalescence)”在P.Atten，J.Electrostat.30，259(1993)中公開。針對電泳力，且與介電泳相比時，電合并不需要場梯度。
當小包是細胞或含有一些細胞時，本發明可以用于對這個細胞或多個細胞進行電穿孔。
本發明還可用于將一個小包分裂成幾個尺寸更小的小包、和用于例如從一微滴中提取一個或幾個尺寸更小的微滴。
根據本發明的微容器可以具有任意尺寸。優選地，所述微容器的至少一個尺寸小于1毫米。在一實施方式中，所述微容器是直徑小于1mm的微毛細管。例如，所述毛細管的橫截面的至少一個尺寸優選處于100μm-1mm之間。在一實施方式中，所述毛細管的至少一個尺寸優選處于10nm-100μm之間，優選處于1μm-100μm之間。在另一實施方式中，所述微容器是厚度小于1mm的微制造的微通道。在一些實施方式中，所述微通道的厚度優選處于100μm-1mm之間。在一實施方式中，所述微通道的厚度優選處于10nm-100μm之間，優選處于1μm-100μm之間。
在本發明中，“微容器”、尤其是“微通道”指的是至少部分由固體表面封閉的體積，所述體積很小。優選地，本發明中的微容器尤其是微通道的表面/體積比基本大于1mm-1，優選大于4mm-1，例如大于10mm-1，可能大于1μm-1。所述微通道也包括納米通道。
在一實施方式中，所述微通道優選是細長的，即，在所述微通道的所述軸線方向上的尺寸比與所述軸線相垂直的其他方向上的尺寸大3倍，優選大10倍，例如大100倍或大1000倍。
所述微通道的所述軸線可以是直線或非直線。
所述微通道的橫截面可以是常量或不是常量。所述橫截面可以例如是圓形、橢圓形、矩形、方形或缽形。
在本發明中，“厚度”指的是所述微通道的兩個相對邊之間在橫截面上的最小內距離。例如，對于具有環形橫截面的筒形微通道，所述厚度是直徑。對于具有矩形橫截面的縫狀微通道，所述厚度是所述矩形的短邊長度。
所述微通道的所述厚度可以是在幾納米到幾毫米之間的任何值。優選地，所述厚度處于1μm至1mm之間。更優選地，所述微通道在其軸線方向上的長度可以選擇成至少為所述厚度的10倍。所述微通道可以具有10mm至幾米間的長度，例如1cm和50cm。
優選地，所述微通道的所述部分(在所述部分中，所述電場與所述微通道的所述軸線基本共線)在所述軸線方向上的長度至少與所述微通道的所述厚度一樣，且小于所述微通道的總長。在本發明的一優選實施方式中，所述微通道的所述部分的長度約處于所述部分的厚度的1倍至100倍之間，優選約處于所述部分的厚度的1倍至10倍之間。
所述微通道可以是剛性或柔性的，且包括例如由柔性非導電材料制成的管。
所述微容器尤其是所述微通道可以由選自下列材料中的至少一種材料制成熔融石英玻璃、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)，任何彈性體或塑料，例如聚乙烯、聚酰亞胺、環氧樹脂、Teflon、Parylene、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、含氟聚合物、聚酯、環烯烴共聚物，不導電氧化物，例如玻璃、二氧化硅、金剛石、不導電陶瓷、硅酮、彈性體、玻璃狀材料、礦物材料、陶瓷、聚合物、熱塑性聚合物、熱固性樹脂、光致固化樹脂、共聚物。
在本發明的一示范性實施方式中，所述微通道具有至少一個進口和/或至少一個出口。任選地，所述口的至少一個可以連接到一個或若干個貯存器、一個或若干個泵、一個或若干個檢測器或傳感器、或連接于一個或若干個取樣裝置。
所述微通道可以是已連接的多個微通道的網絡的一部分。
在本發明的優選實施方式中，所述電極組件與所述微通道的內表面例如通過絕緣材料電絕緣。所述絕緣材料的厚度至少是1nm，例如至少10nm，優選至少100nm，最優選至少1μm，例如高達幾十或幾百微米。一般地，微通道越大，所述絕緣材料的厚度也越大。所述絕緣材料可以由例如聚合物材料制成，例如聚乙烯、聚酰亞胺、環氧樹脂、Teflon、Parylene、PMMA、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、含氟聚合物、聚酯、環烯烴共聚物、PDMS，不導電氧化物，例如玻璃、二氧化硅、金剛石、不導電陶瓷。
優選地，所述電極組件包括沿所述微通道的所述軸線以一距離在所述軸線方向上間隔開的至少兩個電極，所述距離足夠長以使所述電極之間的所述電場與所述微通道的所述軸線基本共線。每個電極可以相對于所述微通道的所述軸線對稱。有利地，所述電極的至少一個包括至少兩個對著所述微通道的彼此面對的等勢部分。所述電極的至少一個可以是具有例如將所述微通道環繞的筒形表面的單片(monolithic)。在一變型中，所述電極的至少一個是復合的，即由多片組成，包括例如將所述微通道夾在中間的、至少兩個基本平行的等勢板。所述電極還可以具有除上述說明以外的其他形狀。
這與如專利申請FR 2794039或Paik等人，Lab Chip，3，28-33(2003)所公開的現有技術不同，在該現有技術中微滴的操縱是通過相反的布置來獲得的，即在穿過腔室的兩彼此面對的平行電極之間施加電勢差，待操縱的微滴容置于腔室內。
優選地，所述電極以一間隙間隔開，所述間隙的長度大于所述微通道的所述厚度，優選大于所述厚度的2倍。
所述發生單元有利地包括電流發生器和電壓發生器中的至少一個，其設置成在所述兩個電極之間產生電勢差，優選是交變電勢。
有利地，所述電極組件構造成在所述微通道的至少一個橫截面中，所述電場的振幅變化小于10倍，優選小于5倍，更優選小于2倍，且優選基本均勻，尤其是在所述電極之間的所述間隙中。
由所述發生單元通過所述電極組件產生的所述電場可以具有任何瞬間曲線，例如連續的、變化的或交變的(AC)、或是上述瞬間曲線的結合。例如所述電場可以是具有可變頻率或均方根(RMS)振幅的交變電場，或者是連續部分和AC部分的疊加。
交變電場(AC場)指的是任何隨時間周期變化的且具有零時間平均值的場。根據本發明的交變電場的實例不限于正弦、方形或鋸齒交變電場。
所述發生單元優選能產生頻率在約0.01Hz至約1GHz范圍、優選在約1Hz至約10MHz范圍內的交變電場。
微滴的合并例如在100Hz和10kHz之間的頻率下有效地實現。至少一個微滴的等分優選在小于50Hz的頻率下完成。
所述發生單元可以構造成根據小包的性質、圍繞所述小包的流體的性質、所述微通道的性質和所述裝置的大小，輸送范圍在1V至30kV之間的、優選范圍在60V至2kV之間的RMS電壓。所述電壓可以隨著所述裝置的尺寸的增加而增加。在所述微通道內位于所述電極之間的所述間隙中的RMS電場可以是例如范圍在100V/cm至100kV/cm之間，優選范圍在500V/cm至20kV/cm之間。
所述發生單元可以構造成輸送這樣的電壓，即所述電壓的振幅和頻率中的至少一個隨時間變化。例如，所述電場的振幅和/或頻率可以隨著兩個小包緊密接觸而改變。
有利地，所述電極組件設在支座中，所述支座具有通過固定元件組裝在一起的兩個分離開的支撐元件，每個支撐元件承載所述電極組件的一個電極。所述支座可以包括至少一個用于容置所述微通道的孔。
當所述微通道連接于一側通道時，所述側通道的橫截面尺寸可以與所述微通道的截面尺寸相當。優選地，所述側通道的橫截面小于所述微通道的截面。在一變型中，所述側通道的橫截面大于所述微通道的橫截面。
與所述側通道相關的所述輸送系統可以包括壓力控制裝置或流量控制裝置。
優選地，所述側通道和所述輸送系統構造成用于在所述微通道中輸送含有表面活性劑的溶液。
術語“表面活性劑”指的是能改變兩流體之間的界面張力的任何物種、分子或分子的組合。表面活性劑可以是例如表面活性(tensioactive)的物種或兩性分子(amphiphilic)的物種。
所述表面活性劑可以選擇成有利于形成水包油乳液。
如果小包是懸浮在非水液體中的水性微滴，則所述表面活性劑一般是具有高HLB(親水/親油平衡)的表面活性劑，例如HLB值大于15。這樣的表面活性劑的非限定實例是十二烷基硫酸鈉(SDS)、油酸和CTAB。
如果小包是在水性環境流體中的油滴，則所述溶液優選含有至少一種低HLB的表面活性劑，例如HLB小于15，且優選小于10。
很多可以降低油相和水相之間的界面張力或有利于微滴合并的表面活性劑記錄在Emulsions，a fundamental and practical approach，J.S.Sjblom Ed，Kluwer，Dordrecht(1992)或P.Becher，Emulsions，Theory and Practice，2ndEd，R.E.Krieger Pub.Co，Malabar，F1(1985)中。
在本發明的一示范性實施方式中，為了將兩微滴合并或分裂，所述裝置包括連接于所述輸送系統的第一側通道，所述微通道可以連接于一第二側通道、優選連接于或接近所述第一側通道、并構造成用于收集通過原始小包合并或分裂形成的小包。
所述微通道可以由各種同類(homogeneous)的或復合材料制成。在US6294063公開的現有技術中，小包被操縱到構造成提供小包相互作用場所的反應表面上；與該現有技術相比，根據本發明的所述微通道壁可以由一種材料制成或用一種材料進行處理，這在包埋(embedding)流體存在的情況下降低小包與所述微通道壁相互作用的風險。在所述小包和所述微通道之間可以沒有任何化學相互作用。
在示范性實施方式中，所述小包是水基微滴，通過處理所述微通道壁和/或通過在微滴中和/或在流體包含添加劑，所述微滴與所述微通道壁之間的界面張力大于所述微滴與周圍流體間的界面張力。
水基液體和表面之間的表面張力可以通過很多方法來增加。例如，可以選擇本質上疏水的表面，例如氟碳或聚乙烯。還可以用諸如TeflonAF、硅烷或氟硅烷之類的疏水材料處理所述表面。
水和氫化的油基流體之間的表面張力可以由于表面活性分子的存在而降低。本領域已知很多這樣的表面活性分子，這里僅列出一些作為例子Pluronics和Symperionics、Triton、Tween、Span80、Tergitol、十二烷基硫酸鈉(SDS)、油酸、甲基纖維素、羥乙基纖維素和羥丙基纖維素、或Coatex。如果流體是氟化的，則諸如1H，1H，2H，2H-全氟正癸醇或1H，1H，2H，2H-全氟正辛醇等氟化表面活性劑特別合適。
氟化的水溶流體可以包括至少一種以下成分部分或完全氟化的烷烴、烯烴或炔烴，例如全氟萘烷等全氟烷烴。在一個實施方式中，所述水溶流體是氟化分子的混合物，諸如“氟利昂”族氟化溶劑，或者是FC氟代表面活性劑，諸如FC40或FC75(3M有售)。優選在所述混合物中沒有既定的分子量的化合物大于混合物的75％w/w(重量比重量)。
在本發明的示范性實施方式中，所述微通道由包圍至少一個小包的流體填充，所述流體可以是任何液體或氣態流體，條件是所述流體不與所述小包或所述微通道壁混溶。
所述包圍小包的流體可以是液體，例如不混溶于水的有機或無機液體。
所述流體可以是氟化液體或氣體，且所述微滴可以是任選含有物種(species)的有機或水-有機(hydroorganic)液體。
在本發明的示范性實施方式中，所述小包和所述周圍流體具有不同的電導率和/或不同的介電常數。例如所述小包的電導率可以大于所述周圍流體的電導率。
在本發明的示范性實施方式中，所述小包是懸浮在不混溶的第二液體中的第一液體的微滴，所述第一液體的導電性比所述第一更大。
所述微滴可以是水基微滴，所述水基微滴可以含有任何天然的、人造的、有機或無機種類，例如生物分子、蛋白質、蛋白質復合物、酶、半抗原、抗原、抗體、核酸適體(aptamer)、表位、核酸、肽、多糖、糖肽、細胞、細胞團聚物、藥、化學品、膠乳、活的或死的生物、病毒、細胞器(organelles)、脂質體、泡囊、微團、合成或天然聚合物、納米顆粒、發光分子、量子點、化學試劑、緩沖劑、表面活性劑和這些種類的組合。
在本發明的另一示范性實施方式中，所述小包是不溶水的液體的微滴，且所述周圍流體是水基溶液。
本發明可以允許操縱尺寸與所述微通道的橫截面相當的小包。
作為示范性實施方式，所述小包的最小橫截面積為至少是所述微通道的在第一電極位置處或在第二電極位置處的橫截面積(無論哪個更小)的一半。
所述小包可以是直徑與所述微通道的直徑相當的球形微滴，或者是跨在所述微通道的整個橫截面上的細長微滴。
根據本發明的所述裝置可以用于例如融合膠體(colloids)以形成鏈。
所述裝置還可以用于篩選工序。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種用于使至少兩個小包在微通道中相向移動的方法，尤其是為了將所述至少兩個小包破壞，所述微通道具有縱軸線，所述方法包括下列步驟-將至少兩個小包引入到所述微通道中，-在所述微通道的至少一個部分中、至少當所述小包位于所述微通道的所述部分內時產生電場，所述電場優選與所述微通道在所述部分處的軸線基本共線、且所述電場的振幅和頻率選擇成使所述兩個小包相向移動。
當所述電場是通過沿所述微通道的所述軸線在軸線方向上間隔開的至少兩個電極產生時，所述電極以一間隙間隔開，所述方法包括下列步驟-在產生所述電場前，將兩個小包定位在所述電極之間的所述間隙內，所述小包處于靜態平衡，-產生所述電場。
在一變型中，用于破壞(collapsing)的所述小包可以在一開始放在流動的流束(flowing stream)中以進行破壞的飛行操作(in-flight operation)。
由此，所述方法可以包括下列步驟-將兩個小包定位在所述微通道中，所述兩個小包中的至少一個處于所述電極之間的所述間隙之外，
-例如通過在所述微通道中的流動的流束，使所述兩個小包朝著所述間隙移動，-至少在所述小包位于所述間隙中時產生所述電場。
在本發明的示范性實施方式中，所述小包中的至少一個含有生物材料，例如細胞或細胞質核(cytoplasm nucleus)。所述用于破壞至少兩個小包的方法在所述小包含有生物膜時尤顯優勢。
所述方法可以被實施，以形成雜交瘤或操縱胚胎形成細胞(embryonicfounder cells)。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種用于使至少兩個小包在微通道中相向移動的方法，尤其是為了將所述至少兩個小包破壞或為了分裂至少一個小包，所述微通道具有軸線，所述方法包括下列步驟-將所述至少兩個小包或所述至少一個小包定位在所述微通道的一部分中，-將表面活性劑溶液輸送到所述微通道的所述部分中，所述表面活性劑能改變所述至少兩個小包之間或所述至少一個小包與其環境之間的界面張力。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種用于在具有縱軸線的微通道中將至少一個小包分裂的方法，所述方法包括下列步驟-將所述至少一個小包引入到所述微通道中，-在所述微通道的至少一部分內、至少當所述至少一個小包位于所述至少一部分內時產生電場，所述電場優選在所述部分處與所述微通道的所述軸線基本共線、且具有選擇成使所述小包分裂的振幅和頻率。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種監控破壞至少兩個小包或分裂至少一個小包的方法，所述方法包括下列步驟-使用上述定義的微流控裝置在微通道中進行破壞或分裂，-檢測所述破壞或分裂，例如通過視頻裝置或通過測量諸如與例如容置在所述微通道中的至少一個物質相關的電阻等電參數。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種用于在有軸線的微通道中使至少一個小包移動的方法，所述方法包括下列步驟-將至少一個小包引入到所述微通道中；-在所述微通道的至少一個部分中、至少當所述至少一個小包位于所述微通道的所述部分內時產生電場，所述電場優選與所述微通道的所述軸線基本共線，以沿著所述微通道移動所述小包。
所述電場可以是連續的。
在所述微通道中移動至少一個小包的操作可以獨立于破壞或分裂的操作。
在一變型中，上述在所述微通道中移動至少一個小包的操作可以被實施，以便在進行所述破壞或分裂操作前將所述至少一個小包恰當地定位在所述微通道中。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種用于在微容器中尤其是在微通道中對至少一個小包進行至少一種操作的方法，其中所述微容器具有至少一個限定了所述微容器的內部空間的管狀部分，其中-所述管狀部分由無內部涂覆的成塊氟化材料制成，或-所述管狀部分由成塊非氟化材料制成，且在所述管狀部分的所有內周表面上都涂有耐久層(permanent layer)，或其中所述微容器包括一連串的至少兩個管狀部分，第一管狀部分由成塊氟化材料制成，第二管狀部分由成塊非氟化材料制成且該第二管狀部分的所有內周面涂覆耐久層，其中所述耐久層優選是疏水的，以及其中所述微容器至少部分填充有與所述小包不混溶的、且含有至少一種表面活性劑的載液，所述表面活性劑的濃度足夠高以降低所述小包和所述載液之間的表面張力。
措辭“成塊材料”指的是單片(monolithic)材料。
例如，根據本發明的成塊材料與由相同材料例如PDMS(聚二甲基硅氧烷)制成的兩部分的組合不同。
成塊材料也與由不同材料制成的兩部分的組合(例如由PDMS制成的部分與由玻璃制成的部分結合而成的組合、或者由硼硅酸鹽制成的部分與由硅酮制成的部分結合而成的組合)不同。
在已知的系統中，微容器或微通道的圓周的不同部分之間的化學性質的差異趨于使得小包或載液與所述不同部分的相互作用不同，從而對所述小包的操作的控制較差。
“耐久層”指的是沒有通過載流體加載到所述微容器的內表面上或從所述微容器的內表面上除去的層，一般如同用于加入到流體中的表面活性組分、特別是諸如SPAN、SDS、Pluronics等表面活性劑的情形。耐久層的使用是有利的，因為它更堅固，且為所述載流體的組成提供更多的自由度。
在根據本發明的方法中，針對一些應用，可以將這樣的表面活性劑加入所述載液。
管狀部分可以具有圓形或非圓形橫截面。例如橫截面可以是矩形。
管狀部分的橫截面可以沿著所述微容器的長度方向改變或不改變。
所述耐久層可以包括選自下列的材料熔融石英玻璃、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)，任何彈性體或塑料，例如聚乙烯、聚酰亞胺、環氧樹脂、Teflon、Parylene、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚酯、環烯烴共聚物，不導電氧化物，例如玻璃、二氧化硅、金剛石、不導電陶瓷、硅酮、彈性體、玻璃狀材料、礦物材料、陶瓷、聚合物、熱塑性聚合物、熱固性樹脂、光致固化樹脂、共聚物、硅烷、氟代硅烷、氟代聚合物。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種用于對埋在載液中的至少一個小包進行至少一化學、物理或生物操作的裝置，所述載液與所述小包不混溶，所述裝置包括至少一個將含有所述小包的所述載液包圍的微容器，其中所述微容器的內表面是氟化的，且所述載液含有比值濃度至少為0.1cmc(臨界膠束濃度)的表面活性劑。
根據本發明的所述微容器可以是任何形狀。例如所述微容器可以是矩形橫截面的微通道、圓柱形的微毛細管、薄板狀體(volume)，或者是圓柱狀、錐形或矩形微瓶(microvial)。
針對一些應用，根據本發明的所述裝置可以將多于一個、優選多于10個或多于100個、且高達幾十萬個這樣的微容器集聚在一起。
在一實施方式中，所述微容器具有至少一個進口。所述微容器可以具有至少一個出口。任選地，所述口可以連接到一個或若干個貯存器、一個或若干個泵、或一個或若干個取樣裝置。
任選地，所述微容器也可以是已連接的多個微通道和多個貯存器的網絡的一部分。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種在微容器中特別是在微通道中對至少一個小包進行至少一種操作的方法，其中所述微容器具有內部管狀疏水表面，其中所述微容器至少部分地被這樣一種載液填充，即所述載液與所述小包不混溶且含有至少一種濃度足夠高以使所述小包和所述載液之間的表面張力降低的表面活性劑。
所述操作可以是移動至少一個小包、分裂至少一個小包、將至少一個小包與至少另一個小包合并、使至少一個小包反應的操作中的至少一種操作。
所述移動可以包括在所述微容器中循環所述載液。
所述操作可以在無任何電場的情況下進行。
所述操作可以包括將所述至少一個小包從所述微容器的進口朝向所述微容器的出口移動。
所述操作可以包括將所述至少一個小包依次暴露在至少兩個不同的物理和/或化學條件下，尤其依次暴露在至少兩個不同的溫度條件下。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種微流控裝置，其包括具有內部管狀表面的微容器、特別是微通道，所述裝置還包括形成所述微容器的內空間的管狀成塊疏水部分，其中所述成塊部分涂覆有疏水層。
在一實施方式中，所述成塊部分由氟化材料制成。在一變型中，所述成塊部分由非氟化材料制成且涂覆有氟化層。
所述微流控裝置可以包括一連串的至少第一成塊部分和第二成塊部分，所述第一成塊部分由氟化材料制成但沒有涂層，所述第二成塊部分由非氟化材料制成且涂有氟化層。
在一變型中，所述微流控裝置可以包括兩個由Teflon制造并組裝在一起的部分，以用于形成所述微通道的周面。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種用于在微容器、特別是微通道中對至少一個小包進行至少一種操作的方法，所述微容器具有內表面，其中所述微容器由與所述小包不混溶的且含有至少一種表面活性劑的載液填充，其中所述小包與所述微容器的內壁之間的界面張力和所述小包與所述載液之間的界面張力的差至少為26mN/m，優選至少為35mN/m。所述差可以約在35mN/m至45mN/m之間。
在Tice等人在Langmuir 2003，19，9127-9133中已提出，如果微滴與載液之間的界面張力小于微滴與微通道之間的界面張力，則在沒有與微通道壁的相互作用下可以在微通道中利用載液進行微滴的運輸。特別是，作者在PDMS微通道(界面張力38mN/m)中采用溶解在含有含氟表面活性劑的氟碳(界面張力12-14mN/m)中的水微滴。
在這種情況下，微滴/微通道和微滴/載液間的差是24-26mN/m。令人驚訝地，已發現在相似的條件下(在硅酮毛細管(水與毛細管之間的界面張力為38mN/m)中在FC40加H，1H，2H，2H-全氟正癸醇中的水微滴(載液與水微滴之間的界面張力為12-20mN/m，見實施例11和圖14))，這種條件(表面張力差為正且在18mN/m至26mN/m之間)可以被滿足，然而仍然可以觀察到微滴的不良表現和在微滴之間的污染(見實施例14)。
相反，用氟硅烷進一步處理硅酮(和水之間的界面張力為55mN/m)，即，如果小包與微通道表面之間的界面張力和小包與載液之間的界面張力的差增加到35mN/m至45mN/m之間的值，則不會觀察到污染。
此外，當在Teflon毛細管(界面張力55mN/m)內在純FC40(水/FC40界面張力51.8mN/m)中運輸水微滴時，Tice等人所述的條件得到滿足，然而觀測到的微滴運輸不令人滿意，且微滴破裂。相反，當微滴/流體界面張力降低到處于10mN/m至20mN/m之間的值時，通過加入0.5％-3％的1H，1H，2H，2H-全氟正癸醇(小包與微通道表面之間的界面張力和小包與流體之間的界面張力的差處于35mN/m至45mN/m之間的值)，微滴的不規則運動和污染可以受到抑制。
在一優選實施方式中，所述表面活性劑在所述載液中的比值濃度至少為0.1cmc(臨界膠束濃度)，優選至少為0.5cmc，且更優選為1cmc。
有利地，所述表面活性劑在所述載液中的濃度在約0.01％至約10％w/w(重量比重量)之間，優選在約0.1％至約3％之間。
在一優選實施方式中，所述表面活性劑為含氟表面活性劑，特別是氟代醇。在一特別的實施方式中，所述含氟表面活性劑是1H，1H，2H，2H-全氟正癸醇。
在一特別的實施方式中，所述成塊部分由硅酮制成。例如，所述微通道由硅酮毛細管形成。
在一特別的實施方式中，所述成塊部分是硅烷化的。例如，所述成塊部分的所述內表面用硅烷處理。
在一實施方式中，所述硅烷選自單甲基硅烷、二甲基硅烷、三甲基硅烷、單氯硅烷、二氯硅烷、三氯硅烷等。在一優選實施方式中，所述硅烷選自單甲基氟硅烷、二甲基氟硅烷、三甲基氟硅烷、單氯氟硅烷、二氯氟硅烷、三氯氟硅烷等。在又一優選實施方式中，所述氟硅烷是全氟硅烷。在一個實施方式中，所述硅烷的末端具有包括至少2個碳原子、優選4個碳原子、更優選8個碳原子、更優選12、16或更多碳原子的骨架。在一實施方式中，所述氟硅烷選自1H，1H，2H，2H-全氟辛基三甲基硅烷和1H，1H，2H，2H-全氟癸基三乙氧基硅烷(Fluorochem出品)。所述硅烷優選溶解諸如乙醇、甲醇、辛烷、DMF等無水溶劑中。在另一實施方式中，通過向所述硅烷表面吹送無水載氣，所述硅烷直接從氣相沉積到表面、然后進到所述微通道中。
在一實施方式中，所述硅烷化在氬氣氣氛下進行。在另一實施方式中，所述硅烷化在空氣氣氛下進行。優選地，所述氣氛是無水的，因為水會引起硅烷水解且阻礙硅烷接枝(graft)。
在另一實施方式中，所述微通道的所述內表面可以在硅烷化之前通過本領域技術人員已知的若干方法中的一種方式進行活化。在一實施方式中，所述活化是等離子體活化。在一優選實施方式中，所述活化是通過在所述微通道中流經酸性溶液來進行的。在一實施方式中，所述溶液溶液選自鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸和氫氟酸(florhydric acid)。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種連接器，其使得至少一個小包無污染地從至少一個微通道向另一微通道運輸，所述連接器由所有內表面上具有疏水層的成塊材料構成，所述疏水層包括氟化材料和硅烷化材料之一。
在一優選實施方式中，所述成塊材料是彈性體。
在又一優選實施方式中，所述連接器涉及其進口或出口中的至少一個，涉及由不同材料、優選是非彈性體材料制成的微通道。
在另一實施方式中，所述連接器具有與微通道相關的至少三個孔口。還令人感興趣的是，為了控制流體在所述連接器中的流動，所述連接器包括可以插入到位于所述連接器的不同孔口之間的夾緊閥(pinch valve)或蠕動泵(perisaltic pump)中的部分。
所述連接器可以任選通過首先制備模制件，然后將彈性管連接到所述連接器的所述孔口中的至少一個孔口上而制成，所述彈性管的內表面也承載有疏水層。
優選地，且與現有技術采用的用于在微流控系統中操縱小包的大多數微通道不同，在本發明中，所述微通道部分是圓柱形的這將避免尖角(sharp angle)以及針式接觸角，以使液體或固體材料保留從而使小包間污染增加的風險。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種微容器，其選自-由成塊氟化材料制成的微容器，-由成塊非氟化材料制成的微容器，所述微容器的整個周面上都覆蓋有耐久絕緣層，-和微通道，其包括至少一由成塊氟化材料制成的部分和至少一由成塊非氟化材料制成的部分，所述由成塊非氟化材料制成的部分的整個周面上都覆蓋有耐久絕緣層，-所述微容器至少部分填充有與所述小包不混溶的、且含有至少一種表面活性劑的載液，所述表面活性劑的濃度足夠高以降低所述小包和所述載液之間的表面張力。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種微流控裝置，其包括至少一個微容器特別是至少一個微通道、以及與所述微容器相通的連接器，所述連接器構造成用于將所述微容器連接于另一微容器特別是微通道和所述裝置的進口或出口中的至少一個上，其中所述連接器的內表面包括至少一個疏水層。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種用于安裝在形成微通道的毛細管的一端的連接器，其中所述連接器的內表面包括至少一個疏水層。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種試劑盒(kit)，其包括-微流控裝置，包括微通道，-如上所述的連接器，待安裝于所述微流控裝置上。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種對小包進行至少一種操作的試劑盒，包括-微容器，特別是微通道，其內表面具有至少一種疏水材料，-載液，與所述小包不混溶且含有至少一種表面活性劑，所述表面活性劑的濃度足夠高以降低所述小包和與水不混溶的所述載液之間的表面張力。
本發明還涉及一種組件，其包括-如上所述的連接器，-至少一個連接于所述連接器的毛細管。
所述連接器可以是T型連接器。
優選地，所述毛細管具有氟化或硅烷化的內表面。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及一種用于進行PCR的裝置，包括-微通道，包括由毛細管制成的盤管，所述盤管至少部分填充有含表面活性劑的含氟溶劑，所述盤管包括暴露在不同溫度條件下的變性區、退火區和延長區。


本發明可以通過閱讀以下非限定的實施方式的詳細說明和附圖的解釋來更好地理解，在附圖中圖1是根據本發明的微流控裝置的部分示意圖，圖2是圖1的裝置的橫截面示意圖，圖3是圖2的裝置的支撐部件的透視示意圖，圖4A至圖4C和圖5A至圖5C分別示意地示出根據本發明的兩個微滴合并的三步驟，圖6A至圖6C部分示意地示出根據本發明的微滴等分的三步驟，圖7是電場在微通道的一部分中分布的示意圖，圖8是根據本發明變型的裝置的部分示意圖，圖9至圖13部分示意地示出本發明其他變型，圖14是如實例11所測量的、含氟表面活性劑1H，1H，2H，2H-全氟正癸醇與氟化油FC-40之間的界面張力的曲線圖，圖15示意并部分示出根據本發明的在實例12和實例13中使用的用于在分段流中擴增DNA的循環PCR系統，圖16是如實例12所述的在一連串微滴中的擴增產物的凝膠電泳，圖17是如實例13所述的相鄰微滴之間無污染的驗證，圖18是在未處理未清洗的硅酮毛細管中的微滴形狀，以FC40為載液(a)原始微滴，(b)稍后微滴(在微滴串中的第60個之后的微滴)；使用不同濃度的含氟表面活性劑，(c)0.15wt％含氟表面活性劑，(d)0.5wt％含氟表面活性劑，(e)3.0wt％含氟表面活性劑(實例14A和實例14B)，圖19是微滴在氬氣氣氛下硅烷化管中的形狀，(a)7.5vol％硅烷，(b)5vol％硅烷，原始微滴，(c)5vol％硅烷，稍后的微滴(第100個之后的微滴)(d)1vol％硅烷，(e)0.25vol％硅烷(實例14C)，
圖20是微滴在空氣下硅烷化管中的形狀，(a)10vol％硅烷，5分鐘反應(b)7.5vol％硅烷，5分鐘反應，稍后微滴的形狀(微滴串中第110個之后的微滴)，(c)5vol％硅烷，30分鐘反應，HCl活化，(d)5vol％硅烷，30分鐘反應，等離子體活化，(e)2.5vol％硅烷，30分鐘反應(實例14D)，圖21是微滴在具有0.5wt％含氟表面活性劑的硅烷化硅酮管中的形狀，(a)2.5vol％硅烷，30分鐘反應，第200個微滴，(b)5vol％硅烷，30分鐘反應，第200個微滴(實例14E)，和圖22至圖24部分示意地給出本發明的無污染連接器。
本發明的最佳實施方式1本發明第一個示范性實施方式圖1示出根據本發明的微流控裝置，所述裝置包括微通道2和電極組件3。所述微通道2具有縱軸線X且內橫截面為圓形。
所述電極組件3包括一對電極4，每個電極4包括金屬例如鋁圓柱。每個電極4的長度為例如4mm，且內徑為1.5mm、外徑為1.9mm。
電極4圍繞微通道2放置，且沿著X軸線以間距6間隔開。所述電極4通過包括電線的連接部件8連接到發生單元9。
所述電極4設置在包括兩個支撐部件11的支座10中，每個支撐部件是由Plexiglas制造的基本長方體，例如寬24mm、高20mm且深20mm。
每個支撐部件11在其中央位置處沿X軸線鉆有例如直徑1.9mm的第一圓柱孔12，用于保持電極4。第一孔12從該支撐部件11的正面13朝與該正面13相對的該支撐部件11的背面14延伸。
鉆取與第一孔12垂直的第二孔17，用于容置將對應的電極4連接于發生單元9的連接部件8。
每個支撐部件11還包括兩個孔20和21，所述兩個孔的軸線與孔12的軸線平行，且所述兩個孔構造成分別用于容置Teflon螺桿22和金屬桿23，以使利用孔12組裝的所述支撐部件11保持共線。
每個電極4安裝在相應的支撐部件11中，以使電極4與正面13平齊，如圖2所示。
所述兩個支撐部件11的正面13以例如2mm的長度間隔開，所述長度限定了所述對電極4之間的2mm的間距6。
發生單元9包括例如與放大器連接的函數發生器，以傳輸頻率高達1kHz的高達2kV的正弦電壓。所述發生單元9還可以包括諸如計算機之類的中央處理單元，以程序化控制提供給所述電極4的電壓。
圖7示意地示出了通過箭頭和等勢線一起給定的電場取向。
可以看到，電場與微通道2的軸線X基本共線，因此有利于電合并并將所有介電泳效應最小化。
如圖1所示，所述裝置1可以裝在連接有CCD照相機31和視頻記錄器32的雙筒顯微鏡30的觀察臺上，因而可以監測在微通道中兩個小包的破壞或一個小包的分裂。
所述裝置可以構造成在所述破壞或分裂之后將所述小包排出。
2本發明第二個示范性實施方式圖8給出了包括兩個復合電極35的電極組件3’，每個復合電極35具有一對彼此面對的基本平行的、且夾著矩形截面的微通道2’的等勢板36。每對板36連接于發生單元9的相應極。
3振蕩方法的實例在一實施方式中，微滴流體是TBE 5x緩沖液(0.45M Trisbase，0.45M硼酸和0.01M EDTA；Sigma)，所述微滴用0.25wt％溴酚藍染色，以便在含有0.5wt％1H，1H，2H，2H-全氟正癸醇(Fluorochem)的氟化油(FC-40，3M)載液中觀察，加入的所述1H，1H，2H，2H-全氟正癸醇(Fluorochem)用于避免與微通道2的壁的相互作用。所述微滴的導電性為3mS/cm，且所述載液的導電性為2.5×10-13mS/cm。為了形成微滴，兩流體在1.5mL Eppendorf管中分層，使得底層由近似0.6mL載液(FC-40/1H，1H，2H，2H-全氟正癸醇)組成，上層由近似0.6mL微滴流體(TBE 5x/溴酚藍)組成。
微通道2由注射泵注入(由KD Scientific提供)，所述注射泵使用例如填充有所述載液的HamiltonGas-Tight 250μL注射器。泵入到微通道中的過量流體可以收集到廢液貯存器中。完全填滿毛細管后，將微通道2放進成層的Eppendorf管的載液相中。然后泵以1ml/hr的速度吸取。通過人工或將微通道裝到機械振蕩器上使微通道在載液相和微滴相之間以例如接近2Hz的頻率振蕩，形成微滴。通過這種方法形成的微滴的直徑與微通道的直徑近似相同。
4在微通道中移動小包的示范性方法所述方法可以采用上述定義的任何裝置來進行。
通過上述描述的振蕩方法形成單個微滴。使用所述注射泵，將微滴吸取到所述電極4之間的間距6中。當微滴已到達所述間距部分時，正好在上游電極前，流動停止且使所述系統穩定在平衡位置。然后施加連續電壓，對與微滴最近的電極4施加正電壓且使與微滴最遠的電極接地。在視頻中可以記錄微滴向接地的電極運動，且測量用于給定移動的時間。微滴僅在位于所述電極4之間時移動，而在位于接地電極時停止。
5靜態合并的實例所述靜態合并可以由上述定義的任何裝置來進行。
由上述振蕩方法形成微滴，以使兩個微滴之間的間距大于所述電極4之間的間距6。一開始利用注射泵將第一微滴引入所述電極4之間的間隙6中。當微滴到達上游電極時，流動停止。利用上述電場作用將微滴向與先前施加的流動的方向相反的方向移動，直到微滴到達下游電極。所述流動直到第一微滴返回到上游電極才重新開始。重復這個過程，直到第二微滴出現在所述電極4之間。然后調整微通道在所述電極中的位置，以使第二微滴在所述電極之間的間隙6之外。第一微滴向與先前施加的流動的方向相反的方向移動，直到兩微滴之間的間距為例如0.5mm。然后重新定位微通道，以使所述微滴的兩個最近的邊緣之間的中點位于所述兩電極的中間，且使所述系統穩定到平衡。
在圖4A至圖4C描述的實例中，第一微滴40的直徑約540μm，第二微滴41的直徑約560μm。對所述電極4施加2kV、1kHz的正弦電壓，微滴的初始移動是穩定的，較小的微滴40以稍大的速度移動(圖4A和圖4B)。當微滴40和41開始緊密接觸時，它們迅速加速且將居間的膜排出(圖4C)，這表明所述裝置1應當提供一開始靠攏的微滴的基本瞬間合并，例如發生在兩微滴同時到達T型連接處時。
6飛行合并(in-flight coalescence)的實例所述飛行合并可以由上述定義的任何裝置來進行。
第一微滴43的直徑可以約為580μm，第二微滴的直徑可以約為560μm。
在將所述微滴定位以后，將所述微通道設置成使得兩個微滴均位于電極4之間的間隙6之外。然后將2kV、1kHz的正弦電壓施加給2mm間隔的所述電極且繼續保持于整個實驗過程。施加電場后，通過注射泵以50μL/hr吸取使得流動開始。
微滴42進入所述電極4之間的間隙6中，且在沒有微滴43(見圖5A)的情況下以恒定速度移動。在13秒后露出微滴43的前界面(leading interface)，但是該前界面對微滴42沒有產生影響。僅當后面的微滴(trailing droplet)完全處于所述電極之間的間隙6中時，偶極力本身才顯現出來。然后，對于這些分隔開得很大的微滴，合并時間與靜態情況下基本相同(約8秒)，但是由于流動，動力學上有點不同。所述偶極力強得足以使微滴42停止(圖5B)，同時微滴43以恒定速度向微滴42移動，這使得以與在靜態情況下基本相同的速度縮短距離。一旦微滴靠攏，所述強大的偶極力將迅速排出居間的流體并完成合并(圖5C)。
7微滴分裂的實例單個大微滴46通過上述的但以較低頻率振蕩界面來形成。通過注射泵吸取，將微滴46引入到所述電極之間的間隙6中(圖6A)。本實施方式中的微滴是具有2.5mm長軸的橢圓形回轉體。施加2kV、0.1Hz的矩形張力(squaretension)，微滴46分裂成兩個較小且穩定的微滴47(圖6B和圖6C)，所述微滴47從間隙6中排出。
獲得干凈的微滴分裂的一般操作條件，也就是一個大微滴分裂成兩個較小的且穩定的微滴而不形成任何伴生微滴(satellite drop)的條件可在于頻率在0.1Hz至1Hz之間且振幅在1kV至2kV之間的矩形電壓。在這樣的條件下，微滴可以在小于一分鐘內破碎。所施加的最低電壓可以得到“最干凈的”分裂，但是所需的時間更長。微滴的長度可以約為間隙6的長度。
8本發明的其他示范性實施方式如圖9和圖10所示，在所述電極4之間的微通道部分50和橫向通道51形成T型交叉。在所述電極4之間的電場引起的微滴合并后，所得到的微滴52例如通過采用連接于橫向通道51的注射泵而在橫向通道51中被驅動。
如圖11和圖12所示，微滴分裂可以通過在兩電極4之間施加電場以從質量較大的流體54中提取微滴53來進行。
因此，在需要時微滴53可以例如通過程序化控制所述電極4來形成。
9本發明另一示范性實施方式圖13表示本發明的裝置60，所述裝置60包括微通道61，微通道61的一部分62連接于第一側通道63和第二側通道64。
所述部分62可以例如基本位于所述微通道的中間。
在本實施方式中，微通道61的厚度約為100μm、寬度約為300μm，側通道63的厚度約為100μm、寬度約為50μm。
側通道63連接于輸送系統66，所述輸送系統66包括具有貯存器67的注射泵，貯存器67容納有濃度大于臨界膠束濃度的十六烷油酸和SDS的表面活性劑溶液。
微通道61填充有濃度調整為避免水性微滴與微通道壁之間的相互作用的、含有十六烷的溶液，所述十六烷含有SPAN。
側通道64連接于注射泵68，注射泵68構造成在吸取模式下從微通道61中吸取所述溶液。
從微通道61的兩端將5X TBE緩沖液的兩個微滴70引入并在微通道61中移動。將所述兩個微滴70從兩端的吸入是同步的，以使所述兩個微滴70從兩端同時到達所述部分62。當所述兩個微滴70處于所述部分62中時，由輸送系統66將容納在貯存器67內的表面活性劑溶液以預定流速輸送到所述微通道的所述部分62中，以使所述兩個微滴70合并。最佳流速可以通過逐漸增加流量直到所述微滴在每次碰撞都合并來確定，這便設定了最佳流速。
在另一實施方式中，表面活性劑溶液可以以脈沖方式輸送，且與所述一對微滴到達所述連接的部分62同步。
得到的微滴71收集在注射泵68中以用于進一步的使用或例如傳輸到另一微通道以用于檢測。
10在容置于含氟聚合物毛細管內的氟化油中的、規則陣列的水微滴的形成和運輸的實例采用連接有電夾緊閥(electro-pinch valve，NResearch，Caldwell NJ出品)的Y型連接器(Upchurch Scientific出品)生成微滴串。所述Y型連接器的一個進口用由0.25wt％溴酚藍染色以便觀察的TBE 5x緩沖液(0.45M Trisbase，0.45M硼酸，和0.01M EDTA，Sigma出品)填充。所述Y型連接器的另一側和測試毛細管(PFA，內徑(i.d.)800μm，Upchurch Scientific出品)用成塊氟化油FC-40(3M)或含有不同量的氟代醇表面活性劑(1H，1H，2H，2H-全氟正癸醇，Fluorochem出品)的FC-40填充。利用LabView程序循環所述電夾緊閥同時利用計算機控制的哈佛毫升模式注射泵(Harvard milliliter module syringepump)吸取，以生成微滴串。一般的循環由6秒的從TBE線吸取和8秒的從FC-40線吸取組成。利用雙筒顯微鏡(Olympus)觀察微滴并采用CCD照相機(Hitachi)和WinTV記錄微滴。
首先測試微滴串在微流控系統中的穩定性。以前在分段流PCR(segmentedflow PCR)中，微滴間的交叉污染歸因于微滴的不穩定型和小的伴生微滴的形成。我們不僅要尋找單個微滴的破碎還要觀察所有含有幾百個微滴的微滴串的整體穩定性。這樣的串的穩定性主要是為了我們技術的高產出應用。
當微滴在純FC-40中被拖拽(entrain)時，觀察到微滴偶爾粘到壁上。這是未預料到的，因為壁和載液都是氟化的，且已預料到壁將會被Fc-40強有力地潤濕。這種粘結歸因于毛細管壁的缺陷(粗糙或化學不均勻性)，這在通過擠壓工藝制造的成塊毛細管中應該預見到。微滴和毛細管壁之間的FC-40層非常薄，且對壁面的小的擾動將會破壞順暢的流動。如論如何，一旦一個微滴拖拽在壁上，即使是暫時的，則整個串都會失去穩定性。后面的微滴與所述受拖拽的微滴碰撞并交換流體，所述受托拽的微滴被從壁上釋放出，然后所述后面的微滴被拖拽。這個過程是無限進行的，且對于任何PCR應用將是災難性的。
然后在FC-40中加入0.5-3.0wt％的氟代醇表面活性劑。通過使一串含有大于200個微滴，則不會觀察到瞬間牽制在壁上、伴生微滴的形成或微滴串不穩定。
11水微滴和含有含氟表面活性劑的溶劑之間的界面張力測量采用家用液滴體積張力計測量界面張力。FC-40/表面活性劑液滴從8mm內徑(ID)Teflon毛細管分配到TBE5x緩沖液的貯存器中。使用最大分辨率的50μL Hamilton氣密注射器(Hamilton gastight syringe)和Hamilton PSD/2注射泵(Hamilton PSD/2 syringe pump)，液滴體積可以在步驟之間的任意等待時間內以25nL的增量增加。為了考慮到表面活性劑的平衡，我們一般在步驟之間等待30秒。張力測量是至少15個液滴的平均，并修正以用于Teflon針頭(tip)的浸潤。
12在根據本發明的裝置中進行DNA的PCR擴增的實例，涉及由成塊含氟聚合物制成的通道圖15給出了PCR裝置80，所述裝置80包括直徑4cm的銅柱體81，且銅柱體81機械加工成與變性區82、退火區83和延長區84對應的三塊。延長區84是其他兩個區大小的兩倍，因此占柱體81的一半。所述三個區由固定在銅柱體的所述三塊之間的聚碳酸酯板85彼此分隔開。加熱器的兩端覆蓋有聚碳酸酯柱以提供結構穩定性，同時保持在兩個區之間的隔離。每1/4的柱體上鉆三個穿過整個裝置的小孔88以提供空氣冷卻的通氣口。在每個區中鉆出部分貫設所述柱體的兩個小孔89(用于熱電偶)和一個較大的中央孔90(用于加熱器)。用于加熱的孔和用于熱電偶的孔不對所述加熱器的空氣冷卻側敞開。每個區覆蓋有與銅柱的相對區接觸的薄鋁箔層，以提供上述的加熱。所述箔層可以用聚碳酸酯殼和棉花層覆蓋，因而所述柱體絕緣并提供橫跨(across)毛細管的均勻溫度。小渦輪將周圍的空氣吹過每1/4柱體中的三個通風孔，以便于更好的溫度控制和均勻性。
每個區包括一個電阻加熱器和兩個Pt-100熱電偶。電阻加熱器位于各自區的中央，而熱電偶位于所述區之間的界面附近。所述加熱器和所述熱電偶連接于客戶端電子器件。所述熱電偶通過Keithley 2701萬用表與寫在LabView中的客戶端PID程序控制連接。每個區的溫度可以任意設置。對于在此討論的實驗，使用的變性溫度為94℃，退火溫度為55.5℃，延長溫度為72℃。在我們的設計中，每個區中的溫差為±0.2℃。
一個4.5米長的透明PFA毛細管92(內徑(i.d.)800μm，Upchurch Scientific出品)通過變性區中的槽進入所述柱體，以提供約1分鐘的初始變性步驟。然后繞銅柱纏繞毛細管35圈，對應35個PCR循環。所述毛細管通過在延長區中的孔從加熱器中引出，以對第35次循環提供約30秒的附加延長。
PCR擴增模板是Litmus 28i(New England Biolabs)的有2823個堿基對的DNA片段。這個片段在從堿基2008至堿基2580的572個堿基對上用Eurogentec引物(primer)(下游引物5’-CGC-ATT-GCG-GTA-TCT-AGA-ACC-GGT-GAC-GTC-3’，上游引物5’-AGC-TTG-GAG-CGA-ACG-ACC-3’，Eurogentech Oligold出品)進行擴增。用Ready Mix Taq反應混合物(Sigma出品)根據生產者的說明書使用最大濃度的模板和引物來制備50μL的PCR混合物。
載液是含有0.5-1.0wt％氟代醇表面活性劑(1H，1H，2H，2H-全氟正癸醇，Fluorochem出品)的成塊氟化油FC-40(3M)。所述表面活性劑避免微滴瞬間吸附到毛細管壁上。利用Hamilton PSD/2泵和100μL Hamilton氣密注射器，通過從毛細管出口抽吸而將2μL水性微滴注入到進口中。用5μL FC-40隔離物(spacer)將所述微滴彼此分離。在注入需要數量的微滴后，所述出口與Hamilton泵斷開，然后所述進口連接到計算機控制的具有5mL Hamilton氣密注射器的哈佛毫升模式泵上。所述微滴以0.1cm/s被循環。
在所述出口處收集所述微滴，并通過在0.5xTAE緩沖液中的1wt％氣溶膠上的凝膠電泳來分析所述微滴。利用在94℃下1分鐘的循環、隨后在94℃下30秒、55℃下30秒和72℃下1分鐘的35次循環，通過在經典PCR熱循環器(Perkin Elmer出品)中擴增50μL的PCR混合物的剩余體積來制備對照擴增樣品。這是模仿在我們連續流動式PCR中的循環，盡管用于加熱和冷卻所述經典循環器的滯后時間(lag time)意味著整個擴增約是我們流動裝置的2倍。被擴增的控制系統的2μL等分試樣用于凝膠電泳。
已獲得5個微滴的串，每個微滴含有PCR混合物和模板。圖16示出了這個在所有微滴中成功擴增的結果。過道(lane)11kbp DNA階梯(ladder)(New England Biolabs出品)，過道22μL具有DNA的混合物對照樣品，過道3微滴1，過道4微滴2，過道5微滴3，過道6微滴4，過道7微滴5。
在根據本發明的所述裝置中的擴增程度(過道3-7)與常規熱循環器得到的擴增程度(過道2)相當。
實施例13在成塊含氟聚合物制成的通道中微滴之間的污染研究。
所述系統已經針對微滴之間的交叉污染進行測試。所有條件與實例12中的條件相同，除了制成兩個單獨的PCR混合物外；第一混合物含有模板、引物和Ready Mix反應混合物，第二混合物除了沒有任何模板外均與第一混合物相同。五個微滴被吸取，但是只有第三個微滴含有模板。為了避免來自所述針尖自身的污染，所述針尖在每次微滴注射之間均用蒸餾水清洗。圖17示出了本實驗的凝膠電泳結果。過道11kbp DNA階梯(New England Biolabs出品)，過道25μL無DNA的混合物對照樣品，過道32μL具有DNA的混合物對照樣品，過道4微滴1(無模板)，過道5微滴2(無模板)，過道6微滴3(有模板)，過道7微滴4(無模板)，過道8微滴5(無模板)。在不同微滴之間沒有可以觀察到的污染，呈現任何DNA擴增的唯一微滴是具有DNA的第三個微滴。
實例14在由非氟化材料制成的具有或不具有氟化材料涂層的通道中傳輸微滴的實例。
在這一系列實例中，微通道是由Cole Parmer出品的硅酮管制成(內徑0.8mm)。載液是FC-40(3M)，且微滴由水性緩沖液TBE 5x制成。在所有情況下，按照實例13所述的相同規程形成微滴串，且利用雙筒顯微鏡和CCD照相機直接觀察和拍攝微滴在該管中的形狀和移動。
14A在未處理的硅酮管內在純FC40中的TBE微滴。
在一些例子中，微滴呈現為球形(圖18a)，這表明壁是不潤濕的。然而，在通過幾百個微滴形成微滴串后，壁在所述串的某些位置處被潤濕(圖18b)。在一些例子中，第一微滴看起來像圖18b所示的情形。已經推測在一些例子中觀察到的無潤濕的表現歸因于制造過程中的殘余產物。由于很多微滴移動穿過該系統，所以這種未知的產物將被從壁上除去。為了驗證這個假設，用5體積的蒸餾純化水清洗所述管。然后，第一微滴的表現始終如圖18b所示。對于所有后來的實驗，總是用5體積的蒸餾純化水清洗所述管，以除去初始條件中的任何變化。
14B在未處理的硅酮管內在添加有含氟表面活性劑的FC-40中的TBE微滴。
通過添加Fluorochem出品的不同wt％的含氟表面活性劑1H，1H，2H，2H-全氟正癸醇，來驗證微滴的表現。所述表面活性劑降低了微滴與FC-40之間的界面張力，但是對固-液張力沒有影響。因此，微滴失穩且破碎成很多小微滴(圖18c，圖18d，圖18e)。破碎的性質取決于表面活性劑濃度，但是甚至在非常低的含氟表面活性劑水平下，微滴依舊不穩定。
14C在氬氣氣氛下硅烷化處理的硅酮管內在沒有添加含氟表面活性劑的FC-40中的TBE微滴。
所述管在氬氣氣氛下被隔離的同時被硅烷化處理。在電爐(hotplate)上將少量1N HCl(Sigma出品)加熱到約60℃。清潔過的硅酮管的一端連接于體積至少為所述管兩倍的注射器，另一端放在溫的HCl溶液中。HCl被吸取到所述管中，直到所述注射器被部分填充。HCl留在所述管中5分鐘，在此期間我們偶爾振蕩注射泵以使局部混合。然后從所述管中排空HCl，并用氬氣流干燥所述管。然后我們將新的注射器連接于所述管的一端，并將所述管的另一端放進氟硅烷和光譜級甲醇(Sigma出品)的溶液中。所述氟硅烷通常是1H，1H，2H，2H-全氟辛基三甲基硅烷(Fluorochem出品)。1H，1H，2H，2H-全氟癸基三乙氧基硅烷(Fluorochem出品)也被測試，且基本上達到相同的結果。這里給出的所有結果是針對1H，1H，2H，2H-全氟辛基三甲基硅烷(Fluorochem出品)的，我們選擇它是因為它比較便宜。將硅烷溶液被吸取到所述管中且保留5分鐘，其間我們偶爾振蕩所述注射泵以使局部混合。然后將硅烷溶液從所述管中排空，用氬氣流干燥所述管。干燥后的所述管被放到110℃烘箱中約20分鐘，以固定硅烷。然后在進行微滴測試之前用幾體積的甲醇和FC-40清洗所述管。
圖19示出了在氬氣-硅烷化管中的微滴的結果。對于vol％大于7.5的情況，我們觀察到對于包括至少200個微滴的串而言則沒有牽制(pinning)。在5vol％時，所述微滴呈現出一開始不潤濕，但是最終被牽制(pin)到壁上。在vol％較低時，微滴總是將壁潤濕。我們得出當反應在氬氣下進行時，7.5vol％氟代硅烷是形成穩定的不潤濕表面的必要條件。
14D在空氣氣氛下硅烷化處理的硅酮管內在沒有添加含氟表面活性劑的FC-40中的TBE微滴。
為了簡化硅烷化的過程，將所述管在空氣中硅烷化。為了更好地保存純硅烷，硅烷/甲醇混合物首先在氬氣下進行，但是反應的剩余物在通風柜(hood)內采用基本與上述相同的規程進行。硅烷的體積百分比vol％和使硅烷與所述管反應的時間(反應時間)是變化的。在一個例子中，HCl活化步驟用等離子體活化代替。
對于10vol％硅烷且反應時間5分鐘，在空氣中的硅烷化與氬氣中的情形沒有區別(圖20a)。對于7.5vol％硅烷且反應時間5分鐘，微滴一開始不潤濕但是最終會潤濕壁(圖20b)。已發現在5vol％硅烷的情況時微滴仍潤濕壁，但是當反應時間增加到30分鐘時，在整個串(大于200微滴，圖20c)中的微滴均不會潤濕壁。測試相同的參數(5vol％硅烷且反應時間30分鐘)，但是所述管放在等離子中1分鐘、而不是用HCl填充。如圖20d所示，等離子體活化沒有導致不潤濕表面。由于等離子體必須擴散通過所述管以用于活化，因此與可以通過抽吸到所述管中的HCl進行的液體活化相比效率低。已經測試進一步降低硅烷濃度至2.5vol％硅烷同時保持30分鐘的反應時間。如圖20e所示，壁有輕微的潤濕。
與在氬氣下硅烷化相比，在空氣中硅烷化可能在表面上產生均勻性較差的涂層，因為空氣中的水與硅烷競爭活化的表面位置。大體上，空氣硅烷化不能像氬氣硅烷化那樣降低水-固體張力。然而，空氣規程可更簡單地進行且更適于自動化。
14E在空氣氣氛下硅烷化處理的硅酮管內在添加有含氟表面活性劑的FC-40中的TBE微滴。
已驗證強力降低FC-40/水的界面張力的含氟表面活性劑是否足以克服在空氣-硅烷化表面上產生的不均勻性(和伴隨地降低水-固體張力)。如圖21所給出的，小濃度的表面活性劑(0.5wt％)足以避免在2.5vol％硅烷和5vol％硅烷的潤濕，甚至在形成一個200個微滴的串之后。
實例15通過定量PCR檢驗在實例14中制備的本發明裝置中運輸的微滴間的DNA污染。
為了檢測是否未牽制住的(unpinned)微滴形狀不會引起污染，使用定量PCR進行一組實驗，以對不同微滴中的DNA濃度進行敏感性測試。
根據下面規程中的一個制備所述管1.無硅烷僅用幾體積蒸餾水清洗所述管。載液是FC-40(3M)，根據實例14A制備。
2.硅烷清洗所述管，然后根據實例14D的規程在空氣中用5vol％硅烷硅烷化，反應時間30分鐘。載液是FC-40。
3.硅烷+表面活性劑清洗所述管，然后根據實例14E的規程在空氣中硅烷化。載液是具有0.5wt％1H，1H，2H，2H-全氟正癸醇的FC-40。
4.成塊含氟聚合物+表面活性劑根據實例13制備一串微滴使用生產者提供的Teflon毛細管。載液是具有0.5wt％1H，1H，2H，2H-全氟正癸醇的FC-40。
所述管的一端連接于Y型連接器，且利用電夾緊閥選擇所述Y型連接器的出口。一個出口連到哈佛毫升模式注射泵和5ml Hamilton氣密注射器，第二出口連接于100μl Hamilton氣密注射器的Hamilton PSD/2注射泵。HamiltonPSD/2用于制造所有微滴(通過吸取)或從所述管中分配微滴(通過泵送)。Hamilton毫升模式用于在所述管中進行微滴振蕩。在每個實驗之前，毛細管完全填充所述載液并且開口端置于所述載液的貯存器中。
微滴是用于定量PCR的Taqman PCR混合物的混合物，Taqman PCR含有Gold Taq聚合酶(Applied Biosystems出品)、qPCR核心試劑盒(Eurogentec)、特定的引物、和熒光探針(3’-ATCTGCTGCATCTGCTTGGAGCCC A-5’，Applied Biosystems出品)。“混合物”樣品含有除模板外的所有用于PCR的成分。“DNA”樣品含有從細胞系A549分離出的濃度6.25ng/μl的cDNA。所述片斷的擴增在與RPLPO基因使用Proligo引物(上游引物3’-GGCGACCTGGAAGTCCAACT-5’；下游引物3’-CCATCAGCACCACAGCCTTC-5’)對應的149bp上進行。我們為每個實驗做了兩個貯存器，一個貯存器具有針對每個對照微滴(一般為30μl)的足夠混合物，而第二貯存器具有針對cDNA微滴(一般為22μl)的足夠混合物和模板。
已經通過如下步驟測試在注射過程中的污染。從DNA貯存器中吸取2μl，然后從載液貯存器中吸取4μl。然后通過將針尖浸在蒸餾水的貯存器中并用ChemWipe干燥，以清洗所述端部。隨后通過從混合物的貯存器中吸取2μl，并從載液貯存器中吸取4μl，以形成連續的5個微滴。所有微滴形成后，我們將所述步驟反向，并且在單獨的Eppendorf管中收集每一微滴。在進行定量PCR之前在-80℃下儲存Eppendorf管。
在Taqman 7700qPCR機(Applied Biosystems出品)上，通過定量PCR來分析每一微滴的含量。在這些實驗中，值35表示在微滴中沒有可檢測到的cDNA的量(即不具有超出噪音閾值的熒光信號的35個擴增循環)，且每個整數增量對應cDNA質量的減半。
表1表示進口污染實驗的結果。在未處理的毛細管中有明顯的污染，正如從微滴的形狀可以預計的那樣。在硅烷化的毛細管中也存在污染。然而，在混合物貯存器中沒有污染，所以我們可以得出污染發生于微滴在毛細管中運輸時。對于具有含氟表面活性劑的硅烷化毛細管，我們觀察到在第一清洗微滴中有污染，且在混合物貯存器中有相同的污染。這使得我們相信在轉移期間污染發生在針尖上，且在吸取DNA微滴后強力清洗針尖足以消除使用硅烷化毛細管和表面活性劑的進口處的污染。使用Teflon針尖沒有污染。
然后我們測試表面活性劑和硅烷化毛細管在微滴運送中避免污染的能力。利用所述表面活性劑和硅烷化毛細管，采用與上述基本相同的吸取步驟，我們先做了兩個混合物微滴，然后是一個cDNA液滴，再后是兩個混合物微滴。本注射規程和上述規程的不同在于為了降低針尖處的污染，我們在注射DNA液滴后在兩個單獨的蒸餾水貯存器中清洗針尖。在步驟結束時，我們獲得任一側帶有兩個2μl混合物微滴的2μlcDNA液滴(前面的對照1和2，后面的對照3和4)，其中每個微滴由4μl載液間隔開。
然后我們使用哈佛毫升模塊吸取，使得微滴處于Olympus雙筒顯微鏡下方的毛細管的直段中。使用計算機控制，我們振蕩哈佛毫升模塊使其以1mm/sec的平均速度將毛細管中的微滴拉5cm，然后以1mm/sec的平均速度推微滴5cm，使得單個循環不會產生微滴的凈移動。我們進行了50次這樣的循環，使得微滴行進的總距離(5m)與我們連續流動PCR機中所要求的距離相當。通過振蕩微滴而不是以恒定速率推著它們穿過5m毛細管，我們模擬在高產出操作下的條件。我們偶爾用顯微鏡觀察微滴以確保它們沒有潤濕壁。
完成50次循環以后，我們在單獨的eppindorf毛細管中收集微滴。在排除每個微滴后，我們吸取2μl的蒸餾水洗滌微滴以清洗針尖。所述洗滌微滴也被收集。通過定量PCR按照上述的方法分析所有微滴和混合物貯存器。
表2給出定量PCR的結果。在任何對照液滴中沒有可檢測到的污染。此外，在所述清洗微滴中沒有可檢測到的污染。在所述混合物貯存器中有一些污染，但是這不會導致在任何對照微滴中的污染。我們得出所述含氟表面活性劑和硅烷化毛細管的結合應該足以防止在高產出應用中的污染。
我們使用Teflon毛細管和含氟表面活性劑進行了基本相同的振蕩實驗。唯一的不同在于在此實驗中，我們在收集微滴或使用另外的清洗微滴時沒有清洗針尖。
表3給出了采用Teflon管和含氟表面活性劑的結果。如在進口污染測試中那樣，混合物中沒有污染，這表明洗滌足以將DNA從針尖上清除。在液滴2中有一些污染。我們相信這個污染是由于在收集微滴時沒有清洗針尖造成的。液滴2緊接著cDNA液滴從系統中排出。可能少部分cDNA液滴被牽制(entrain)在針尖表面的缺陷處，然后將轉移到液滴2中。一個自動的微滴收集或在線檢測步驟可以除去這樣的污染源。
表1.進口污染的定量PCR結果。35.00對應無可檢測到的cDNA，且每個整數減量對應于加倍的相對cDNA質量。

表2.在具有含氟表面活性劑的硅烷化毛細管內的循環過程中針對污染的定量PCR結果。35.00對應無可檢測到的cDNA，且每個整數減量對應于加倍的相對cDNA質量。

表3.在具有含氟表面活性劑的Teflon毛細管內的循環過程中針對污染的定量PCR結果。35.00對應無可檢測到的cDNA，且每個整數減量對應于加倍的相對cDNA質量。

實例16設計和制造無污染的T型連接器。
此實例給出具有非常低死體積的、無污染地連接于與夾緊閥相適應的三個不同進口的PDMS T-型連接器100的概念。
連接器100是在PDMS(KODAK SYLGARD 184)中用1∶10比例的固化劑制造。用于制造連接器100的模具101是PMMA平行六面體(內部長度和寬度均為9mm，內部高度為8mm)。在平行六面體的三個面103的中心均鉆取內徑800μm的孔102。第一Teflon毛細管105(外徑800μm)的5mm部分104引入到3cm長的第二Teflon毛細管(外徑1.5mm，內徑800μm)的端部內，且伸出1.5mm。以這種方式制造三個部件，并將這三個部件引入并保持在所述平行六面體中，以形成彼此面對的較小管狀的T型(見圖22)。然后將PDMS106除氣20分鐘，注入到這樣構造的模具中且放入65℃烤箱3小時。
三小時后，溫和地拖拉Teflon件104和105以將它們取下，從模具101中取出得到的T型連接器。T型連接器100有三個孔口108，每個孔口包括彼此跟隨的共軸的柱狀空心部分，外面的部分110具有1.5mm的直徑且長度3mm，里面的部分111具有800μm的直徑且長度1.5mm。然后將涂有硅橡膠(Dow Corning出品)的5cm硅烷毛細管109(Cole-Parmer；外徑1.8mm，內徑800μm)引入到T型連接器的每個孔口的3mm處(對應外柱體)，且通過在PDMS T型連接器進口附近的管的周圍加入更多橡膠來加強所述連接器。由于硅烷和PDMS的彈性，可以將外徑1.8mm的硅烷管推入到T型連接器的1.5mm直徑的孔口中，從而提供良好的連接緊密性。將得到的連接器放入烘箱2小時。
采用實例14所述的方法將具有硅烷毛細管的T型連接器100進一步硅烷化。通過這個方法得到具有非常低的死體積且即使在高壓下也沒有泄漏的固體連接器。而且，硅烷管的使用允許使用沒有死體積的夾緊閥。
應用的實例根據本發明制造的裝置可以用于進行，例如-混合，-核酸篩選，-核酸擴增，例如通過PCR、NASBA、滾環擴增(rolling circle amplification)，-RNA反轉錄-基因分型(genotyping)，-蛋白質組(proteomic)分析，-轉錄組(transcriptome)分析，-結晶，且特別是蛋白質結晶，-尋找和評價藥物靶點、藥物目標或引藥，或藥物，-酶-蛋白反應，-抗原-抗體反應，-生物制品的化學庫的篩選，-高產出篩選，-藥物遞送，-診斷，-至少一個活細胞或死細胞的分解或溶解，-微生物分析，-化學反應，-反應性-催化劑反應-聚合反應，-使顆粒例如膠體熔融以形成鏈，-膠體、乳劑、泡囊的制備、特別是單分散膠體物質的制備，-納米顆粒或微米顆粒的制備，-環境控制，
-污染物檢測，-工業過程控制。
權利要求
1.一種微流控裝置(1)，用于使至少一個小包變形尤其是分裂，或將至少兩個小包相向移動特別是用于破壞所述小包，所述裝置包括-具有軸線(X)的微通道(2)；-小包操縱裝置，包括以下中的至少一個●發生單元(9)和電極組件(3)，所述電極組件連接于所述發生單元(9)并構造成用于在所述微通道的至少一部分內產生與所述微通道的所述軸線(X)基本共線的電場，其中所述發生單元(9)能產生具有這樣的振幅和頻率的電場，即所述電場引起所述至少一個小包變形或所述至少兩個小包在所述微通道中相向移動，●至少一個側通道，所述側通道的第一端與所述微通道的一部分連接，且所述側通道的第二端與輸送系統連接，所述輸送系統適于輸送能改變所述至少兩個小包之間或所述至少一個小包和其環境之間的界面張力的溶液，所述輸送系統構造成至少在所述小包經過所述微通道的所述部分時將所述溶液輸送到所述微通道的所述部分中。
2.根據權利要求1所述的裝置，其中產生與所述微通道的所述軸線(X)基本共線的電場的、所述微通道的所述至少一部分具有為所述部分厚度的約1倍至約100倍之間的長度，且所述長度優選為所述部分厚度的約1倍至約10倍之間。
3.根據前述權利要求中任一項所述的裝置，其中所述電極組件(3)與所述微通道(2)的內表面電絕緣。
4.根據前述權利要求中任一項所述的裝置，其中所述電極組件(3)包括沿所述微通道的所述軸線在軸線方向上以一距離間隔開的至少兩個電極(4；35)，所述距離足夠長以使所述電極之間的電場與所述微通道的所述軸線(X)基本共線。
5.根據權利要求4所述的裝置，其中所述電極(4；35)中的至少一個電極包括至少兩個對著所述微通道(2)的彼此面對的等勢部分。
6.根據權利要求4或5所述的裝置，其中所述電極中的至少一個電極(4)是單片的。
7.根據權利要求4-6中任一項所述的裝置，其中所述電極中的至少一個電極(4)具有環繞所述微通道的柱形表面。
8.根據權利要求4或6所述的裝置，其中所述電極中的至少一個電極(35)是復合的。
9.根據權利要求8所述的裝置，其中所述電極中的至少一個電極(35)包括至少兩個基本平行的、夾著所述微通道(2)的等勢板(36)。
10.根據權利要求4-9中任一項所述的裝置，其中所述電極(4；35)以一間隙(6)間隔開，所述間隙的長度大于所述微通道的厚度，所述長度優選大于所述微通道的厚度的2倍。
11.根據前述權利要求中任一項所述的裝置，其中所述電極組件(3；3’)構造成在所述微通道的至少一個橫截面中，所述電場的振幅變化小于10倍，較優選小于2倍，最優選所述電場的振幅是基本一致的。
12.根據前述權利要求中任一項所述的裝置，其中所述發生單元能產生連續場。
13.根據權利要求1-11中任一項所述的裝置，其中所述發生單元能產生可變場。
14.根據權利要求13所述的裝置，其中所述發生單元能產生交變電場。
15.根據權利要求14所述的裝置，其中所述發生單元(9)能產生頻率在約0.01Hz至約1GHz之間的范圍內的交變電場，優選頻率在約1Hz至約10MHz之間的范圍內的交變電場。
16.根據權利要求15所述的裝置，其中所述發生單元(9)能產生頻率在100Hz至10kHz之間的交變電場，以用于合并微滴。
17.根據權利要求15所述的裝置，其中所述發生單元(9)能產生頻率小于50Hz的交變電場，以用于等分至少一個微滴。
18.根據權利要求1所述的裝置，其中所述溶液含有表面活性劑。
19.一種用于在具有軸線的微通道中移動至少一個小包的方法，所述方法包括下述步驟-將至少一個小包引入到所述微通道中；-在所述微通道的至少一個部分中、至少當所述至少一個小包位于所述部分內時產生電場，所述電場優選與所述微通道的所述軸線基本共線以使所述小包沿著所述微通道移動。
20.一種用于在微通道(2)中將至少兩個小包破壞的方法，所述微通道具有縱軸線(X)，所述方法包括下述步驟-將至少兩個小包引入到所述微通道中，-在所述微通道的至少一個部分中、至少當所述小包位于所述微通道的所述部分內時產生電場，優選在所述部分中所述電場與所述微通道的軸線基本共線、且所述電場的振幅和頻率選擇成使所述兩個小包相向移動。
21.根據權利要求20所述的方法，所述電場是通過至少兩個沿所述微通道的所述軸線(X)在軸線方向上間隔開的電極產生時，所述電極是以一間隙(6)間隔開，所述方法包括下述步驟-在產生所述電場前，將兩個小包定位在所述電極之間的所述間隙內，所述小包處于靜態平衡，-產生所述電場。
22.根據權利要求20所述的方法，所述電場是通過沿所述微通道的所述軸線在軸線方向上間隔開的至少兩個電極(4；35)產生時，所述電極是以一間隙間隔開，所述方法包括下述步驟-將兩個小包定位在所述微通道中，所述兩個小包中的至少一個小包處于所述電極之間的所述間隙之外，-例如通過在所述微通道中的流動的流束，使所述兩個小包朝著所述間隙移動，-至少在所述小包位于所述間隙中時產生所述電場。
23.根據權利要求20-22中任一項所述的方法，其中所述小包中的至少一個小包含有生物材料。
24.一種用于在微通道中將至少兩個小包破壞或分裂至少一個小包的方法，所述微通道具有軸線，所述方法包括下述步驟-將所述至少兩個小包或所述至少一個小包定位在所述微通道的一部分中，-將表面活性劑溶液輸送到所述微通道的所述部分中，所述表面活性劑能改變所述至少兩個小包之間或所述至少一個小包與其環境之間的界面張力。
25.一種用于在具有縱軸線的微通道中將至少一個小包分裂的方法，所述方法包括下述步驟-將所述至少一個小包引入到所述微通道中，-在所述微通道的至少一部分內、至少當所述至少一個小包位于所述至少一部分內時產生電場，優選在所述部分中所述電場與所述微通道的所述軸線基本共線、且所述電場的振幅和頻率選擇成使所述小包分裂。
26.一種用于在微容器尤其是微通道中對至少一個小包進行至少一種操作的方法，其中所述微容器具有至少一個限定了所述微容器的內部空間的管狀部分，其中-所述管狀部分由無內部涂覆的成塊氟化材料制成，或-所述管狀部分由成塊非氟化材料制成，且在所述管狀部分的所有內周表面上都涂有耐久層，其中所述耐久層優選是疏水的，并且其中所述微容器至少部分填充有與所述小包不混溶的、且含有至少一種表面活性劑的載液，所述表面活性劑的濃度足夠高以降低所述小包和所述載液之間的表面張力。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所述微容器包括一連串的至少兩個管狀部分，第一管狀部分由成塊氟化材料制成，第二管狀部分由成塊非氟化材料制成且該第二管狀部分的所有內周面涂覆有耐久層。
28.根據權利要求26或27所述的方法，其中所述耐久層包括選自下列材料的材料熔融石英玻璃、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)，任何彈性體或塑料，例如聚乙烯、聚酰亞胺、環氧樹脂、Teflon、Parylene、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚酯、環烯烴共聚物，不導電氧化物，例如玻璃、二氧化硅、金剛石、不導電陶瓷、硅酮、彈性體、玻璃狀材料、礦物材料、陶瓷、聚合物、熱塑性聚合物、熱固性樹脂、光致固化樹脂、共聚物、硅烷、氟代硅烷、氟代聚合物。
29.根據權利要求26-28中任一項所述的方法，其中所述成塊材料選自熔融石英玻璃、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)，任何彈性體或塑料，例如聚乙烯、聚酰亞胺、環氧樹脂、Teflon、Parylene、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚酯、環烯烴共聚物，不導電氧化物，例如玻璃、二氧化硅、金剛石、不導電陶瓷、硅酮、彈性體、玻璃狀材料、礦物材料、陶瓷、聚合物、熱塑性聚合物、熱固性樹脂、光致固化樹脂、共聚物。
30.一種在微容器特別是微通道中對至少一個小包進行至少一種操作的方法，其中所述微容器具有內部管狀疏水表面，其中所述微容器至少部分填充有與所述小包不混溶的、且含有至少一種表面活性劑的載液，所述表面活性劑的濃度足夠高以降低所述小包和所述載液之間的表面張力。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述操作是移動所述至少一個小包、分裂所述至少一個小包、將所述至少一個小包與至少另一個小包合并、使所述至少一個小包反應的操作中的至少一種操作。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述移動包括在所述微容器中循環所述載液。
33.根據權利要求30-32中任一項所述的方法，其中所述操作在無任何電場的情況下進行。
34.根據權利要求30-33中任一項所述的方法，其中所述操作包括將所述至少一個小包從所述微容器的進口朝向所述微容器的出口移動。
35.根據權利要求30-34中任一項所述的方法，其中所述操作包括將所述至少一個小包依次暴露在至少兩個不同的物理和/或化學條件下，尤其依次暴露在至少兩個不同的溫度條件下。
36.一種用于在微容器特別是微通道中對至少一個小包進行至少一種操作的方法，所述微容器具有內表面，其中所述微容器填充有與所述小包不混溶的、且含有至少一種表面活性劑的載液，其中所述小包與所述微容器的內壁之間的界面張力和所述小包與所述載液之間的界面張力的差至少為26mN/m，優選至少為35mN/m，所述差例如在約35mN/m至約45mN/m之間。
37.根據權利要求36所述的方法，其中所述表面活性劑在所述載液中的濃度在約0.01％至約10％w/w(重量比重量)之間，優選在約0.1％至約3％之間。
38.根據權利要求36或37所述的方法，其中所述表面活性劑為含氟表面活性劑，特別是氟代醇。
39.根據權利要求38所述的方法，其中所述含氟表面活性劑是1H，1H，2H，2H-全氟正癸醇。
40.根據權利要求36-39中任一項所述的方法，其中所述成塊部分是硅烷化的。
41.一種用于對埋在載液中的至少一個小包進行至少一化學、物理或生物操作的裝置，所述載液與所述小包不混溶，所述裝置包括至少一個將含有所述小包的所述載液包圍的微容器，其中所述微容器的內表面是氟化的，且所述載液含有比值濃度至少為0.1cmc(臨界膠束濃度)的表面活性劑。
42.一種微流控裝置，其包括微容器特別是微通道，所述裝置還包括形成所述微容器的內部空間的管狀成塊疏水部分，其中所述成塊部分涂覆有疏水層。
43.一種連接器，其使得至少一個小包無污染地從至少一個微通道向另一微通道運輸，所述連接器包括、優選地由所有內表面上具有疏水層的成塊材料構成，所述疏水層包括氟化材料和硅烷化的材料之一。
44.根據權利要求43所述的連接器，其中所述成塊材料是彈性體。
45.一種微流控裝置，其包括至少一個微容器特別是至少一個微通道、以及與所述微容器相通的連接器，所述連接器構造成用于將所述微容器連接于另一微容器特別是微通道和所述裝置的進口或出口中的至少一個上，其中所述連接器的內表面包括至少一個疏水層。
46.一種連接器，構造成用于安裝在形成微通道的毛細管的一端，其中所述連接器的內表面包括至少一個疏水層。
47.一種試劑盒，包括-微流控裝置，其包括微通道，-如上所述的連接器，其待安裝于所述微流控裝置上。
48.一種對小包進行至少一種操作的試劑盒，包括-微容器特別是微通道，其內表面具有至少一種疏水材料，-載液，其與所述小包不混溶且含有至少一種表面活性劑，所述表面活性劑的濃度足夠高以降低所述小包和與水不混溶的所述載液之間的表面張力。
49.一種組件，其包括-如權利要求43所述的連接器，-至少一個連接于所述連接器的毛細管。
50.根據權利要求49所述的組件，其中所述連接器是T型連接器。
51.根據權利要求49或50所述的組件，其中所述毛細管具有氟化或硅烷化的內表面。
52.一種用于進行PCR的裝置，其包括-微通道，其包括由毛細管制成的盤管，所述盤管至少部分填充有含表面活性劑的含氟溶劑，所述盤管包括暴露在不同溫度條件下的變性區、退火區和延長區。
53.一種根據權利要求1所述的方法，用于進行下列中的至少一種操作-混合，-核酸篩選，-核酸擴增，例如通過PCR，NASBA，滾環擴增，-RNA反轉錄-基因分型，-蛋白質組分析，-轉錄組分析，-結晶，特別是蛋白質結晶，-尋找和評價藥物靶點、藥物目標或引藥，或藥物，-酶-蛋白反應，-抗原-抗體反應，-生物制品的化學庫的篩選，-高產出篩選，-藥物遞送，-診斷，-至少一個活細胞或死細胞的分解或溶解，-微生物分析，-化學反應，-反應性-催化劑反應-聚合反應，-使顆粒例如膠體熔融，以形成鏈，-膠體、乳劑、泡囊的制備，特別是單分散膠體物質的制備，-納米顆粒或微米顆粒的制備，-環境控制，-污染檢測，-工業過程的控制。
全文摘要
本發明涉及用于對至少一個小包無污染地進行物理、化學或生物處理的微流控裝置(1)。
文檔編號F04B19/00GK101052468SQ200580035988
公開日2007年10月10日 申請日期2005年9月9日 優先權日2004年9月9日
發明者讓-路易斯·維奧維, 馬克思·沙貝爾, 凱文·多爾夫曼 申請人:居里研究所, 國家科學研究中心