專利名稱：催化肉桂醇氧化生成肉桂醛的方法
技術領域：
本發明涉及有機合成和電化學領域，具體為利用氯過氧化物酶修飾電極催化肉桂醇氧化生成肉桂醛的方法。
背景技術：
傳統的肉桂醛生產方法主要由桂皮油、肉桂油等天然油與亞硫酸氫鈉的加成法，或由苯甲醛與乙醛先在堿性下發生羥醛縮合反應、再用苯進行溶劑抽提的生產方法。也有將重鉻酸鹽和高錳酸鹽等氧化劑用于醇類的氧化反應。然而，不但難以控制醇類的部分氧化(往往會有羧酸生成)，還會產生大量的金屬鹽類廢料，并且很容易殘留在主產品中。因此，在傳統生產工藝中要增加產品的分離和提純等繁雜的生產工序、增加成本的同時對環境保護造成很大的問題。中科院山西煤炭化學研究所何月等人合成了新型分子篩，并用于對肉桂醇的選擇性氧化反應，但催化劑的制備方法繁瑣，催化肉桂醇的氧化反應必須在二氧六環溶劑中進行，也會對環境產生污染。據報道，CPO能夠催化多種類型的氧化反應，包括N、S雜原子的氧化、環氧化、醇類的氧化等。John Geigert等人研究了過氧化物酶(Peroxidase)催化醇氧化到醛的可行性，有很好的選擇性和產率，但仍然存在以下問題。首先，作為其氧供體的過氧化氫和其它過氧化物一旦加入量不當，便會造成酶的失活；其次，在均相溶液中反應時，需要的酶量大，成本高；催化反應后，酶很難再回收利用。結合電化學方法的生物酶催化氧化，應用于藥物及其中間體合成具有成本低廉，易于控制等優點，因而具有廣闊的應用前景。這一方面的研究工作還未見國內外報道。
發明內容
本發明旨在提供一種用固定了氯過氧化物酶的電極催化肉桂醇生成肉桂醛的方法。催化肉桂醇氧化生成肉桂醛的方法，包括如下步驟用CPO修飾電極電解反應液，并連續通入氧氣使反應液中氧氣飽和；在-0. 3 -0. 6V下電解；所述反應液為含有肉桂醇的磷酸緩沖液，PH值為4 5，肉桂醇的含量為0. 01 0. 05mol/L,優選為0. 02 0. 03mol/L,更優選為0. 02 0. 025mol/L ；電解時間為1 4小時；所述CPO修飾電極的制備方法包括如下步驟(a)在預處理后的玻碳電極表面滴涂氯過氧化酶和雙十二烷基溴化銨混合液，其中氯過氧化物酶濃度2. 0 3. OX 10_4mol/L，雙十二烷基溴化銨濃度5 lOmmol/L ；(b)干燥后滴涂殼聚糖溶液；殼聚糖溶液濃度為0. 5 2mg/ml，還含有0. 8% 1.2%冰醋酸。步驟(a)中所述預處理包括將玻碳電極打磨拋光。還包括，在打磨拋光后的玻碳電極表面滴涂質量濃度為0. 05% 0. 2%的Nafion溶液并干燥。
本發明將氯過氧化物酶(Chloroperoxidase，CP0)固定在雙十二烷基溴化胺(Didodecyldimethyl-ammonium bromide, DDAB)形成的類生物膜修飾的玻碳電極上，并用殼聚糖封裝。利用制得的CPO修飾電極，在不加入過氧化氫的條件下可高效、選擇性地催化肉桂醇氧化生成肉桂醛。利用修飾電極上的CPO電催化還原氧原位產生酶催化反應所需的過氧化氫，避免了加入過氧化氫不當引起酶的失活，并可實現酶的反復利用，同時，整個反應過程中不會對環境造成危害，是一種綠色、高效的新技術。本發明利用類生物膜的方法把酶固定在電極表面，使酶處于最接近自然狀態、可以有效地發揮其催化能力；并用電化學方法還原空氣中的氧氣原位產生過氧化氫，避免了人為加入過氧化氫難以控制以及由此所需的設備費；同時固定在電極表面的酶、原位產生的過氧化氫和底物在一個微小的三維空間中發生酶促反應，大大提高催化效率；此外，酶外層殼聚糖的保護使修飾電極的穩定性大大提高，多次使用后仍具有很高的催化能力，酶的反復利用也成為可能。本發明的有益效果在于1.本發明的催化體系是利用類生物膜將CPO固定在電極上。然后應用電化學方法直接在電極表面催化氧氣還原產生酶催化肉桂醇氧化反應所需的過氧化氫。該方法較之酶投入到溶液中催化有機反應獲得更高的轉化率，酶用量大大減少。同時由于原位產生過氧化氫，可精確地控制反應；CPO固定化方法簡便易操作，CPO修飾電極的穩定性好，而且可反復利用。2.固定酶以后滴涂一層殼聚糖，使酶電極穩定性大大提高，多次使用后仍具有很高的催化能力，為生物酶催化有機合成反應的實際應用提供了可能。3.肉桂醛具有潛在藥用價值，使用本發明的CPO修飾電極可催化肉桂醇氧化生成肉桂醛，顯示出高的轉化率、以及只有醛類產物沒有羧酸產物的高選擇性，表明CPO修飾電極在藥物合成中的應用前景。國內外尚未見類似的工作報道。4.電催化肉桂醇氧化生成肉桂醛的反應是在水溶液中進行的，是一種非常高效和綠色的有機合成方法。電化學原位產生過氧化氫、催化肉桂醇氧化為肉桂醛的轉化效率高、成本低，是一種值得推廣的高效、長效和環境友好的催化體系。此外，CPO修飾電極具有極高的催化選擇性，在有機合成、藥物中間體的生產、以及環境處理等許多領域均有著廣闊的應用前景。
圖1為殼聚糖/氯過氧化物酶-DDAB/Naf ion/玻碳修飾電極在飽和氮氣(a)和飽和空氣(b)pH4.5磷酸緩沖液中的循環伏安曲線圖2為是應用本發明CPO修飾電極催化肉桂醇氧化所得到的產物(a)和使用相同量的酶外加H2O2得到的產物的色譜圖(b)圖3為應用本發明CPO修飾電極催化肉桂醇氧化所得到的產物的質譜4為應用本發明CPO修飾電極多次催化氧化肉桂醇的實驗結果
具體實施方式
下面結合實施例對本發明做進一步詳細、完整地說明。主要試劑有5% Nafion (Sigma公司)，使用時用無水乙醇稀釋至0. 1% ；殼聚糖(Chitosan，挪威進口分裝)用Iwt %冰乙酸溶解并稀釋至Img · ml/1 ；雙十二烷基溴化銨(Didodecyldimethyl-ammonium bromide, DDAB，美國 Sigma 公司)，氯過氧化物酶(CP0，美國Sigma公司)，肉桂醇(國藥集團上海分公司)。其余試劑皆為分析純；研究溶液均用超純水配制。實施例1制備修飾電極玻碳電極(Glassy carbon,GC, φ=5 mm )先在金相砂紙上輕輕打磨一下，再依次用0. 3、0. 05 μ m的Al2O3粉拋光至鏡面。超純水超聲清洗后用微量移液器移取5μ L 0. 1% Nafion滴涂于GC電極表面，室溫干燥后移取IyL CP0(2. 9Xl(T4mol/L)與5yL 10mmol/L的DDAB混合均勻后滴于Nafion修飾的GC電極表面，室溫干燥。最后取5 μ L Img · mL—1殼聚糖滴于電極表面，遂制得用于催化有機化學反應的Chitosan/CPO-DDAB/Nafion/GC修飾電極。實施例2以實施例1制得的Chitosan/CPO-DDAB/Nafion/GC修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)作參比電極，鉬片電極作輔助電極，以pH 4.5的磷酸緩沖液為電解液進行電化學測量。電化學測量采用三電極體系。有氧氣和無氧氣時Chitosan/CPO-DDAB/Nafion/GC修飾電極的循環伏安曲線(速率0. lV/s)如圖1所示。曲線a為飽和氮氣磷酸緩沖液的循環伏安曲線；曲線b為飽和空氣磷酸緩沖液的循環伏安曲線。氮氣飽和(充分除氧)的緩沖溶液中可見一對對稱的氧化還原電流峰，可歸因于CPO與電極之間發生了如下式所示的直接、可逆的電子傳遞反應(圖1曲線a)。
CPO-Fe (III) + e S CPO-Fe (II)(1)根據Q = nFA廣計算得到被固定的具有電活性的CPO的量約為6. 16*10-10mol · cm_2。在空氣飽和的溶液中測得的CV曲線上還原峰電流明顯增大，是典型的氧氣被電催化還原的結果(圖1曲線b)，為構建可控性強的原位產生過氧化氫、推動酶催化有機反應體系提供了保障。CPO (FeIH) +O2 — CPO (Fe Π = 0) +2 (2)實施例3將實施例1所制備的Chitosan/CPO-DDAB/Nafion/GC修飾電極置于2mL磷酸鹽緩沖溶液(pH = 4. 5)，加入6 μ L肉桂醇(0. 047mmol)混勻，反應體系中肉桂醇濃度為0.023mol/L，室溫下連續通入氧氣以使反應液中氧氣飽和，以飽和甘汞電極(SCE)作參比電極，鉬片電極作輔助電極，在-0. 6V下進行恒電位電解2小時。本發明的催化體系的實驗結果與外加H》2的化學方法進行了比較，方法如下移取IyL CP0(2.9X10_4mol/L)加入2mL磷酸鹽緩沖溶液中(反應體系中最終濃度為1.45 Xl(TmoVL)，加入6μ L肉桂醇(0. 047mmol)，室溫下每5min滴加2 μ L H2O2，共滴加17 μ L (約0. 15mmol)。滴加完畢后加入亞硫酸鈉飽和溶液終止反應(反應時間約1小時)。使用氣質聯用色譜(GC-MS，Agilent 7890-5975C氣相色譜儀)對產物進行分析。即用等量乙醚對反應液萃取后采用直接進樣方式，使用分流模式(分流比為20 1)、進樣1 μ L0進樣口溫度250°C ；采用程序升溫法，40°C保持lmin，再以10°C /min升溫至200°C，保持3min ；柱流量lmL/min ；電子轟擊(EI)離子源；電子轟擊電壓:70eV ；MS Source 230°C ；MS Quad :150°C ；HP-5 色譜柱(30mX0. 25mm, 0. 25 μ m)；質譜掃描分子量范圍為 20-200。圖2是應用CPO修飾電極催化肉桂醇氧化所得到的產物(a)和使用相同量的酶外加H2A得到的產物的色譜圖(b)，表明使用電催化氧化的方法比外加H2A的化學方法有更高的轉化率。圖3是應用CPO修飾電極催化肉桂醇氧化所得到的產物的質譜圖，經檢索證明該產物就是肉桂醛。表明反應底物肉桂醇存在時，同時發生如(3)和(4)所示的反應。CPO (FeIH) +H2O2 — CPO (FeIV = 0) +H2O(3)CPO (FeIV = 0) + 肉桂醇一CPO (FeIH) + 肉桂醛(4)圖4是使用CPO修飾電極多次催化氧化肉桂醇的實驗結果。顯然，修飾電極能保持較穩定的轉化效率。4次總共催化產生23. 35 μ mol肉桂酸，而在溶液中外加H2A的方法只產生3.6μπι01肉桂醛，電催化法是溶液法轉化量的6. 5倍。上述試驗結果證明，應用電化學方法原位產生過氧化氫，CPO修飾電極可以高效地催化肉桂醇氧化生成肉桂醛。
權利要求
1.催化肉桂醇氧化生成肉桂醛的方法，其特征在于，包括如下步驟用CPO修飾電極作為工作電極，電解反應液，并連續通入氧氣使反應液中氧氣飽和；在-0. 3 -0. 6V下電解；所述反應液為含有肉桂醇的磷酸緩沖液，PH值為4 5，肉桂醇的含量為0. 01 0.05mol/L ；所述CPO修飾電極的制備方法包括如下步驟(a)在預處理后的玻碳電極表面滴涂氯過氧化物酶和雙十二烷基溴化銨混合溶液，其中氯過氧化物酶濃度2. 0 3. OX 10_4mol/L，雙十二烷基溴化銨濃度為5 lOmmol/L ；(b)干燥后滴涂殼聚糖溶液。
2.權利要求1所述催化肉桂醇氧化生成肉桂醛的方法，其特征在于，反應液中肉桂醇的含量為0. 02 0. 03mol/Lo
3.權利要求1所述催化肉桂醇氧化生成肉桂醛的方法，其特征在于，電解時間為1 4小時。
4.權利要求1所述催化肉桂醇氧化生成肉桂醛的方法，其特征在于，步驟(b)中殼聚糖溶液濃度為0. 5 ang/ml，還含有0. 8wt% 1.醋酸。
5.權利要求1所述催化肉桂醇氧化生成肉桂醛的方法，其特征在于，步驟(a)中所述預處理包括將玻碳電極打磨拋光。
6.權利要求1或5所述催化肉桂醇氧化生成肉桂醛的方法，其特征在于，步驟(a)中所述預處理還包括，在打磨拋光后的玻碳電極表面滴涂質量濃度為0. 05% 0. 2%的Nafion溶液并干燥。
全文摘要
本發明涉及有機合成和電化學領域，具體為利用氯過氧化物酶修飾電極催化肉桂醇氧化生成肉桂醛的方法，將氯過氧化物酶固定在雙十二烷基溴化銨形成的類生物膜修飾的玻碳電極上，并用殼聚糖封裝。利用制得的CPO修飾電極，在不加入過氧化氫的條件下可高效、選擇性地催化肉桂醇氧化生成肉桂醛。
文檔編號C25B11/06GK102383144SQ20111027764
公開日2012年3月21日 申請日期2011年9月19日 優先權日2011年9月19日
發明者吳霞琴, 田海濤, 陸中慶 申請人:上海師范大學