一種高效檢測體內蛋白相互作用的方法

專利名稱：：一種高效檢測體內蛋白相互作用的方法
技術領域：
：本發明屬生物
技術領域：
，涉及蛋白質相互作用，具體涉及一種高效檢測體內蛋白相互作用的方法
背景技術：
：現有技術揭示了細胞的大部分生物學功能是通過多個蛋白質的相互作用來介導的，雖然有一些蛋白質可以以單體的形式發揮作用，但是大部分的蛋白質都是與其他蛋白質形成復合物的形式來發揮作用的。細胞接受外源或是內源的信號(生理的、病理的、以及藥物等)，通過相應的信號傳遞途徑，調節其基因的表達，以保持其生物學特性和發揮相應的生物學功能。在上述整個過程中，蛋白質之間的相互作用都參與其間，并且隨著時間和空間的變化而變化(l)。由于細胞中蛋白質的數量龐大，因此，在后基因組時代，要更好地理解細胞的生物學活性、理解某些藥物的作用機制，高通量的蛋白質相互作用的檢測就至關重要。蛋白質相互作用的研究將有助于理解細胞的信號傳導過程，對尋找和開發相關的對疾病進行有針對性治療的藥物和治療方法都十分重要。本領域公認，較為理想的用于檢測蛋白質相互作用的方法，應該具有特異性并能夠盡量的反映蛋白質在生理狀態下的相互作用，而且要高效，能適應高通量檢測的需求。但是目前的有關檢測方法均難以滿足上述需求，它們的主要缺陷表現為起始細胞用量巨大，特異性不高，耗時費力。親和純化技術主要基于特異性抗體或與靶蛋白融合的標簽肽段來富集耙蛋白及相應的相互作用蛋白，而在此基礎上發展的串聯親和純化(tandemaffinitypurification,TAP)技術則串行兩步的親和純化。該方法的優點是l)不需要過多的背景知識就可以得到大量含靶蛋白的復合體，大量與靶蛋白相互作用的未知蛋白質可鑒定出；2)蛋白表達及與復合物的結合都接近生理水平，是一種檢測體內蛋白相互作用的方法；3)TAP采用兩步親和純化，提高了純化產物的特異性(2)。但TAP技術尚存在如下缺點l)在哺乳動物細胞中天然表達的蛋白量很少，需要超大規模的培養細胞(一般達到109數量級)才能獲得用于質譜鑒定的蛋白量；2)多步洗滌的過程中弱的和瞬時的相互作用復合物會丟失；3)標簽肽段過大，可能妨礙靶蛋白與其它蛋白的相互作用。為了在親和純化過程中獲得更多的靶蛋白，Burckstummer等更改了傳統的標簽肽段，分別用蛋白G和鏈霉親合素結合肽(38個氨基酸)取代原來是雙標簽(3)。該方法可使最初的細胞使用量減少至5X107，但該方法仍然沒有避免TAP技術的一些固有缺陷，如標簽肽段過大，仍需多步洗滌純化等等。為了簡化純化步驟，deBoer等建立了基于生物素-鏈霉親合素系統的一步親和純化方法(4)。此方法首先與靶蛋白融合了一個人工的可生物素化的小肽段標簽(23個氨基酸)，該標簽可被在細胞中同時轉染表達的生物素化酶BirA生物素化，被生物素化的靶蛋白最終由鏈霉親合素微珠結合富集。由于生物素-鏈霉親合素之間的相互作用力是目前己知的最強的存在于自然界中的非共價作用力，比抗體和通常使用的其它親和標簽肽段高幾個數量級，所以利用該系統可一步特異性的純化耙蛋白及其相互作用蛋白。然而，建立在親和純化基礎上的技術仍然會得到一些非特異性結合的蛋白，因此如何將與靶蛋白特異性相互作用的蛋白區分開來同樣變得十分重要。穩定同位素特征標記生物質譜可以很好的解決這個問題。這一技術將不同質量的穩定同位素如碳13或氮"或氘作為在DNA和蛋白質分子中特征質量標記引入生物質譜領域(5)。在蛋白質定量研究中，將穩定同位素碳13或氮15標記的某種氨基酸作為標記載體加入細胞培養液中，由此所產生的細胞中的蛋白質群體會在相應氨基酸序列的位置包含這些比自然氨基酸更重的標記載體，從而在質譜上很容易被區分開來，該技術被稱為氨基酸代謝標記(aminoacid-codedmasstagging,AACT)技術(6，7)，或者SILAC(stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture)技術(8)。在蛋白質相互作用研究中，Chen等將AACT技術與一步親和純化技術結合起來，又發展了雙標記蛋白質組學研究技術，即同時將靶蛋白用親和純化肽段標簽(如FLAG、Myc等)和穩定同位素標記(9-11)，將標記與未標記的細胞等比例混合后提取總蛋白，靶蛋白及其復合物經肽段標簽的抗體親和純化后，質譜鑒定，通過同位素標記與否的肽質量差異來確定特異性相互作用蛋白。利用該方法，Chen等進行了一系列的蛋白質相互作用研究，包括巨噬細胞中TLR信號通路關鍵接頭分子MyD88的相互作用蛋白(9，10)，以及DNA修復過程中組蛋白H2AX的相互作用蛋白(11)，發現了一些新的重要相互作用蛋白分子。但是，由于該方法使用基于抗體相互作用的親和純化肽段標簽，因此仍需要大量的起始細胞(約109或更多)用來富集靶蛋白，從而制約了使用該方法進行大規模高通量的蛋白質相互作用檢測，尤其是信號通路中低豐度蛋白質的相互作用檢測與研究。與本發明相關的現有技術有下述文獻(分別被引用于上文中)。現有技術1.BerggardT,LinseS，JamesP.Methodsforthedetectionandanalysisofprotein-proteininteractions.Proteomics.2007，7:833-42.2.關薇，王建，賀福初.大規模蛋白質相互作用研究方法進展.生命科學.2006，18:507-12.3.BurckstummerT,BennettKL，PreradovicA，SchutzeG，HantschelO,Superti-FurgaG,BauchA.Anefficienttandemaffinitypurificationprocedureforinteractionproteomicsinmammaliancells.NatMethods.2006,3:1013-9.4.deBoerE,RodriguezP，BonteE,KrijgsveldJ,KatsantoniE,HeckA,GrosveldF，Strouboulis丄Efficientbiotinylationandsingle-steppurificationoftaggedtranscriptionfactorsinmammaliancellsandtransgenicmice.ProcNatlAcadSciUSA.2003,100:7480-5.5.ChenX,SmithLM,BradburyEM.Site-specificmasstaggingwithstableisotopesinproteinsforaccurateandefficientproteinidentification.AnalChem.2000,72:1134-43.6.ZhuH，PanS,GuS，BradburyEM，ChenX.Aminoacidresiduespecificstableisotopelabelingforquantitativeproteomics.RapidCommunMassSpectrom.2002，16:2115-23.7.ChenX,Sunl_,YuY,XueY,YangP.Aminoacid-codedtaggingapproachesinquantitativeproteomics.ExpertRevProteomics.2007，4:25-37.8.OngSE，BlagoevB，KratchmarovaI,KristensenDB,SteenH，PandeyA,MannM.Stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture,SII_AC,asasimpleandaccurateapproachtoexpressionproteomics.MolCellProteomics.2002,1:376-86.9.WangT，GuS，RonniT，DuYC,ChenX.Invivodual-taggingproteomicapproachinstudyingsignalingpathwaysinimmuneresponse.JProteomeRes.2005，4:941-9.10.WangT，ChuangTH，RonniT,CaiH,SunHQ,YinHL,ChenX.FlightlessIHomologNegativelyModulatestheTl_RPathway.JImmunol.2006，176:1355-1362.11.DuYC,GuS,ZhouJ,WangT，CaiH,MaclnnesMA，BradburyEM，ChenX.TheDynamicAlterationsofH2AXComplexduringDNARepairDetectedbyaProteomicApproachRevealtheCriticalRolesofCa2+/CalmodulinintheIonizingRadiation-inducedCellCycleArrest.
發明內容本發明的目的是為克服現有技術的缺陷，提供一種高效檢測體內蛋白相互作用的方法。本發明利用高效瞬時轉染表達系統，改進生物素-鏈霉親合素一步親和純化技術，應用只15個氨基酸的標簽，整合同位素標記技術，建立了本發明蛋白質相互作用檢測方法。本發明方法采用用量為107數量級的起始細胞，應用于原代細胞的蛋白質相互作用檢測，特異性和效率明顯高于現有技術方法，能鑒定出更多的相互作用蛋白尤其是弱的和瞬時相互作用，同時檢測耗時和費用也大為減少。本方法包括下述步驟1、構建質粒表達載體建立含有表達可生物素化的人工小肽段標簽(由已知公開文獻獲得-Beckett,D.，Kovaleva，E.&Schatz，P.J.(1999)ProteinSci.8，921-929，15個氨基酸，基因序列為TCCGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAA)的通用質粒載體(基于Invitrogen公司的pcDNA3.1DirectionalTOPO載體)，該載體有兩個亞型，分別用于將肽段標簽連于靶蛋白的N端和C端，分別命名為pAP-N和pAP-C;構建含生物素化酶BirA基因的真核質粒表達載體(命名為pBirA，所述基因具有序列1的序列，由PubMed檢索獲得)；2、人工小肽段標簽的可生物素化通過在細胞中共瞬時轉染表達生物素化酶BirA基因實現與靶蛋白融合的肽段標簽的生物素化；3、建立一步親和純化方法被生物素化的靶蛋白通過鏈霉親合素磁珠富集純化，所采用的儀器和試劑為德國美天旎公司的免疫磁珠分離系統，具體操作方法參照該公司提供的說明書；4、整合AACT技術與一步親和純化方法將細胞穩定同位素標記(AACT技術)，按文獻報道)與可生物素化肽段標簽一步親和純化技術整合；5、蛋白質酶解、質譜鑒定、數據庫搜索和蛋白鑒定相關操作方法參照文獻報道(JProteomeRes.2005,4:941-9;MolCellProteomics.2006,5:1033-1044.)。本發明以研究293T細胞中的重要接頭蛋白14-3-3￡的相互作用蛋白作為實例，獲得最佳實驗方案并建立了相應的技術體系，能滿足高通量、高效蛋白質相互作用檢測及研究的需求。具體實施例方式本發明以293T細胞中的重要接頭蛋白14-3-3e的相互作用蛋白作為實例，詳細闡述本發明方法及步驟。實施例11.構建質粒載體以含有表達可生物素化的人工小肽段標簽的質粒pAP-N為基礎，構建同時含14-3-3e的質粒PAP-N-1433。14-3-3e的基因序列插入pAP-N的Xbal和EcoRV酶切位點。細胞轉染用質粒的中量提取采用lnvitrogen公司中抽試劑盒(貨號K210004)。2.細胞培養HEK293T細胞(市購)為人的胚胎腎細胞，貼壁生長。穩定細胞系于37'C、5%的二氧化碳培養箱中培養，其培養基為正常的或d3-Leu標記的高糖DMEM。293T細胞用AACT技術標記并培養在含10%透析胎牛血清、帶標記氨基酸的DMEM培養液中淋為293T-d3)，同時未標記的293T細胞則用含10%胎牛血清的普通DMEM培養液培養(稱為293T-d0)。有關的AACT標記技術可參閱現有技術(JProteomeRes.2005，4:941-9;MolCellProteomics.2006,5:1033-1044.)。3.以Lipofectamine2000脂質體(Invitrogen公司)轉染293T細胞轉染293T細胞的流程參照Invitrogen公司脂質體說明書進行(https:Z/catalog.invitrogen.com/index.cfmfuseaction=viewCatalog.viewProductDetails&productDescription=541)。本實施例在6孔細胞培養板中置等量的293T-d3和293T-dO細胞各3孔，轉染前細胞生長密度為80%左右，于細胞培養板中的3孔293T-d3細胞均轉染pAP-N-1433質粒，而3孔293T-dO細胞則均共轉染pBirA和pAP-N-1433質粒。4.提取細胞蛋白轉染40小時后，上述兩種細胞總共各用400微升裂解液(碧云天公司，Western及IP細胞裂解液，P0013),裂解細胞后獲得總蛋白，具體操作按裂解液說明書。5.—步親和純化14-3-3e靶蛋白及復合物儀器和試劑使用德國美天旎公司的免疫磁珠分離系統，上述兩種400微升細胞裂解液分別和IOO微升鏈霉親合素磁珠結合反應，具體的操作按公司說明書提供的方法:(http:〃www.miltenyibiotec.com/en/PG—562—489—Display—technology,aspx禾口http:〃www.miltenyibiotec,com/download/datasheets/95/DS130-074-皿.pdf)。最后分別用IOO微升1XSDS蛋白上樣緩沖液分別洗出磁珠結合蛋白，混合兩者。6.蛋白分離得到的蛋白混合物在沸水中煮5分鐘，進行常規的12W的SDS-PAGE膠電泳，至溴芬藍到達底部。7.蛋白質酶解(膠內酶解)1)水洗用前先用去離子水洗一下SDS-PAGE，浸泡幾十分鐘；2)切膠切成1平方毫米大小的膠粒，放入EP管中；3)脫色脫色液為50%ACN+50mMNH4HC03，50-100u1/次，振蕩洗滌2-3次，洗至顏色基本去掉；4)脫水先用50%ACN脫水，60-100u1/次，5min;然后用100%ACN再次脫水，脫水后膠粒會縮小；5)干燥將脫水后的膠粒用氮氣吹干或37'C烘至完全脫水，一般10分鐘以上；6)加酶原液(或儲備液)為100ng/u1,需稀釋8倍至12.5ng/y1Trypsin,10-20ul/次(酶20ul+140ul25/20mMNH4HC03),加完酶解液，放入4。C冰箱10-15min，以便酶被完全吸收，之后吸出多余酶液，再加入10-20u125/20mMNH4HC03，有時也可以用水，37'C酶解，振蕩過夜；7)提肽0.1%TFA+50%ACN,50u1，上清不吸出，超聲10min(超聲容器內加冰)，離心后，收集上清于EP管中。再加50ul0.1%TFA+50%ACN，超聲10min，加冰，合并兩次的上清。8)凍干每個試管用膜封好，扎幾個孔，放入一8(TC，同時把冷凍干燥的架子也冷凍好，3-4小時后，放入低溫冷凍干燥機中凍干。將凍干好的樣品放入一80'C備用。上述有關操作還可參閱現有技術(JProteomeRes.2005，4:941-9;MolCellProteomics.2006，5:1033—1044.)。8.質譜鑒定酶解的肽段進行LC-MS/MS分離分析，具體操作是在配置有Finnigan動態納噴霧源的LTQ-Orbitrap雜交質譜(ThermoFinnigan,Bremen,Germany)。肽段混合物先用液相的流動相溶解，然后上樣到一ZORBAX300SB-C18柱子(來自Agilent,4.6X250，5um)，流速為1.6ul/min，120min的梯度洗脫。流動相A為含5%乙腈、0.1%甲酸的水相；流動相B為含95%乙腈、0.1%甲酸的有機相。樣品用流動相A溶解，肽段先用10W的流動相B洗脫2.5min,然后采用一個線性梯度，于92.5min時流動相B達到60%，在95.5min時，升至95%的流動相B，保持在95%的流動相中10min，然后在5min內迅速將流動相降為10X的流動相B，使之平衡。LTQ-Orbitrap雜交質譜按照依靠數據處理的模式進行操作，采用前三個最強峰策略。簡單的說，在一個掃描周期中，先在orbitr鄰中進行質荷比400-2000(m/z400-2000)的全質量范圍掃描，質量分辨率設為60000,然后在線性離子阱選取最強的3個母離子進行串級掃描，單電荷離子在串級掃描時被剔除。9有關的操作還可參閱現有技術(JProteomeRes.2005，4:941-9;MolCellProteomics.2006，5:1033-1044.)。9.數據庫搜索和蛋白鑒定使用TurboSequestV.27(rev.12)搜索引擎，將所得的所有的MS/MS質譜進行了人類數據庫搜索，搜索參數設置如下胰酶特異性酶切，最大允許2個漏切位點；母離子的質量誤差為10ppm，碎片離子的誤差為IDa;可變修飾為磷酸化的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸(+79.9663)以及d3標記的亮氨酸(+3.018)。所鑒定到的肽段用XCorr、肽的概率、deltaCn、肽質量準確度及不同的肽段數進行過濾，XCorr設定為1.9、2.7、3.5，分別對應于相應的2+、3+和4+母離子；deltaCn〉0.1;肽的概率〈0.001;肽的質量準確度〉0.01Da;兩條以上的肽段匹配一個蛋白。有關的操作還可參閱現有技術(JProteomeRes.2005,4:941-9;MolCellProteomics.2006，5:1033-1044.)。結果顯示，本發明以6孔板中總共6個孔的細胞數量為起始，轉染時細胞總共5X106，起始細胞量少，從細胞培養到得到相互作用復合物只需用3天時間，一次在293T細胞中共鑒定到297個14-3-3e的特異性相互作用蛋白。比較現有技術需用穩轉的方法，從細胞培養到得相互作用復合物需用2個月左右的時間，本發明方法可用于哺乳動物細胞中蛋白質相互作用檢測及研究，具有高效、高特異性、省時省力省經費的優勢。表1是293T細胞中檢測到的297個14-3-3e的特異性相互作用蛋白。表2是本發明與現有技術方法的比較。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>673527.97IPI00149650.323398PPWD1766929.7IPI00215720.12332FMR1892349.12IPI00290439.16732SRPK1926671.44IPI00011253.36188RPS310228418.1IPI00006213.25108PCM111113885.4IP醒42487.284451KIAA18041227727.73IPI00021263.37534Y職Z1373004.98IPI00021786.15894RAF11465268.93IPI00020096.23831KLC11574560.49IPI00219330.23609ILF31659173.52IPI00012998.211052CPSF61790875.27IPI00396435.31665DHX151866080.77IPI00179713.610644IGF2BP21932874.17IPI00007188.5292SLC25A52011657.85IPI00008529.16181RPLP22129155.42IPI00000816.17531Y腿E2292433.83IPI00396370.58662EIF3B23129685.2IPI00022043.17248TSC124101933.6IP應40楊.427044SND12534039.85IPI00219729.38402SLC25A112625804.39IPI00219685.551079NDUFA13271醒2.4IPI00449049.5142PARP12829785.91IPI00017334.15245PHB2915413.43IPI00029750.16229RPS243035777.4IPI00289907.784248FYTTD131178043.8IPI00220365.51981EIF4G13249734.93IPI00295387.551379CRLF33369697.31IPI00513803.310746麼3K23426210.74IP讓柳17.111051NUDT2135175328.8IPI00186194.49859CEP17036130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41.42IPI00009922.381892C14orfl5620925526.43IPI00012340.18683SFRS921032122.71IPI00027569.1343069,PCL1211101160.2IPI00023555.1260310SBPL321246841.23IPI00009328.49775EIF4A321353322.68IPI00221354.12521FUS214106796.6IPI00167804.71148800SBPL621582379.86IPI00293655.31653DDX121673830.8IPI00375907.7200186CRTC221710796.64IPI00029266.16635SNRPE21831836.25IPI00164944.155103RALGPS221928473.77IPI00063245.18939FUBP322070009.18IPI00304925.53303HSPA1A221123434.1IPI00185919.323367LARP1222146380.7IPI00742905.11660DHX922327746.77IPI00018146.110971Y,22485530.05IPI00014344.11859DYRK1A22576074.75IPI00002349.257532NUFIP21522610356.48IPI00219291.49551ATP5J222738413.99IPI00294536.111171STRAP22852132.14IPI00012442.110146G3BP122954382,39IPI00030320.41656DDX6230206313.1IPI00021954.18729GBF123130190.56IPI00179138.323450SF3B323244962.38IPI00025815.223435TARDBP233110354.2IPI00292953.626064RAI1423462055.67IPI00019463.35610EIF2AK223577653.88IPI00290158.62011MARK223627727.81IPI00215884.46426SFRS123777024.49IPI00016250.69513FXR223884383.71IPI00303797.3673BRAF23996758.57IPI00015924.124144TFIP112408212.73IPI00215790.66169RPL3824129207.21IPI00030179.36129RPL724234756.34IPI00026689.4983CDC224328284.91IPI00220642.77532Y腿G24413273.37IPI00302850.46632S服PD1245119838.3IPI00026970.411198SUPT16H24670899.22IPI00012074.310236HNRNPR24788924.16IPI00479217.13192臓NPU24821621.07IPI00215719.66141RPL1824913518.22IPI00017963.16633SNRPD225065825.37IPI00021304.13849KRT225163417.24IPI00008557.510642IGF2BP125220239.65IPI00376798.36135RPL1125372733.09IPI00025874.26184■125462340.01IPI00009867.33852KRT525517684.13IPI00021266.1647099hCG—16001256180095.6IPI00220514.14763NF125718553.06IPI00247583.5729402LOC72940225847667.51IPI00003918.66124RPL425963932.53IPI00006181.18664EIF3D26017767.9IPI00306332.46152RPL24261241258.3IP腿83572.485440DOCK726282947.01IPI00031522.23030HADHA26345642.86IPI00003881.53185臓PF26438364.39IPI00021728.38894EIF2S226538197.41IPI00012066.25094PCBP226655174.95IPI00550689.351493C22orf2826746124.6IPI00025491.11973EIF4A126857185.75IP腿79964.55725PTBP1269295818.6IPI00083708.223215BAT2D127070738.26IPI00012726.48761PABPC4271165433.8IPI00300621.18871SYNJ227238901.1IPI00006754.110238WDR6827349198.42IPI00013881.63187臓PH1274137316.1IPI00218136.357530CGN27592193.73IPI00465294.2988CDC5L27634251.79IPI00008530.16175RPLP0277273424.6IPI00007928.410594PRPF827853619.17IPI00418471.67431VIM27913500.53IPI00018278.394239H2AFV28072706.76IPI00030910.14076CAPRIN128120829.8IPI00022276.328957MRPS2828228663IPI00021840.16194RPS628370626.04IPI00008524.126986PABPC128439121.96IPI00654777.28665EIF3F285100389.1IP蘭77437.551340C腿L1286510073.5IPI00289776.323077MYCBP228744933.99IPI00176706.184991RBM1728822577.56IPI00221088.56203RPS928967518.59IPI00375441.28880FUBP129011360.38IPI00453473.68359HIST1H4A29165922.5IPI00444262.34691NCL29224190.17IPI00216587.96202RPS8293123031.7IPI00395663.523294ANKS1A29426136.23IPI00015833.154927CHCHD329528201.02IPI00216319.37533YWHAH29648197.23IPI00008575.310657KHDRBS1297113303.8IPI00456359.111273ATXN2L表2本發明以往方法(以TAP為例)起始細胞量轉染時細胞總共5X1061X109得到蛋白復合物時間3天2月特異性很高低檢測到的相互作用蛋白幾百個一般幾十個17一種高效檢測體內蛋白相互作用的方法SEQUENCELISTING〈110〉復旦大學<120>—種高效檢測體內蛋白相互作用的方法<130>11<160>1<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>966<212〉腿<213>動物<柳〉1atgaaggataacaccgtgcc3ctgaaattgattgccctgttagcg肪cggtg犯tttcsc60tctggcgagc3gttgggtg3aacgctgggafitgsgccgggcggctattaataaacacatt120cagacactgcgtgactggggcgttgatgtctttaccgttccgggtaaaggatacagcctg180cctgagcctatccagttacttaBtgct肌scagatattgggtcagctggatggcggtagt240gtagccgtgctgccagtgattgactccacgaatcagtaccttcttgatcgtatcgg卿g300cttaaatcgggcgatgcttgcattgcBg幼taccagcaggctggccgtggtcgccggggt360cggaaatggttttcgccttttggcgc犯acttatatttgtcgatgUctggcgtctggaa420caaggcccggcggcggcgattggttt幼gtctggttatcggtatcgtgatggcggaagta480ttacgcaagctgggtgcagataaagttcgtgtt幼atggcctaatgacctctatctgcag540gatcgc肌gctggcsggcattctggtggagctgactggcaaaactggcgatgcggcgcaa600atagtcattggagccgggatc幼catggcaatgcgccgtgttgaeig卿gtgtcgtt肪t660caggggtggatcacgctgcagg卿cggggatcaatctcgatcgtaatacgttggcggcc720atgct幼taicgtgaatteicgtgctgcgttggaactcttcgaac朋gaaggattggcacct780tatctgtcgcgctgggaaaagctggataatttteittaatcgcccagtgaaacttatcatt840ggtgat犯agaaatatttggcatttcacgcgg幼tagacaaacagggggctttattactt900gagcaggatggaat&ataaaaccctggatgggcggtgaaatatccctgcgtagtgcagaa卿96權利要求1、一種高效檢測體內蛋白相互作用的方法，其特征是采用用量為107數量級的起始細胞，檢測原代細胞的蛋白質相互作用，包括下述步驟1)構建質粒表達載體建立含有表達可生物素化的15個氨基酸的人工小肽段標簽的通用質粒載體，構建含生物素化酶BirA基因的真核質粒表達載體；2)人工小肽段標簽的可生物素化通過在細胞中共瞬時轉染表達生物素化酶BirA基因實現與靶蛋白融合的肽段標簽的生物素化；3)建立一步親和純化方法被生物素化的靶蛋白通過鏈霉親合素磁珠富集純化；4)整合氨基酸代謝標記技術與一步親和純化方法將細胞穩定同位素標記與可生物素化肽段標簽一步親和純化技術整合；5)蛋白質酶解、質譜鑒定、數據庫搜索和蛋白鑒定。2、按權利要求1所述的高效檢測體內蛋白相互作用的方法，其特征是所述的步驟1)的15個氨基酸其序列為TCCGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAA。3、按權利要求1所述的高效檢測體內蛋白相互作用的方法，其特征是所述的步驟1)的通用質粒載體基于pcDNA3.1DirectionalTOPO載體，所述載體有兩個亞型，分別用于將肽段標簽連于靶蛋白的N端和C端，分別命名為pAP-N和pAP-C。4、按權利要求1所述的高效檢測體內蛋白相互作用的方法，其特征是所述的步驟1)的BirA基因具有序列1的序列。全文摘要本發明屬生物
技術領域：
，涉及一種高效檢測體內蛋白相互作用的方法。本發明利用高效瞬時轉染表達系統，改進生物素-鏈霉親合素一步親和純化技術，應用只15個氨基酸的標簽，整合同位素標記技術，建立了蛋白質相互作用檢測方法。本方法采用用量為10⁷數量級的起始細胞，應用于原代細胞的蛋白質相互作用檢測，特異性和效率明顯高于現有技術，能鑒定出更多的相互作用蛋白尤其是弱的和瞬時相互作用，同時檢測耗時和費用也大為減少。本發明有助于理解細胞的信號傳導過程，對開發相關的對疾病有針對性治療的藥物及治療方法具有重要參考價值。文檔編號G01N33/15GK101581727SQ200810037359公開日2009年11月18日申請日期2008年5月13日優先權日2008年5月13日發明者賀宇飛,先陳申請人:復旦大學