一種新型基于拓撲異構酶的核酸納米網狀結構及制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種核酸納米結構，具體而言是一種新型依賴于拓撲異構酶構建穩定核酸納米網狀結構及其構建技術。本發明所使用的DNA網狀結構是由3條DNA單鏈通過拓撲異構酶構建而成的二維網狀結構，其中擁有互補配對片段和活性片段。活性片段可以設計成為實現相關生物學功能的目的序列，攜帶相關生物基團，發揮相應的生物學效應。本方法具有熱穩定性高、擁有活性片段，制作簡單方便等特點。
【專利說明】
一種新型基于拓撲異構酶的核酸納米網狀結構及制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種核酸納米結構，具體而言是一種新型依賴于核酸拓撲異構酶構建 的核酸納米網狀結構及制備方法。
【背景技術】
[0002] DNA納米技術概念，是納德里安?西曼(Nadrian Seeman)在1980年代早期提出的， 在2000年后開始引起廣泛的關注。最近幾年，一種被稱為DNA Origami(DNA折紙）的技術得 到了廣泛的發展與應用，這種技術利用已知序列的長鏈病毒DNA(通常是M13噬菌體的 M13mpl8的DNA)和大量的短鏈DNA構造出相對復雜的納米級形狀和圖案。這一領域的研究者 已經構建了大量的靜止結構(如，二維和三維晶體結構、毫微管、多面體和其他多種造型)和 功能結構（如，納米機器和DNA計算機）。該技術的成果被廣泛的應用于結構生物學、生物物 理學的理論研究；晶體學和光譜學應用研究；其應用領域正在向分子電子學和納米醫學擴 展。
[0003] DNA折紙技術所需的長鏈一般通過滾環擴增(RCA)的方法獲得，RCA技術模擬自然 界微生物環狀DNA的滾環復制過程發展起來的一種核酸等溫擴增方法，可以得到長鏈DNA。 其產物具有序列確定、長度合適的DNA鏈，因此RCA長鏈是一種替代DNA折紙中天然長鏈DNA 的理想材料。
[0004] 現有的DNA折紙技術通過將DNA長鏈降溫退火，在DNA鏈之間通過堿基互補的氫鍵， 形成富含DNA雙鏈的納米片層結構;再通過使用小DNA分子(也稱DNA訂書釘)與剩余的長鏈 DNA中沒有形成雙鏈結構的部分形成雙鏈，穩定片層結構。目前的DNA折紙結構能夠提供相 對穩定的DNA片層結構，但是還存在著以下不足，主要表現在兩個方面：
[0005] (1)穩定性差
[0006] 這種DNA折紙結構的穩定性是相對的，由于其結構主要依靠氫鍵等非共價鍵維持， 因此當溫度升高時，結構會解體；
[0007] (2)與外源分子結合力差
[0008] 出于穩定DNA折紙結構穩定性的目的，引入小DNA分子，與長鏈DNA分子中的單鏈部 分結合，封閉了長鏈DNA分子上的大量DNA單鏈，使得與外源分子結合的活性位點減少，造成 與外源分子的結合力較差。
[0009] 本發明為克服以上不足，倉ll造性的使用了DNA拓撲異構酶(DNA Topiosomreases)， 在DNA折紙納米片層結構中引入了天然DNA所具備的拓撲結構，使得長鏈和長鏈之間相互纏 繞形成天然DNA所具備的雙鏈拓撲結構，具有很強的穩定性，而伴隨著這種穩定性，可以避 免額外使用DNA訂書釘，保留大量的DNA單鏈作為結合其他成分的活性位點。
[0010] DNA拓撲酶是能將線狀、環狀、單鍵或雙鍵DNA分子進行拓撲變換的一種酶。拓撲變 換是指對物體進行不改變其拓撲性質的變換。拓撲性質簡單地講是指將物體進行彈性操作 (位移)時物體保持不變的一種狹義的幾何性質。DNA通過拓撲酶作用，形成類似于鐵絲網的 mesh結構。
[0011] 總之，我們構建的新型基于拓撲異構酶的核酸納米網狀結構核酸納米網狀結構的 優勢在于，通過RCA過程獲得長鏈后，仿照〃DNA折紙〃的構造方法，利用堿基氫鍵互補作用將 DNA長鏈中的一個循環單元中的50%的堿基配位成雙鏈，使其折疊成特定的形狀。由于RCA 長鏈是大量相同的重復序列組成的，因此設計一個循環單元的折疊方式可以拓展到整條長 鏈。通過這種方式，我們利用三條不同序列的DNA長鏈折疊成所希望的納米圖案。而后使用 DNA拓撲異構酶，在雙鏈部分引入超螺旋形成穩定的網狀結構。同時，在設計模板鏈的過程 中，我們保留了50%左右的未匹配片段，可以與DNA單鏈結合，成為多種活性基團的結合位 點。
[0012] 這種設計更為簡便，具有可控操作區且具有熱穩定性的核酸納米網狀結構可以作 為模板組裝功能納米材料或分子，能夠在光學、電磁學、醫學等領域獲得廣泛的應用，具有 重要的理論意義和應用價值。
【發明內容】
[0013]本發明的目的：
[0014] 本發明旨在構建一種穩定性強，與外源分子結合力強的的新型核酸納米網狀結 構。
[0015] 本發明的技術原理：
[0016] 本發明主要依靠 DNA自主裝技術原理實現，DNA自組裝是在熱力學驅動下，兩條互 補的單鏈DNA分子自發雜交的動力學過程。在雜交過程中，DNA雙鏈通過氫鍵、范德華力和靜 電力相互作用，嚴格遵守Watson-Crick堿基互補配對原則，自發形成結構穩定、復雜有序且 具有某些特定功能的分子聚集體或超分子結構。而后通過核酸拓撲異構酶引入超螺旋得到 穩定性強，與外源分子結合力強的的新型核酸納米網狀結構。
[0017] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0018] 1.環狀模板鏈(Tl、T2、T3)、成環短鏈(LI、L2、L3)的設計
[0019] 本研究所使用的三條DNA長鏈來源于，三個環狀DNA分子。每個環狀DNA分子具有四 個區域依次分別為結合位點1 (I )、活性位點1 (II)、結合位點2(III)、活性位點2(IV)。由此 環狀DNA分子經等溫擴增得到的DNA長鏈分子具有多個重復序列單元，每個重復序列單元具 有四個區域，依次分別為I、II、III、IV。
[0020] 三個環狀DNA分子的四個區域的排布分別為：
[0021] 環狀 DNA 分子一 :A、M、B、N。
[0022] 環狀DNA分子二:A'（與A反義互補）、P、C、Q。
[0023]環狀DNA分子三:B'（與B反義互補）、X、C'（與C反義互補）、Y。
[0024]由這三個環狀DNA分子得到的DNA長鏈分子的區域排布分別為：
[0025] 長鏈 DNA 分子一的模式：為 A-M-B-N-(-A-M-B-N-)n-A-M-B-N;
[0026] 長鏈 DNA 分子二的模式為 A' -P-C-Q-(-A' -P-C-Q-)n-A' -P-C-Q;
[0027] 長鏈 DNA 分子三的模式為:B ' -X-C ' -Y- (-B ' -X-C ' -Y-) n-B ' -X-C ' -Y。
[0028] 三個環狀DNA分子分別使用三條與DNA環狀分子等長的線性DNA分子(T1、T2和T3) 與另外三個DNA短鏈分子(LI、L2、L3)兩兩配對合成。
[0029]具體而言，T1的3'端片段與L1的5'端片段反義互補，T1的5'端片段與L1的3'端片 段反義互補，且形成的DNA分子為T1的3'端與T1的5'端能夠在L1的作用下緊密臨近，形成不 閉合的不完全雙鏈DNA環狀分子。該環狀分子能夠被DNA連接酶連接，產物為單鏈閉合的環 狀DNA分子（由T1連接而成)結合一個短的線性DNA分子(L1)。
[0030] T2與L2;T3與L3,同T1與L1的關系。
[0031]依據上述原則合成環狀模板鏈(T1、T2、T3)以及成環短鏈(L1、L2、L3)。
[0032] 2.單鏈環狀DNA分子的合成
[0033] (1)將L分子以及與它匹配的T分子稀釋到10mM，依據1:1比例混合。
[0034] (2)取T4連接酶依據說明書加入適當成分。
[0035] (3)依據說明書使用恒溫裝置(PCR儀、水浴鍋、金屬浴等)在最適反應溫度下反應 相應的時間。
[0036] (4)反應結束后加熱至94。(：滅活lOmin。
[0037] (5)使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測鏈接產物。
[0038] (6)如果出現分子量與環狀DNA分子分子量相應的條帶或者出現分子量與環狀DNA 分子分子量整倍數相應的條帶，則證明鏈接可能成功。
[0039] 3 ?純化
[0040] 取連接產物加入五倍體積4°C預冷的冰乙醇加入裝有產物的PCR管中，在-20°C下 靜置5min，而后使用高速離心機在12000rpm(轉頭直徑大于12cm)下離心5min，完成后，倒掉 上清液，待產物自然風干完全后，加入30yL的雙蒸水放入-20 °C冰箱中保存待用。
[0041] 三個環狀模板鏈和對應的成環短鏈分別使用相同的方法進行連接，合成單鏈環狀 DNA分子。
[0042] 4.RCA滾環擴增
[0043]在成環短鏈的DNA分子的3'端具有活性的基礎上，使用具有鏈置換功能的DNA聚合 酶(如Bst DNA聚合酶)進行滾環擴增，具體步驟為：
[0044] (1)取Bst DNA聚合酶，依據說明書配置RCA滾環擴增反應混合物。
[0045] (2)加入連接產物2此。
[0046] (3)使用恒溫裝置(PCR儀、水浴鍋、金屬浴等)65°C孵育該混合物4h。
[0047] (4)使用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測產物。
[0048] (5)如能觀察到分子量大于lOOOObp的DNA擴增產物則證明得到了所需的長鏈。 [0049]三個單鏈環狀DNA分子分別使用相同的方法進行擴增得到對應的長鏈。
[0050] 5.長鏈DNA分子褪火成網
[00511 (1)使用紫外分光光度計依次檢測三條長鏈DNA分子的產物濃度。
[0052] (2)依據長鏈DNA分子的物質的量比1:1:1的比例，混合三個長鏈DNA分子。
[0053] (3)加熱混合物至95°C恒溫20min，逐漸降溫，降溫至37°C。
[0054] (4)加入DNA拓撲異構酶反應混合液，（DNA拓撲異構酶反應混合液依據說明書配 置），37°C孵育2h。
[0055] (5)孵育結束后，使用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測成網產物。
[0056] (6)如發現泳道中無 DNA樣本所形成的條帶，而膠孔附近有大量DNA樣本則證明成 網反應成功，此時DNA網由于分子量過大不能進入瓊脂糖凝膠。
[0057] 6.原子力顯微鏡(AFM)觀察DNA網狀結構
[0058] 將構造所得DNA產物在AFM下觀察并拍照，以確證是否獲得DNA網狀結構。
【附圖說明】
[0059] 圖1為預期得到的核酸納米網狀結構的部分示意圖（未加拓撲異構酶修飾）。
[0060] 圖中所示合成的三條DNA鏈冷卻之后互補配對，形成一種二級網狀結構。
[0061] 圖2為使用拓撲異構酶修飾后預期的核酸納米網狀結構部分示意圖。
[0062] 圖3為拓撲異構酶修飾后期望得到的核酸納米網狀結構。
[0063] 此時的網狀結構和圖1所示的網狀結構序列相同，結構相似，不同點在于用拓撲異 構酶作用后該網狀結構由于加入了超螺旋，形成了穩定的網狀結構。
[0064] 圖4為實施例1中模板鏈連接成環產物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示連接成功的 特異性片段。
[0065] 圖中M為Marker，1，2泳道為環1多階產物;3，4泳道為環2多階產物;5,6泳道為環3 多階產物。圖中可見多條條帶，為鏈接形成的不同長度的多階產物。
[0066]圖5為在原子力顯微鏡下混合成功產物的形態結構。
[0067] 圖中可以看出，在微觀層面我們已經形成了所預期的結構。
【具體實施方式】
[0068] 實施例1
[0069] 1.環狀模板鏈(TP 1、TP2、TP3)、成環短鏈(LP1、LP2、LP3)的設計依據設計原理設計 三條100bp的DNA單鏈，分別為TP1、TP2、TP3。
[0070]其中TP1的核苷酸序列為：
[0071] TAGCA AGCTT CCTAC TCCGT CATGC AAGTT TTAAC TACTA CTGCA GTCTC TTGCG AGCCC TGTCC GTTCA CTACT GCGCT CGTCG GACCT GATGT GGAGA。
[0072] 其模式為A、M、B、N。
[0073] A區的序列為TCATG CAAGT ITTAA CTACT ACTGC AGTCTC;
[0074] B區的序列為ACTAC TGCGC TCGTC GGACC TGATG TGGAG A。
[0075]其促環LP1促環引物的核苷酸序列為：
[0076] ACGGA GTAGG AAGCT TGCTA TCTCC ACATC AGGTC CGACG。
[0077] 該序列中包括既能夠和TP1的5 '端20nt又可以與3 '端20nt互補配對的序列。
[0078] TP2的核苷酸序列為：
[0079] TAGCA AGCTT CCTAC TCCGG AGACT GCAGT AGTAG TTAAA ACTTG CATGA TTGCG AGCCC TGTCC GTTCA CTTCA CACCC CAGCT AAATA GAGGC ACAAG；
[0080] 其模式為:A，、P、C、Q。
[0081] A'區的序列為GAGAC TGCAG TAGTA GTTAAAACTTG CATGA;
[0082] C區的序列為ACTTC ACACC CCAGC TAAAT AGAGG CACAA G。
[0083] LP2促環引物的核苷酸序列為：
[0084] CTTGT GCCTC TATTT AGCTG CCGGA GTAGG AAGCT TGCTA。
[0085] 該序列中包括既能夠和TP2的5 '端20nt又可以與3 '端20nt互補配對的序列。
[0086] TP3的核苷酸序列為：
[0087] TCTCC ACATC AGGTC CGACG AGCGC AGTAG TTTGC GAGCC CTGTC CGTTC CTTGT GCCTC TATTT AGCTG GGGTG TGGGG TTAGC AAGCT TCCTA CTCCG。
[0088] 其模式為:B，、P、C，、Q。
[0089] B'區的序列為TCTCC ACATC AGGTC CGACG AGCGC AGTAG T
[0090] C'區的序列為CTTGT GCCTC TAITT AGCTG GGGTG TGGGG T
[0091] LP3的促環引物的核苷酸序列為：
[0092] CGTCGGACCTGATGTGGAGACGGAGTAGGAAGCTTGCTAAo
[0093] 該序列中包括既能夠和TP3的5 '端20nt又可以與3 '端20nt互補配對的序列。
[0094]其余區域為非匹配區。
[0095] 2.單鏈環狀DNA分子的合成
[0096] (1)將LP1、LP2、LP3分子以及與它匹配的TP1、TP2、TP3分子稀釋到10mM，將LP1與 TP1依據1:1比例混合;將LP2與TP2依據1:1比例混合;LP3與TP3依據1:1比例混合。
[0097] (2)取T4連接酶依據說明書加入適當成分。
[0098] (3)依據說明書使用恒溫裝置(PCR儀、水浴鍋、金屬浴等)在16°C下反應12小時。
[0099] (4)反應結束后加熱至94°C滅活lOmin。
[0100] (5)使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測鏈接產物。
[0101] (6)發現分子量為100bp以及相當于100的整數倍堿基對所折合分子量的相對應的 條帶，證明鏈接可能成功。
[0102] 3.純化
[0103]取LP1與TP 1的連接產物100uL，加入五倍體積4 °C預冷的冰乙醇加入裝有產物的 PCR管中，在-20°C下靜置5min，而后使用高速離心機在12000rpm(轉頭直徑大于12cm)下離 心5min，完成后，倒掉上清液，待產物自然風干完全后，加入30此的雙蒸水放入-20°C冰箱中 保存待用。
[0104]使用同樣的方法處理LP2與TP2的連接產物和LP3與TP3的連接產物。
[0105] 4.RCA滾環擴增
[0106] (1)取Bst DNA聚合酶，依據說明書配置RCA滾環擴增反應混合物。
[0107] (2)分別取3管反應混合物，每管取23iiL。
[0108] (3)每管內加入連接產物2此。各管分別加入LP1與TP1的連接產物、LP2與TP23的連 接產物、LP3與TP3的連接產物。
[0109] (4)使用PCR儀65 °C孵育該混合物4h。
[0110] (6)使用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測產物。
[0111] (7)觀察到分子量大于10000bp的DNA擴增產物，證明得到了所需的長鏈。
[0112] 5.長鏈DNA分子褪火成網
[0113] (1)使用紫外分光光度計依次檢測三條長鏈DNA分子的產物濃度。
[0114] (2)依據長鏈DNA分子的物質的量比1:1:1的比例，混合三個長鏈DNA分子。
[0115] (3)取混合物25此，加熱混合物至95 °C恒溫20min，逐漸降溫，降溫速度為0.5 °C/ min降溫至37°C。
[0116] (4)加入DNA拓撲異構酶反應混合液，（含DNA拓撲異構酶III 2yL約200U)，37°C孵 育2h。
[0117] (5)孵育結束后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測成網產物。
[0118] (6)發現泳道中無 DNA樣本所形成的條帶，而膠孔附近有大量DNA樣本，證明成網反 應成功，此時DNA網由于分子量過大不能進入瓊脂糖凝膠。
[0119] 6 ?原子力顯微鏡(AFM)觀察DNA網狀結構
[0120] 將構造所得DNA產物在AFM下觀察并拍照，能夠觀察到相應的網狀結構。
[0121] 7.穩定性比較
[0122] 取本實施例中的5 . (3)步驟中的混合物25此，加熱混合物至95 °C恒溫20min，驟冷 至4°C。將所得DNA產物在AFM下觀察并拍照，不能夠觀察到網狀結構。證明拓撲異構酶的作 用確實起到了引入超螺旋，提高DNA納米網穩定性的作用。
[0123] 8.與外源分子結合能力分析
[0124] (1)取本實施例5.(6)驗證過的0嫩網狀結構溶液25此，加入能夠和非匹配區的0嫩 單鏈通過堿基互補配對結合的DNA單鏈，該單鏈的5 '端進行地高辛標記。
[0125] (2)加熱混合物至95°C恒溫20min，然后按本實施例中5. (3)的步驟逐漸降溫處理。
[0126] (3)取混合物加入1倍體積冰乙醇，lOOOOrpm離心5分鐘，此時分子量巨大的DNA網 狀結構以沉淀的形式存在，而小分子量的DNA單鏈則在溶液中。將得到的DNA網狀結構溶液 滴加在載玻片上，加熱固定。
[0127] (4)向載玻片上均勻涂布一層標記熒光基團的地高辛抗體溶液，而后進入熒光顯 微鏡，使用該焚光基團發射光波長的濾光片觀察載玻片。
[0128] (5)可見在滴加網狀結構的位置形成明顯的光斑，證明其具備與外源分子結合的 能力。
[0129] 實施例2:
[0130] 1.環狀模板鏈(TF1、TF2、TF3)、成環短鏈(LF1、LF2、LF3)的設計
[0131] 本實施例以三條290nt長度的DNA單鏈（以下分別簡稱TF1、TF2、TF3)為模板，構建 核酸納米網狀結構。
[0132] 其中TF1的核苷酸序列為：
[0134] 其模式為A、M、B、N。
[0135] 其促環LF1促環引物的核苷酸序列為：
[0136] TACAAGCCGACCATTCTTACCCTCCTCGGGTCCTTACTGCAGAAGGAG。
[0137] 該序列中包括既能夠和TF1的5 '端又可以與3 '端互補配對的序列。
[0138] TF2的核苷酸序列為：
ATATAAGTGAAAAATCTGTAACTTTTAATCCCTCACGAGCAACTTGGCTTCCTCTAGTGo
[0140] 其模式為:A'、P、C、Q。
[0141] LF2促環引物的核苷酸序列為：
[0142] ATATGCAGAATTCATTCGTTGACAGGGTCACTAGAGGAAGCCAAGTTGCTCGTGAGo
[0143] 該序列中包括既能夠和TF2的5 '端又可以與3 '端互補配對的序列。
[0144] TF3的核苷酸序列為：
[0146] 其模式為:B'、P、C'、Q。
[0147] LF3的促環引物的核苷酸序列為：
[0148] TGTCGCCGGTACCGAAACATTGTCATCAAGATTTCGGTGCTGGACGCACGGATAAG
[0149] 該序列中包括既能夠和TF3的5 '端又可以與3 '端互補配對的序列。
[0150] 其余區域為非匹配區。
[0151] 2.單鏈環狀DNA分子的合成
[0152] (1)將LF1、LF2、LF3分子以及與它匹配的TF1、TF2、TF3分子稀釋到10mM，將LF1與 TF1依據1:1比例混合;將LF2與TF2依據1:1比例混合;LF3與TF3依據1:1比例混合。
[0153] (2)取T4連接酶依據說明書加入適當成分。
[0154] (3)依據說明書使用恒溫裝置(PCR儀、水浴鍋、金屬浴等)在16°C下反應12小時。
[0155] (4)反應結束后加熱至94°C滅活lOmin。
[0156] (5)使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測鏈接產物。
[0157] (6)發現分子量為300bp以及相當于300的整數倍堿基對所折合分子量的相對應的 條帶，證明鏈接可能成功。
[0158] 3.純化
[0159] 取LF1與TF1的連接產物100yL，加入五倍體積4°C預冷的冰乙醇加入裝有產物的 PCR管中，在-20°C下靜置5min，而后使用高速離心機在12000rpm(轉頭直徑大于12cm)下離 心5min，完成后，倒掉上清液，待產物自然風干完全后，加入30此的雙蒸水放入-20°C冰箱中 保存待用。
[0160] 使用同樣的方法處理LF2與TF2的連接產物和LF3與TF3的連接產物。
[0161] 4.RCA滾環擴增
[0162] (1)取Bst DNA聚合酶，依據說明書配置RCA滾環擴增反應混合物。
[0163] (2)分別取3管反應混合物，每管取23yL。
[0164] (3)每管內加入連接產物2此。各管分別加入LF1與TF1的連接產物、LF2與TF23的連 接產物、LF3與TF3的連接產物。
[0165] (4)使用PCR儀65 °C孵育該混合物4h。
[0166] (8)使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物。
[0167] (9)觀察到分子量大于lOOOObp的DNA擴增產物，證明得到了所需的長鏈。
[0168] 5.長鏈DNA分子褪火成網
[0169] (1)使用紫外分光光度計依次檢測三條長鏈DNA分子的產物濃度。
[0170] (2)依據長鏈DNA分子的物質的量比1:1:1的比例，混合三個長鏈DNA分子。
[0171] (3)取混合物25此，加熱混合物至95 °C恒溫20min，逐漸降溫，降溫速度為0.5 °C/ min降溫至37°C。
[0172] (4)加入DNA拓撲異構酶反應混合液，（含DNA拓撲異構酶III 2yL約200U)，37°C孵 育2h。
[0173] (5)孵育結束后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測成網產物。
[0174] (6)發現泳道中無 DNA樣本所形成的條帶，而膠孔附近有大量DNA樣本，證明成網反 應成功，此時DNA網由于分子量過大不能進入瓊脂糖凝膠。
[0175] 6.原子力顯微鏡(AFM)觀察DNA網狀結構
[0176] 將構造所得DNA產物在AFM下觀察并拍照，能夠觀察到相應的網狀結構。
【主權項】
1. 一種新型基于拓撲異構酶的核酸納米網狀結構及制備方法，其特征在于，一種新型 基于拓撲異構酶的核酸納米網狀結構，該結構由三條不同的長鏈DNA組成。2. 根據權利要求1所述的一種新型基于拓撲異構酶的核酸納米網狀結構，其特征在于， 這三條不同的DNA長鏈，每條都具有多個重復序列單元，每個重復序列單元具有四個區域， 長鏈分子一的模式為A-M-B-N-(-A-M-B-N-) n-A-M-B-N;長鏈DNA分子二的模式為六'卞^-(-A ' -P-C-Q-) n-A ' -P-C-Q;長鏈 DNA 分子三的模式為：B ' -X-C ' -Y- (-B ' -X-C ' -Y-) n-B ' -X-C'-Y;其中A'與A反義互補，B'與B，C'與C反義互補。3. 根據權利要求1所述的一種新型基于拓撲異構酶的核酸納米網狀結構，其特征在于， 這三條長鏈組成的DNA納米網狀結構，在彼此之間的雙鏈配對區存在DNA超螺旋。4. 根據權利要求1所述的一種新型基于拓撲異構酶的核酸納米網狀結構，其特征在于， 這三條長鏈組成的DNA納米網狀結構，在彼此之間的非雙鏈配對區存在能夠和其他核酸分 子結合的DNA單鏈。5. -種新型基于拓撲異構酶的核酸納米網狀結構的制備方法，其特征在于，使用滾環 擴增的方法制備三條不同的DNA長鏈。6. 根據權利要求5所述的一種新型基于拓撲異構酶的核酸納米網狀結構的制備方法， 其特征在于，使用三條線性DNA分子與另外三個DNA短鏈分子兩兩配對DNA環形分子，該DNA 環形分子的堿基序列又線性DNA分子決定，其序列具有以下特點，環狀DNA分子一的區域為 A、M、B、N;環狀DNA分子二的區域為A'（與A反義互補）、P、C、Q;環狀DNA分子三:B'（與B反義互 補）、X、C'（與C反義互補）、Y。7. 根據權利要求5所述的一種新型基于拓撲異構酶的核酸納米網狀結構的制備方法， 其特征在于，長鏈DNA分子褪火成網的方法為，將使用紫外分光光度計依次檢測三條長鏈 DNA分子的產物濃度;依據長鏈DNA分子的物質的量比1: 1:1的比例，混合三個長鏈DNA分子； 加熱混合物至95°C恒溫20min，逐漸降溫降溫速度為每分鐘0.5攝氏度，降溫至37°C。8. 根據權利要求5所述的一種新型基于拓撲異構酶的核酸納米網狀結構的制備方法， 其特征在于，取DNA長鏈混合--加熱--降溫后的混合物25yL，加入DNA拓撲異構酶III 200U，37 °C孵育2h，處理DNA納米網狀結構，引入超螺旋。
【文檔編號】B82Y40/00GK105883714SQ201610254978
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月19日
【發明人】劉寅, 楊朔, 李超, 蘭文潔, 王世卿, 朱麟, 周冠舟, 劉晶劼, 劉子暖, 李慧宇, 于佳, 王雨蓉, 陳雙, 張文嘉
【申請人】南開大學