一種免疫磁珠的制備方法
【專利摘要】本發明公開一種免疫磁珠的制備方法，首先取冷凍干燥過的硅基磁珠分散到極性有機溶劑中超聲處理后，加入溶解于該極性有機溶劑中的分散劑，攪拌后，滴加溶解于該極性有機溶劑的帶有雙端羧基的有機小分子，滴加完畢后反應6~18h；反應結束后，磁分離出羧基磁珠，依次用無水乙醇及去離子水反復洗滌沉淀物數次至洗滌液pH值為6～7，超聲處理15～30min，分散在萬分之二NaN3水中，即得到羧基磁珠；羧基磁珠用MES緩沖液清洗至少一次，重懸羧基磁珠于MES緩沖液中，通過活化劑碳二亞胺將磁珠活化后，在MES緩沖液環境中偶聯抗體。本發明工藝流程簡單，操作簡便，適于批量化生產。
【專利說明】一種免疫磁珠的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于免疫學檢測【技術領域】，特別是涉及一種免疫磁珠的制備方法。
【背景技術】
[0002]目前，免疫檢測和免疫診斷使用的方法是使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。在測定時，把受檢標本(測定其中的抗原或抗體)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。但是，目前所用的固相載體存在問題有:批間差異不易控制，包被操作繁復，自動化程度不高，不適宜大批量樣本的操作。
[0003]免疫磁珠是由作為載體的磁性微球和免疫配基結合而成的納米級材料。磁性微球載體通常是帶有氨基、羧基、羥基或巰基等化學官能團的磁珠，該官能團與不同的免疫配基如活性蛋白、抗體、抗原、親和素、生物素等結合形成免疫磁珠。磁性微球載體具有超順磁性特點，可使免疫磁珠置于磁場時，顯示其磁性，從磁場移出時，磁性消除，免疫磁珠重新分散。
[0004]包被抗體的免疫磁珠作為固相載體，其上的抗體與相應抗原發生特異性結合形成抗原-抗體-磁珠復合物，這種復合物在磁場作用下，迅速向磁場移動，使復合物與其他物質分離，達到分離特異性抗原的目的，這種分離方法具有檢測速度快、特異性高、靈敏度高、重復性好等優點。免疫磁珠的磁分離方法還可借助親和素-生物素系統的生物放大作用進行更深入的應用。免疫磁珠的磁分離方法可重復性好，操作簡單，不需要昂貴的儀器設備，不影響被分離生物材料的生物學性狀和功能；并且由于磁珠特殊的性能，可以將免疫檢測實現自動化，用于大規模樣本的檢測，其反應動力學較傳統免疫檢測方法快，并且具有更大的固相結合表面。
[0005]納米Fe3O4由于制備簡單、穩定性高、較強的超順磁性、生物相容性和表面易于修飾等特點，成為目前應用最廣泛的磁珠材料之一。但是，由于納米Fe3O4的小尺寸效應、磁偶極子引力等作用，磁性納米粒子易于團聚，且化學穩定性不高易受氧化，表面羥基不足，導致其難以直接應用到生物領域。
【發明內容】
[0006]為解決上述問題，本發明的目的是提供一種免疫磁珠的制備方法，其工藝流程簡單，操作簡便，原料成本低，適宜于工業化大批量生產。
[0007]為實現上述發明目的，本發明采用如下技術方案:
一種免疫磁珠的制備方法，其包括以下步驟:
S1、羧基磁珠的制備
取冷凍干燥過的硅 基磁珠2~100 g分散到0.2^3L極性有機溶劑中超聲處理30~60min后，加入溶解于該極性有機溶劑中的分散劑10~100ml，分散劑濃度為10~50g/L，攪拌3(T60min后，滴加溶解于該極性有機溶劑的帶有雙端羧基的有機小分子30~500ml，帶有雙端羧基的有機小分子濃度為4~20g/L，控制滴加速度為0.1~0.5ml/min，體系溫度為60~80°C,滴加完畢后反應6~18h ;反應結束后,磁分離出羧基磁珠,依次用無水乙醇及去離子水反復洗滌沉淀物數次至洗滌液PH值為6~7，超聲處理15~30min，分散在萬分之二 NaN3水中，即得到羧基磁珠；
S2、免疫磁珠的制備
上述步驟SI中所得的羧基磁珠用MES緩沖液清洗至少一次，重懸(I~20)mg羧基磁珠于200 μ I MES緩沖液中，通過活化劑碳二亞胺將磁珠活化后，在MES緩沖液環境中偶聯抗體，羧基磁珠與活化劑碳二亞胺按照(4~10):1的體積比。
[0008]上述免疫磁珠的制備方法中，步驟SI中采用的硅基磁珠為本 申請人:的專利申請“一種核酸提取磁珠的制備方法及應用”(申請號:201410125272.4、申請日:2014年3月31日)中的硅基磁珠。此硅基磁珠為核殼結構，包括Fe3O4納米顆粒內核，SiO2外殼層，SiO2外殼層包覆在多個Fe3O4納米顆粒外表面；硅基磁珠經超聲分散處理Ih后，用納米激光粒度儀測得其二次粒徑為400nm~I μ m，飽和磁化強度為43.0~74.5emu/g。
[0009]此硅基磁珠的制備方法，其包括以下步驟:
(1)、Fe3O4納米顆粒的制備
分別配制濃度為0.1~lmol/L的Fe3+和Fe2+鹽溶液，按Fe3+與Fe2+物質的量的比為
1.5~2.0混合；上述混 合液攪拌均勻后，加入0.15mol/L的聚乙二醇-8000水溶液，聚乙二醇-8000體積為Fe鹽溶液總體積的1/10-?/5，通入氬氣除氧30 min，調整反應體系溫度60~70°C，再向混合液中滴加質量濃度為25%氨水至體系PH值為10~11，在溫度為70~80°C條件下反應3~6h，冷卻至室溫后，磁分離出黑色沉淀，依次用質量濃度為I %氨水、5%NaCl及去離子水反復洗滌沉淀物數次至洗滌液為中性，-10~-20°C冷凍干燥24~48h，得到超順磁性Fe3O4納米顆粒；
其中磁性納米Fe3O4粒子顆粒分散到超純水中經超聲分散處理Ih后，用納米激光粒度儀測得其二次粒徑為100~300nm，飽和磁化強度較高為57.4~79.4 emu/g ；
(2)、納米硅基磁珠的制備
將步驟SI中所得的超順磁性Fe3O4納米顆粒稱取2~500g分散到0.1~3L無水乙醇中超聲波處理30~60min后，加入20~1000ml濃度為10~50g/L的分散劑,攪拌均勻后，向混合液中加入質量濃度為25%氨水至體系PH值為10，再滴加0.25~500ml體積比為1:1的正硅酸四乙酯與乙醇混合溶液，控制滴加速度為0.1~0.5ml/min，體系溫度為30~50°C，滴加完畢后反應3~5h，磁分離出表面硅基修飾的Fe3O4納米顆粒，用去離子水反復洗滌數次至洗滌液PH值為6~7，超聲分散15~30min，分散在萬分之二 NaN3水中，即得到硅基包被磁珠。
[0010]進一步地，上述步驟(1)中采用的分散劑為乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸三鈉、十六烷基溴化銨、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或幾種混合。
[0011]此硅基磁珠，無外加磁場時，呈黑色懸浮液狀態，放置有永磁鐵時，核酸提取磁珠能夠與水快速分離。
[0012]上述免疫磁珠的制備方法中，步驟SI中采用的極性有機溶劑為四氫呋喃、N，N_ 二甲基甲酰胺、乙二胺、三乙胺、乙二醇及、丙三醇中的一種。
[0013]上述免疫磁珠的制備方法中，步驟SI中采用的分散劑為檸檬酸三鈉、十六烷基溴化銨、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇-1000、聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000中的一種。
[0014]上述免疫磁珠的制備方法中，步驟SI中采用的帶有雙端羧基的有機小分子為
I,4- 丁二酸、庚二酸、十二酸、丁二酸酐中的一種。
[0015]上述免疫磁珠的制備方法中，步驟S2的具體方法是:
S2-1、活化磁珠:取羧基磁珠于離心管中，震蕩30~60min ;將離心管放置于磁分離架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉；加入1ml PH 6.0的MES溶液洗滌羧基磁珠，重復洗滌一次；用100 μ L濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES重懸磁珠，再加入100 μ L濃度為IOmg/ml的碳二亞胺溶液，混勻，將磁珠在室溫條件下震蕩孵育30~60min，將磁珠活化；
S2-2、包被磁珠:用Iml濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES洗滌活化后的磁珠數次，將抗體加入500 μ I濃度為15mmol/L、PH 6.0 MES溶液中，混勻，在室溫條件下震蕩孵育24h，得到免疫磁珠；
S2-3、免疫磁珠活性檢測
取100 μ L濃度為10mg/ml的人IgG磁珠，用PBST洗滌三次，加入500 μ L按1:5000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育30min，用PBST洗滌四次，加入顯色液100 μ L，待顯色完全后加入50 μ L終止液終止反應，用酶標儀檢測試驗結果。
[0016]上述免疫磁珠的制備方法，其制得的羧基磁珠為核殼結構，包括Fe3O4納米顆粒內核，包覆在多個Fe3O4納米顆粒外表面的SiO2中間層，SiO2層外鍵合帶有雙端羧基的有機小分子；IOmg羧基磁珠分散在100mL無水乙醇中經超聲分散處理Ih后,用納米激光粒度儀測得其二次粒徑為500ηπm~.2 μ m，飽和磁化強度為41.0~77.4emu/g。
[0017]上述免疫磁珠的制備方法，其制得的羧基磁珠，無外加磁場時，呈黑色懸浮液狀態，放置有永磁鐵時，羧基磁珠能夠與水快速分離。
[0018]一種免疫磁珠的應用方法，免疫磁珠利用酶聯免疫吸附法進行病原檢測。
[0019]上述免疫磁珠應用于人體、動物、食品、化妝品、飼料和臨床樣本檢驗中。
[0020]由于采用如上所述的技術方案，本發明具有如下優越性:
本發明免疫磁珠的制備方法，其在硅基磁珠表面化學偶聯羧基小分子，工藝流程簡單，操作簡便，適于批量化生產；制得的羧基磁珠，飽和磁化強度較高為41.0~77.4emu/g，剩磁和矯頑力接近于零，能夠在較小的磁場作用下達到快速徹底的固液分離效果，當撤去外加磁場后又能很快到分散到溶液中；采用的硅基磁珠通過在Fe304納米顆粒外表面包覆Si02殼層，能很大程度地降低粒子的零電點和屏蔽磁偶極子的互相作用，使粒子具有良好的水溶性、化學穩定性及生物相容性，且Si02表面存在豐富的羥基，可使復合粒子容易進一步生物功能化；在極性有機溶劑條件下加入帶有雙端羧基的有機小分子，該分子一端羧基與娃基磁珠的表面鍵合，另一端裸露在外部，形成了羧基磁珠；羧基磁珠能夠與蛋白特異性結合，經驗證磁珠法酶聯免疫吸附實驗操作簡便，靈敏度高，背景值低。
[0021]本發明免疫磁珠的制備方法，其制得的免疫磁珠具有高的表面質量比，可以結合更多的抗體參加免疫 反應；免疫磁珠表面通過共價鍵結合抗體，較物理吸附更堅固；免疫磁珠由于粒徑很小，在溫育過程中，均勻分散在反應液中，近似于均相反應，反應迅速、高均一性；免疫磁珠超順磁性在后期洗滌分離過程中更利于全自動儀器應用。【具體實施方式】
[0022]參照以下實施例可以對本發明作進一步詳細說明；但是，以下實施例僅僅是例證，本發明并不局限于這些實施例。
[0023]實施例一
S1、娃基磁珠的制備
稱取無水三氯化鐵300g溶解于IL超純水中，稱取六水硫酸亞鐵銨392g溶解于IL超純水中，把兩種溶液轉入5L反應釜中200r/min攪拌30min后，稱取45g聚乙二醇-8000溶解于400ml超純水中轉入反應釜；通氬氣除氧30min，調整反應溫度為60°C，調整轉速為500r/min，向溶液中滴加25%氨水至體系pH值為11，升溫至80°C，調整轉速為IOOr/min條件下反應3h;反應完畢后冷卻至室溫，停止攪拌關閉氬氣，取出反應物，磁分離出黑色沉淀，依次用質量濃度為I %氨水、5%NaCl及去離子水反復洗滌沉淀物3次至洗滌液為中性，-10°C冷凍干燥48h，得到超順磁性Fe3O4納米顆粒；
稱取超順磁性Fe3O4納米顆粒IOOg分散到3L無水乙醇中，超聲處理30min后，加入IL濃度為50 g/L乙二胺四乙酸鈉的水溶液；200r/min攪拌30min后，向體系中加入質量濃度為25%氨水至體系pH值為10 ;再滴加體積比為1:1的正硅酸四乙酯與乙醇混合溶液30ml，控制滴加速度為0.5ml/min，體系溫度為50°C，滴加完畢后反應3h ;取出反應物，磁分離出表面硅基修飾的Fe3O4納米顆粒，用無水乙醇清洗3遍后，超純水反復洗滌數次至洗滌液pH值為7，超聲分散30min，分散在萬分之二 NaN3水中即得到硅基包被磁珠，將其固含量調整為 100mg/ml。
[0024]S2、羧基磁珠的制備
取冷凍干燥過的娃基磁珠2g分散到200ml四氫呋喃中超聲處理30min后,加入IOml濃度為20g/L的聚乙二醇-1000的四氫呋喃溶液，500r/min攪拌30min后，滴加溶解于四氫呋喃中的1，4-丁二酸溶液30ml其濃度為4g/L，控制滴加速度為0.lml/min，體系溫度為60°C,滴加完畢后反應6h ;反應結束后,磁分離用無水乙醇及去離子水依次洗滌數次至洗滌液PH值為6，超聲處理30min，分散在萬分之二 NaN3水中，調整其濃度為10mg/ml，即得到羧基磁珠；
S3、羧基磁珠偶聯人IgG
S3-1、活化磁珠:取Iml羧基磁珠于離心管中，在樣品混合儀上震蕩30min ;將離心管放置于磁分離架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉；加入Iml PH 6.0的MES溶液洗滌羧基磁珠，重復洗滌一次；用100 μ L濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES重懸磁珠，再加入100 μ L濃度為10mg/ml的碳二亞胺溶液，混勻，將磁珠在室溫條件下震蕩孵育30?60min，將磁珠活化；
S3-2、包被磁珠:用Iml濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES洗滌活化后的磁珠2遍，將400μ g人IgG加入500μ I濃度為15mmol/L、PH 6.0 MES溶液中，混勻，在室溫條件下震蕩孵育24h，制成人IgG免疫磁珠；
S3-3、免疫磁珠活性檢測
取100 μ L濃度為10mg/ml的人IgG磁珠，用I3BST洗滌三次，加入500 μ L按1:5000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育30min，用PBST洗滌四次，加入顯色液100 μ L，待顯色完全后加入50 μ L終止液終止反應，用酶標儀檢測試驗結果。
[0025]實施例二
51、娃基磁珠的制備
與實施例一中步驟Si相同；
52、羧基磁珠的制備
取冷凍干燥過的硅基磁珠10 g分散到700ml N，N-二甲基甲酰胺溶液中超聲處理60min后，加入20ml濃度為50g/L的檸檬酸三鈉的N，N- 二甲基甲酰胺溶液，500r/min攪拌30min后，滴加溶解于N，N-二甲基甲酰胺中的順丁烯二酸溶液IOOml其濃度為10g/L，控制滴加速度為0.5ml/min,體系溫度為60°C,滴加完畢后反應IOh ;反應結束后,磁分離用無水乙醇及去離子水依次洗滌數次至洗滌液PH值為6，超聲處理30min，分散在萬分之二 NaN3水中，調整其濃度為10mg/ml，即得到羧基磁珠；
53、羧基磁珠偶聯甲胎蛋白
S3-1、活化磁珠:取Iml羧基磁珠于離心管中，在樣品混合儀上震蕩30min ;將離心管放置于磁分離架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉；加入Iml PH 6.0的MES溶液洗滌羧基磁珠，重復洗滌一次；用100 μ L濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES重懸磁珠，再加入100 μ L濃度為10mg/ml的碳二亞胺溶液，混勻，將磁珠在室溫條件下震蕩孵育30?60min，將磁珠活化；
S3-2、包被磁珠:用Iml濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES洗滌活化后的磁珠2遍，將400 Ug甲胎蛋白加入500 μ I濃度為15mmol/L、PH 6.0 MES溶液中，混勻，在室溫條件下震蕩孵育24h，得到免疫磁珠；用PBS洗滌3次，磁分離，將共價鍵結合配體的磁珠分散于PBS中，4 C保存備用；
S3-3、免疫磁珠活性檢測
取100 μ L濃度為10mg/ml的免疫磁珠，用PBST洗滌三次，加入500 μ L按1:5000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育30min，用PBST洗滌四次，加入顯色液100 μ L，待顯色完全后加入50 μ L終止液終止反應，用酶標儀檢測試驗結果。
[0026]實施例三
51、娃基磁珠的制備
與實施例一中步驟Si相同；
52、羧基磁珠的制備
取冷凍干燥過的硅基磁珠100 g分散到3L N, N- 二甲基甲酰胺溶液中超聲處理60min后，加入IOOml濃度為50g/L的檸檬酸三鈉的N，N-二甲基甲酰胺溶液，500r/min攪拌30min后，滴加溶解于N，N-二甲基甲酰胺中的順丁烯二酸溶液500ml其濃度為5g/L，控制滴加速度為0.5ml/min,體系溫度為60°C,滴加完畢后反應18h ;反應結束后,磁分離用無水乙醇及去離子水依次洗滌數次至洗滌液PH值為6，超聲處理30min，分散在萬分之二 NaN3水中，調整其濃度為10mg/ml，即得到羧基磁珠；
53、羧基磁珠偶聯甲肝抗原
S3-1、活化磁珠:取Iml羧基磁珠于離心管中，在樣品混合儀上震蕩30min ;將離心管放置于磁分離架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉；加入Iml PH 6.0的MES溶液洗滌羧基磁珠，重復洗滌一次；用100 μ L濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES重懸磁珠，再加入100 μ L濃度為10mg/ml的碳二亞胺溶液，混勻，將磁珠在室溫條件下震蕩孵育30~60min，
將磁珠活化；
S3-2、包被磁珠:用Iml濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES洗滌活化后的磁珠2遍，將400 Ug甲肝抗原加入500μ I濃度為15mmol/L、PH 6.0 MES溶液中，混勻，在室溫條件下震蕩孵育24h，得到免疫磁珠；
S3-3、免疫磁珠活性檢測
取100 μ L濃度為10mg/ml的免疫磁珠，用PBST洗滌三次，加入500 μ L按1:5000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育30min，用PBST洗滌四次，加入顯色液100 μ L，待顯色完全后加入50 μ L終止液終止反應，用酶標儀檢測試驗結果。
[0027]免疫磁珠活性檢測結果:
【權利要求】
1.一種免疫磁珠的制備方法，其特征是:其包括以下步驟: 51、羧基磁珠的制備 取冷凍干燥過的硅基磁珠2~100 g分散到0.2^3L極性有機溶劑中超聲處理30~60min后，加入溶解于該極性有機溶劑中的分散劑10~100ml，分散劑濃度為10~50g/L，攪拌3(T60min后，滴加溶解于該極性有機溶劑的帶有雙端羧基的有機小分子30~500ml，帶有雙端羧基的有機小分子濃度為4~20g/L，控制滴加速度為0.1~0.5ml/min，體系溫度為60~80°C,滴加完畢后反應6~18h ;反應結束后,磁分離出羧基磁珠,依次用無水乙醇及去離子水反復洗滌沉淀物數次至洗滌液PH值為6~7，超聲處理15~30min，分散在萬分之二 NaN3水中，即得到羧基磁珠； 52、免疫磁珠的制備 上述步驟SI中所得的羧基磁珠用MES緩沖液清洗至少一次，重懸(I~20)mg羧基磁珠于200 μ I MES緩沖液中，通過活化劑碳二亞胺將磁珠活化后，在MES緩沖液環境中偶聯抗體，羧基磁珠與活化劑碳二亞胺按照(4~10):1的體積比。
2.根據權利要求1所述的免疫磁珠的制備方法，其特征是:步驟SI中采用的硅基磁珠為核殼結構，包括F e3O4納米顆粒內核，SiO2外殼層，SiO2外殼層包覆在多個Fe3O4納米顆粒外表面；硅基磁珠經超聲分散處理Ih后，用納米激光粒度儀測得其二次粒徑為400nm~I μ m,飽和磁化強度為43.0~74.5emu/g。
3.根據權利要求2所述的免疫磁珠的制備方法，其特征是:硅基磁珠的制備方法，其包括以下步驟: (1)、Fe3O4納米顆粒的制備 分別配制濃度為0.1~lmol/L的Fe3+和Fe2+鹽溶液，按Fe3+與Fe2+物質的量的比為1.5~2.0混合；上述混合液攪拌均勻后，加入0.15mol/L的聚乙二醇-8000水溶液，聚乙二醇-8000體積為Fe鹽溶液總體積的1/10-?/5，通入氬氣除氧30 min，調整反應體系溫度60~70°C，再向混合液中滴加質量濃度為25%氨水至體系PH值為10~11，在溫度為70~80°C條件下反應3~6h，冷卻至室溫后，磁分離出黑色沉淀，依次用質量濃度為I %氨水、5%NaCl及去離子水反復洗滌沉淀物數次至洗滌液為中性，-10~-20°C冷凍干燥24~48h，得到超順磁性Fe3O4納米顆粒； 其中磁性納米Fe3O4粒子顆粒分散到超純水中經超聲分散處理Ih后，用納米激光粒度儀測得其二次粒徑為100~300nm，飽和磁化強度較高為57.4~79.4 emu/g ； (2)、納米硅基磁珠的制備 將步驟SI中所得的超順磁性Fe3O4納米顆粒稱取2~500g分散到0.1~3L無水乙醇中超聲波處理30~60min后，加入20~1000ml濃度為10~50g/L的分散劑,攪拌均勻后，向混合液中加入質量濃度為25%氨水至體系PH值為10，再滴加0.25~500ml體積比為1:1的正硅酸四乙酯與乙醇混合溶液，控制滴加速度為0.1~0.5ml/min，體系溫度為30~50°C，滴加完畢后反應3~5h，磁分離出表面硅基修飾的Fe3O4納米顆粒，用去離子水反復洗滌數次至洗滌液PH值為6~7，超聲分散15~30min，分散在萬分之二 NaN3水中，即得到硅基包被磁珠。
4.根據權利要求1所述的免疫磁珠的制備方法，其特征是:步驟SI中采用的極性有機溶劑為四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、乙二胺、三乙胺、乙二醇及、丙三醇中的一種。
5.根據權利要求1所述的免疫磁珠的制備方法，其特征是:步驟SI中采用的分散劑為檸檬酸三鈉、十六烷基溴化銨、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇-1000、聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000中的一種。
6.根據權利要求1所述的免疫磁珠的制備方法，其特征是:步驟SI中采用的帶有雙端羧基的有機小分子為1，4- 丁二酸、庚二酸、十二酸、丁二酸酐中的一種。
7.根據權利要求1所述的免疫磁珠的制備方法，其特征是:步驟S2的具體方法是: S2-1、活化磁珠:取羧基磁珠于離心管中，震蕩30~60min ;將離心管放置于磁分離架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉；加入1ml PH 6.0的MES溶液洗滌羧基磁珠，重復洗滌一次；用100 μ L濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES重懸磁珠，再加入100 μ L濃度為IOmg/ml的碳二亞胺溶液，混勻，將磁珠在室溫條件下震蕩孵育30~60min，將磁珠活化； S2-2、包被磁珠:用Iml濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES洗滌活化后的磁珠數次，將抗體加入500 μ I濃度為15mmol/L、PH 6.0 MES溶液中，混勻，在室溫條件下震蕩孵育24h，得到免疫磁珠； S2-3、免疫磁珠活性檢測 取100 μ L濃度為10mg/ml的人IgG磁珠，用PBST洗滌三次，加入500 μ L按1:5000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育30min，用PBST洗滌四次，加入顯色液100 μ L，待顯色完全后加入50 μ L終止液終止反應，用酶標儀檢測試驗結果。
8.根據權利要求1所述的免疫磁珠的制備方法，其特征是:其制得的羧基磁珠為核殼結構，包括Fe3O4納米顆粒內核，包覆在多個Fe3O4納米顆粒外表面的SiO2中間層，SiO2層外鍵合帶有雙端羧基的有機小分子；10mg羧基磁珠分散在100mL無水乙醇中經超聲分散處理Ih后，用納米激光粒度儀測得其二次粒徑為500ηm~1.2 μ m,飽和磁化強度為41.0~77.4emu/g。
9.一種權利要求1~8中任一權利要求所述的方法制得的免疫磁珠的應用方法，其特征是:免疫磁珠利用酶聯免疫吸附法進行病原檢測。
10.一種權利要求1~8中任一權利要求所述的方法制得的免疫磁珠應用于人體、動物、食品、化妝品、詞料和臨床樣本檢驗中。
【文檔編號】B82Y30/00GK103926398SQ201410181299
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月30日 優先權日:2014年4月30日
【發明者】杜德光, 高祥輝, 姜夏, 馬睿 申請人:洛陽惠爾納米科技有限公司