專利名稱：一種具有光熱及熒光增強雙功能的金納米星@量子點復合型細胞探針及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及復合納米探針技術領域，具體涉及一種具有光熱及熒光增強雙功能的金納米星O量子點復合型細胞探針及其制備方法和應用。
背景技術：
光熱材料是一種能吸收某種光，尤其是近紅外光(因為它的波長范圍賦予了它的獨特光學安全性質，可透過人體皮膚和深組織，是病灶部位的天窗)。通過等離子體共振或者能量躍遷帶產生的熱、從而在局部導致高溫，并最終殺死腫瘤細胞的納米功能材料。光熱轉化功能材料由于能將近紅外光轉換成高熱而倍受青睞，在生物應用上成為研究熱點。各種金納米構型(金納米棒、金納米球殼、金納米籠等)光熱探針使用最為廣泛，這是因為相比于其它金屬，金顆粒對腫瘤組織有著更好的生物相容性，更重要的是容易在近紅外波段產生等離激元增強效應。另一方面，熒光量子點示蹤在細胞顯像、化學識別和細胞轉移監測及傳感等領域得到了廣泛的應用，并成為成功實現上述功能的一種主要的技術手段。然而量子點探針在制備過程中熒光強度會受到周圍介質的影響而降低，因此一種具有增強量子點熒光效應的探針的制備就迫在眉睫。
發明內容
為了實現高的光熱轉換效率，實現對量子點的熒光增強，本發明的目的是提供一種具有光熱及熒光增強雙功能的金納米星@量子點復合型細胞探針。
本發明的另一目的是提供一種制備具有光熱及熒光增強雙功能的金納米星@量子點復合型細胞探針的方法。本發明的還一目的是提供所述復合型細胞探針在生物靶向中的應用。為了實現本發明的目的，本發明提供了以下技術方案:一種復合型細胞探針，其由內至外依次包括金納米星、二氧化硅層、量子點和二氧化硅納米殼層；其是采用化學逐層生長方法(Layer-By-Layer)制備的:首先利用籽晶生長方法制備金納米星；接著利用水解的方式在金納米星外包裹二氧化硅層，形成包裹有金納米星的二氧化硅球；然后通過交聯反應將量子點鏈接在二氧化硅球表面，形成內包裹有金納米星、外鏈接有量子點的二氧化硅球復合材料；最后在復合材料表面再包裹一層二氧化硅納米殼層，得所述復合型細胞探針。優選的，所述復合型細胞探針還包括對二氧化硅納米殼層表面進行交聯劑的修飾。進一步地，本發明提供了一種制備所述復合型細胞探針的方法，具體包括以下步驟:(I)金納米星的制備:使用還原劑還原氯金酸的方式得到金籽晶溶液，通過控制加入氯金酸、還原劑的量以及還原劑的種類來控制得到不同尺寸的球形金籽晶；向所得金籽晶溶液中加入氯金酸和生長抑制劑得金納米星，通過改變加入的生長抑制劑量、氯金酸量及金籽晶量，來得到不同尖角數量和尺寸的金納米星；(2)金納米星@量子點復合材料的制備:先將步驟(I)所得金納米星溶解在乙醇和水的混合液中，隨后向混合體系中加入氨水，然后將正硅酸四乙酯滴加到反應溶液中進行二氧化硅球殼對金納米星的包覆，反應24小時后進行離心洗滌，形成包裹有金納米星的二氧化硅球溶膠；用修飾劑修飾所得二氧化硅球，然后將MPA穩定水溶性熒光量子點加入到修飾過的二氧化硅球溶膠中，使其反應24小時，然后離心并分散在乙醇中，得金納米星@量子點復合材料乙醇溶液；(3)金納米星@量子點復合探針的制備向步驟(2)中制備好的復合材料中加入氨水和正硅酸四乙酯，室溫下攪拌反應24小時，反應結束后進行硅烷偶聯劑的修飾，使其表面帶有各種修飾基團，最終得所述復合型細胞探針。優選的，步驟(I)中所述還原劑與氯金酸的體積比為(1-10):(0.1-5);其中，所述氯金酸濃度為I毫摩爾/升，還原劑質量分數為1% ;所述還原劑為檸檬酸鈉、硼氫化鈉、抗壞血酸、或四羥甲基氯化磷。優選的，步驟(I)中所述還原反應中加熱的溫度為25-100度；反應時間為5-400分鐘。優選的，步驟(I)中所述金`籽晶溶液與氯金酸和生長抑制劑的體積比為(10-5000): (5 X IO3-1OO X103):( 20-4000);其中，所述生長抑制劑優選為硝酸銀，其濃度是
2摩爾/升；所述氯金酸濃度為I毫摩爾/升。優選的，步驟(2)中所述金納米星與氨水和正硅酸四乙酯的體積比為4:(100-20000):(1-40000)。優選的，步驟(2)所述修飾劑為3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS)或氨丙基三乙氧基硅烷；所述修飾劑用量可以適當多點，后來多余的通過洗滌就洗去了，一般在全部制備好的顆粒時加入200-3000微升。優選的，所述熒光量子點為CdTeS、CdTe、CdSe、Mn-doped ZnS、CdS 或 CdTe/CdS/ZnS。優選的，所述娃燒偶聯劑為乙稀基娃燒偶聯劑、氣基娃燒偶聯劑、環氧基娃燒偶聯齊L1、甲基丙稀酸氧基娃燒偶聯劑、疏基娃燒偶聯劑或服基娃燒偶聯劑。所述娃燒偶聯劑的用量應適當多加，后來多余的洗掉，一般在全部制備好的顆粒時加入150-4000微升，優選為200-300 微升。更進一步地，本發明提供了所述復合型細胞探針在生物靶向中的應用。具體為將多種生物分子連接在該復合型細胞探針表面各種修飾基團上，以完成靶向標記的作用。所述生物分子優選為抗體、鏈霉親和素、DNA片段、生物配體、陽離子多肽等。本發明的積極效果如下:相對于傳統的探針，此探針是集光熱治療與熒光標記于一身的探針，可以有效的定向殺死癌細胞，同時量子點的熒光強度得到增強，金納米星和量子點的生物毒性被有效的避免了，另外還具有非常好的生物相容性。具體如下:(I)本發明的復合探針首次將金納米星納入到該復合探針中，使該復合探針具有了光熱轉換的功能；(2)在復合納米探針中，熒光量子點可以實現對細胞的熒光靶向標記，同時由于金納米星具有局域等離激元(LSP)效應，實現了對量子點的熒光增強；(3)相對于傳統的光熱探針和量子點熒光探針，由于金屬或半導體材料直接裸露在探針表面不可避免的產生生物毒性。我們通過二氧化硅的包覆作用可以有效地避免生物毒性，同時二氧化硅表面可以鏈接多種交聯劑，以提高與生物分子的相容性。
圖1金納米星@量子點突光/光熱復合型探針的應用示意圖；圖2金納米星@量子點的復合探針；圖3復合探針的吸收光譜；圖4復合探針納米星探針及對照組(水溶液)的升溫曲線(808nm激發光功率密度:2ff/cm2)；圖5金納米星對乳腺癌細胞的光熱療效(細胞中間黑的小泡為死細胞)；圖6金納米星@量子點復合探針的熒光與相同量子點熒光對比圖。
具體實施例方式下面結合附圖及其具體實施方式
詳細介紹本發明。但本發明的保護方位并不局限于以下實例，應包含權利要求書中的全部內容。I化學藥品:氯金酸，檸檬酸三鈉，正硅酸四乙酯(TE0S)，氨水，無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司。3-巰丙基三甲氧基硅烷(MPTMS，sigma)，3-氨丙基三甲氧基硅氧燒(APTMS, sigma)、CdTeS 量子點制備按照文獻[Weiyong Mao, Jia Guo, WuliYang,Changchun Wang,Jia He and Jiyao Chen Synthesis of high-qualitynear-1nfrared-emitting CdTeS alloyed quantum dots via the hydrothermal method.Nanotechnology, 200718485611]。2操作程序如下(I)金納米星的制備:將1-1Oml的ImM的HAuCl4溶液煮沸后，往其中加入0.l_5ml的質量分數為1%的檸檬酸鈉(或者硼氫化鈉、抗壞血酸、四羥甲基氯化磷)溶液，加熱(溫度為25-100度)反應5-400分鐘得到尺寸在5-200nm金籽晶溶液；向5-100mL的ImM的HAuCl4 (混有50uL HCl溶液)中加入10-5000uL上述金籽晶溶液后攪拌5分鐘，然后加入20-4000uL的2M的AgNO3溶液攪拌30s，離心后備用；制備的金納米星尺寸在20-400nm可調；(2)金納米星@量子點復合材料的制備:將制備好的金納米星4mL溶解在乙醇和水的混合液中(優選的，所述乙醇和水的混合液的量以能溶解金納米星為準，其中所述乙醇:水的體積比優選為4:1 )，加入
0.l-20mL氨水，然后將1-40000UL的正硅酸四乙酯(TEOS)滴加到反應溶液中進行二氧化硅球殼對金納米星的包覆，反應24小時后進行離心洗滌；然后將100-3000uL的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS)或氨丙基三乙氧基硅烷對硅球表面進行修飾，然后將0.l-30mL的I摩爾 / 升 MPA 穩定水溶性熒光量子點(CdTeS、CdTe、CdSe、Mn-doped ZnS、CdS 或 CdTe/CdS/ZnS)加入到修飾過的二氧化硅溶膠中，使其反應24小時，然后離心并分散在乙醇中(所述乙醇用量以能溶解上述二氧化硅溶膠為準);(3)金納米星@量子點復合探針的制備:向(2)中制備好的全部復合材料中加入0.1-1Oml氨水和20-2000微升的TE0S，室溫下攪拌反應24小時，反應結束后使用各種硅烷偶聯劑(乙烯基硅烷偶聯劑、氨基硅烷偶聯劑、環氧基娃燒偶聯劑、甲基丙稀酸氧基娃燒偶聯劑、疏基娃燒偶聯劑或服基娃燒偶聯劑)，使其表面帶有各種基團，然后可以連接多種生物分子(如抗體、鏈霉親和素、DNA片段、生物配體、陽離子多肽等)。以下對優選實施方式作具體闡釋:實施例1:(I)將4mL的ImM的HAuC14溶液煮沸后，往其中加入0.7mL的質量分數為1%的檸檬酸鈉溶液，加熱80度，反應15min后得到金籽晶溶液。向IOmL的ImM的HAuCl4 (混有50uL HCl溶液)中加入IOOuL金籽晶溶液后攪拌5分鐘，然后加入IOOuL的2M的AgNO3溶液攪拌30s，離心后備用。(2)將制備好的金納米星4mL溶解在乙醇和水的混合液中(優選的，所述乙醇和水的混合液的量以能溶解金納米星為準，其中所述乙醇:水的體積比優選為4:1)，加入2mL氨水，然后將300uL的正硅酸四乙酯(TEOS)滴加到反應溶液中進行二氧化硅球殼對金納米星的包覆，反應24小時后進行離心洗滌；然后將300uL的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS)對硅球表面進行修飾，然后將3mL 的I摩爾/升MPA穩定水溶性熒光CdTeS量子點加入到修飾過的二氧化硅溶膠中，使其反應24小時，然后離心并分散在乙醇中。(3)向(2)中制備好的全部復合材料中加入2mL氨水和500微升的TE0S，反應24小時后，使用300uL的MPTMS進行修飾使其表面帶有巰基集團，然后可以連接多種生物分子(如抗體、鏈霉親和素、DNA片段、生物配體、陽離子多肽等)。實施例2:(I)將4mL的ImM的HAuCl4溶液煮沸后，往其中加入1.0mLl%的檸檬酸鈉溶液，60度反應15min后得到金籽晶溶液。向IOmL的ImM的HAuCl4 (混有50uL HCl溶液)中加入200uL金籽晶溶液后攪拌5分鐘，然后加入100uL2M的的AgNO3溶液攪拌30s，離心后備用。(2)將制備好的金納米星4mL溶解在乙醇和水的混合液中(優選的，所述乙醇和水的混合液的量以能溶解金納米星為準，其中所述乙醇:水的體積比優選為4:1)，加入2mL氨水，然后將600uL的正硅酸四乙酯(TEOS)滴加到反應溶液中進行二氧化硅球殼對金納米星的包覆，反應24小時后進行離心洗滌；然后將600uL的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS)對硅球表面進行修飾，然后將3mL的I摩爾/升MPA穩定水溶性熒光CdTeS量子點加入到修飾過的二氧化硅溶膠中，使其反應24小時，然后離心并分散在乙醇中。(3)向(2)中制備好的全部復合材料中加入ImL氨水和200微升的TE0S，反應24小時后，使用300uL的MPTMS進行修飾使其表面帶有巰基集團，然后可以連接多種生物分子(如抗體、鏈霉親和素、DNA片段、生物配體、陽離子多肽等)。
實施例3:(I)將3mL的ImM的HAuCl4溶液煮沸后，往其中加入1.0mL的1%的硼氫化鈉溶液，加熱40度反應15min后得到金籽晶溶液。向IOmL的ImM的HAuCl4 (混有50uL HCl溶液)中加入15000uL金籽晶溶液后攪拌5分鐘，然后加入50uL2M的AgNO3溶液攪拌30s，離心后備用。(2)將制備好的金納米星4mL溶解在乙醇和水的混合液中(優選的，所述乙醇和水的混合液的量以能溶解金納米星為準，其中所述乙醇:水的體積比優選為4:1)，加入2mL氨水，然后將400uL的正硅酸四乙酯(TEOS)滴加到反應溶液中進行二氧化硅球殼對金納米星的包覆，反應24小時后進行離心洗滌；然后將IOOuL的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS)對硅球表面進行修飾，然后將6mL的I摩爾/升MPA穩定水溶性熒光CdTeS量子點加入到修飾過的二氧化硅溶膠中，使其反應24小時，然后離心并分散在乙醇中。(3)向(2)中制備好的全部復合材料中加入4mL氨水和200微升的TE0S，反應24小時后，使用IOOOuL的MPTMS進行修飾使其表面帶有巰基集團，然后可以連接多種生物分子(如抗體、鏈霉親和素、DNA片段、生物配體、陽離子多肽等)。實施例4:(I)將6mLlmM的的HAuCl4溶液煮沸后，往其中加入0.4mLl%的四羥甲基氯化磷溶液，加熱100度反應15min后得到金籽晶溶液。向IOmL的ImM的HAuCl4C^有50uL HCl溶液)中加入500uL金籽晶溶液后攪拌5分鐘，然后加入400uL的2M的AgNO3溶液攪拌30s，離心后備用。(2)將制備好的金納米星4mL溶解在乙醇和水的混合液中(優選的，所述乙醇和水的混合液的量以能溶解金納米星為準，其中所述乙醇:水的體積比優選為4:1)，加入2mL氨水，然后將300uL的正硅酸四乙酯(TEOS)滴 加到反應溶液中進行二氧化硅球殼對金納米星的包覆，反應24小時后進行離心洗滌；然后將400uL的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS)對硅球表面進行修飾，然后將3mL的I摩爾/升MPA穩定水溶性熒光CdTeS量子點加入到修飾過的二氧化硅溶膠中，使其反應24小時，然后離心并分散在乙醇中。(3)向(2)中制備好的復合材料中加入1.5mL氨水和400微升的TE0S，反應24小時后，使用150uL的MPTMS進行修飾使其表面帶有巰基集團，然后可以連接多種生物分子(如抗體、鏈霉親和素、DNA片段、生物配體、陽離子多肽等)。實施例5:(I)將4mL的ImM的HAuCl4溶液煮沸后，往其中加入0.3mLl%的檸檬酸鈉溶液，加熱50度反應15min后得到金籽晶溶液。向IOmLlmM的HAuCl4 (混有50uL HCl溶液)中加入200uL金籽晶溶液后攪拌5分鐘，然后加入300uL2M的AgNO3溶液攪拌30s，離心后備用。(2)將制備好的金納米星4mL溶解在乙醇和水的混合液中(優選的，所述乙醇和水的混合液的量以能溶解金納米星為準，其中所述乙醇:水的體積比優選為4:1)，加入2mL氨水，然后將50uL的正硅酸四乙酯(TEOS)滴加到反應溶液中進行二氧化硅球殼對金納米星的包覆，反應24小時后進行離心洗滌；然后將600uL的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS)對硅球表面進行修飾，然后將0.7mL的I摩爾/升MPA穩定水溶性熒光CdTeS量子點加入到修飾過的二氧化硅溶膠中，使其反應24小時，然后離心并分散在乙醇中。(3)向(2)中制備好的復合材料中加入6mL氨水和5000微升的TEOS，反應24小時后，使用4000uL的MPTMS進行修飾使其表面帶有巰基集團，然后可以連接多種生物分子(如抗體、鏈霉親和素、DNA片段、生物配體、陽離子多肽等)。應用例I將100微升的抗體anti_CK19 (細胞角蛋白抗體，北京博奧森生物技術有限公司)的加入到實施例1納米探針中，在37度的恒溫恒濕箱中培養一晚上后離心分離在磷酸鹽緩沖液(PBS，PH=7.4)中。將100微升制備好的探針-抗體加入到細胞中進行培養4小時，然后進行激光照射10分鐘(波長8.8nm,功率2w/cm2)后在顯微鏡下觀察凋亡情況。復合探針結果如圖1所示，中心是金納米星，中間圓點是CdTeS量子點，最外層是用巰基修飾的二氧化硅層。制備好的復合探針的投射電子顯微鏡圖像如圖2所示，圖3為復合探針的吸收光譜，從吸收光譜上可以看到探針在800納米具有非常好的吸收性質可以用來進行光熱轉換，另外在500nm也有一個小的吸收峰可以用來進行增強熒光。圖4為水溶液(4a)和探針溶液(4b)在808納米激光照射下溫度隨時間的變化關系，可以看到復合探針在相同的時間內升溫遠遠超出水溶液，證明我們復合探針具有非常好的光熱效果。圖5為復合探針對小鼠的乳腺癌細胞的光熱療效，圖中圓鼓鼓的飄在表面的是死細胞，在培養基底部靠在一起的是活細胞，通過圖中可以看到在用808nm激光照射5分鐘后99%細胞已經凋亡。圖6是熒光量子點在水溶液中(6a)和在復合探針中(6b)的的熒光對比圖，可以看到在復合探針中熒光增強增強了 27% (由于金屬的局域表面等離子增強效應)，峰位發生9nm的紅移(由于在探針中量子點周圍的介電常數增大)。以上對本發明的描述是說明性的，而非限制性的，本專業技術人員理解，在權利要求限定的精神與范圍之內可對其進行許多修改、變化或等效，但是它們都將落入本發明的保護范 圍內。
權利要求
1.一種具有光熱及熒光增強雙功能的金納米星O量子點復合型細胞探針，其特征在于，其由內至外依次包括金納米星、二氧化硅層、量子點和二氧化硅納米殼層；其是采用化學逐層生長方法制備的:首先利用籽晶生長方法制備金納米星；接著利用水解的方式在金納米星外包裹二氧化硅層，形成包裹有金納米星的二氧化硅球；然后通過交聯反應將量子點鏈接在二氧化硅球表面，形成內包裹有金納米星、外鏈接有量子點的二氧化硅球復合材料；最后在復合材料表面再包裹一層二氧化硅納米殼層，得所述復合型細胞探針。
2.根據權利要求1所述的復合型細胞探針，其特征在于，所述復合型細胞探針還包括對二氧化硅納米殼層表面進行交聯劑的修飾。
3.一種制備權利要求1或2所述復合型細胞探針的方法，具體包括以下步驟: (1)金納米星的制備: 使用還原劑還原氯金酸的方式得到金籽晶溶液，通過控制加入氯金酸、還原劑的量以及還原劑的種類來控制得到不同尺寸的球形金籽晶； 向所得金籽晶溶液中加入氯金酸和生長抑制劑得金納米星，通過改變加入的生長抑制劑量、氯金酸量及金籽晶量，來得到不同尖角數量和尺寸的金納米星； (2)金納米星@量子點復合材料的制備: 先將步驟(I)所得金納米星溶解在乙醇和水的混合液中，隨后向混合體系中加入氨水，然后將正硅酸四乙酯滴加到反應溶液中進行二氧化硅球殼對金納米星的包覆，反應24小時后進行離心洗滌，形成包裹有金納米星的二氧化硅球溶膠； 用修飾劑修飾所得二氧化硅球，然后將MPA穩定水溶性熒光量子點加入到修飾過的二氧化硅球溶膠中，使其反應24小時，然后離心并分散在乙醇中，得金納米星@量子點復合材料乙醇溶液； (3)金納米星@量子點復合探針的制備 向步驟(2)中制備好的復合材料中加入氨水和正硅酸四乙酯，室溫下攪拌反應24小時，反應結束后進行硅烷偶聯劑的修飾，使其表面帶有各種修飾基團，最終得所述復合型細胞探針。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述還原劑與氯金酸的體積比為(1-10):(0.1-5)，其中，所述氯金酸濃度為I毫摩爾/升，還原劑質量分數為1%;所述還原劑為檸檬酸鈉、硼氫化鈉、抗壞血酸、或四羥甲基氯化磷；所述還原反應中加熱的溫度為25-100度，反應時間為5-400分鐘。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述金籽晶溶液與氯金酸和生長抑制劑的體積比為(10-5000):(5X IO3-1OOX IO3):(20-4000);其中，所述生長抑制劑的濃度是2摩爾/升；所述氯金酸濃度為I毫摩爾/升。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述金納米星與氨水和正硅酸四乙酯的體積比為 4:(100-20000): (1-40000)。
7.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述修飾劑為3-氨丙基三甲氧基硅氧烷或氨丙基三乙氧基硅烷；所述修飾劑用量可以適當多點，后來多余的通過洗滌就洗去了，一般在全部制備 好的顆粒時加入200-3000uL微升。
8.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述熒光量子點為CdTeS、CdTe,CdSe,Μη-doped ZnS,CdS 或 CdTe/CdS/ZnS。
9.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述硅烷偶聯劑為乙烯基硅烷偶聯劑、氨基娃燒偶聯劑、環氧基娃燒偶聯劑、甲基丙稀酸氧基娃燒偶聯劑、疏基娃燒偶聯劑或服基娃燒偶聯劑。
10.權利要求1所 述復合型細胞探針在生物靶向中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種具有光熱及熒光增強雙功能的金納米星@量子點復合型細胞探針，其由內至外依次包括金納米星、二氧化硅層、量子點和二氧化硅納米殼層；其是采用化學逐層生長方法制備的首先利用籽晶生長方法制備金納米星；接著利用水解的方式在金納米星外包裹二氧化硅層，形成包裹有金納米星的二氧化硅球；然后通過交聯反應將量子點鏈接在二氧化硅球表面，形成內包裹有金納米星、外鏈接有量子點的二氧化硅球復合材料；最后在復合材料表面再包裹一層二氧化硅納米殼層。相對于傳統的探針，此探針是集光熱治療與熒光標記于一身的探針，同時量子點的熒光強度得到增強，金納米星和量子點的生物毒性被有效的避免了，另外還具有非常好的生物相容性。
文檔編號B82Y30/00GK103205258SQ20131011703
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月7日 優先權日2013年4月7日
發明者尹乃強, 朱立新, 許小亮 申請人:中國科學技術大學