專利名稱：基于聚合酶鏈反應的金-銀核殼結構二聚體的手性研究的方法
技術領域：
一種基于聚合酶鏈反應的金-銀核殼結構二聚體的手性研究的方法，屬于材料化學領域。
背景技術：
納米材料的自組裝是納米技術的一個研究熱點，原因在于自組裝納米材料能夠表現出不同于單分散的納米粒子的獨特的光學，電學，磁學和化學性質，通過研究自組裝材料的性質可以更好地理解宏觀材料的物理和化學性質。聚合酶鏈反應(Polymerase ChainReaction)，是分子生物學中應用的基礎實驗手段，是上世紀80年代中期發展起來的一種體外特定核酸序列擴增技術。它具有特異性強、擴增效率高、快速、簡便、重復性好、易實現自動化等優點。納米技術與生物技術相結合產生的納米生物技術憑借其獨特的性質得到了廣泛的研究發展，被越來越多的科研人士所青睞。而金納米粒子，由于其獨特的物理、化學性質及生物相容性，在生物電化學、材料學及生物醫學等領域都有很廣泛的應用。將納米材料結合到PCR過程中·已成為近年來的研究熱點，對于提高PCR的特異性和效率和組裝結構手性性質的研究有很大的作用。本發明首先合成了具有不同銀殼厚度的金-銀核殼納米粒子，首次通過PCR方法進行了金-銀核殼結構二聚體的可控組裝，并首先對核殼結構的手性性質進行了研究和探討。圓二色譜(CD)的原理是由不對稱分子組成的物質是光學各向異性的，物質對R和L兩種圓偏振光吸收程度不同的現象稱為圓二色性。這種吸收程度的不同與波長的關系稱圓二色譜，是一種測定分子不對稱結構的光譜法。可以用圓二色譜研究某些立體結構，對PCR組裝后不同銀殼厚度的金-銀核殼結構二聚體的手性進行研究。
發明內容
本發明的目的是提供一種基于聚合酶鏈反應的金-銀核殼結構二聚體的手性研究，并對具有不同銀殼厚度的組裝結構的手性性質進行研究。本發明的技術方案:一種基于聚合酶鏈反應的金-銀核殼結構二聚體的手性研究的方法，包括具有不同銀殼厚度Inm-1Onm的大金納米粒子和具有不同銀殼厚度Inm-1Onm的小金納米粒子的合成，其表面的引物偶聯，金-銀核殼結構納米粒子-引物偶聯物的穩定，金-銀核殼結構二聚體的PCR組裝，組裝產物的手性性質表征。具體步驟:(I)不同銀殼厚度Inm-1Onm的25nm金納米粒子合成采用檸檬酸三鈉還原氯金酸合成25nm金納米粒子，通過調節70 μ L 300 μ LlmM硝酸銀的量達到合成不同銀殼厚度Inm-1Onm的25nm金納米粒子。(2)不同銀殼厚度Inm-1Onm的IOnm金納米粒子合成采用單寧酸還原氯金酸合成IOnm金納米粒子,通過調節70 μ L 300 μ LlmM硝酸銀的量達到具合成不同銀殼厚度Inm-1Onm的IOnm金納米粒子。
(3)金-銀核殼結構納米粒子和引物的偶聯將新合成的25nm Au-Ag核殼結構納米粒子和巰基修飾的上游引物F-primer偶聯，將新合成的IOnm Au-Ag核殼結構納米粒子和巰基修飾的下游引物R-primer偶聯,分別形成金-銀核殼結構納米粒子-引物偶聯物。(4)金-銀核殼結構納米粒子-引物偶聯物的穩定將金-銀核殼結構納米粒子-引物偶聯物和巰基修飾的聚乙二醇(PEGicicici)反應，以達到穩定納米粒子的作用。(5)金-銀核殼結構二聚體的PCR組裝及組裝產物的手性性質表征以λ DNA為模板，通過優化PCR擴增條件，將金-銀核殼結構納米粒子_引物偶聯物在PCR體系中進行不同循環數2 20個循環的組裝，離心濃縮，得組裝產物，進行TEM和⑶的表征。所述具有不同銀殼厚度的金納米粒子的合成:采用傳統方法朽1檬酸三鈉還原氯金酸合成25nm金納米粒子；將500 μ L0.1M的磷酸鹽緩沖液和100 μ Ll%聚乙烯吡咯烷酮溶液和50 μ L0.1M抗壞血酸混合均勻，加入50 μ L新合成的2nM25nm金納米粒子，震蕩均勻，加入70 μ L 300 μ LlmM的硝酸銀溶液，搖晃3h，離心去除上清，將沉淀分散在50 μ L的超純水中，得銀殼厚度Inm-1Onm的25nm Au-Ag ;加入硝酸銀的量越多,得到的銀殼就越厚；采用傳統方法單寧酸還原氯金酸合成IOnm金納米粒子；將500 μ L0.1M的磷酸鹽緩沖液和100 μ Ll%聚乙烯吡咯烷酮溶液和50 μ L0.1M抗壞血酸混合均勻 ，加入50 μ L新合成的IOnMlOnm金納米粒子,震蕩均勻，加入70 μ L 300 μ LlmM的硝酸銀溶液，搖晃3h，離心去除上清，將沉淀分散在50 μ L的超純水中，得IOnmAu-Ag ;加入硝酸銀的量越多，得到的銀殼就越厚；通過調節70 μ L 300 μ LlmM硝酸銀的量達到合成不同銀殼厚度(Inm-1Onm)的25nm金-銀和IOnm金-銀核殼結構納米粒子。所述金-銀核殼結構納米粒子和上下游引物的偶聯:( i ) 25nm金-銀核殼結構納米粒子和上游引物F-primer偶聯:將制備好的50 μ L25nm金-銀核殼結構納米粒子加入50 μ L200nM的F-primer，混勻，室溫反應12h ；(ii) IOnm金-銀核殼結構納米粒子和下游引物R-primer偶聯:將制備好的50 μ LlOnm金-銀核殼結構納米粒子加入50 μ LI μ M的R-primer,混勻，室溫反應12h ；(iii)將上述(i )和(ii )步驟中反應溶液分別以7000rpm及13000rpm離心IOmin,棄上清，后用50 μ L的超純水分散沉淀，4°C保藏、待用。所述金-銀核殼結構納米粒子-引物偶聯物的穩定:將步驟(3)中所得金-銀核殼結構納米粒子-引物偶聯物中加入2 μ LlOO μ M的PEG1000,室溫反應12h，反應后的溶液8000rpm離心lOmin，棄上清，后用50 μ L的超純水分散沉淀，4 C保減、待用。所述金-銀核殼結構二聚體的PCR組裝及組裝產物的手性性質表征:①PCR:以λ DNA為模板，采用制得的25nm金-銀核殼結構納米粒子-F-Primer及IOnm金-銀核殼結構納米粒子-R-Primer進行PCR ；PCR反應體系:dNTPsl μ L，0.5 μ L的Taq DNA聚合酶，λ DNA模板質粒0.5 μ L，PCR反應緩沖液5 μ L，分別取25nm金-銀核殼結構納米粒子-F-Primer及IOnm金-銀核殼結構納米粒子-R-Primer各4 μ L,加滅菌水至總體積為50 μ L ；②擴增程序為:94°C預變性3min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，2 20個循環；72°C再延伸IOmin ;10°C保存，得PCR組裝產物；③TEM和CD表征:取500yL PCR組裝產物進行8000rpm離心lOmin，棄上清，后用100 μ L的超純水分散沉淀，進行TEM和⑶表征。表I模板、上下游引物和模板序列及長度
權利要求
1.一種基于聚合酶鏈反應的金-銀核殼結構二聚體的手性研究的方法，其特征在于包括具有不同銀殼厚度Inm-1Onm的大金納米粒子和具有不同銀殼厚度Inm-1Onm的小金納米粒子的合成，其表面的引物偶聯，金-銀核殼結構納米粒子-引物偶聯物的穩定，金-銀核殼結構二聚體的PCR組裝，組裝產物的手性性質表征； 具體步驟: (1)不同銀殼厚度Inm-1Onm的25nm金納米粒子合成 采用朽1檬酸三鈉還原氯金酸合成25nm金納米粒子,通過調節70 μ L 300 μ LlmM硝酸銀的量達到合成不同銀殼厚度Inm-1Onm的25nm金納米粒子； (2)不同銀殼厚度Inm-1Onm的IOnm金納米粒子合成 采用單寧酸還原氯金酸合成IOnm金納米粒子,通過調節70 μ L 300 μ LlmM硝酸銀的量達到合成不同銀殼厚度Inm-1Onm的IOnm金納米粒子； (3)金-銀核殼結構納米粒子和引物的偶聯 將新合成的25nm Au-Ag核殼結構納米粒子和巰基修飾的上游引物F-primer偶聯,將新合成的IOnm Au-Ag核殼結構納米粒子和巰基修飾的下游引物R-primer偶聯,分別形成金-銀核殼結構納米粒子-引物偶聯物； (4)金-銀核殼結構納米粒子-引物偶聯物的穩定 將金-銀核殼結構納米粒子-引物偶聯物和巰基修飾的聚乙二醇PEGiwtl反應，以達到穩定納米粒子； (5)金-銀核殼結構二聚體的PCR組裝及組裝產物的手性性質表征 以λ DNA為模板，通過優化PCR擴增條件，將金-銀核殼結構納米粒子-引物偶聯物在PCR體系中進行不同循環數2 20個循環的組裝，離心濃縮，得組裝產物，進行TEM和⑶的表征。
2.根據權利要求1所述基于聚合酶鏈反應的金-銀核殼結構二聚體的手性研究的方法，其特征在于具有不同銀殼厚度的金納米粒子的合成: 采用傳統方法檸檬酸三鈉還原氯金酸合成25nm金納米粒子； 將500 μ L0.1M的磷酸鹽緩沖液和100 μ Ll%聚乙烯吡咯烷酮溶液和50 μ L0.1M抗壞血酸混合均勻，加入50 μ L新合成的2nM25nm金納米粒子，震蕩均勻，加入70 μ L 300 μ LlmM的硝酸銀溶液，搖晃3h，離心去除上清，將沉淀分散在50 μ L的超純水中，得銀殼厚度Inm-1Onm的25nm Au-Ag ;加入硝酸銀的量越多,得到的銀殼就越厚； 采用傳統方法單寧酸還原氯金酸合成IOnm金納米粒子； 將500 μ L0.1M的磷酸鹽緩沖液和100 μ Ll%聚乙烯吡咯烷酮溶液和50 μ L0.1M抗壞血酸混合均勻，加入50 μ L新合成的IOnMlOnm金納米粒子，震蕩均勻，加入70 μ L 300 μ LlmM的硝酸銀溶液，搖晃3h，離心去除上清，將沉淀分散在50 μ L的超純水中，得IOnmAu-Ag ;加入硝酸銀的量越多，得到的銀殼就越厚； 通過調節70 μ L 300 μ LlmM硝酸銀的量達到合成不同銀殼厚度Inm-1Onm的25nm金-銀和不同銀殼厚度Inm-1Onm的IOnm金-銀核殼結構納米粒子。
3.根據權利要求1所述基于聚合酶鏈反應的金-銀核殼結構二聚體的手性研究的方法，其特征在于金-銀核殼結構納米粒子和引物的偶聯: (i )25nm金-銀核殼結構納米粒子和上游引物F-primer偶聯:將制備好的50 μ L25nm金-銀核殼結構納米粒子加入50 μ L200nM的F-primer,混勻，室溫反應12h ； (ii )10nm金-銀核殼結構納米粒子和下游引物R-primer偶聯:將制備好的50 μ LlOnm金-銀核殼結構納米粒子加入50 μ LI μ M的R-primer,混勻，室溫反應12h ； (iii)將上述(i )和(ii )步驟中反應溶液分別以7000rpm及13000rpm離心IOmin,棄上清，后用50 μ L的超純水分散沉淀，4°C保藏、待用；F-primer:5’ -SH-(CH2) 6_TGGCTGACCC TGATGAGTTC G-3’，擴增長度為 50bp ；R-primer:5’ -SH-(CH2) 6_GGGCCATGAT TACGCCAGTT-3’，擴增長度為 50bp。
4.根據權利要求1所述基于聚合酶鏈反應的金-銀核殼結構二聚體的手性研究的方法，其特征是金-銀核殼結構納米粒子-引物偶聯物的穩定: 將步驟(3)中所得金-銀核殼結構納米粒子-弓I物偶聯物中加入2 μ LlOO μ M的PEGicicici,室溫反應12h,反應后的溶液 8000rpm離心IOmin,棄上清,后用50 μ L的超純水分散沉淀，4C保減、待用。
5.根據權利要求1所述基于聚合酶鏈反應的金-銀核殼結構二聚體的手性研究的方法，其特征在于金-銀核殼結構二聚體的PCR組裝及組裝產物的手性性質表征: ①PCR:以λ DNA為模板，采用制得的25nm金-銀核殼結構納米粒子-F-Primer及IOnm金-銀核殼結構納米粒子-R-Primer進行PCR ;PCR反應體系:dNTPsl μ L，0.5μ L的Taq DNA聚合酶，λ DNA模板質粒0.5 μ L，PCR反應緩沖液5 μ L，分別取25nm金-銀核殼結構納米粒子-F-Primer及IOnm金-銀核殼結構納米粒子-R-Primer各4 μ L,加滅菌水至總體積為50μ L ； ②擴增程序為:94°C預變性3min;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，2 20個循環；72°C再延伸IOmin ; 10°C保存，得PCR組裝產物； ③TEM和⑶表征:取500μ L PCR組裝產物進行8000rpm離心lOmin，棄上清，后用100μ L的超純水分散沉淀，進行TEM和⑶表征。
全文摘要
基于聚合酶鏈反應的金-銀核殼結構二聚體的手性研究的方法，屬于材料化學領域。本發明主要內容是具有不同銀殼厚度的金-銀核殼結構納米粒子合成，及表面引物偶聯量的可控修飾，為了達到金納米粒子在PCR體系中的穩定性，并對金納米粒子-引物偶聯物用PEG1000進行修飾。在合適的PCR條件下，進行金-銀核殼結構二聚體組裝，并對其進行TEM表征和CD信號比較。本發明首先合成了具有不同銀殼厚度的金-銀核殼納米粒子，首次通過PCR方法進行了金-銀核殼結構二聚體的可控組裝，并首次對該金-銀核殼結構二聚體的手性性質進行了研究和探討。
文檔編號B82Y40/00GK103212704SQ20131007948
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月13日 優先權日2013年3月13日
發明者王利兵, 趙媛, 胥傳來, 馬偉, 徐麗廣, 匡華, 劉麗強, 宋珊珊, 胡擁明, 丁利 申請人:江南大學