從二氧化碳和水光生物生產丁醇的設計者生物體的制作方法

專利名稱：從二氧化碳和水光生物生產丁醇的設計者生物體的制作方法
技術領域：
本發明一般涉及生物安全防護型生物燃料能源生產技術。更具體地說，本發明 提供一種基于設計者轉基因(designer transgenic)植物如轉基因藻類、藍綠藻(藍藻 (cyanobacteria)和原綠球藻(oxychlorcAacteria))或植物細胞的光生物丁醇生產方法， 所述設計者轉基因植物被產生來利用從光合過程獲得的還原力(NADPH)和能量(ATP)直接 從二氧化碳(CO2)和水(H2O)立即合成丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)。
背景技術：
丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)是一種四碳醇，可用作液體燃料以驅動發動機，例如 汽車。丁醇可代替汽油，并且這兩種燃料的能含量幾乎相同(每加侖丁醇的能含量為 110，OOOBtu ；每加侖汽油的能含量為115，OOOBtu)。與乙醇相比，丁醇作為替代燃料也有很 多優越的性質。這些性質包括1) 丁醇的能含量(每加侖丁醇的能含量為110，OOOBtu)高 于乙醇(每加侖乙醇的能含量為84，OOOBtu) ；2) 丁醇的“蒸發性”比乙醇小6倍，比汽油小 13. 5倍，使得其作為氧合物使用時更加安全，從而消除在夏季和冬季對非常特殊的摻合物 的需求；幻丁醇可通過現有的燃料基礎設施(包括汽油管道)運輸，而乙醇必須通過鐵路、 駁船或卡車運送；和4) 丁醇可以加侖對加侖地用作汽油的替代品，例如100%或任何其它 百分比，而乙醇只能用作汽油的添加劑，最高為約85% (E-85)，并且只有在對發動機顯著 改進后才能使用(而丁醇可作為100%替代燃料工作，無需改進現有汽車發動機)。丁醇作為液體燃料在當前的運輸和能源系統中已有巨大的潛在市場。丁醇也用作 工業溶劑。在美國，丁醇目前主要是由石油制造。歷史上(20世紀初到20世紀50年代)， 人們通過典型地利用特定產丁醇菌(例如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) 和拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii))的發酵方法從玉米和糖蜜制造生物丁醇，所述 發酵過程也產生丙酮和乙醇并且被稱為ABE(丙酮、丁醇、乙醇)發酵。然而，當大約1卯4 年美國失去從古巴的低價糖供應時，利用發酵的丁醇生產就開始下滑，主要是因為石油價 格降到比糖價還低的水平。最近，對于使用梭菌和/或酵母發酵方法，從例如玉米淀粉等 生物質生產丁醇和/或乙醇重新給予了 R&D關注。然而，與“玉米淀粉乙醇生產”的情形類 似，“玉米淀粉丁醇生產”方法也需要很多的耗能步驟，包括農業玉米作物培育、玉米谷物收 獲、玉米谷物淀粉加工和淀粉制糖制丁醇發酵。“玉米淀粉丁醇生產”方法也可能消耗與其 丁醇產物的能量值幾乎一樣多的能量。這并不令人吃驚，可以理解的原因是當前技術可以 利用的玉米淀粉只占包括玉米桿、葉子和根的玉米作物生物質的一小部分。玉米秸通常被 丟棄在農田里，緩慢分解成CO2，因為其在很大程度上代表了無法由當前的生物精煉工業有 效用于生產乙醇或丁醇的木質纖維素生物質材料。人們已經進行研究試圖從木質纖維素植物生物質材料制造乙醇或丁醇，即稱作“纖維素乙醇”或“纖維素丁醇”的概念。然而，植物 生物質已經進化出了有效機制以用于抵御微生物和動物界對其細胞壁結構糖的攻擊。這種 性質構成天然頑抗性(natural recalcitrance)的基礎，從而為節省成本地將木質纖維素 生物質轉換為可發酵糖設置了障礙。因此，一個被稱作“木質纖維素頑抗性”的難題在節省 成本地將植物生物質轉換為可發酵糖這一方面構成了難以逾越的技術屏障。也就是說，因 為頑抗性問題，木質纖維素生物質(例如玉米秸、柳枝稷和木本植物材料)無法容易地轉換 為可發酵糖，從而無法在沒有特定預處理的情況下制造乙醇或丁醇，預處理通常與高昂的 加工成本有關。雖然在木質纖維素生物質預處理和發酵型丁醇生產加工方面的R&D工作已 有50多年之久，但是頑抗性木質纖維素的問題仍然是至今也無法消除的難以逾越的技術 屏障。此外，木質纖維素生物質培育、收獲、預處理加工和纖維素制糖制丁醇發酵等步驟都 消耗能量。因此，任何可規避生物質技術中的這些瓶頸問題的新技術都是有用的。生氧光細菌(oxyphotobacteria)(也稱作藍綠藻，包括藍藻和原綠 球藻)和藻類(例如萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、亞心形扁藻 (Platymonassubcordiformis) > /J、 求 (Chlorella fusca) > 1 it (Dunaliella salina)、布朗纖維藻(Ankistrodesmus braunii)禾口斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)) 可在液體培養基中利用從水形成的A來執行ω2的光合同化，其太陽能轉換為生物質能的 最大理論轉換率為約 ο %，并且在作為清潔再生能源方面具有巨大的潛力。然而，野生型產 氧光合綠色植物，例如藍綠藻和真核藻類，并不具有從(X)2和H2O直接生產丁醇的能力。野 生型光合作用利用從光合水裂解和穿過藻類類囊體膜系統的與質子梯度偶聯的電子傳遞 過程產生的還原力(NADPH)和能量(ATP)，在藻類或綠色植物葉綠體的基質區域，用統稱為 “卡爾文循環(Calvincycle) ”的一系列酶將CO2還原為碳水化合物(CH2O)n，例如淀粉。野 生型光合過程的最終結果是根據以下過程反應利用太陽光能將(X)2和H2O轉化為碳水化合 物(CH2O) n 和 O2 n(X)2+nH20— (CH2O) η+η02[1]碳水化合物(CH2O)n然后在細胞代謝和生長期間進一步轉換為各種各樣的復雜細 胞(生物質)材料，包括蛋白質、脂質和纖維素，以及其它細胞壁材料。在某些藻類如萊茵衣藻中，一些有機儲備物如淀粉可通過二級發酵代謝途徑緩慢 代謝成乙醇(而不是丁醇)。藻類發酵代謝途徑與酵母發酵過程類似，淀粉借此被分解成較 小的糖，例如葡萄糖，其接著通過糖酵解過程轉換為丙酮酸。丙酮酸然后可通過許多其它代 謝步驟轉換為甲酸、乙酸和乙醇(G feller 和 Gibbs (1984)“Fermentative metabolism of Chlamydomonas reinhardtii, "PlantPhysiol. 75 :212-218)。此二級代謝過程的效率非常 有限，可能是因為其只能利用藻類細胞中有限的有機儲備物如淀粉中的一小部分。此外，天 然藻類二級代謝過程不能產生任何丁醇。如上所述，丁醇具有許多優越的物理性質，使得其 可代替汽油用作燃料。因此，需要具有高的太陽能至丁醇能源轉換效率的新穎光生物丁醇 生產機制。本發明提供革命性的設計者光合生物體，其能夠利用太陽光直接從CO2和H2O合成 丁醇。本發明提供的光生物丁醇生產系統可避免上述生物質技術的所有瓶頸問題。

發明內容
本發明提供基于設計者轉基因植物(例如藻類和生氧光細菌)或植物細胞的光 生物丁醇生產方法。設計者光合生物體是通過基因工程來產生，使得內源光合調控機制被 馴化，并且從光合水裂解和與質子梯度偶聯的電子傳遞過程獲得的還原力(NADPH)和能量 (ATP)可用于從二氧化碳(CO2)和水(H2O)直接合成丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)。本發明的光生 物丁醇生產方法通過避免生物質技術的瓶頸問題完全消除了頑抗性木質纖維素的問題。預 期本發明的光合丁醇生產技術的太陽能至丁醇能源轉換效率顯著高于當前技術。本發明的光合丁醇生產方法的基礎特征是產生設計者植物(例如藻類)或植物細 胞，其含有編碼一組酶的轉基因，所述酶可作用于卡爾文循環的中間產物并將中間產物直 接轉化為丁醇，而不是制造淀粉和其它復雜生物質材料。因此，本發明尤其提供基于設計者 植物或植物細胞生產丁醇的方法，編碼設計者丁醇生產途徑的基因的DNA構建體，以及產 生的設計者植物和設計者植物細胞。一方面，本發明提供一種通過使設計者植物(例如設計者藻類或設計者藍綠藻) 或植物細胞在液體培養基中生長來光合生產丁醇的方法，其中所述植物或植物細胞經基因 工程改造以表達一組酶，所述酶可作用于卡爾文循環的中間產物并將中間產物轉化為丁醇。根據本發明，用于光合生產丁醇的設計者植物(例如設計者藻類)或設計者植 物細胞可利用基本上任何植物、植物組織或植物細胞作為宿主來產生，只要這類植物、植 物組織和細胞具有光合能力并且能在液體培養基中培養即可。在一優選實施方案中，利 用水生植物來產生設計者植物，包括(但不限于)水下水草(submersed aquatic herbs) (例如黑藻(Hydrilla verticillata)、/K 蘊草(Elodea densa)、氣泡草(Aponogeton boivinanus)、7jC羅蘭(Hygrophiladifformmis))、浮萍(duckweeds)(例如紫萍(Spirodela polyrrhiza)、無根萍(WolfTiaglobosa)、紫萍(Landoltia punctata) )、/K 芙蓉(water cabbage/Pistia stratiotes)、毛茛(buttercups/Ranunculus)、菱角(water caltrop) (四角菱(Trapa natans)和烏菱(Trapa bicornis))、睡蓮(water lily)(例如齒葉 睡蓮(Nymphaea lotus))、 /K 葫聲(water hyacinth)(Eichhornia crassipes)、海藻 (seagrasses)(例如小竹葉(Heteranthera Zosterifolia))禾口藻類。在一特別優選的實施方案中，使用藻類作為宿主來產生用于光合生產丁醇的設計 者藻類。適用于本發明的藻類可為單細胞或多細胞藻類(后者包括(但不限于)海藻， 例如青海苔(Ulva latissima)(海白菜(sea lettuce))、褐藻(AscophylIum nodosum) 和紫菜(Porphyra tenera))，并且包括綠藻(綠藻門(Chlorophyta))、紅藻(紅藻門 (Rhodophyta))、褐藻(褐藻門(Phaeophyta))、硅藻(硅藻門(Bacillariophyta))和藍綠 藻(生氧光細菌，包括藍藻(Cyanophyta (cyanobacteria))和原綠球藻(Prochlorophyte ( oxychlorobacteria)))。原核藍綠藻(生氧光細菌)和真核藻類都非常適用于本發明。用 于本發明的尤其優選的藻類物種是綠藻物種萊茵衣藻，其基因組最近已被測序。適合用于在宿主中產生設計者丁醇生產途徑的酶的選擇取決于設計者途徑在卡 爾文循環的何種中間產物處開始從卡爾文循環分叉。在一個實施方案中，設計者途徑從甘 油醛-3-磷酸點分叉，并通過使用例如由甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘 油酸變位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶(或丙酮酸-NADP+ 氧化還原酶)、硫解酶、3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰輔酶A脫氫酶、丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶組成的一組酶將其轉化為丁醇。在此設計者途徑中，為了將兩分子的甘油 醛-3-磷酸轉化為丁醇，在由甘油醛-3-磷酸脫氫酶催化的從甘油醛-3-磷酸至1，3- 二磷 酸甘油酸的步驟中從NAD+產生兩個NADH分子；同時兩個NADH分子轉化為NAD+ —個是在 由3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶催化的將乙酰乙酰輔酶A還原為3-羥基丁酰輔酶A的步驟 中，另一個是在由丁酰輔酶A脫氫酶催化的將巴豆酰輔酶A還原為丁酰輔酶A的步驟中。 因此，在此設計者途徑中，所消耗NADH分子的數量與所產生NADH分子的數量保持平衡。此 外，由丁醛脫氫酶催化的將丁酰輔酶A還原為丁醛的步驟和由丁醇脫氫酶催化的將丁醛還 原為丁醇的最終步驟皆可使用NADPH，其可通過光合水裂解和與質子梯度偶聯的電子傳遞 過程再生。因此，此設計者丁醇生產途徑可連續工作。在另一個實例中，產生設計者途徑，其采用中間產物3-磷酸甘油酸，并通過使用 例如由磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶、硫解 酶、3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰輔酶A脫氫酶、丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶組成 的一組酶將其轉化為丁醇。為了此3-磷酸甘油酸分叉的丁醇生產途徑能夠工作，使用可利 用NADPH的3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶和丁酰輔酶A脫氫酶非常重要，NADPH可由光驅動的 電子傳遞過程供應。可選地，當使用只能利用NADH的3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶和丁酰輔酶 A脫氫酶時，此處優選使用另一種實施方案，其可賦予NADPH/NADH轉化機制，通過將NADPH 轉化為NADH來供應NADH，以便于經由3-磷酸甘油酸分叉的設計者途徑光合生產丁醇。在另一個實例中，產生設計者途徑，其采用果糖-1，6-二磷酸，并通過使用例如由 醛縮酶、磷酸丙糖異構酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯 醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-NADP+氧化還原酶(或丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶)、硫 解酶、3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰輔酶A脫氫酶、丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶組 成的一組酶將其轉化為丁醇。在設計者生物體中添加另一種酶——即磷酸果糖激酶——可 允許產生另一種設計者途徑，其從果糖-6-磷酸點分叉以便生產丁醇。類似于甘油醛-3-磷 酸分叉的丁醇生產途徑，果糖-1，6- 二磷酸分叉的途徑和果糖-6-磷酸分叉的途徑自身皆 可產生NADH以用于途徑中的以下步驟由3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶催化的將乙酰乙酰輔 酶A還原為3-羥基丁酰輔酶A的步驟，和由丁酰輔酶A脫氫酶催化的將巴豆酰輔酶A還原 為丁酰輔酶A的步驟。在這些設計者丁醇生產途徑的每一種中，所消耗NADH分子的數量與 所產生NADH分子的數量保持平衡；并且丁醛脫氫酶(催化將丁酰輔酶A還原為丁醛的步 驟)和丁醇脫氫酶(催化將丁醛還原為丁醇的最終步驟)皆可利用NADPH，其可通過光合 水裂解和與質子梯度偶聯的電子傳遞過程再生。因此，這些設計者丁醇生產途徑可連續工 作。應注意，某些組的設計者酶可允許兩種或兩種以上的設計者途徑、即從卡爾文循環的兩 個或兩個以上點分叉的用于生產丁醇的途徑。根據本發明，對編碼這些酶的核酸進行基因工程改造，使得所表達的酶插入宿主 葉綠體中以實現靶向細胞定位。設計者丁醇生產途徑酶的靶向插入可經由使用編碼基質 “信號”肽的核苷酸序列來實現，所述核苷酸序列被放置成與編碼設計者酶的核苷酸序列可 操作地連接。許多轉運肽序列都適合用于設計者丁醇生產酶靶向插入葉綠體中，包括(但 不限于)氫化酶載脂蛋白(例如Hydl)、鐵氧還蛋白載脂蛋白(Frxl)、硫氧還蛋白m載脂 蛋白(Trx2)、谷氨酰胺合成酶載脂蛋白((^2)、LhcII載脂蛋白、PSII-T載脂蛋白(PsbT)、 PSII-S 載脂蛋白 O3SbShPSn-W載脂蛋白(PsbW)、CFtlCF1 亞基 ι 載脂蛋白(AtpC) XF0CF1亞基-δ載脂蛋白(AtpDhCFciCF1亞基-II載脂蛋白(AtpG)、光系統I (PSI)載脂蛋白(例 如基因 PsaD、PsaE, PsaF, PsaG, PsaH 和 PsaK 的 PSI 載脂蛋白)和 Rubisco 小亞基(SSU) 載脂蛋白(例如RbcS^的轉運肽序列。優選的轉運肽序列包括Hydl轉運肽、Frxl轉運肽 和Rubisco SSU轉運肽(例如RbcS2)。另外根據本發明，設計者丁醇生產途徑的表達是經由使用外部誘導型啟動子來控 制，使得設計者轉基因在某些特定條件下誘導性地表達。在一個實施方案中，用于控制設計 者基因表達的誘導型啟動子是可由厭氧生活誘導的啟動子，包括例如氫化酶基因(Hydl)、 編碼細胞色素C6的載脂蛋白的Cyc6基因和編碼糞生素(coprogen)氧化酶的Cpxl基因的 啟動子。適合用于本發明的其它誘導型啟動子包括硝酸還原酶(Nial)啟動子、熱休克蛋白 啟動子HSP70A、CabII-I啟動子、Cal啟動子、Ca2啟動子、亞硝酸還原酶基因(nirA)啟動 子、雙向氫化酶基因hox啟動子、光反應性和熱反應性groE啟動子、Rubisco操縱子rbcL啟 動子、金屬(鋅)誘導型smt啟動子、鐵反應性idiA啟動子、氧化還原反應性crhR啟動子、 熱休克基因hspl6. 6啟動子、小分子熱休克蛋白(Hsp)啟動子、CO2反應性碳酸酐酶基因啟 動子、綠光/紅光反應性cpcB2A2啟動子、UV光反應性lexA、recA和ruvB啟動子、硝酸還 原酶基因(narB)啟動子和其組合。在本發明的另一方面，提供設計者DNA構建體，其含有編碼一種或一種以上設計 者丁醇生產途徑酶的一種或一種以上核苷酸序列，所述核苷酸序列各自被放置成與誘導型 啟動子和編碼適當葉綠體靶向轉運肽的核苷酸序列可操作地連接。構建體可含有其它適當 序列，例如選擇標記基因，以便于篩選和鑒別轉化體。攜帶設計者基因的核酸構建體可使用 可用的基因轉化技術遞送到宿主藻類、植物生物體或植物組織或細胞中，例如電穿孔、天然 轉化、接合、PEG誘導的攝入、DNA的基因槍遞送和農桿菌介導的轉化。已經產生的含有一種或一種以上設計者構建體的設計者植物(例如設計者藻 類)、植物組織和植物細胞形成本發明的另一個實施方案。在進一步的方面，本發明提供用 于增強光合丁醇生產的其它方法，相關設計者構建體，和設計者植物、植物組織和細胞。在一具體實施方案中，如上所述的光合產丁醇設計者植物(例如設計者藻類)、植 物組織或細胞已被進一步修飾成含有其它設計者轉基因，以便誘導性地表達一種或一種以 上促進NADPH/NADH轉化的酶，例如NAD+依賴性甘油醛_3_磷酸脫氫酶、NADPH磷酸酶和NAD 激酶。可選地，設計者植物、植物組織或細胞的3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶、丁酰輔酶A脫氫 酶、丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶可被選擇和修飾，使得其也可利用NADPH。在另一個實施方案中，光合產丁醇設計者植物或植物組織或細胞已被進一步修飾 成使淀粉合成活性失活。在一具體實施方案中，所述進一步修飾包括引入編碼和誘導性地 表達干擾RNA (iRNA)分子的設計者DNA構建體，所述iRNA分子特異性地抑制淀粉合成途徑 酶(例如淀粉合成酶、葡萄糖-ι-磷酸腺苷酰轉移酶、磷酸葡萄糖異構酶和/或磷酸葡萄糖 變位酶)的合成，以便增強丁醇光生物生產。在另一個實施方案中，光合產丁醇設計者植物或植物組織或細胞已被進一步修飾 成含有另外一組促進基質中的淀粉降解和糖酵解的設計者基因。此類其它設計者基因包 括例如編碼淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖變位酶和磷酸葡萄糖異構酶的基 因。在另一個實施方案中，光生物丁醇生產途徑是分成幾部分分布在葉綠體和細胞質中。設計者丁醇生產途徑酶在葉綠體與細胞質之間的分布是通過在設計者DNA構建體中使 用和/或缺失轉運肽序列來控制。在另一個實施方案中，光生物丁醇生產途徑是全部分布在細胞質中，如在包括設 計者藍藻和設計者原綠球藻的設計者生氧光細菌(藍綠藻)的情況下。本發明還提供一種生物安全防護型光生物生物燃料生產技術，其是基于細胞分裂 可控型設計者轉基因植物、藻類、藍綠藻(藍藻和原綠球藻)或植物細胞。細胞分裂可控型 設計者光合生物體含有兩種關鍵功能設計者生物安全機制和設計者生物燃料生產途徑。 設計者生物安全特征是由包括以下的許多機制賦予(1)設計者質子通道可誘導性地插入 細胞質膜以使任何細胞分裂和/或雜交能力永久喪失，( 選擇性地應用設計者細胞分裂 周期調控蛋白或干擾RNA(iRNA)，以永久抑制細胞分裂周期且優選使細胞保持在G1期或 狀態，和C3)創新使用高(X)2需求的宿主光合生物體以用于表達設計者生物燃料生產途徑。 設計者細胞分裂控制技術可幫助確保使用設計者生物體來光合生產生物燃料中的生物安 全。本發明進一步提供一種使用設計者光合生物體(例如設計者藍藻或藻類)結合光 生物反應器系統和丁醇分離/收集方法，利用太陽光從(X)2和H2O直接光生物生產丁醇和A 的方法。工業CO2來源和/或來自環境的大氣(X)2皆可用于光生物丁醇生產方法中。


圖1展現從卡爾文循環分叉的設計者丁醇生產途徑，其使用來自光合水裂解和與 質子梯度偶聯的電子傳遞過程的還原力(NADPH)和能量(ATP)，通過一系列酶促反應將二 氧化碳(CO2)還原為丁醇CH3CH2CH2CH2OtL圖2A展現設計者丁醇生產途徑基因的DNA構建體。圖2B展現用于NADPH/NADH相互轉化的NADPH/NADH轉化設計者基因的DNA構建體。圖2C展現設計者iRNA淀粉/糖原合成抑制劑基因的DNA構建體。圖2D展現設計者淀粉降解-糖酵解基因的DNA構建體。圖2E展現用于細胞溶質表達的設計者丁醇生產途徑基因的DNA構建體。圖2F展現用于在生氧光細菌中整合式基因轉化的具有兩個重組位點的設計者丁 醇生產途徑基因的DNA構建體。圖2G展現設計者生物安全控制基因的DNA構建體。圖2H展現設計者質子通道基因的DNA構建體。圖3A說明含有兩種關鍵功能的細胞分裂可控型設計者生物體設計者生物安全 機制和設計者生物燃料生產途徑。圖;3B說明利用設計者生物安全機制從二氧化碳(CO2)和水(H2O)光生物生產丁醇 (CH3CH2CH2CH2OH)的細胞分裂可控型設計者生物體。圖3C說明用于從二氧化碳(CO2)和水(H2O)生物安全守護性地光生物生產其它生 物燃料如乙醇(CH3CH2OH)的細胞分裂可控型設計者生物體。設計者光合生物體，例如設計者轉基因植物(例如藻類和生氧光細菌)或植物細 胞。設計者植物和植物細胞是使用基因工程技術來產生，使得內源光合調控機制被馴化，并且從光合水裂解和與質子梯度偶聯的電子傳遞過程獲得的還原力(NADPH)和能量(ATP)可 立即用于根據以下過程反應從二氧化碳(CO2)和水(H2O)直接合成丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)4C02+5H20 — CH3CH2CH2CH20H+602[2]本發明的光生物丁醇生產方法通過避免生物質技術的瓶頸問題完全消除了頑抗 性木質纖維素的問題。如圖1所示，設計者生物體中的光合過程有效地利用來自光合水 裂解和與質子梯度偶聯的電子傳遞過程的還原力(NADPH)和能量(ATP)，以便立即從二氧 化碳(CO2)和水(H2O)直接合成丁醇(CH3CH2CH2CH2OH),而不會排入用于合成非常難以且通 常不能用于生物精煉工業的不合需要的木質纖維素材料的其它途徑中。這種方法與現有 的“玉米淀粉丁醇生產”方法也有所不同。根據本發明，丁醇可直接從二氧化碳(CO2)和水 (H2O)生產，而無需經歷玉米淀粉丁醇生產方法必須經歷的許多耗能步驟，包括玉米作物培 育、玉米谷物收獲、玉米谷物玉米淀粉加工和淀粉制糖制丁醇發酵。因此，預期本發明的光 合丁醇生產技術具有顯著高于(超過10倍)當前技術的太陽能至丁醇能源轉化效率。假 定所提議的光合丁醇生產方法的太陽能轉化效率為10%，那么最大理論生產力(產量)可 為每年每英畝約72，700kg 丁醇，這可維持約70輛汽車(每年每英畝)。因此，本發明可為 社會帶來重要的能力以幫助確保能源安全。本發明也可幫助保護地球環境，避免大氣中CO2 的危險積聚，因為本發明方法將(X)2直接轉化為清潔的丁醇能源。本發明方法的基本特征是利用植物(例如藻類或生氧光細菌)或植物細胞，將編 碼一組酶的核酸分子引入植物或植物細胞中，所述酶可作用于卡爾文循環的中間產物并將 中間產物轉化為丁醇，如圖1所示，而不是通過野生型光合途徑制造淀粉和其它復雜細胞 (生物質)材料作為終產物。因此，本發明尤其提供生產丁醇的方法，其是基于設計者植物 (例如設計者藻類和設計者生氧光細菌)、設計者植物組織或設計者植物細胞、編碼設計者 丁醇生產途徑的基因的DNA構建體，以及所產生的設計者藻類、設計者生氧光細菌(包括設 計者藍藻)、設計者植物、設計者植物組織和設計者植物細胞。本發明的各個方面在下文得 到更詳細的描述。宿主光合生物體根據本發明，本發明的用于光合生產丁醇的設計者生物體或細胞可利用任何具有 光合能力(即通過光合作用捕獲光能，使用所述能量將無機物轉化為有機物的活性光合裝 置和酶促途徑)的植物(包括藻類和生氧光細菌)、植物組織或植物細胞作為宿主來產生。 優選地，宿主生物體應具有足夠的光合ω2固定率，例如以支持從(X)2和H2O光合生產丁醇， 產率為每年每英畝至少約1，450kg 丁醇，更優選為每年每英畝7，270kg 丁醇，或甚至更優選 為每年每英畝72，700kg 丁醇。在一優選實施方案中，利用水生植物來產生設計者植物。水生植物，也稱為水 棲植物，是生活在水生環境中或水生環境上的植物，例如水中(包括水面上或水面下) 或永久飽和土壤中。如本文所用，水生植物包括例如藻類、藍綠藻(藍藻和原綠球藻)、 水下水草(黑藻、水蘊草、杉葉藻(Hippuris vulgaris)、氣泡草、硬葉浪草(Aponogeton Rigidifolius)、大卷浪草(AponogetonLongiplumulosus)、牛頓草(Didiplis Diandra)、 新加坡莫絲(Vesicularia Dubyana)、小柳(Hygrophilia Augustifolia)、珍珠金線 (Micranthemum Umbrosum)、大艾克草(Eichhornia Azurea)、美洲三白草(Saururus Cernuus)、舌頭椒草(CryptocoryneLingua)、北極杉百葉草(Hydrotriche Hottoniiflora
19Eustralis Stellata)、紅苦草(Vallisneria Rubra)、柳葉水蓑衣(Hygrophila Salicifolia)、泰國水劍(CyperusHelferi)、培茜椒草(Cryptocoryne Petchii)、美洲 苦草(Vallisneria americana)、托塔苦草(Vallisneria Torta)、北極杉(Hydrotriche Hottoniiflora)、黑樂草(CrassulaHelmsii)、石龍尾(Limnophila Sessiliflora)、穿葉目艮 子菜(PotamogetonPerfoliatus)、紅松尾(Rotala Wallichii)、貝克椒草(Cryptocoryne Becketii)、無尾水篩(Blyxa Aubertii)、水羅蘭)、浮萍(紫萍、無根萍、品藻(Lemna trisulca)、卵葉青萍(Lemna gibba)、青萍(Lemna minor)、紫萍(Landoltia punctata))、 水芙蓉、毛茛、菱角(四角菱和烏菱)、睡蓮(齒葉睡蓮、睡蓮科(Nymphaeaceae)和蓮科 (Nelumbonaceae))、7_K葫聲(Eichhornia crassipes)、黑木藏(Bolbitisheudelotii)、7_K盾 草(Cabomba sp.)、海藻(小竹葉、波喜蕩草科(Posidoniaceae)、大葉藻科(Zosteraceae)、 水鱉科(Hydrocharitaceae)和絲粉藻科(Cymodoceaceae))。從水生植物產生的丁醇可擴 散到水里，從而允許植物的正常生長和植物更穩定地產生丁醇。水生植物組織(包括(但 不限于)多細胞藻類)或細胞(包括(但不限于)單細胞藻類)的液體培養物也非常適合 使用，因為從設計者丁醇生產途徑生產的丁醇分子可容易地從細胞或組織擴散到液體水介 質中，其可充當儲存產物丁醇的巨大的池，產物丁醇隨后可通過過濾和/或蒸餾/蒸發技術 收集。雖然水生植物或細胞是用于本發明方法的優選宿主生物體，但是具有光合能力且 可在液體培養基中培養的非水生植物的組織和細胞也可用于產生設計者組織或細胞以供 光合生產丁醇。舉例來說，也可選擇以下非水生植物組織或細胞用作本發明的宿主生物體 木蘋果(Feronia limonia)的光自養幼苗組織培養物、玉米植物(Zea mays)的葉綠素愈傷 組織培養物、菊科(Asteraceae)和茄科(Solanaceae)物種的綠色根培養物、甘蔗莖桿薄壁 組織的組織培養物、小立碗蘚(Physcomitrella patens)的組織培養物、大豆植物(Glycme max)的光合細胞懸浮培養物、綠色普通煙草(Nicotiana tabacum L.)細胞的光自養和光混 合營養培養物、針晶粟草(Gisekia pharnaceoides) (C4植物)的細胞懸浮培養物，和鮑威爾 覽(Amaranthus powellii Wats.)、毛曼陀羅(Datura innoxia Mill.)、陸地棉(Gossypium hirsutum L.)禾口普通煙草(Nicotiana tabacum) χ 心葉煙(Nicotianaglutinosa L.)融合 雜交體的光合懸浮培養細胞系。“液體培養基”意謂液態水加上相對少量的無機營養物(例如N、P、K等，通常呈鹽 形式)，用于光自養培養物；有時候也包括某些有機底物(例如蔗糖、葡萄糖或乙酸鹽)，用 于光混合營養和/或光異養培養物。在一特別優選的實施方案中，本發明的丁醇生產方法所用的植物是藻類或藍綠 藻。藻類和/或藍綠藻的使用具有一些優勢。其可在開放池塘中大量且低成本地生長。丁 醇從水相中的收集和純化也可通過蒸餾/蒸發或膜分離容易地實現。適用于本發明的藻類包括單細胞藻類和多細胞藻類。可被選擇用于本發明的多細 胞藻類包括(但不限于)海藻，例如青海苔(海白菜)、褐藻、刺松藻(Codiumfragile)、墨 角藻(Fucus vesiculosus)、細齒麒麟菜(Eucheuma denticulatum)、細江蘺(Gracilaria gracilis)、/K 網藻(Hydrodictyon reticulatum)、海帶(Laminariajaponica)、裙帶菜 (Undaria pinntifida)、昆布(Saccharina japonica)、條斑紫菜(Porphyra yezoensis)禾口 紫菜。合適的藻類也可選自以下藻類門綠藻(綠藻門)、紅藻(紅藻門)、褐藻(褐藻門)、硅藻(硅藻門)和藍綠藻(生氧光細菌，包括藍藻和原綠球藻)。合適的綠藻目包括石莼 目(Ulvales)、絲藻目(Ulotrichales)、團藻目(Volvocales)、小球藻目(Chlorellales)、 裂體藻目 Gchizogoniales)、鞘藻目(Oedogoniales)、雙星藻目(Zygnematales)、剛毛 藻目(Cladophorales)、管藻目(Siphonales)和絨枝藻目(Dasycladales)。合適的紅 藻屬是紫菜屬(Porphyra)、角叉菜屬(Chondrus)、紅藻屬(Cyanidioschyzon)、紫球藻屬 (Porphyridium)、江萬屬(Gracilaria)、卡中白藻屬(Kappaphycus)、石花菜屬(Gelidium) 和Agardhiella。合適的褐藻屬有昆布屬(Laminaria)、裙帶菜屬(Undaria)、巨藻屬 (Macrocystis)、馬尾藻屬(Sargassum)和網管藻屬(Dictyosiphon)。合適的藍藻屬 (也稱為藍細菌)包括(但不限于)席藻屬(Phoridium)、集胞藻屬(Synechocystis)、 (Syncechococcus) > 1 ig M (Oscillatoria)禾口 fe 月星■ M (Anabaena) 。 & 適的原綠球藻屬(也稱為原綠球藻)包括(但不限于)原綠藻屬(Prochloron)、原 綠毛菌屬(Prochlorothrix)和原核綠藻屬(Prochlorococcus)。合適的硅藻屬有小 環藻屬(Cyclotella)、筒柱藻屬(Cylindrotheca)、舟形藻屬(Navicula)、海鏈藻屬 (Thalassiosira)和褐指藻屬(Phaeodactylum)。用于本發明的優選藻類物種包括萊茵衣 藻、亞心形扁藻、小球藻、耐熱性小球藻(Chlorella sorokiniana)、尋常小球藻(Chlorella vulgaris)、橢圓小球藻(‘Chlorella ‘ ellipsoidea)、小球藻(Chlorella spp.)、杜 氏鹽藻、韋氏杜氏藻(Dunaliella viridis)、巴氏杜氏藻(Dunaliella bardowil)、雨 生血球藻(Haematococcus pluvialis) ；Parachlorella kessleri、瓊枝(Betaphycus gelatinum)、敏波角叉菜(Chonrus crispus)、原始紅藻(Cyanidioschyzon merolae)、 Cyanidiumcaldarium、Galdieria sulphuraria、匍枝凝花菜(Gelidiella acerosa)、張氏 江萬(Gracilaria changii)、長心卡中白藻(Kappaphycus alvarezii) > Porphyra miniata、 Ostreococcus tauri、條斑紫菜(Porphyra yezoensis)、紫球藻(Porphyridium sp·)、掌狀 紅皮藻(Palmaria palmata)、江蘺(Gracilaria spp.)、球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、 + 中白■ (Kappaphycus spp.) > ! ! (Laminaria japanica) > ! ! (Laminariaspp.) >-RlIM (Monostroma spp.)、微擬球藻(Nannochloropsis oculata)、紫菜(Porphyra spp.)、紫 球藻(Porphyridium spp.)、裙帶菜(Undaria pinnatifida)、石藥(Ulva lactuca)、石藥 (Ulva spp.)、裙帶菜(Undaria spp.)、三角褐指藻(Phaeodactylum Tricorntum)、舟形藻 (Navicula saprophila)、^急甲藻(Crypthecodinium cohnii)、筒tt藻(Cylindrotheca fusiformis)、隱秘小環藻(Cyclotella cryptica)、纖細眼蟲(Euglena gracilis)、前 溝藻(Amphidinium sp.)、單細胞雙鞭毛藻(Symbiodinium microadriaticum) > 巨藻 (Macrocystis pyrifera)、布朗纖維藻和斜生柵藻。 用于本發明的優選藍綠藻(生氧光細菌，包括藍藻和原綠球藻)物種包括細長 嗜熱聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)BP-1、發菜(Nostoc sp. )PCC 7120、細 長聚球藻(Synechococcus elongatus) PCC 6301、聚球藻 PCC 7942 株、聚球藻 PCC 7002 株、集胞藻PCC 6803株、海洋原綠球藻(Prochlorococcus marinus)MED4、海洋原綠球藻 MIT 9313、海洋原綠球藻NATL1A、原綠球藻SS120、鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis) (鈍頂節旋藻(Arthrospira platensis))、太平洋螺旋藻(Spirulina pacifica)、巨大 鞘絲藻(Lyngbya majuscule)、魚月星藻(Anabaenasp.)、集胞藻(Synechocystis sp.)、 細長聚球藻(Synechococcus elongates)、聚球藻(Synechococcus) (MC-A)、束毛藻(Trichodesmium sp.)、胞內植生藻(Richeliaintracellularis)、聚球藻 WH7803、聚球 藻 WH8102、念珠藻(Nostoc punctiforme)、聚球藻 PCC 7943 株、集胞藻(Synechocyitis) PCC 6714藻藍蛋白缺陷型突變株PD-1、藍桿菌(Cyanothece) 51142株、藍桿菌CCY0110、 豐裕顫藻(Oscillatoria limosa)、巨大鞘絲藻(Lyngbya majuscula)、蘚生束藻 (Symploca muscorum)、無類囊體藍藻(Gloeobacter violaceus)、原綠藻(Prochloron didemni)、荷蘭原綠絲藍細菌(Prochlorothrix hoi landica)、聚球藻(MC-A)、束毛 藻、胞內植生藻、海洋原綠球藻、原綠球藻SS120、聚球藻WH8102、巨大鞘絲藻、蘚生束 藻、Synechococcusbigranulatus> 口譽冷賓員藻(cryophilic Oscillatoria sp.)、席藻 (Phormidium sp.)、發菜 _1、墻壁眉藻(Calothrix parietina)、口譽熱 Synechococcus bigranulatus、灰藍聚 求藻(Synechococcus lividus)、口譽熱層理！!更枝藻(Mastigocladus laminosus)、佛氏擬綠膠藍細菌(Chlorogloeopsis fritschii)PCC 6912、瓦氏聚球藻 (Synechococcus vulcanus)、聚球藻MA4株、聚球藻MA19株和細長嗜熱聚球藻。適當選擇宿主光合生物體的遺傳背景和某些特殊特征也是有利的。舉例來 說，從可在雪和冰中生長的嗜冷藻類(嗜冷生物)和/或從耐冷宿主菌株(例如衣藻 (Chlamydomonas)冷菌株CCMG1619——其已被表征為能在低達4°C執行光合水裂解(Lee， Blankinship 禾口 Greenbaum(1995)， “ Temperature effect onproduction of hydrogen and oxygen by Chlamydomonas cold strain CCMP1619 andwild type 137c, " Applied
Biochemistry and Biotechnology 51/52 :379-386))-產生的光合產丁醇設計者藻類
即使在寒冷季節或區域如加拿大也可允許光生物丁醇生產。同時，從嗜熱/耐熱光合生物 體(例如嗜熱藻類如Cyanidium caldarium禾口 Galdieria sulphuraria,禾口 /或嗜熱藍藻 (藍綠藻)如細長嗜熱聚球藻BP-I和Synechococcus bigranulatus)產生的設計者藻類 可允許本發明在天氣通常炎熱的炎熱季節或區域(例如墨西哥和美國西南地區，包括內華 達、加利福尼亞、亞利桑那、新墨西哥和德克薩斯)良好實施。此外，從海洋藻如亞心形扁藻 產生的光合產丁醇設計者藻類允許使用海水實施本發明，而從淡水藻如萊茵衣藻產生的設 計者藻類則可使用淡水。光合產丁醇設計者藻類的其它可選特征包括減小的葉綠素天線 尺寸，其已被證實可提供較高的光合生產率(Lee，Mets和Greenbaum(2002). “Improvement of photosynthetic efficiency at high lightintensity through reduction of chlorophyll antenna size,，，Applied Biochemistry andBiotechnology,98-100 : 37-48)；和丁醇耐受性，其允許從CO2和H2O更耐久且更有效地光合生產丁醇。通過使用 集胞藻PCC 6714的藻藍蛋白缺陷型突變株，已在實驗上證明了光抑制也可通過降低捕光 色素的含量來減輕(Nakajima，Tsuzuki 和 Ueda(1999) "Reduced photoinhibition of a phycocyanin-deficient mutant ofSynechocystis PCC 6714", Journal of Applied Phycology 10:447-452)。這些可選特征可例如通過使用丁醇耐受性和/或葉綠素天線缺 陷型突變株(例如萊茵衣藻DS521株)作為用設計者丁醇生產途徑基因進行基因轉化的宿 主生物體而并入設計者藻類中。因此，在各種實施方案之一中，宿主藻類選自綠藻、紅藻、 褐藻、藍綠藻(生氧光細菌，包括藍藻和原綠球藻)、硅藻、海洋藻、淡水藻、單細胞藻類、多 細胞藻類、海藻、耐冷藻株、耐熱藻株、捕光天線色素缺陷型突變株、耐丁醇藻株和其組合。在宿主中產生設計者丁醇生產途徑選擇適當的設計者酶
本發明的關鍵特征之一是產生設計者丁醇生產途徑，以便馴化天然光合機制并與 其合作，從而符合需要地直接從CO2和H2O合成丁醇。天然光合機制包括(1)光合水裂解和 穿過類囊體膜的與質子梯度偶聯的電子傳遞過程，其產生還原力(NADPH)和能量(ATP)，和 ⑵卡爾文循環，其通過消耗還原力(NADPH)和能量(ATP)來還原CO2。根據本發明，使用一系列酶來產生設計者丁醇生產途徑，其采用卡爾文循環的中 間產物并將中間產物轉化為丁醇，如圖1所示。“設計者丁醇生產途徑酶”在此處是定義為 用作設計者丁醇生產途徑的至少一個步驟的催化劑的酶。根據本發明，可利用卡爾文循環 的許多中間產物來產生設計者丁醇生產途徑；且設計者丁醇生產途徑所需的酶的選擇是取 決于設計者丁醇生產途徑在卡爾文循環的何種中間產物處開始從卡爾文循環分叉。在一個實例中，產生設計者途徑，其采用甘油醛-3-磷酸，并通過使用例如由甘油 醛-3-磷酸脫氫酶01、磷酸甘油酸激酶02、磷酸甘油酸變位酶03、烯醇化酶04、丙酮酸激酶
05、丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶06、硫解酶07、3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶08、巴豆酸酶 09、丁酰輔酶A脫氫酶10、丁醛脫氫酶11和丁醇脫氫酶12組成的一組酶(如圖1中的數 字標識01-12所示)，將其轉化為丁醇。在此甘油醛-3-磷酸分叉的設計者途徑中，為了將 兩分子的甘油醛-3-磷酸轉化為丁醇，在由甘油醛-3-磷酸脫氫酶01催化的甘油醛-3-磷 酸生成1，3-二磷酸甘油酸的步驟從NAD+產生兩個NADH分子；同時兩分子的NADH轉化為 NAD+ 一個是在由3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶08催化的將乙酰乙酰輔酶A還原為3-羥基丁 酰輔酶A的步驟中，另一個是在由丁酰輔酶A脫氫酶10催化的將巴豆酰輔酶A還原為丁酰 輔酶A的步驟中。因此，在此甘油醛-3-磷酸分叉的設計者途徑(01-12)中，所消耗NADH 分子的數量與所產生NADH分子的數量保持平衡。此外，由丁醛脫氫酶11催化的途徑步驟 (將丁酰輔酶A還原為丁醛)和由丁醇脫氫酶12催化的最終步驟(將丁醛還原為丁醇)皆 可使用NADPH，所述NADPH可通過光合水裂解和與質子梯度偶聯的電子傳遞過程再生。因 此，此甘油醛-3-磷酸分叉的設計者丁醇生產途徑可連續工作。在另一實例中，產生設計者途徑，其采用中間產物3-磷酸甘油酸，并通過使用例 如由磷酸甘油酸變位酶03、烯醇化酶04、丙酮酸激酶05、丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶
06、硫解酶07、3_羥基丁酰輔酶A脫氫酶08、巴豆酸酶09、丁酰輔酶A脫氫酶10、丁醛脫氫 酶11和丁醇脫氫酶12組成的一組酶(如圖1中的數字標識03-12所示)將其轉化為丁 醇。值得注意的是，甘油醛-3-磷酸分叉的設計者丁醇生產途徑(01-12)中的最后10種 酶(03-12)與3-磷酸甘油酸分叉的設計者途徑(03-1 所用的酶相同。換句話說，甘油 醛-3-磷酸分叉的途徑的設計者酶(01-1 允許從卡爾文循環的3-磷酸甘油酸點和甘油 醛-3-磷酸點生產丁醇。然而，這兩種途徑具有不同的特征。與甘油醛-3-磷酸分叉的丁醇 生產途徑不同，僅由10種酶(03-12)的活性組成的3-磷酸甘油酸分叉的途徑自身無法產 生在以下兩個位置使用所必需的任何NADH —個是在由3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶08催化 的將乙酰乙酰輔酶A還原為3-羥基丁酰輔酶A的步驟中，另一個是在由丁酰輔酶A脫氫酶 10催化的將巴豆酰輔酶A還原為丁酰輔酶A的步驟中。也就是說，如果(或當)使用只能 嚴格利用NADH而不能利用NADPH的3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶和/或丁酰輔酶A脫氫酶， 那么3-磷酸甘油酸分叉的途徑(03-12)的工作將需要NADH供應。因此，為了 3-磷酸甘油 酸分叉的丁醇生產途徑能夠工作，使用可利用NADPH的3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶08和丁 酰輔酶A脫氫酶10非常重要，NADPH可由光驅動的電子傳遞過程供應。因此，對于此3-磷酸甘油酸分叉的設計者丁醇生產途徑(圖1中的03-12)，優選使用可利用NADPH或NADPH 與NADH兩者(即NAD (P) H)的3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶和丁酰輔酶A脫氫酶。可選地，當 使用只能利用NADH的3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶和丁酰輔酶A脫氫酶時，此處優選使用另 一種實施方案，其可在設計者生物體中賦予NADPH/NADH轉化機制(以通過將NADPH轉化為 NADH來供應NADH，更多細節參看下文)，以便于通過3-磷酸甘油酸分叉的設計者途徑光合 生產丁醇。在另一個實例中，產生設計者途徑，其采用果糖-1，6-二磷酸，并通過使用由醛縮 酶20、磷酸丙糖異構酶21、甘油醛-3-磷酸脫氫酶22、磷酸甘油酸激酶23、磷酸甘油酸變位 酶對、烯醇化酶25、丙酮酸激酶沈、丙酮酸-NADP+氧化還原酶(或丙酮酸-鐵氧還蛋白氧 化還原酶)27、硫解酶觀、3_羥基丁酰輔酶A脫氫酶四、巴豆酸酶30、丁酰輔酶A脫氫酶31、 丁醛脫氫酶32和丁醇脫氫酶33組成的一組酶(如圖1中的數字標識20-33所示)將其轉 化為丁醇，其中僅有醛縮酶20和磷酸丙糖異構酶21相對于甘油醛-3-磷酸分叉的設計者 途徑是額外的酶。使用丙酮酸-NADP+氧化還原酶27 (而不是丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還 原酶)催化丙酮酸分子轉化為乙酰輔酶A可產生NADPH，其可用于丁醇生產途徑的一些其它 步驟。在設計者生物體中添加另一種酶——即磷酸果糖激酶19可允許產生另一種設計者 途徑，其從卡爾文循環的果糖-6-磷酸點分叉以生產丁醇。與甘油醛-3-磷酸分叉的丁醇 生產途徑類似，果糖-1，6-二磷酸分叉的途徑(20-3 和果糖-6-磷酸分叉的途徑(19-33) 自身皆可產生NADH，以用于所述途徑中由3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶四催化的將乙酰乙酰 輔酶A還原為3-羥基丁酰輔酶A的步驟和由丁酰輔酶A脫氫酶31催化的將巴豆酰輔酶A 還原為丁酰輔酶A的步驟。在這些設計者丁醇生產途徑的每一種中，所消耗NADH分子的數 量與所產生NADH分子的數量保持平衡；并且丁醛脫氫酶32 (催化將丁酰輔酶A還原為丁醛 的步驟)和丁醇脫氫酶33 (催化將丁醛還原為丁醇的最終步驟)皆可利用NADPH，其可通過 光合水裂解和與質子梯度偶聯的電子傳遞過程再生。因此，這些設計者丁醇生產途徑可連 續工作。表1列舉包括上文所鑒別的用于構建設計者丁醇生產途徑的酶的實例。在本說明 書中，當提及酶時，例如表1所列舉的任何酶，其包括其同工酶、功能類似物和經修飾的設 計者酶和其組合。這些酶可被選擇用于構建設計者丁醇生產途徑(例如圖1所示的那些途 徑)。“同工酶或功能類似物”是指具有相同催化功能，但可能具有或可能不具有完全相同的 蛋白質結構的某些酶。酶最基本的特征在于其催化酶促反應的活性位點。因此，也可選擇 含有此類活性催化位點的某些酶-蛋白質片段或亞基用于本發明。出于各種原因，一些天 然酶不僅含有必需催化結構，而且還含有對于指定應用可能需要或可能不需要的其它結構 組分。使用生物信息學輔助的分子設計技術，可以選擇用于構建編碼期望設計者酶的設計 者DNA構建體的必需催化結構。因此，在各種實施方案之一中，通過根據生物信息學輔助的 分子序列設計而人工合成DNA構建體來產生設計者酶基因。使用計算機輔助的合成生物方 法，可選擇性地修飾設計者酶的任何DNA序列(因此可選擇性地修飾其蛋白質結構)以通 過設計獲得更期望的結果。因此，術語“經修飾的設計者序列”和“經修飾的設計者酶”在本 文中被定義為用生物信息學輔助的分子設計修飾的DNA序列和酶蛋白。舉例來說，當從線 粒體酶的序列設計葉綠體靶向的設計者酶的DNA構建體時，優選例如通過選擇性地切除掉 不適用于指定應用的某些結構組分(例如其線粒體轉運肽序列)，和/或通過添加為了賦予設計者蛋白質的葉綠體靶向插入能力所需的某些肽結構(例如外源葉綠體轉運肽序列(例 如135-bp Rubisco小亞基轉運肽(RbcS2)))，修飾一些蛋白質結構。因此，各種實施方案之 一靈活使用所述酶、其同工酶、功能類似物、經修飾的設計者酶和/或其組合構建設計者丁 醇生產途徑。如表1所示，上文鑒別的酶的許多基因已經從各種生物體克隆和/或測序。可使用 基因組DNA和/或mRNA序列數據設計和合成設計者DNA構建體，以用于轉化宿主藻類、生氧 光細菌、植物、植物組織或細胞，從而產生用于光生物丁醇生產的設計者生物體(圖1)。然 而，因為各種來源生物體和細胞區室相對于特定宿主生物體和其葉綠體/類囊體環境(其 中丁醇生產途徑被設計成與卡爾文循環一起工作)通常存在可能的變化，所以在DNA構建 體設計中的某些分子工程技術，包括密碼子使用優化和序列修飾，通常是設計者DNA構建 體(圖幻良好工作所必需的。舉例來說，在產生產丁醇設計者真核藻類中，如果源序列是 來自細胞溶質酶(序列)，那么可添加功能葉綠體靶向序列，以便使由未知基因編碼的設計 者酶能夠插入宿主葉綠體中，從而將其功能賦予設計者丁醇生產途徑。此外，為了對設計者 丁醇生產途徑提供切換能力，如圖2A所示在某些設計者DNA構建體中包含功能誘導型啟動 子序列，例如氫化酶(Hydl)或硝酸還原酶(Nial)基因或亞硝酸還原酶(nirA)基因的啟動 子，以控制設計者基因的表達，這也是重要的。此外，如先前所述，這些酶(序列)、葉綠體靶 向轉運肽序列和誘導型啟動子序列的某些功能衍生物或片段也可被選擇使用，以全部、部 分或組合形式用于產生根據本發明的各種實施方案的設計者生物體。產生和使用設計者生 物體的技術在下文進一步描述。表1列舉用于構建設計者丁醇生產途徑的酶的實例。
權利要求
1.一種光合生產丁醇的方法，其包括使轉基因設計者植物或植物細胞在液體培養基 中生長，其中所述植物或植物細胞是經基因工程改造以表達一組酶，所述酶作用于卡爾文 循環的中間產物并將所述中間產物轉化為丁醇；和從所述液體培養基回收丁醇。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述植物是水生植物。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述水生植物選自由以下組成的組水 下水草(submersed aquatic herbs)(黑藻(Hydrilla verticillata)、 /K 蘊草 (Elodeadensa)、杉葉藻(Hippuris vulgaris)、氣泡草(Aponogeton Boivinianus)、硬 口十夕良 ^ft (Aponogeton Rigidifolius) > ；^ ·夕良胃(Aponogeton Longiplumulosus) > 41 頓草(Didiplis Diandra)、新加坡莫絲(Vesicularia Dubyana)、小柳(Hygrophilia Augustifolia)、珍珠金線(Micranthemum Umbrosum)、大艾克草(Eichhornia Azurea)、 美洲三白草(Saururus Cernuus)、舌頭椒草(Cryptocoryne Lingua)、北極杉百葉草 (Hydrotriche Hottoniiflora EustralisStellata)、紅苦草(Vallisneria Rubra)、 柳葉水蓑衣(Hygrophila Salicifolia)、泰國水劍(Cyperus Helferi)、培茜椒草 (Cryptocoryne Petchii)、美洲苦草(Vallisneria americana)、托塔苦草(Vallisneria Torta)、北極杉(HydrotricheHottoniiflora)、黑樂草(Crassula Helmsii)、石龍尾 (Limnophila Sessiliflora)、穿葉目艮子菜(Potamogeton Perfoliatus)、紅松尾(Rotala Wallichii)、貝克椒草(Cryptocoryne Becketii)、無尾水篩(Blyxa Aubertii)、水羅蘭 (HygrophilaDifformmis))、浮萍(duckweeds)(紫萍(Spirodela polyrrhiza)、無 f艮萍 (Wolffiaglobosa)、品藻(Lemna trisulca)、卵葉青萍(Lemna gibba)、青萍(Lemnaminor)、, (Landoltia punctata))> ^R 胃 _ (water cabbage/Pistia stratiotes)> (buttercups/Ranunculus)、菱角(water caltrop)(四角菱(Trapa natans)禾口烏菱(Trapa bicornis))、睡蓮(water lily)(齒葉睡蓮(Nymphaea lotus)、睡蓮禾斗(Nymphaeaceae) 禾口 蓮禾斗(Nelumbonaceae))、 /K 葫聲(waterhyacinth/Eichhornia crassipe)、黑 木蕨(Bolbitis heudelotii)、/K 盾草(Cabombasp.)、海藻(seagrasses)(小竹葉 (Heteranthera Zosterifolia)、波喜蕩草禾斗(Posidoniaceae)、大葉藻禾斗(Zosteraceae)、 水鱉科(Hydrocharitaceae)和絲粉藻科(Cymodoceaceae))和藻類。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述藻類選自由以下組成的組綠藻、紅藻、褐 藻、藍綠藻(生氧光細菌(oxyphotobacteria)，包括藍藻(cyanobacteria)和原綠球藻 (oxychlorobacteria))、硅藻、海洋藻、淡水藻、耐冷藻株、耐熱藻株、天線色素缺陷型突變 株、耐丁醇藻株和其組合。
5.根據權利要求3所述的方法，其中所述藻類選自由以下組成的組萊茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)、亞心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、小球藻 (Chlorella fusca)、耐熱性小球藻(Chlorella sorokinima)、尋常小球藻(Chlorella vulgaris)、橢圓小球藻(‘Chlorella' ellipsoidea)、小球藻(Chlorellaspp.)、杜氏鹽 藻(Dunaliella salina) λ^ ^:(Dunaliella viridis)、巴氏_土 氏―(Dunaliella bardowil)、雨生血球藻(Haematococcus pluvialis)、Parachlorella kessleri、瓊枝 (Betaphycus gelatinum)、敏波角叉菜(Chondruscrispus)、原始紅藻(Cyanidioschyzon merolae)、Cyanidium caldarium、Galdieriasulphuraria、匍枝凝花菜(Gelidiella acerosa)、張氏江蘺(Gracilaria changii)、長心卡巾白藻(Kappaphycus alvarezii)、Porphyra miniata、Ostreococcus tauri、條斑紫菜(Porphyra yezoensis)、紫 求藻 (Porphyridium sp·)、掌狀紅皮藻(Palmaria palmata)、江蘺(Gracilaria spp·)、球等鞭 金藻(Isochrysisgalbana)、卡巾白藻(Kappaphycus spp·)、海帶(Laminaria japonica)、海 帶(Laminaria spp·)、礁膜(Monostroma spp·)、微擬球藻(Nannochloropsisoculata)、紫 菜(Porphyra spp·)、紫球藻(Porphyridium spp·)、裙帶菜(Undariapinnatifida)、石藥 (Ulva lactuca)、石藥(Ulva spp.)、裙帶菜(Undaria spp·)、三角褐指藻(Phaeodactylum Tricornutum)、舟形藻(Navicula saprophila)、寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)、 筒柱藻(Cylindrotheca fusiformis)、隱秘小環藻(Cyclotella cryptica)、纖細眼 蟲(Euglena gracilis)、前溝藻(Amphidinium sp·)、單細胞雙鞭毛藻(Symbiodinium microadriaticum)、巨藻(Macrocystis pyrifera)、布朗纖維藻(Ankistrodesmus braunii)、斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)禾口其組合。
6.根據權利要求4所述的方法，其中所述藻類是萊茵衣藻。
7.根據權利要求4所述的方法，其中所述藻類選自由單細胞藻類、多細胞藻類和海藻 組成的組。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述海藻選自由以下組成的組青海苔(Ulva latissima)(海白菜(sea lettuce))、褐藻(Ascophyllum nodosum)、剌松藻(Codium fragile)、墨角藻(Fucus vesiculosus)、細齒麒麟菜(Eucheumadenticulatum)、細江 蘺(Gracilaria gracilis)、水網藻(Hydrodictyonreticulatum)、海帶(Laminaria japonica)、裙帶菜(Undaria pinntifida)、昆布(Saccharina japonica)、條斑紫菜 (Porphyra yezoensis)禾口紫菜(Porphyratenera) 0
9.根據權利要求4所述的方法，其中所述藍綠藻(生氧光細菌，包括藍藻和原綠球 藻)選自由以下組成的組細長嗜熱聚球藻(Thermosynechococcuselongatus)BP-I、發 菜(Nostoc sp.)PCC 7120、細長聚球藻(Synechococcuselongatus)PCC 6301、聚球藻 (Syncechococcus sp.)PCC 7942 株、聚球藻 PCC7002 株、集胞藻(Syncechocystis sp.)PCC 6803株、海洋原綠球藻(Prochlorococcus marinus)MED4、海洋原綠球藻MIT 9313、海洋原 綠球藻 NATL1A、原綠球藻(Prochlorococcus) SS120、鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis) (鈍頂節旋藻(Arthrospira platensis))、太平洋螺旋藻(Spirulina pacifica)、巨大 鞘絲藻(Lyngbya majuscule)、魚月星藻(Anabaena sp·)、集胞藻(Synechocystis sp.)、 細長聚球藻(Synechococcus elongates)、聚球藻(MC-A)、束毛藻(Trichodesmium sp.)、胞內植生藻(Richelia intracellularis)、聚球藻 WH7803、聚球藻 WH8102、念珠 藻(Nostoc punctiforme)、聚球藻 PCC 7943 株、集胞藻(Synechocyitis)PCC 6714 藻 藍蛋白缺陷型突變株PD-I、藍桿菌(Cyanothece) 51142株、藍桿菌CCYOl 10、豐裕顫 藻(Oscillatoria limosa)、巨大鞘絲藻(Lyngbya majuscula)、蘚生束藻(Symploca muscorum)、無類囊體藍藻(Gloeobacter violaceus)、原綠藻(Prochloron didemni)、荷 蘭原綠絲藍細菌(Prochlorothrix hollandica)、聚球藻(MC-A)、束毛藻、胞內植生藻、 海洋原綠球藻、原綠球藻SS120、聚球藻WH8102、巨大鞘絲藻、蘚生束藻、Synechococcus bigranulatus、口譽冷賓員藻(cryophilic Oscillatoria sp·)、席藻(Phormidium sp.)、發 5 (Calothrix parietina)Synechococcus bigranulatus>^cMIK5l<iS (Synechococcus lividus)、嗜熱層理鞭枝藻(Mastigocladus laminosus)、佛氏擬綠膠藍細菌(Chlorogloeopsisfritschii)PCC 6912、瓦氏聚球藻(Synechococcus vulcanus)、聚 球藻MA4株、聚球藻MA19株和細長嗜熱聚球藻。
10.根據權利要求1所述的方法，其中所述植物細胞是水生植物組織或細胞培養物。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述植物細胞是非水生植物組織或細胞培養物。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述非水生植物組織或細胞培養物選自由以 下組成的組木蘋果(Feronia limonia)的幼苗組織培養物、玉米植物(Zeamays)的葉綠 素愈傷組織培養物、菊科(Asteraceae)和茄科(Solanaceae)物種的綠色根培養物、甘蔗 莖桿薄壁組織的組織培養物、小立碗蘚(Physcomitrella patens)的組織培養物、大豆植 物(Glycine max)的光合細胞懸浮培養物、綠色普通煙草(Nicotiana tabacum L.)細胞 的光自養和光混合營養培養物、針晶粟草(Gisekia pharnaceoides) (C4植物)的細胞懸浮 培養物，和鮑威爾莧(Amaranthus powellii Wats·)、毛曼陀羅(Datura innoxiaMill.)、 陸地棉(Gossypium hirsutum L.)和普通煙草(Nicotiana tabacum) χ 心葉煙(Nicotiana glutinosa L.)融合雜交體的光合懸浮培養細胞系。
13.根據權利要求1所述的方法，其中所述一組酶是由磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶、 丙酮酸激酶、丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶(或丙酮酸-NADP+氧化還原酶)、硫解酶、 3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰輔酶A脫氫酶、丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶和其組合 組成。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶可利用NADPH，或 NADPH 禾口 NADH0
15.根據權利要求1所述的方法，其中所述一組酶是由甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘 油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶(或 丙酮酸-NADP+氧化還原酶)、硫解酶、3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰輔酶A脫 氫酶、丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶和其組合組成。
16.根據權利要求1所述的方法，其中所述一組酶是由醛縮酶、磷酸丙糖異構酶、甘 油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮 酸-NADP+氧化還原酶(或丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶)、硫解酶、3-羥基丁酰輔酶A脫 氫酶、巴豆酸酶、丁酰輔酶A脫氫酶、丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶和其組合組成。
17.根據權利要求1所述的方法，其中所述一組酶是由磷酸果糖激酶、醛縮酶、磷酸丙 糖異構酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶、丙酮酸 激酶、丙酮酸-NADP+氧化還原酶(或丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶)、硫解酶、3-羥基丁 酰輔酶A脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰輔酶A脫氫酶、丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶和其組合組成。
18.根據權利要求1所述的方法，其中所述一組酶是由淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖 激酶、磷酸葡萄糖變位酶、磷酸葡萄糖異構酶、磷酸果糖激酶、醛縮酶、磷酸丙糖異構酶、甘 油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮 酸-NADP+氧化還原酶(或丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶)、硫解酶、3-羥基丁酰輔酶A脫 氫酶、巴豆酸酶、丁酰輔酶A脫氫酶、丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶和其組合組成。
19.根據權利要求1所述的方法，其中所述一組酶是經基因工程改造以插入宿主光合 生物體的葉綠體中。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述一組酶插入所述葉綠體中是由基質信號肽引導。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述信號肽選自由以下組成的組氫化酶轉 運肽序列(HydAl和HydA^、鐵氧還蛋白轉運肽序列(Frxl)、硫氧還蛋白m轉運肽序列 (Trx2)、谷氨酰胺合成酶轉運肽序列(Gs2)、LhcII轉運肽序列、PSII-T轉運肽序列(I^bT)、 PSII-S轉運肽序列(PsbS)、PSII-W轉運肽序列(PsbWhCFtlCF1亞基-γ轉運肽序列(AtpC)、 CF0CF1亞基-δ轉運肽序列(AtpD)^CF0CF1亞基-II轉運肽序列(AtpG)、光系統I (PSI)轉 運肽序列、Rubisco SSU轉運肽序列和其組合。
22.根據權利要求20所述的方法，其中所述信號肽是選自由以下組成的組的蛋白 MW^fisliii^ll :Hydl( i^^ll :msalvlkpca avsirgsscr arqvapraplaastvrvala tleaparrIg nvacaa, SEQ ID NO 54)、RbcS2(maaviakssvsaavarpars svrpmaalkp avkaapvaap aqanq, SEQ ID NO :55)、鐵氧還蛋白轉運肽(mamamrs，SEQ ID NO :56)、和 CF0CfI 亞基一δ 轉運月太(mlaaksiagp rafkasavraapkagrrtvv vma, SEQ ID NO :57)禾口其組合。
23.根據權利要求1所述的方法，其中所述酶的表達由誘導型啟動子控制。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述啟動子可由厭氧生活誘導。
25.根據權利要求M所述的方法，其中所述啟動子是氫化酶啟動子。
26.根據權利要求23所述的方法，其中所述啟動子可通過操縱設計者生物體培養基中 的硝酸鹽相對于銨的濃度來誘導。
27.根據權利要求沈所述的方法，其中所述啟動子是硝酸還原酶啟動子。
28.根據權利要求1所述的方法，其中所述植物或植物細胞是經基因工程改造以便還 含有編碼至少一種促進NADPH/NADH轉化以增強丁醇光生物生產的酶的DNA構建體。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述酶是NADPH磷酸酶或NAD激酶或其組合。
30.根據權利要求四所述的方法，其中所述酶的表達是由誘導型啟動子控制，且在表 達后，所述酶插入葉綠體的基質區域。
31.根據權利要求觀所述的方法，其中所述酶是NAD+依賴性甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述NADPH/NADH轉化是通過兩步機制實現i)使用卡爾文循環的甘油醛-3-磷酸脫氫酶的步驟，其利用NADPH將1，3- 二磷酸甘油酸還原為甘油醛-3-磷酸；和 )使用所述NAD+依賴性甘油醛-3-磷酸脫氫酶的步驟，其在將甘油醛-3-磷酸氧化 為1，3_ 二磷酸甘油酸中產生NADH。
33.根據權利要求1所述的方法，其中所述植物或植物細胞經基因工程改造以還使淀 粉合成活性失活。
34.根據權利要求33所述的方法，其中所述淀粉合成活性失活包括抑制淀粉合成酶、 葡萄糖-ι-磷酸腺苷酰轉移酶、磷酸葡萄糖異構酶或磷酸葡萄糖變位酶的表達或活性。
35.根據權利要求34所述的方法，其中所述失活包括引入DNA構建體，其編碼和誘導性 地表達干擾iRNA分子。
36.根據權利要求35所述的方法，其中所述iRNA分子選自由淀粉合成酶iRNA、葡萄 糖-1-磷酸-腺苷酰轉移酶iRNA、磷酸葡萄糖異構酶iRNA、磷酸葡萄糖變位酶iRNA和其組 合組成的組。
37.根據權利要求1所述的方法，其中所述植物或植物細胞經基因工程改造以誘導性地表達另一組設計者酶，其促進葉綠體基質區域中的淀粉降解和糖酵解。
38.根據權利要求37所述的方法，其中所述另一組設計者酶包括淀粉酶、淀粉磷酸化 酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖變位酶、磷酸葡萄糖異構酶、磷酸果糖激酶、醛縮酶、磷酸丙糖異 構酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶 和其組合。
39.一種核酸構建體，其從5’到3’包含誘導型啟動子、編碼基質信號肽的核苷酸序列 和編碼光合丁醇生產途徑酶的核苷酸序列。
40.根據權利要求39所述的構建體，其中所述酶選自由以下組成的組磷酸果糖激酶、 醛縮酶、磷酸丙糖異構酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯 醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-NADP+氧化還原酶(或丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶)、硫 解酶、3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰輔酶A脫氫酶、丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶和 其組合。
41.一種核酸構建體，其從5’到3’包含誘導型啟動子、編碼基質信號肽的核苷酸序列 和編碼至少一種促進NADPH/NADH轉化的酶的核苷酸序列。
42.根據權利要求41所述的構建體，其中所述酶是NADPH磷酸酶或NAD激酶或NAD+依 賴性甘油醛-3-磷酸脫氫酶或其組合。
43.一種核酸構建體，其從5’到3’包含誘導型啟動子和編碼抑制淀粉合成酶表達的干 擾RNA分子的核苷酸序列。
44.根據權利要求43所述的構建體，其中所述淀粉合成酶選自由淀粉合成酶、葡萄 糖-1-磷酸(G-I-P)腺苷酰轉移酶、磷酸葡萄糖變位酶和磷酸己糖異構酶組成的組。
45.一種核酸構建體，其從5’到3’包含誘導型啟動子、編碼基質信號肽的核苷酸序列 和編碼促進淀粉降解和糖酵解的酶的核苷酸序列。
46.根據權利要求45所述的構建體，其中所述酶選自由以下組成的組淀粉酶、淀粉磷 酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖變位酶、磷酸葡萄糖異構酶、磷酸果糖激酶、醛縮酶、磷酸丙 糖異構酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶、丙酮酸 激酶和其組合。
47.根據權利要求39、41、43或45中任一項權利要求所述的構建體，其中所述啟動子 選自由以下組成的組氫化酶啟動子[HydAl(Hydl)和HydA2，登記號AJ308413、AM89201、 AY090770]、Cyc6基因啟動子、Cpxl基因啟動子、熱休克蛋白啟動子HSP70A、CabII-I基因 (登記號MM072)啟動子、Cal基因(登記號P20507)啟動子、Ca2基因(登記號P24258) 啟動子、硝酸還原酶(Nial)啟動子、亞硝酸還原酶基因(nirA)啟動子、雙向氫化酶基因hox 啟動子、光反應性和熱反應性groE啟動子、Rubisco操縱子rbcL啟動子、金屬(鋅)誘導 型smt啟動子、鐵反應性idiA啟動子、氧化還原反應性crhR啟動子、熱休克基因hspl6. 6 啟動子、小分子熱休克蛋白(Hsp)啟動子、CO2反應性碳酸酐酶基因啟動子、綠光/紅光反應 性cpcB2A2啟動子、UV光反應性lexA、recA和ruvB啟動子、硝酸還原酶基因(narB)啟動 子和其組合。
48.根據權利要求39、41、43或45中任一項權利要求所述的構建體，其中所述信號 肽是選自由以下組成的組的蛋白質的轉運肽序列氫化酶載脂蛋白、鐵氧還蛋白載脂蛋白 (Frxl)、硫氧還蛋白m載脂蛋白(Trx2)、谷氨酰胺合成酶載脂蛋白((^2) ,LhcII載脂蛋白、PSII-T 載脂蛋白(PsbT)、PSII-S 載脂蛋白(PsbS)、PSII-W 載脂蛋白(PsbW) JFtlCF1 亞基-Y 載脂蛋白(AtpChCFciCF1亞基-δ載脂蛋白(AtpDhCFciCF1亞基-II載脂蛋白(AtpG)、光系 統I(PSI)載脂蛋白、Rubisco SSU載脂蛋白和其組合。
49.一種可用于光合生產丁醇的轉基因植物或植物細胞，其包含根據權利要求39、41、 43或45中任一項權利要求所述的核酸構建體。
50.一種可用于光合生產丁醇的轉基因植物或植物細胞，其經基因工程改造以在葉綠 體中誘導性地表達磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還 原酶(或丙酮酸-NADP+氧化還原酶)、硫解酶、3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰 輔酶A脫氫酶、丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶。
51.根據權利要求50所述的轉基因植物或植物細胞，其還在葉綠體中誘導性地表達甘 油醛-3-磷酸脫氫酶和磷酸甘油酸激酶。
52.根據權利要求51所述的轉基因植物或植物細胞，其還在葉綠體中誘導性地表達醛 縮酶和磷酸丙糖異構酶。
53.根據權利要求52所述的轉基因植物或植物細胞，其還在葉綠體中誘導性地表達磷 酸果糖激酶。
54.根據權利要求53所述的轉基因植物或植物細胞，其還在葉綠體中誘導性地表達淀 粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖變位酶、磷酸葡萄糖異構酶。
55.根據權利要求49-54中任一項權利要求所述的轉基因植物或植物細胞，其還在 葉綠體中誘導性地表達以下至少一種=NADPH磷酸酶；NAD激酶；抑制磷酸葡萄糖異構酶 (G-P-異構酶)或磷酸葡萄糖變位酶表達的干擾RNA分子；或促進淀粉降解和糖酵解的由 以下組成的一組酶的一部分或全部淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖變位酶、 磷酸葡萄糖異構酶、磷酸果糖激酶、醛縮酶、磷酸丙糖異構酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸 甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶和其組合。
56.根據權利要求49-55中任一項權利要求所述的轉基因植物，其中所述植物是藻類。
57.根據權利要求49-55中任一項權利要求所述的轉基因植物，其中所述設計者丁醇 生產途徑酶不僅在葉綠體中，而且也在細胞質中表達和分布。
58.根據權利要求57所述的轉基因植物，其中所述設計者丁醇生產途徑酶在細胞質中 的所述表達通過在丁醇生產途徑基因設計中省略葉綠體靶向序列實現。
59.根據權利要求49-55中任一項權利要求所述的轉基因植物，其中所述植物是藍綠 藻(藍藻或原綠球藻)。
60.根據權利要求59所述的轉基因植物，其中所述設計者丁醇生產途徑酶通過在丁醇 生產途徑基因設計中省略葉綠體靶向序列而全部在細胞質中表達。
61.一種光合生產丁醇的方法，所述方法包括以下步驟a)使轉基因設計者植物、藻類、藍綠藻或植物細胞在包含水的液體培養基中生長，其中 所述轉基因設計者植物、藻類、藍綠藻或植物細胞包含用于至少一種設計者丁醇生產途徑 的至少一種外源轉基因；b)誘導所述轉基因設計者植物、藻類、藍綠藻或植物細胞以產生被誘導轉基因生物體， 其使所述至少一種轉基因被激活以賦予至少一種設計者丁醇生產途徑；和c)提供二氧化碳和光能，借此被誘導的轉基因設計者植物、藻類、藍綠藻或植物細胞將二氧化碳、水和光能轉化為某些中間產物，最終轉化為丁醇和氧。
62.根據權利要求61所述的方法，其中所述轉基因設計者生物體使用(X)2作為主要碳 源進行光自養生長。
63.根據權利要求61所述的方法，其中轉基因設計者生物體使用選自由以下組成的組 的有機底物進行光異養或光混合營養生長蔗糖、葡萄糖、乙酸鹽、丁醇、甲醇、丙醇、丁醇、 丙酮、淀粉、半纖維素、纖維素、脂質、蛋白質、有機酸、生物質材料和其組合。
64.根據權利要求61所述的方法，其中步驟a)中具有氫化酶啟動子控制型設計者基因 的設計者生物體的生長是在有氧環境下進行。
65.根據權利要求61所述的方法，其中步驟a)中具有硝酸還原酶啟動子控制型設計者 基因的設計者生物體的生長是在有氧環境下在銨而不是硝酸鹽形式的氮肥存在下進行。
66.根據權利要求61所述的方法，其中步驟a)中具有硝酸還原酶啟動子控制型設計者 基因的設計者生物體的生長是在厭氧環境下在銨而不是硝酸鹽形式的氮肥存在下進行。
67.根據權利要求61所述的方法，其中步驟b)中具有氫化酶啟動子控制型設計者基因 的設計者生物體的誘導是在無A的厭氧環境下進行。
68.根據權利要求61所述的方法，其中步驟b)中具有硝酸還原酶啟動子控制型設計者 基因的設計者生物體的誘導是在有氧環境下通過添加硝酸鹽形式的氮肥進行。
69.根據權利要求61所述的方法，其中步驟b)中具有硝酸還原酶啟動子控制型設計者 基因的設計者生物體的誘導是在厭氧環境下通過添加硝酸鹽形式的氮肥進行。
70.根據權利要求61所述的方法，其中所提供的CO2的來源是來自燃燒化石燃料和/ 或燃燒生物質的工業設施的煙氣co2。
71.根據權利要求61所述的方法，其中來自燃燒化石燃料和/或燃燒生物質的工業設 施的煙氣(X)2流通過管道引入生物反應器中。
72.根據權利要求61所述的方法，其中所提供的(X)2的來源是來自環境和大氣的空氣CO2。
73.根據權利要求61所述的方法，其中所提供的CO2的其它來源選自由氣態CO2、溶解 CO2、碳酸氫鹽和碳酸鹽組成的組。
74.根據權利要求70所述的方法，其中產生CO2供應的所述燃燒化石燃料和/或燃燒生 物質的工業設施選自由以下組成的組燃煤電廠、煉鋼鐵工業、水泥廠、煉油設施、化肥廠、 燃燒生物質和/或化石燃料的生物燃料蒸餾/分離設施、生物質熱解工藝、煙 、發酵生物 反應器、生物燃料精煉設施和其組合。
75.根據權利要求61所述的方法，其進一步包括以下步驟d)通過膜過濾與丁醇收集技術的組合從環境收集丁醇；e)收集用過的從被誘導轉基因生物體轉化而來的轉基因設計者生物體；f)重復權利要求61的步驟a)到c)和步驟d)和e)，以用于連續的光生物丁醇生產。
76.根據權利要求75所述的方法，其進一步包括收集也可由被誘導的轉基因設計者生 物體利用所述設計者丁醇生產途徑生產的中間產物的步驟。
77.根據權利要求76所述的方法，其中可利用所述設計者途徑從(X)2和H2O光生物生產 的所述中間產物選自由以下組成的組丁醛、丁酰輔酶A、巴豆酰輔酶A、3-羥基丁酰輔酶A、 乙酰乙酰輔酶A、乙酰輔酶A、丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸、2-磷酸甘油酸、1，3-二磷酸甘油酸、甘油醛-3-磷酸、二羥基丙酮磷酸、果糖-1，6- 二磷酸、果糖-6-磷酸、6-磷酸葡萄糖、葡萄 糖、葡萄糖-1-磷酸和其組合。
78.根據權利要求77所述的方法，其中所述中間產物的生產可通過關閉催化設計者途 徑中所述中間產物的消耗的設計者酶活性來選擇性地增強。
79.根據權利要求77所述的方法，其中所述中間產物的生產可通過使用設計者生物體 來增強，其中編碼催化所述中間產物的消耗的酶的設計者基因從設計者途徑中選擇性地省 略。
80.一種用于生物燃料的生物安全防護型光合生產的方法，其包括使細胞分裂可控 型轉基因設計者植物或植物細胞在液體培養基中生長，其中所述植物或植物細胞經基因工 程改造以含有設計者生物安全機制并表達一組設計者生物燃料生產途徑酶，所述酶作用于 卡爾文循環的中間產物并將所述中間產物轉化為生物燃料；和從所述液體培養基回收生物 燃料。
81.根據權利要求80所述的方法，其中所述植物是水生植物。
82.根據權利要求81所述的方法，其中所述水生植物選自由以下組成的組水下水 草(黑藻、水蘊草、杉葉藻、氣泡草、硬葉浪草、大卷浪草、牛頓草、新加坡莫絲、小柳、珍珠金 線、大艾克草、美洲三白草、舌頭椒草、北極杉百葉草、紅苦草、柳葉水蓑衣、泰國水劍、培茜 椒草、美洲苦草、托塔苦草、北極杉、黑樂草、石龍尾、穿葉眼子菜、紅松尾、貝克椒草、無尾水 篩、水羅蘭)、浮萍(紫萍、無根萍、品藻、卵葉青萍、青萍、紫萍)、水芙蓉、毛茛、菱角(四角 菱和烏菱)、睡蓮(齒葉睡蓮、睡蓮科和蓮科)、水葫蘆、黑木蕨、水盾草、海藻(小竹葉、波喜 蕩草科、大葉藻科、水鱉科和絲粉藻科)和藻類。
83.根據權利要求82所述的方法，其中所述藻類選自由以下組成的組綠藻、紅藻、褐 藻、藍綠藻(生氧光細菌，包括藍藻和原綠球藻)、硅藻、海洋藻、淡水藻、耐冷藻株、耐熱藻 株、天線色素缺陷型突變株、耐丁醇藻株和其組合。
84.根據權利要求82所述的方法，其中所述藻類選自由以下組成的組萊茵衣藻、 亞心形扁藻、小球藻、耐熱性小球藻、尋常小球藻、橢圓小球藻、小球藻、杜氏鹽藻、韋氏杜 氏藻、巴氏杜氏藻、雨生血球藻、Parachlorella kessleri、瓊枝、皺波角叉菜、原始紅藻、 Cyanidium caldarium、Galdieria sulphuraria、甸枝凝花菜、張氏江萬、長心卡帕藻、 Porphyra miniata、Ostreococcus tauri、條斑紫菜、紫球藻、掌狀紅皮藻、江蘺、球等鞭金 藻、卡帕藻、海帶、海帶、礁膜、微擬球藻、紫菜、紫球藻、裙帶菜、石莼、石莼、裙帶菜、三角褐 指藻、舟形藻、寇氏隱甲藻、筒柱藻、隱秘小環藻、纖細眼蟲、前溝藻、單細胞雙鞭毛藻、巨藻、 布朗纖維藻、斜生柵藻和其組合。
85.根據權利要求82所述的方法，其中所述藻類是萊茵衣藻。
86.根據權利要求82所述的方法，其中所述藻類選自由單細胞藻類、多細胞藻類和海 藻組成的組。
87.根據權利要求86所述的方法，其中所述海藻選自由以下組成的組青海苔(海白 菜)、褐藻、刺松藻、墨角藻、細齒麒麟菜、細江蘺、水網藻、海帶、裙帶菜、昆布、條斑紫菜和紫ο
88.根據權利要求83所述的方法，其中所述藍綠藻(生氧光細菌，包括藍藻和原綠球 藻)選自由以下組成的組細長嗜熱聚球藻BP-1、發菜PCC 7120、細長聚球藻PCC 6301、聚球藻PCC 7942株、聚球藻PCC 7002株、集胞藻PCC 6803株、海洋原綠球藻MED4、海洋原綠 球藻MIT 9313、海洋原綠球藻NATL1A、原綠球藻SS120、鈍頂螺旋藻(鈍頂節旋藻)、太平洋 螺旋藻、巨大鞘絲藻、魚腥藻、集胞藻、細長聚球藻、聚球藻(MC-A)、束毛藻、胞內植生藻、聚 球藻WH7803、聚球藻WH8102、念珠藻、聚球藻PCC 7943株、集胞藻PCC 6714藻藍蛋白缺陷 型突變株PD-1、藍桿菌51142株、藍桿菌CCY0110、豐裕顫藻、巨大鞘絲藻、蘚生束藻、無類囊 體藍藻、原綠藻、荷蘭原綠絲藍細菌、聚球藻(MC-A)、束毛藻、胞內植生藻、海洋原綠球藻、原 綠球藻SS120、聚球藻WH8102、巨大鞘絲藻、蘚生束藻、Synechococcus bigranulatus、嗜冷 顫藻、席藻、發菜-1、墻壁眉藻、嗜熱Synechococcus bigranulatus、灰藍聚球藻、嗜熱層理 鞭枝藻、佛氏擬綠膠藍細菌PCC 6912、瓦氏聚球藻、聚球藻MA4株、聚球藻MA19株和細長嗜 熱聚球藻。
89.根據權利要求80所述的方法，其中所述植物細胞是水生植物組織或細胞培養物。
90.根據權利要求80所述的方法，其中所述植物細胞是非水生植物組織或細胞培養物。
91.根據權利要求90所述的方法，其中所述非水生植物組織或細胞培養物選自由以下 組成的組木蘋果的幼苗組織培養物、玉米植物的葉綠素愈傷組織培養物、菊科和茄科物種 的綠色根培養物、甘蔗莖桿薄壁組織的組織培養物、小立碗蘚的組織培養物、大豆植物的光 合細胞懸浮培養物、綠色普通煙草細胞的光自養和光混合營養培養物、針晶粟草(C4植物) 的細胞懸浮培養物，和鮑威爾莧、毛曼陀羅、陸地棉和普通煙草χ心葉煙融合雜交體的光合 懸浮培養細胞系。
92.根據權利要求80所述的方法，其中所述設計者生物安全機制包括可在某些特定誘 導條件下誘導的設計者質子通道基因。
93.根據權利要求92所述的方法，其中所述設計者質子通道基因是在某些特定誘導條 件下誘導性地表達，以將設計者質子通道插入細胞質膜并保持光合類囊體膜完好。
94.根據權利要求93所述的方法，其中設計者質子通道在細胞質膜中的所述插入破 壞橫跨細胞質膜的質子梯度，從而使任何細胞分裂和雜交能力永久喪失以幫助確保生物安 全。
95.根據權利要求92所述的方法，其中所述設計者質子通道基因包括誘導型啟動子、 質子通道編碼序列和轉錄與翻譯終止子。
96.根據權利要求95所述的方法，其中所述質子通道編碼序列是蜂毒肽編碼序列。
97.根據權利要求95所述的方法，其中所述誘導型啟動子是硝酸還原酶Mal啟動子。
98.根據權利要求80所述的方法，其中所述設計者生物安全機制包括可在某些特定誘 導條件下誘導的設計者細胞分裂周期iRNA基因。
99.根據權利要求98所述的方法，其中所述設計者細胞分裂周期iRNA基因在某些特定 誘導條件下誘導性地表達，以永久抑制細胞分裂周期并保持細胞處于G1期或狀態以幫助 確保生物安全。
100.根據權利要求80所述的方法，其中所述設計者生物安全機制是通過使用高(X)2需 求突變株作為宿主生物體而賦予，所述宿主生物體是供設計者生物燃料生產途徑基因轉化 之用，以便產生所述設計者細胞分裂可控型光合生物體。
101.根據權利要求100所述的方法，其中所述高CO2需求突變株選自由以下組成的組萊茵衣藻碳酸酐酶缺陷型突變株12-1C(CC-1219 cal mt_)、萊茵衣藻cia3突變株、聚球藻 PCC 7942株的高CO2需求突變株M3、集胞藻PCC 6803的羧酶體缺陷型細胞和其組合。
102.根據權利要求100所述的方法，其中所述設計者生物燃料生產途徑基因選自由以 下組成的組設計者丁醇生產途徑基因、設計者乙醇生產途徑基因、生物油生產基因、生物 氫生產基因和其組合。
103.根據權利要求80所述的方法，其中所述設計者生物燃料生產途徑酶選自由以下 組成的組設計者乙醇生產途徑酶、設計者丁醇生產途徑酶和其組合。
104.根據權利要求80所述的方法，其中所述設計者生物燃料生產途徑酶選自由以下 組成的組淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖變位酶、磷酸葡萄糖異構酶、磷酸 果糖激酶、醛縮酶、磷酸丙糖異構酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸 變位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶、丙酮酸-NADP+氧化還原酶(或丙 酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶)、硫解酶、3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰輔酶A 脫氫酶、丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶和其組合。
105.根據權利要求80所述的方法，其中所述設計者生物安全機制和所述生物燃料生 產途徑酶的表達是通過使用誘導型啟動子控制。
106.根據權利要求80所述的方法，其中所述誘導型啟動子選自由以下組成的組氫化 酶啟動子[HydAl(Hydl)和 HydA2，登記號AJ308413、AM89201、AY090770]、Cyc6 基因啟動 子、Cpxl基因啟動子、熱休克蛋白啟動子HSP70A、CabII-I基因(登記號MM072)啟動子、 Cal基因(登記號P20507)啟動子、Ca2基因(登記號P24258)啟動子、硝酸還原酶(Nial) 啟動子、亞硝酸還原酶基因(nirA)啟動子、雙向氫化酶基因hox啟動子、光反應性和熱反 應性groE啟動子、Rubisco操縱子rbcL啟動子、金屬(鋅)誘導型smt啟動子、鐵反應性 idiA啟動子、氧化還原反應性crhR啟動子、熱休克基因hspl6.6啟動子、小分子熱休克蛋白 (Hsp)啟動子、CO2反應性碳酸酐酶基因啟動子、綠光/紅光反應性cpcB2A2啟動子、UV光 反應性leXA、recA和ruvB啟動子、硝酸還原酶基因(narB)啟動子和其組合。
107.一種光合生產生物燃料的方法，所述方法包括以下步驟a)使細胞分裂可控型轉基因設計者植物、藻類、藍綠藻(生氧光細菌)或植物細胞在包 含水的液體培養基中生長，其中所述轉基因設計者植物、藻類、藍綠藻或植物細胞包含用于 至少一種設計者生物燃料生產途徑的至少一種外源轉基因；b)誘導所述轉基因設計者植物、藻類、藍綠藻或植物細胞以產生被誘導轉基因生物體， 其使得所述至少一種轉基因被激活以賦予至少一種設計者生物燃料生產途徑；和c)提供二氧化碳和光能，借此被誘導的轉基因設計者植物、藻類、藍綠藻或植物細胞將 二氧化碳、水和光能轉化為某些中間產物，最終轉化為生物燃料(例如乙醇和/或丁醇)和 氧。
108.根據權利要求107所述的方法，其中所述細胞分裂可控型轉基因設計者生物體使 用(X)2作為主要碳源進行光自養生長。
109.根據權利要求107所述的方法，其中細胞分裂可控型轉基因設計者生物體使用選 自由以下組成的組的有機底物進行光異養或光混合營養生長蔗糖、葡萄糖、乙酸鹽、甲醇、 丙醇、丁醇、丙酮、淀粉、半纖維素、纖維素、脂質、蛋白質、有機酸、生物質材料和其組合。
110.根據權利要求107所述的方法，其中步驟a)中具有氫化酶啟動子控制型設計者基因的細胞分裂可控型設計者生物體的生長是在有氧環境下進行。
111.根據權利要求107所述的方法，其中步驟a)中具有硝酸還原酶啟動子控制型設計 者基因的細胞分裂可控型設計者生物體的生長是在有氧環境下在銨而不是硝酸鹽形式的 氮肥存在下進行。
112.根據權利要求107所述的方法，其中步驟a)中具有硝酸還原酶啟動子控制型設計 者基因的細胞分裂可控型設計者生物體的生長是在厭氧環境下在銨而不是硝酸鹽形式的 氮肥存在下進行。
113.根據權利要求107所述的方法，其中步驟b)中具有氫化酶啟動子控制型設計者基 因的細胞分裂可控型設計者生物體的誘導是在無O2的厭氧環境下進行。
114.根據權利要求107所述的方法，其中步驟b)中具有硝酸還原酶啟動子控制型設計 者基因的設計者生物體的誘導是在有氧環境下通過添加硝酸鹽形式的氮肥進行。
115.根據權利要求107所述的方法，其中步驟b)中具有硝酸還原酶啟動子控制型設計 者基因的設計者生物體的誘導是在厭氧環境下通過添加硝酸鹽形式的氮肥進行。
116.根據權利要求107所述的方法，其中所提供的(X)2的來源是來自燃燒化石燃料和 /或生物質的工業設施的煙氣co2。
117.根據權利要求107所述的方法，其中來自燃燒化石燃料和/或生物質的工業設施 的煙氣(X)2流通過管道引入生物反應器中。
118.根據權利要求107所述的方法，其中所提供的(X)2的來源是來自環境和大氣的空 氣 CO2。
119.根據權利要求107所述的方法，其中所提供的(X)2的其它來源選自由氣態0)2、溶 解CO2、碳酸氫鹽和碳酸鹽組成的組。
120.根據權利要求119所述的方法，其中產生CO2供應的所述燃燒化石燃料和/或生 物質的工業設施選自由以下組成的組燃煤電廠、煉鋼鐵工業、水泥廠、煉油設施、化肥廠、 生物質燃燒和/或化石燃料燃燒生物燃料蒸餾/分離設施、生物質熱解工藝、煙 、發酵生 物反應器、生物燃料精煉設施和其組合。
121.根據權利要求107所述的方法，其進一步包括以下步驟d)通過膜過濾與生物燃料收集技術的組合從環境收集生物燃料；e)收集用過的從被誘導轉基因生物體轉化而來的轉基因設計者生物體；f)使用所述細胞分裂可控型設計者生物體，重復權利要求107的步驟a)到c)和步驟 d)和e)，以用于生物燃料的連續的生物安全防護型光生物生產。
122.根據權利要求121所述的方法，其進一步包括收集也可由被誘導轉基因設計者生 物體利用所述設計者丁醇生產途徑生產的中間產物的步驟。
123.根據權利要求122所述的方法，其中可利用所述設計者途徑從(X)2和H2O光生物 生產的所述中間產物選自由以下組成的組乙醛、丁醛、丁酰輔酶A、巴豆酰輔酶A、3-羥基 丁酰輔酶A、乙酰乙酰輔酶A、乙酰輔酶A、丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸、2-磷酸甘油酸、1，3- 二 磷酸甘油酸、甘油醛-3-磷酸、二羥基丙酮磷酸、果糖-1，6- 二磷酸、果糖-6-磷酸、6-磷酸 葡萄糖、葡萄糖、葡萄糖-ι-磷酸和其組合。
全文摘要
本發明提供一種基于設計者轉基因植物、設計者藻類、設計者藍綠藻(藍藻(cyanobacteria)和原綠球藻(oxychlorobacteria))或設計者植物細胞的生物安全防護型光生物丁醇生產技術。產生設計者光合生物體以便馴化內源光生物調控機制，且從光合過程獲得的還原力(NADPH)和能量(ATP)是用于從二氧化碳(CO2)和水(H2O)直接合成丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)。本發明的丁醇生產方法通過避免生物質技術的瓶頸問題完全消除了頑抗性木質纖維素的問題。預期本發明的光生物丁醇生產技術具有比當前技術高得多的太陽能至丁醇能源轉換效率，并且也可幫助保護地球環境，避免大氣中CO2的危險積聚。
文檔編號C10L1/30GK102124118SQ200980114542
公開日2011年7月13日 申請日期2009年2月21日 優先權日2008年2月23日
發明者詹姆斯·偉甫·酈 申請人:詹姆斯·偉甫·酈