專利名稱：食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的定量檢測方法，屬于食品的一種檢驗方法。
背景技術：
亞硝酸鹽和硝酸鹽屬于食品的一種發色劑，食品在加工生產過程中，食品中的硝酸鹽被腸道中的細菌還原成亞硝酸鹽，當在人體中的攝入量過多時，使血液中二價鐵的紅血蛋白變成三價鐵的血紅蛋白，使人體失去攜氧功能而窒息，同時亞硝酸鹽還能與胺類化合物形成亞硝胺，具有強烈的致癌作用。在食品檢測中將亞硝酸鹽和硝酸鹽列為強制檢驗項目。其次，在我國部分地區，由于水質的原因，水中的亞硝酸鹽和硝酸鹽含量較高，當地人們的身體健康狀況受到影響，因此，進行食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢驗已成為質量安全保證的關注要點。
目前在食品中硝酸鹽和亞硝酸鹽檢測的方法有很多種，如定性的液體試劑法和固體試劑法；定量的試劑盒法、極譜法、色譜法、分光光度法等。但每種方法的適用性不同，色譜、分光光度法、極譜法需要配備貴重的檢測設備，試劑盒法屬于快速法耗材費用較高，不同的檢測方法適用范圍有限，方法之間交叉太大，尋求一種既經濟且準確性高的方法非常有必要。
發明內容
本發明的目的在于提供一種實用性廣泛，可以檢測不同種類食品中的亞硝酸鹽和硝酸鹽的方法，本發明的方法不僅節約時間，且節約成本，同時提高工作效率和檢驗結果，是一種準確性高的食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的定量檢測方法。
本發明的檢測原理為將樣品用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白去脂肪，搖勻，過濾，分別取等體積的濾液，一份濾液在酸性條件下加磺胺和萘乙二胺鹽酸鹽，在波長538nm處測量，測定樣品中本身含有的亞硝酸根(NO2-)，通過換算計算出樣品中的亞硝酸鹽；另一份濾液通過鎘柱，使濾液中的硝酸根離子(NO3-)還原為亞硝酸離子(NO2-)，然后同上進行顯色，測量樣品中原有的亞硝酸離子(NO2-)和硝酸離子(NO3-)還原生成的亞硝酸離子(NO2-)的總量，由二者之差計算硝酸離子(NO3-)含量，進而計算出樣品中的硝酸鹽含量。
在本發明的檢測方法中，所用試劑除注明者外，均為分析純，水為去離子水，不含亞硝酸鹽及硝酸鹽；飽和硼砂溶液0.25mol/L(即106±0.1g/L)亞鐵氰化鉀溶液，1mol/L(即220±0.1g/L)乙酸鋅溶液。
在本發明的檢測方法中，所用的顯色溶液溶液I2g/L的磺胺溶液；溶液II1g/L萘乙二胺鹽酸鹽溶液，避光貯存，冰箱保存；溶液III鹽酸水溶液，其中鹽酸∶水為445∶555(體積比)。
在本發明的檢測方法中，使用的鹽酸-氨水緩沖溶液為pH 9.60～9.70(其產生的作用，除控制溶液的pH外，還可緩解鎘對亞硝酸根的還原)，用精密的pH計調PH值為9.60～9.70；所使用的EDTA溶液為335g/L的二水乙二胺四乙酸二鈉(Na2C10H14N2O32H2O)。
在本發明的檢測方法中，使用的儀器設備為分析天平感量0.001g、0.0001g；電熱恒溫水浴鍋溫度可調；刮勺末端用聚四氯乙烯包裹；高速組織搗碎機1000-12000r/min；分光光度計；濾紙無亞硝酸離子(NO2-)。
在本發明的檢測方法中，請特別注意對于顏色較深的樣品，須經過脫色處理，否則樣品本身的顏色影響吸光度的測定；由于鎘是有害元素，在處理鎘粒時，不要用手直接接觸(處理時，可以帶上橡膠手套等，可以采用鑷子等工具夾取)，同時注意不要弄到皮膚上，一旦接觸立即用大量清水沖洗。
在本發明的檢測方法中，其中沒有特定提及的物質濃度、所使用物質的體積、容器的體積、所使用的儀器、所使用的時間等一些參數，都是本領域所熟知的，或者屬于本領域技術人員按照常規知識可確定的。
本發明的技術方案包括如下步驟1.樣品的制備根據種類不同，在制備樣品時略有不同，基本原則都是無論哪種種類，都是將待測樣品用搗碎機充分搗碎混勻來制備的1.1.新鮮果蔬先將新鮮水果、蔬菜洗凈，涼(就是將水自然瀝干)去表面水分，用四分法取可食部分，切碎，按比例加入一定量水(蕃茄、桔子等多汁樣品可不加水)，用高速搗碎機制成均漿，但在稱試樣時應扣除水量。加水量的比例一般為切碎所得物質重量的1倍或兩倍重量，本領域技術人員可以很容易地按照常規技術確定加水量。
1.4.冷凍罐頭及醬制品罐頭及醬制品應全部倒出，制成均漿備用。冷凍制品應先在密閉容器中解凍，混勻，分取一部分備用。
1.5.添加果料制品(如果粒酸奶、橙汁等)將待測樣品用搗碎機充分搗碎混勻，備用。
1.4.乳粉及嬰幼兒食品取有代表性樣品將其混勻，備用其中代表性樣品是指所取樣品能夠代表整體待測樣品的特性及均勻性和樣品的一致性，在檢測中我們是取小部分檢測，用其結果代表整批樣品，所以取樣要有代表性，這是通常取樣的一般性要求。
2.樣品的分析2.1.制備無色清亮濾液按照試樣中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的大小，準確稱取制備的樣品(均漿的)10-30g(精確到0.0001g)放入燒杯中，加入5±0.1mL飽和硼砂溶液和100±1mL(70-80℃)熱水；置沸水浴中加熱15min～20min，并用磁力攪拌器連續攪拌。取出后冷卻到室溫，再加入10±0.1mL亞鐵氰化鉀溶液，10±0.1mL乙酸鋅溶液和脫色劑，每次加入后均充分搖勻。然后定量轉入容量瓶中，用水定容。用濾紙過濾，得到無色清亮濾液。
2.2.亞硝酸鹽含量的測定用移液管吸取一定量上述無色清亮濾液置于適量容積的容量瓶中，用約三倍的水稀釋。加入適量的溶液III和適量的溶液I混勻，置于室溫下避光處，再加入適量的溶液II，混勻，5～10min后用水定容，于15min～20min內，在分光光度計上，用1cm光徑吸收池，以零管調零，于波長538nm測其吸光度。通過亞硝酸鹽標準曲線求出樣品的濃度。同時做空白試驗，即不加樣品，其它步驟同樣品檢測一致。
在該亞硝酸鹽含量測定中，優選地，無色清亮濾液∶稀釋用水∶溶液III∶溶液I∶溶液II的體積比為20∶60∶6∶5∶2。
2.3.硝酸鹽含量的測定2.3.1將無色清亮的濾液用過鎘柱還原用移液管吸取一定量的無色清亮濾液置于適量容積的容量瓶中，加氨緩沖液，倒入鎘柱頂部的貯液杯中，以小于6mL/min的流速過柱。洗提液(過柱后的液體)接入容量瓶中。
當貯液杯快要排空時，用水沖洗小燒杯，再倒入貯液杯中。沖洗水流完后，再用水重復一次。當第二次沖洗水快流完時，將貯液杯裝滿水，以最大流速(即為將硝酸鹽還原裝置中的止水夾開關打到最大)過柱，得到洗提液。
當容量瓶中的洗提液接近容量瓶容積時，取出容量瓶，用水定容，混勻。同時作空白實驗，(即用實驗用水代替無色清涼濾液，加氨緩溶液進行過柱，得到空白的洗提液)。
在該步驟中，無色清亮濾液∶氨緩沖液一般為20∶5，但氨緩溶液可多加，直到與濾液混合后，澄清為止。
2.3.2測定移取一定量的洗提液加入于適量容量瓶中，加入適量的溶液III和適量的溶液I混勻，置于室溫下避光處，再加入適量的溶液II，混勻，5～10min后用水定容，于15～20min內，在分光光度計上測定，通過亞硝酸鹽標準曲線求出樣品的濃度。同時做空白試驗，即從得到的空白的洗提液中吸取一定量的體積進行顯色，進行空白測試。
在該步測定中，優選地，洗提液∶溶液III∶溶液I∶溶液II的體積比為20∶6∶5∶2。
3.計算亞硝酸鹽的含量和硝酸鹽含量3.1亞硝酸鹽的含量3.1.1樣品中 C1-無色清亮濾液的吸光度，通過亞硝酸鹽標準曲線的回歸方程計算出的NO2-的濃度，μg/mL；
m-樣品的質量，g；V1-所取無色清亮濾液的體積，mL；3.1.2.樣品中以亞硝酸鈉表示亞硝酸鹽含量W(NaNO2)＝1.5×W(NO2-)---------------------------(2)式中W(NO2-)-樣品中亞硝酸根的含量，mg/kg；W(NaNO2)-樣品中以亞硝酸鈉表示的亞硝酸鹽的含量，mg/kg；上述兩種計算公式中，測定結果應準確至0.1mg/kg。
3.2.硝酸鹽含量3.2.1樣品中 式中C2-洗提液的吸光度，通過回歸方程計算出的亞硝酸根離子的濃度，μg/ml；m-樣品的質量，g；V2-所取洗提液的體積，mL；W(NO2-)-根據式(1)計算出的亞硝酸根含量；若不考慮柱的還原能力，則可認為r＝100。
3.2.2樣品中以硝酸鈉表示硝酸鹽含量W(NaNO3)＝1.371×W(NO3-)--------------------(4)式中W(NO3-)-樣品中硝酸根的含量，mg/kg；W(NaNO3)-樣品中以硝酸鈉計的硝酸鹽的含量，mg/kg。
上述兩種計算公式中，測定結果應準確至0.1mg/kg。
在本發明的檢測方法中，在硝酸鹽含量測定中使用的鎘柱，例如可按照如下方法制備得到在用于盛裝鍍銅鎘粒的玻璃柱的底部裝上幾厘米(優選2～3厘米)高的玻璃纖維。在玻璃柱中裝入水，排凈氣泡。將鍍銅鎘粒盡快地裝入玻璃柱，使其暴露于空氣的時間盡量短。鍍銅鎘粒的高度應在15～20cm的范圍內。其中，鎘粒可通過用鋅棒制備或直接購買鍍銅鎘粒(例如，可購自黑龍江省哈爾濱市盛搏科技有限公司)。
在本發明的檢測方法中，亞硝酸鹽標準曲線是按照如下方法制備的1).首先制備亞硝酸鈉標準儲備溶液稱取在115±5℃下烘至恒重的亞硝酸鈉(純度為分析純，優選高于分析純)0.1500g，于1000ml容量瓶中，加水溶解后定容。該溶液為標準工作溶液，含亞硝酸離子(NO2-)10μg/ml，使用時現配。于1000ml容量瓶中，吸取10mL上述溶液和20ml緩沖溶液，用水定容。1毫升此標準溶液含1.00μg的NO2-。
2).曲線制作分別移取(或用滴定管移出)0、2、4、6、8、10、12、16、20mL亞硝酸鈉標準溶液于九個100ml容量瓶中(可根據樣品含量不同增加標準溶液個數)。在每個容量瓶中加水，使其體積達到60ml。
在每個容量瓶中加入6mL溶液III和5.0mL溶液I混勻，置于室溫下避光處，再加入2mL溶液II，混勻，5min后用水定容，在15min內，在分光光度計上，用1cm光徑吸收池，以零管調零，于波長538nm測其吸光度，根據對應的濃度與吸光度值繪制亞硝酸鹽標準曲線。
在本發明的檢測方法中，所使用的鎘柱是按照如下方法制備的1).配制硝酸鉀標準溶液-相當于硝酸鹽的濃度為0.0045g/L將硝酸鉀(KNO3)在110℃～120℃的范圍內干燥至恒重。冷卻后稱取1.4680g(準確至0.0001g)，溶于1000mL的容量瓶中，用水定容。
在使用當天，與1000mL的容量瓶中，取5.00±0.015ml上述溶液和20±0.1ml緩沖溶液，用水定容。1ml的該標準溶液含有4.50μg的NO3-。
2).新制備柱的處理以不大于6mL/min的流量將由700～800ml水、220～230ml硝酸鉀標準溶液、20±0.030mL緩沖溶液和20±1ml EDTA溶液組成的混合溶液通過剛裝好鎘粒的玻璃柱，接著用50±5ml水以不大于6ml/min的流速沖洗該柱。
對于按照本發明制備的鎘柱，在使用中，優選地需要按時檢查柱的還原能力，這種檢查每天至少要進行兩次，一般在開始時和一系列測定之后進行檢查，檢查方法如下用移液管將20±0.030mL的硝酸鉀標準溶液移入還原柱頂部的貯液杯中，再立即向該貯液杯中添加5±0.1ml緩沖溶液。用一個100ml的容量瓶收集洗提液。洗提液的流量不應超過6ml/min。(空白試驗中用水過柱)在貯液杯將要排空時，用約15ml水沖洗杯壁。沖洗水流完后，再用15ml水重復沖洗。當第二次沖洗水也流完后，將貯液杯灌滿水，并使水以最大流量流過柱子。
當容量瓶中的洗提液接近100ml時，從柱子下取出容量瓶，用水定容至刻度，混合均勻。
移取10ml洗提液于100ml容量瓶中，加水至60mL(左右)。然后按上述亞硝酸鹽標準曲線制作中給容量瓶中加水，使其體積達到60mL之后的步驟開始同2.3.2操作。于波長538nm測其吸光度，通過回歸方程計算硝酸鉀標準使用液經過過鎘柱還原后，洗提液所對應的NO2-的含量，與理論值NO2-的含量為0.067μg/mL時還原能力為100％進行比較，求出此時的還原力的百分率。還原力在95％～105％時符合要求，方可進行樣品的測定如果所述鎘柱的還原能力小于95％或大于105％，柱子就需要再生，按如下步驟進行再生在100mL水中加入約5ml EDTA溶液和2mL 0.1mol/L鹽酸溶液。以10ml/min左右的速度過柱。當貯液杯中混合液排空后，按順序用25ml水、25ml鹽酸和25ml水沖洗柱子。檢查柱子的還原能力，如低于95％或高于105％，要重復再生。
本發明的方法具有很好的重復性在本發明的測定方法中，由同一分析人員在短時間間隔內測定的兩個亞硝酸鹽結果之間的差值，不應超過1mg/kg；由同一分析人員在短時間間隔內測定的兩個硝酸鹽結果之間的差值，在硝酸鹽含量小于30mg/kg時，不應超過3mg/kg；在硝酸鹽含量大于30mg/kg時，不應超過結果平均值的10％。
本發明的檢測方法也具有很好的重現性由不同實驗室的兩個分析人員對同一樣品測得的兩個硝酸鹽結果之差，在硝酸鹽含量小于30mg/kg時，差值不應超過8mg/kg；在硝酸鹽含量大于或等于30mg/kg時，該差值不應超過結果平均值的25％。
圖1為本發明所述的鎘柱還原裝置圖。
圖2為亞硝酸鹽標準曲線示意圖；具體曲線制作的依據說明書中亞硝酸鹽標準的制作，曲線作好后要求曲線的相關系數r大于等于0.9990，方可符合要求。
實施方式實施例1按照所述產品中是否有色素干擾的不同進行分別按照本發明的方法處理，得到樣品本身所含有的亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量，檢測對比結果如下
通過對以上表內的結果得知，對于產品中無色素的食品，經過脫色處理后，結果差異很小，而產品中富含色素的食品，在樣品處理中人為添加脫色劑，消除色素對測定結果的影響，結果有明顯的差異，經過脫色處理后，結果偏低。
實驗例2按照本發明的方法進行樣品的平行檢測，結果如下
通過用此方法進行平行檢測，同一樣品的重復性檢測結果符合方法的允許差，即亞硝酸鹽結果不超過1mg/kg，硝酸鹽結果在硝酸鹽含量小于30mg/kg時，兩次測定之差不超過3mg/kg。方法的重復性好。
權利要求
1.一種檢測食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的定量檢測方法，其特征在于，所述方法包括如下三個步驟(1).樣品的制備；(2).樣品的分析；(3).計算亞硝酸鹽的含量和硝酸鹽含量；其中，步驟2樣品的分析包括亞硝酸鹽含量的測定和硝酸鹽含量的測定。
2.權利要求1的定量檢測方法，其特征在于，其中步驟1樣品的制備通常無論是種類相同或不同，基本原則都是將待測樣品用搗碎機充分搗碎混勻來制備的，具體可分為以下幾類1.1.新鮮果蔬先將新鮮水果、蔬菜洗凈，涼去表面水分，用四分法取可食部分，切碎，按比例加入一定量的水-多汁樣品可不加水，用高速搗碎機制成均漿，但在稱試樣時應扣除水量；1.2.冷凍罐頭及醬制品罐頭及醬制品應全部倒出，制成均漿備用；冷凍制品應先在密閉容器中解凍，混勻，分取一部分備用；1.3.添加果料制品將待測樣品用搗碎機充分搗碎混勻；1.4.乳粉及嬰幼兒食品取有代表性樣品將其混勻，備用。
3.權利要求1的定量檢測方法，其特征在于，其中步驟2樣品的分析包括如下步驟2.1.制備無色清亮濾液按照試樣中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的大小，準確稱取制備的樣品10-30g放入燒杯中，加入5±0.1mL飽和硼砂溶液和100±1mL熱水；置沸水浴中加熱，并用磁力攪拌器連續攪拌，取出后冷卻到室溫，再加入10±0.1mL亞鐵氰化鉀溶液，10±0.1mL乙酸鋅溶液和脫色劑，每次加入后均充分搖勻，然后定量轉入容量瓶中，用水定容，用濾紙過濾，得到無色清亮濾液；2.2.亞硝酸鹽含量的測定用移液管吸取一定量上述無色清亮濾液置于適量容積的容量瓶中，用水稀釋；加入適量的溶液III和適量的溶液I混勻，置于室溫下避光處，再加入適量的溶液II，混勻，用水定容，于15min～20min內，在分光光度計上，于波長538nm測其吸光度；通過亞硝酸鹽標準曲線求出樣品的濃度；同時做空白試驗，即不加樣品，其它步驟同樣品檢測一致；在該亞硝酸鹽含量測定中，無色清亮濾液∶稀釋用水∶溶液III∶溶液I∶溶液II的體積比為20∶60∶6∶5∶2；2.3.硝酸鹽含量的測定2.3.1將無色清亮的濾液用過鎘柱還原用移液管吸取一定量的無色清亮濾液置于適量容積的容量瓶中，加氨緩沖液，倒入鎘柱頂部的貯液杯中，以小于6mL/min的流速過柱；洗提液-過柱后的液體接入容量瓶中；當貯液杯快要排空時，用水沖洗小燒杯，再倒入貯液杯中；沖洗水流完后，再用水重復一次；當第二次沖洗水快流完時，將貯液杯裝滿水，以最大流速過柱，得到洗提液；當容量瓶中的洗提液接近容量瓶容積時，取出容量瓶，用水定容，混勻；同時作空白實驗；在該步驟中，無色清亮濾液∶氨緩沖液一般為20∶5，但氨緩溶液可多加，直到與濾液混合后，澄清為止；2.3.2測定移取一定量的洗提液加入于適量容量瓶中，加入適量的溶液III鹽酸水溶液和適量的溶液I磺胺溶液混勻，置于室溫下避光處，再加入適量的溶液II萘乙二胺鹽酸鹽溶液，混勻，用水定容，于15～20min內，在分光光度計上測定，通過亞硝酸鹽標準曲線求出樣品的濃度；同時做空白試驗；在該步測定中，洗提液∶溶液III∶溶液I∶溶液II的體積比為20∶6∶5∶2。
4.權利要求1的定量檢測方法，其特征在于，其中步驟3計算亞硝酸鹽的含量和硝酸鹽含量是按照如下方法計算的3.1亞硝酸鹽的含量3.1.1樣品中 C1-無色清亮濾液的吸光度，通過亞硝酸鹽標準曲線的回歸方程計算出的NO2-的濃度，μg/mL；m-樣品的質量，g；V1-所取無色清亮濾液的體積，mL；3.1.2.樣品中以亞硝酸鈉表示的亞硝酸鹽含量W(NaNO2)＝1.5×W(NO2-)---------------------(2)式中W(NO2-)-樣品中亞硝酸根的含量，mg/kg；W(NaNO2)-樣品中以亞硝酸鈉表示的亞硝酸鹽的含量，mg/kg；上述兩種計算公式中，測定結果應準確至0.1mg/kg；3.2.硝酸鹽含量3.2.1樣品中 式中C2-洗提液的吸光度，通過回歸方程計算出的亞硝酸根離子的濃度，μg/ml；m-樣品的質量，g；V2-所取洗提液的體積，mL；W(NO2-)-根據式(1)計算出的亞硝酸根含量；若不考慮柱的還原能力，則可認為r＝100；3.2.2樣品中以硝酸鈉表示的硝酸鹽含量W(NaNO3)＝1.371×W(NO3-)-------------(4)式中W(NO3-)-樣品中硝酸根的含量，mg/kg；W(NaNO3)-樣品中以硝酸鈉計的硝酸鹽的含量，mg/kg；上述兩種計算公式中，測定結果應準確至0.1mg/kg。
5.權利要求2-4中任一項所述的定量檢測方法，其特征在于，其中步驟2的2.1中，熱水的溫度為70-80℃，沸水浴中加熱時間為15-20min；步驟2.2中，稀釋無色清亮濾液的水量為3倍的無色清亮濾液體積量。
6.權利要求2-4中任一項所述的定量檢測方法，其特征在于，其中溶液I磺胺水溶液為2g/L；溶液II萘乙二胺鹽酸鹽溶液為1g/L，避光貯存，冰箱保存；溶液III鹽酸水溶液，其中按體積比，鹽酸∶水為445∶555。
7.權利要求2-4中任一項所述的定量檢測方法，其特征在于，其中使用的鹽酸-氨水緩沖溶液為pH 9.60～9.70，所使用的EDTA溶液為335g/L的二水乙二胺四乙酸二鈉。
8.權利要求3所述的量檢測方法，其特征在于，其中亞鐵氰化鉀溶液的濃度為106±0.1g/L，乙酸鋅溶液的濃度為220±0.1g/L。
全文摘要
本發明涉及檢測不同種類食品中的亞硝酸鹽和硝酸鹽的方法，本發明的方法不僅節約時間，且節約成本，同時提高工作效率和檢驗結果，是一種準確性高的食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的定量檢測方法。
文檔編號G06F19/00GK101059429SQ20071008538
公開日2007年10月24日 申請日期2007年3月2日 優先權日2007年3月2日
發明者張秀梅, 李翠枝 申請人:內蒙古伊利實業集團股份有限公司