核酸的復制方法及新型人工堿基對的制作方法

專利名稱：：核酸的復制方法及新型人工堿基對的制作方法
技術領域：
：本發明涉及核酸的復制方法及新型人工堿基對。
背景技術：
：核酸通過A-T(U)和G-C堿基對的自身互補性進行擴增，并且作為催化劑和配體發揮功能。然而，與天然型蛋白質中的20種不同氨基酸相比，天然型核酸僅由4種不同的堿基所構成的核苷酸形成，這種數量上的限制制約了DNA和RNA分子的功能。非天然型堿基對系統可以增加核酸堿基的種類、擴展遺傳信息，因而是上述問題的解決之道(非專利文獻1-5)。作為非天然型堿基對，要求其具有高特異互補性，可以通過聚合酶催化反應在DNA和RNA中位點特異性地導入特殊的核苷酸類似物。這如能實現，則受天然存在堿基的數量制約的當前的基因工程將被使用非天然型堿基對系統的新技術替代。Benner等進行了構建非天然型堿基對的最初嘗試(非專利文獻6-7)。他們采用不同于天然型堿基對的氫鍵模式開發出數種非天然型堿基對，諸如異鳥嘌呤-異胞嘧啶(isoG-isoC)和黃苷-二氨基嘧啶等。最近，這些非天然型堿基對被應用于含有該堿基對的DNA片段的PCR擴增(非專利文獻8-9)、和序列分析(非專利文獻10)。然而，其保真度不高、和/或需要麻煩的方法。除這些問題外，像isoC和二氨基嘧啶這樣的2-氨基嘧啶類似物不能作為底物被T7RNA聚合酶所識別。因此，這堿基對的應用受到了限制。接著，Kool等合成了具有與天然型堿基相類似的形狀，但在堿基配對中缺乏形成氫鍵的能力的疏水性堿基(非專利文獻11-12)。這些疏水性堿基可以被DNA聚合酶選擇性地識別，因而這提示在復制中，堿基對間的幾何學的形狀的互補性比氫鍵相互作用更為重要。最近，Romesberg等開發了一系列疏水性堿基對，而且利用大腸桿菌來源的DNA聚合酶I的克列諾片段將這些堿基對互補地導入到了DNA中(非專利文獻13-15)。然而，在復制中，疏水堿基出現了不遵從形狀互補性的疏水性堿基間非特性導入(非專利文獻14)。而且，尚未有報道說這些堿基對在轉錄中具有功能。通過組合氫鍵模式與形狀互補性的概念，本發明人等開發出如下非天然型堿基對2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤(s)與2-氧代吡啶(y)(非專利文獻16-17)、以及2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤(v)與y(非專利文獻18)。s和v的6位的大取代基有效地抑制其與天然型堿基形成不希望的堿基對(non-cognatepairing)，而且，通過T7RNA聚合酶能夠將y和修飾y堿基底物(核苷5’-3磷酸)部位特異性地導入到RNA中，來與模板中的s或v互補。這種特異性轉錄可以作為開發功能性RNA分子的方法而實用化(非專利文獻19-21)，但復制中s-y和v-y堿基對的選擇性不如轉錄中的選擇性那么高(非專利文獻16、18)。為了解決上述問題，需要在復制和轉錄(功能性核酸的創造)、或者復制·轉錄·翻譯的全過程中(功能性蛋白質的創造)效率、選擇性良好的新型人工堿基對。以下文獻的全部內容引入本文作為參考文獻。專利文獻1WO2001/005801專利文獻2WO2004/007713專利文獻3WO2005/026187專利文獻4特愿2005-226492號非專利文獻1Benner，S.A.，Burgstaller，P.，Battersby，T.R.&Jurczyk，S.inTheRNAWorld(edsGesteland，R.F.，Cech，T.R.&Atkins，J.F.)163-181(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1999).非專利文獻2Henry，A.A.&Romesberg，F.E.BeyondA，C，GandTaugmentingnature’salphabet，Curr.Opin.Chem.Biol.7，727-733(2003).非專利文獻3Moser，M.J.&Prudent，J.R.Enzymaticrepairofanexpandedgeneticinformationsystem.NucleicAcidsRes.31，5048-5053(2003).非專利文獻4Bergstrom，D.E.Orthogonalbasepairscontinuetoevolve.Chem.Biol.11，18-20(2004).非專利文獻5Benner，S.A.&Sismour，A.M.Syntheticbiology.Nat.Rev.6，533-543(2005).非專利文獻6Piccirilli，J.A.，Krauch，T.，Moroney，S.E.&Benner，S.A.EnzymaticincorporationofanewbasepairintoDNAandRNAextendsthegeneticalphabet.Nature343，33-37(1990).非專利文獻7Switzer，C.Y.，Moroney，S.E.&Benner，S.A.Enzymaticrecognitionofthebasepairbetweenisocytidineandisoguanosine.Biochemistry32，10489-10496(1993).非專利文獻8Sismour，A.M.etal.PCRamplificationofDNAcontainingnon-standardbasepairsbyvariantsofreversetranscriptasefromHumanImmunodeficiencyVirus-1.NucleicAcidsRes.32，728-735(2004).非專利文獻9Johnson，S.C.，Sherrill，C，B.，Marshall，D.J.，Moser，M.J.&Prudent，J.R.AthirdbasepairforthepolymerasechainreactioninsertingisoCandisoG.NucleicAcidsRes.32，1937-1941(2004).非專利文獻10Ahle，J.D.，Barr，S.，Chin，A.M.&Battersby，T.R.Sequencedeterminationofnucleicacidscontaining5-methylisocytosineandisoguanineidentificationandinsightintopolymerasereplicationofthenon-naturalnucleobases.NucleicAcidsRes.33，3176-3184(2005).非專利文獻11Morales，J.C.&Kool，E.T.Efficientreplicationbetweennon-hydrogen-bondednucleosideshapeanalogs.Nat.Struct.Biol.5，950-954(1998).非專利文獻12Kool，E.T.，Morales，J.C.&Guckian，K.M.MimickingthestructureandfunctionofDNAInsightsintoDNAstabilityandreplication.Angew.Chem.Int.Ed.39，990-1009(2000).非專利文獻13McMinn，D.L.etal.EffortstowardexpansionofthegeneticalphabetDNApolymeraserecognitionofahighlystable，self-pairinghydrophobicbase.J.Am.Chem.Soc.121，11585-11586(1999).非專利文獻14Wu，Y.etal.Effortstowardexpansionofthegeneticalphabetoptimizationofinterbasehydrophobicinteractions.J.Am.Chem.Soc.122，7621-7632(2000).非專利文獻15Ogawa，A.K.etal.EffortstowardtheexpansionofthegeneticalphabetInformationstorageandreplicationwithunnaturalhydrophobicbasepairs.J.Am.Chem.Soc.122，3274-3287(2000).非專利文獻16Fujiwara，T.，Kimoto，M.，Sugiyama，H.，Hirao，I.&Yokoyama，S.Synthesisof6-(2-thienyl)purinenucleosidederivativesthatformunnaturalbasepairswithpyridin-2-onenucleosides.Bioorg.Med.Chem.Lett.11，2221-2223(2001).非專利文獻17Hirao，I.etal.Anunnaturalbasepairforincorporatingaminoacidanalogsintoproteins.Nat.Biotechnol.20，177-182(2002).非專利文獻18Mitsui，T.，Kimoto，M.，Harada，Y.，Yokoyama，S.&Hirao，I.Anefficientunnaturalbasepairforabase-pair-expandedtranscriptionsystem.J.Am.Chem.Soc.24，8652-8658(2005).非專利文獻19KimotoM.etal.Site-specificincorporationofaphoto-crosslinkingcomponentintoRNAbyT7transcriptionmediatedbyunnaturalbasepairs.Chem.Biol.11，47-55(2004).非專利文獻20Moriyama，K.，Kimoto，M.，Mitsui，T.，Yokoyama，S.&Hirao，I.Site-specificbiotinylationofRNAmoleculesbytranscriptionusingunnaturalbasepairs.NucleicAcidsRes.33，e129(2005).非專利文獻21Kawai，R.etal.Site-specificfluorescentlabelingofRNAmoleculesbyspecifictranscriptionusingunnaturalbasepairs.J.Am.Chem.Soc.inpress.非專利文獻22Matray，T.J.&Kool，E.T.AspecificpartnerforabasicdamageinDNA.Nature399，704-708(1999).非專利文獻23Doublié，S.，Tabor，S.，Long，A.M.，Richardson，C.C.&Elenberger，T.CrystalstructureofabacteriophageT7DNAreplicationcomplexat2.2resolution.Nature391，251-258(1998).非專利文獻24Kiefer，J.R.，Mao，C.，Braman，J.C.&Beese，L.S.VisualizingDNAreplicationinacatalyticallyactiveBacillusDNApolymerasecrystal.Nature391，304-307(1998).非專利文獻25Morales，J.C.&Kool，E.T.Functionalhydrogen-bondingmapoftheminorgroovebindingtracksofsixDNApolymerases.Biochemistry39，12979-12988(2000).非專利文獻26Mitsui，T.etal.Anunnaturalhydrophobicbasepairwithshapecomplem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發明內容發明要解決的問題本發明的目的是提供以下的方案1-27。方案1核酸的復制方法，其特征在于在復制反應中，使用γ位磷酸羥基被選自氨基、甲氨基、二甲氨基、巰基及氟基的基團替代的脫氧核糖核苷5’-三磷酸作為底物。方案2方案1的方法，其中，所述替代基團為氨基。方案3方案1或2的方法，其中，在復制反應中使用具有外切核酸酶活性的DNA聚合酶。方案4方案1～3任一項的方法，其中，具有外切核酸酶活性的聚合酶選自具有3’→5’外切核酸酶活性的克列諾片段、T4DNA聚合酶及嗜熱菌來源的DNA聚合酶。方案5方案1～4任一項的方法，其中，作為底物的脫氧核糖核苷5’-三磷酸具有非天然型堿基。方案6方案1～4任一項的方法，其中，作為底物的脫氧核糖核苷5’-三磷酸具有天然型堿基。方案7方案1～5任一項的方法，其中，作為底物的脫氧核糖核苷5’-三磷酸具有用式1表示的堿基化學式1此處，R1為氫或氨基，R2為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且A為N或CH。方案8方案1～5任一項的方法，其中，作為底物的脫氧核糖核苷5’-三磷酸具有用式2表示的堿基化學式2此處，R3為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3的烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基團，而且R4為甲酰基或硝基。方案9一種脫氧核糖核苷5’-三磷酸，其γ位磷酸羥基已被選自氨基、甲氨基、二甲氨基、巰基及氟基的基團替代。方案10一種脫氧核糖核苷5’-三磷酸，其γ位磷酸的羥基已被選自氨基、甲氨基、二甲氨基、巰基及氟基的基團替代，且其具有非天然型堿基。方案11一種脫氧核糖核苷5’-三磷酸，其γ位磷酸的羥基已被選自氨基、甲氨基、二甲氨基、巰基及氟基的基團替代，且其具有天然型堿基。方案12γ位磷酸的羥基被選自氨基、甲氨基、二甲氨基、巰基及氟基的基團替代了的脫氧核糖核苷5’-三磷酸的應用，其在方案1～8任一項的核酸的復制方法中用作底物。方案13一種核酸，其中具有用式1表示的堿基的核苷酸與具有用式2表示的堿基的核苷酸形成堿基對式1化學式3此處，R1為氫或氨基，R2為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且A為N或CH；式2化學式4此處，R3為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基團，而且R4為甲酰基或硝基。方案14方案13的核酸，其中，式1的堿基選自下組A1)7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；A2)7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；A3)7-(1H-2-咪唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；A4)5-氨基-7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；A5)5-氨基-7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；A6)5-氨基-7-(1H-2-咪唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；A7)4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；A8)4-(2-噻唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；A-9)4-(1H-2-咪唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基A-10)6-氨基-4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；A-11)6-氨基-4-(2-噻唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；及A-12)6-氨基-4-(1H-2-咪唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基。方案15方案13的核酸，其中式2的堿基選自下組B1)2-甲酰基-1H-吡咯-1-基；B2)2-甲酰基-4-碘-1H-吡咯-1-基；B3)2-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-1-基；B4)2-甲酰基-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；B5)2-甲酰基-4-(2-取代氨基乙烯基)-1H-吡咯-1-基；B6)2-甲酰基-4-(3-取代氨基-1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；B7)2-硝基-1H-吡咯-1-基；B8)2-硝基-4-碘-1H-吡咯-1-基；B9)2-硝基-4-甲基-1H-吡咯-1-基；B10)2-硝基-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；B11)2-硝基-4-(2-取代氨基乙烯基)-1H-吡咯-1-基；及B12)2-硝基-4-(3-取代氨基-1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基。方案16方案13～15任一項的核酸，其堿基對是在轉錄、逆轉錄、復制或翻譯步驟中形成的。方案17包含具有用式1表示的堿基的核苷酸的核酸的制備方法，其中，以包含具有用式2表示的堿基的核苷酸的核酸作為模板，進行轉錄、逆轉錄或復制，在所述具有式2的堿基的核苷酸的互補位置摻入所述具有式1的堿基的核苷酸式1化學式5此處，R1為氫或氨基，R2為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且A為N或CH；式2化學式6此處，R3為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基團，而且R4為甲酰基或硝基。方案18包含具有式2表示的堿基的核苷酸的核酸的制備方法，其中，以包含具有式1表示的堿基的核苷酸的核酸作為模板，進行轉錄、逆轉錄或復制，在所述具有式1的堿基的核苷酸的互補位置摻入所述具有式2的堿基的核苷酸式2化學式7此處，R3為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基團，而且R4為甲酰基或硝基；式1化學式8此處，R1為氫或氨基，R2為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且A為N或CH。方案19包含具有式1及/或式2的堿基的核苷酸的核酸，其是采用方案17或18的方法制備的。方案20方案19的核酸，其為tRNA、mRNA、反義DNA或RNA、核酶、適體或siRNA。方案21具有式1表示的堿基的核糖核苷5’-三磷酸式1化學式9此處，R1為氫或氨基，R2為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且A為N或CH。方案22具有式2表示的堿基的核糖核苷5’-三磷酸式2化學式10此處，R3為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基團，而且R4為甲酰基或硝基。方案23具有式3表示的堿基的5’-O-(4、4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-(2-氰乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)脫氧核糖核苷式3化學式11此處，R5為氫或取代氨基，R6為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且A為N或CH。方案24具有式4表示的堿基的5’-O-(4、4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-(2-氰乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)脫氧核糖核苷式4化學式12此處，R7為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基團，而且R8為甲酰基或硝基，但不包括R7為氫或1-丙炔基且R8為甲酰基的情況。方案25采用方案18的方法制備的、包含具有式2表示的堿基的核苷酸的核酸，其中，式2的取代基R3為用生物素或熒光分子取代的C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。方案26方案22的核糖核苷5’-三磷酸，其中，R3為用生物素或熒光分子取代的C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。方案27方案24的5’-O-(4、4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-(2-氰乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)脫氧核糖核苷，其中，R7為用生物素或熒光分子取代的C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。解決問題的手段本發明人等為解決上述問題進行了創造性研究，結果完成了本發明。本發明的非天然型堿基對系統開發的來龍去脈本發明者為了獲得在復制和轉錄反應中效率和選擇性良好的人工堿基對，通過將自行開發的數個非天然型堿基對進行組合，對構建的堿基對進行了研究。本發明者發現2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤-9-基(s)(非專利文獻17、33)和2-甲酰基-1H-吡咯-1-基(Pa)(非專利文獻26)的組合在轉錄中顯示高度的選擇性和效率(專利文獻4未公開)。而且，在本發明中進一步制備了將s嘌呤環中的6員環的2個N原子之一替代為CH并將2位的氨基替換成氫(即脫氮雜、脫氨基化)的7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds)，考察了Ds與Pa人工堿基對的匹配性。其結果，Ds與Pa人工堿基對在復制和轉錄中無論哪一個作為模板或底物，均顯示出高度的選擇性和效率，從而完成了本發明。具體地，發現了7-(2-噻吩基)-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)和吡咯-2-甲醛(Pa)間、以及Ds和4-丙炔基吡咯-2-甲醛(Pa’)(圖1a)間的疏水性堿基對在體外復制和轉錄中顯示出高選擇性(圖1c)。在復制中，本發明人等將常規的5’-三磷酸與修飾5’-三磷酸即5’-γ-三磷酸酰胺(5’—γ—アミド三リン酸)(圖1b)底物組合，進一步通過使用具有3’→5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶，實現了能夠對含有Ds-Pa堿基對的DNA片段進行PCR擴增的高選擇性。進一步，在基于T7RNA聚合酶的常規轉錄中將這些非天然型堿基互補地導入到了RNA中。更詳細地說，本發明人等考慮到以下的兩個理念對Ds-Pa堿基對進行了設計1)為了提高堿基對的選擇性，采用了形狀與天然型堿基不同的疏水性堿基(非專利文獻12、22)、2)增加了與聚合酶相互作用所必需的(非專利文獻23-25)質子受體基團，例如Ds的4位的氮(對應于A和G的3位)和Pa的醛基(對應于C和T的2位的酮基)。疏水性堿基對的致命問題是會有效地形成不遵從堿基形狀互補性的疏水性堿基-疏水性堿基間的堿基對(例如，Ds-Ds配對)(非專利文獻14、29)。為了測定復制中Ds-Pa堿基對的選擇性，本發明人等通過使用了無外切核酸酶活性的克列諾片段(KFexo-)的單核苷酸插入實驗，考察了底物與模板間的堿基對形成能力(圖2a)(非專利文獻30-32)。實驗中使用的底物(dDsTP和dPaTP)以及含Ds或Pa的模板DNA是化學合成的(實施例I及II)。實驗結果顯示形成Ds-Pa堿基對和形成A-T堿基對的選擇性高于其它組合的堿基間配對的選擇性(圖2b和表1及2)。表1利用克列諾片段的針對模板DNA的單核苷酸導入實驗表1a.測定如下進行在含50mMTris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、1mMDTT和0.05mg/ml牛血清白蛋白的溶液(10μl)中，使用5μM模板-引物雙鏈、5-50nM酶、和0.3-1500μM核苷5’-三磷酸，于37℃進行1-35分鐘。各變量用3～8個數據組平均化。b.標準偏差示于括號中。c.使用1500μM核苷5’-三磷酸和50nM酶進行20分鐘溫育后，基本上未檢出產物(<2％)。d.該術語的單位為％min-1M-1。表2利用克列諾片段的針對模板DNA的單核苷酸導入實驗表2-1a.測定如下進行在含50mMTris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、1mMDTT和0.05mg/ml牛血清白蛋白的溶液(10μl)中，使用5μM模板-引物雙鏈、5-50nM酶、和0.3-1500μM核苷5’-三磷酸，于37℃進行1-35分鐘。各數據用3～8個數據組平均化。b.標準偏差示于括號中。c.使用1500μM核苷5’-三磷酸和50nM酶溫育20分鐘后，基本上未檢出產物(<2％)。d.單位為％m-1M-1。然而，對應于模板中的Ds高效地摻入了dDsTP(Vmax/KM＝2.0×105)，這比對應于Ds的dPaTP的導入效率(Vmax/KM＝6.2×104)還要高。該Ds-Ds對是成問題的不遵從堿基形狀互補性的疏水性堿基-疏水性堿基間形成的堿基對，因此改變了B型DNA結構。其結果，對應于模板中的Ds，一旦導入了dDsTP，其后復制的延伸停止。例如，如果使用含Ds的模板DNA、在含dPaTP和dDsTP兩種底物的溶液中進行引物延伸反應，則隨著dDsTP的增加(dPaTP的0.5或1摩爾當量)，對應于模板中的Ds摻入了dDsTP，因而阻礙了通過具有3’→5’外切核酸酶活性的克列諾片段(KFexo+)進行的引物延伸(圖2d、泳道3和4)。因此，為了解決復制中的這種疏水堿基對的本質問題，本發明人等進一步采用了Ds的修飾5’-三磷酸即5’-γ-三磷酸酰胺(圖1b)(以dDsTPN表示)作為底物。本發明人等發現對應于模板中的Ds的dDsTPN的導入效率(Vmax/KM＝9.9×103)顯著下降。但是，進一步的問題是對應于模板中的Pa的dDsTPN的導入效率(Vmax/KM＝6.7×104)降低，接近于對應于模板中的Pa的A的導入效率(Vmax/KM＝4.3×104)的水平。這個問題通過使用A的5’-γ-三磷酸酰胺(dATPN)得到了解決。通過使用dATPN替代dATP，對應于模板Pa的dDsTPN的導入效率比對應于模板Pa的dATPN的導入效率(Vmax/KM＝1.8×103)高37倍，能夠保持Pa-Ds堿基對的高選擇性。因此，本發明人等通過組合使用常規的5’-三磷酸即dPaTP、dGTP、dCTP和dTTP、與5’-γ-三磷酸酰胺即dDsTPN和dATPN，在復制中實現了非天然型堿基對的高互補選擇性(圖2c)。在修飾底物dDsTPN的存在下，針對模板Ds導入Pa后的引物延伸反應無阻礙地進行(圖2d、泳道5和6)。而且，針對模板Pa導入dDsTPN、或者針對模板T導入dATPN后的引物延伸也有效地進行(圖2e、泳道2和圖2e、泳道14)。有趣的是，與針對模板Pa錯誤導入了dATP后的延伸反應相比，針對模板Pa錯誤導入了dATPN后的延伸反應的反應效率顯著降低(圖2e、泳道4和5)。為了進一步改善非天然型堿基對的選擇性，本發明人等在本系統中使用了具有3’→5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。通過使用KFexo+，顯著地降低了形成不希望的A-Pa和Ds-T堿基對后的引物延伸反應效率，引物延伸在非天然型堿基位置附近中止(圖2d泳道1、以及圖2e泳道9，10，17和18)。因此，本發明人等優選將常規5’-三磷酸底物和修飾5’-三磷酸底物與具有3’→5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶相組合，制成了在復制中與A-T和G-C堿基對一起發揮功能的特異性非天然型堿基對系統。非天然型堿基對因堿基間特異性形狀的互補性而形成，兩者之間不存在氫鍵相互作用。在復制中，通過將常規5’-三磷酸與修飾5’-三磷酸即5’-γ-三磷酸酰胺的組合作為DNA聚合酶的底物，該非天然型堿基對顯示出非常高的選擇性，其中，所述DNA聚合酶具有3’→5’外切核酸酶活性(exonuclease-proficient)，能夠進行優選為實用水平的高可信度的PCR擴增。含非天然型堿基的DNA片段的序列可以通過基于添加非天然型堿基底物的雙脫氧核苷酸鏈終止法的測序進行確定。而且，非天然型堿基對的互補性還能夠介導這些堿基通過常規T7轉錄導入RNA。本發明提供新型核酸擴增系統，其使用了以下1)-3)之一或者它們的組合。1)在復制反應中使用下述脫氧核糖核苷5’-三磷酸作為底物，所述脫氧核糖核苷5’-三磷酸的γ位磷酸羥基已被選自氨基、甲氨基、二甲氨基、巰基及氟基的基團替代；2)在復制反應中使用具有外切核酸酶活性的DNA聚合酶；以及3)利用后述的具有式1所示堿基的核苷酸與具有式2所示堿基的核苷酸的人工堿基對。以上，為了理解本發明，說明了直至構思出本發明的來龍去脈，但本發明的范圍不受上述說明的限制，而是由權利要求書的記載決定。核酸的復制方法本發明在一個方案中提供核酸的新復制方法。本發明的方法，其特征在于在復制反應中使用γ位磷酸羥基被選自氨基、甲氨基、二甲氨基、巰基及氟基的基團替代的脫氧核糖核苷5’-三磷酸作為底物。在復制反應中，通過用上述基團替代作為底物的脫氧核糖核苷5’-三磷酸的γ位磷酸羥基，進一步提高復制反應的選擇性。通過利用這樣的修飾5’-三磷酸，即使是在底物的攝取效率較使用無取代物低的情況下，通過提高選擇性，摻入人工堿基對的復制反應也能夠以實質上可利用的方式進行。優選所述替代基團為氨基。對于脫氧核糖核苷5’-三磷酸γ位磷酸羥基的修飾方法沒有特殊限制，可以采用公知的方法進行。例如，本說明書的實施例I-3-(15)及(16)公開了對應于取代基為氨基的情況的從核苷開始的合成例。或者，非專利文獻47也公開了γ-酰胺化核苷酸的合成方法。當取代基為甲氨基、二甲氨基、巰基、氟基等、氨基以外的基團時，本領域技術人員同樣可以采用公知的方法進行合成。對于復制反應，只要使用上述底物，沒有特殊限制，可以采用公知方法進行。并非限定，但例如，復制反應中為了防止形成不希望的非特異性堿基對，優選使用具有外切核酸酶活性的DNA聚合酶。具有外切核酸酶活性的聚合酶選自克列諾片段、T4DNA聚合酶及嗜熱菌來源的DNA聚合酶(例如，Thermococcuslitoralis來源的VentDNA聚合酶)，它們具有3’→5’外切核酸酶活性。作為本發明方法的一個方案，可以使用具有非天然型堿基的脫氧核糖核苷5’-三磷酸作為底物。近年來進行了具有異于天然型堿基對的氫模式、且能夠通過空間位阻來排斥與天然型堿基配對的堿基對的創造研究，已經報導了數種人工堿基對。已知人工堿基對是利用了堿基間的氫鍵的組合，或是利用了堿基的疏水性的組合，等等。本發明通過在具有這些非天然型堿基的核酸中對γ位磷酸羥基進行修飾，能夠提高轉錄、復制及/或翻譯反應中的選擇性、效率。對于本發明中的非天然型堿基的種類沒有特殊限制，包括利用例如具有下述公知的任意非天然型堿基的脫氧核糖核苷酸。2-氨基-6-二甲基氨基嘌呤(x)和2-氨基-6-噻吩基嘌呤(s)(非專利文獻33)2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基(s)和2-氧代-(1H)吡啶-3-基(y)(專利文獻1、非專利文獻17)2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤-9-基(v)和2-氧代-(1H)吡啶-3-基(y)(專利文獻3、非專利文獻18)吡咯-2-甲醛(Pa)和7-甲基-咪唑并[4，5-b]吡啶(Q)(非專利文獻26、非專利文獻34)本發明者進一步考察了新型人工堿基對，于2005年8月4日進行了專利申請(特愿2005-226492號)。上述申請涉及吡咯-2-甲醛(Pa)與2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基(s)的人工堿基對。上述堿基對特別是在以Pa為模板、以s為底物的轉錄反應中顯示出良好的選擇性。進一步，本發明人等在本發明中提供另外的新型人工堿基對。該新型人工堿基對也可以有效地用于本發明的復制反應。因而，并非限定，作為底物的脫氧核糖核苷5’-三磷酸是具有以下式1表示的堿基的脫氧核糖核苷5’-三磷酸，式1化學式13[此處，R1為氫或氨基，R2為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且A為N或CH]。或者，作為底物的脫氧核糖核苷5’-三磷酸是具有以下式2表示的堿基的脫氧核糖核苷5’-三磷酸式2化學式14此處，R3為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基團，而且R4為甲酰基或硝基]。在將式1的堿基及式2的堿基中的任何一個用于底物和/或模板時，在復制反應中顯示良好的選擇性、效率。而且，在轉錄反應中顯示良好的選擇性、效率。關于本發明中提供的式1的堿基與式2的堿基的新型人工堿基對，將在“基于本發明的人工堿基對的核酸”一項中進行詳細描述。或者，作為底物的脫氧核糖核苷5’-三磷酸也可以具有天然型堿基。脫氧核糖核苷的天然型堿基已知有腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及胸腺嘧啶(T)4種。與具有非天然型堿基的情況相同，在具有這些天然型堿基的情況下，γ位磷酸羥基被替代的脫氧核糖核苷5’-三磷酸也能夠作為底物有效地用于核酸的復制反應。脫氧核糖核苷5’-三磷酸本發明還提供γ位磷酸羥基已被選自氨基、甲氨基、二甲氨基、巰基及氟基的基團替代的脫氧核糖核苷5’-三磷酸。本發明的脫氧核糖核苷5’-三磷酸可以具有非天然型堿基，也可以具有天然型堿基。關于“非天然型堿基”及“天然型堿基”，如關于核酸的復制方法的描述。本發明的脫氧核糖核苷5’-三磷酸可以在上述本發明的核酸的復制方法中，作為底物使用。基于本發明的人工堿基對的核酸本發明者為了得到在復制、轉錄及翻譯的全部反應部效率和選擇性良好的人工堿基對，對通過自行開發的數種非天然型堿基對的組合而構建的堿基對進行了研究。其結果發現了2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤-9-基(s)(非專利文獻17、33)與2-甲酰基-1H-吡咯-1-基(Pa)(非專利文獻26)的組合在轉錄中顯示高度的選擇性和效率(專利文獻4未公開)。而且，在本發明中進一步制備了將s嘌呤環中的6員環的2個N原子之一替代為CH并將2位的氨基替換成氫(即脫氮雜、脫氨基化)的7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds)，考察了Ds與Pa人工堿基對的匹配性。其結果，發現Ds與Pa人工堿基對在復制和轉錄中無論哪一個作為模板或底物，均顯示出高度的選擇性和效率，從而想到了本發明。因而，本發明在其一個方案中提供下述核酸，所述核酸中，具有以下式1表示的堿基的核苷酸與具有以下式2表示的堿基的核苷酸形成了堿基對式1化學式15此處，R1為氫或氨基，R2為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且、A為N或CH]。式2化學式16此處，R3為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基團，而且R4為甲酰基或硝基。在本發明中，“核苷”是指核酸堿基與糖的還原基團通過糖苷鍵結合而形成的糖苷化合物。而且，“核酸堿基”的概念包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及這些堿基的衍生物。對“衍生物”的種類沒有特殊限制，具體地，可以列舉出例如上述式1表示的堿基、式2表示的堿基等。“核苷酸”是指所述核苷的糖部分與磷酸成酯而形成的化合物。更優選的是一、二、或三磷酸酯。核苷或核苷酸的糖部分可以是呋喃核糖基、2’-脫氧呋喃核糖基、或者2’位具有鹵素等取代基的2’-取代呋喃核糖基。并非限定，磷酸部分優選γ位磷酸羥基已被選自氨基、甲氨基、二甲氨基、巰基及氟基的基團替代。糖部分及磷酸部分可以采取見于公知的核苷、核苷酸或者其衍生物的結構。糖部分為呋喃核糖基的核糖核苷酸是RNA的構成成分，糖部分為脫氧呋喃核糖基的脫氧核糖核苷酸為DNA的構成成分。在式1的堿基中，R2的噻吩基、噻唑基或咪唑基可以無取代，或者，其4位及/或5位可以被獨立地選自甲基基、氨基、硝基及羥基中的一種或多種基團取代。在本發明的式1的堿基中，當R2為取代或無取代的2-噻吩基時，在本說明書的上下文中稱作“Ds”或“Ds類似物”。在本發明式1的堿基中，當R2為取代或無取代的2-噻唑基時，在本說明書的上下文中稱作「Dv」或「Dv類似物」。在本發明式1的堿基中，當R2為取代或無取代的1H-2-咪唑基時，在本說明書的上下文中稱作「Dm」或「Dm類似物」。在本說明書中，式1的R1，例如在稱作“Ds”時，包括R1為氫或者氨基的任何情況。與此相對，在現有技術文獻中，有時會根據R1的形式而區別描述，例如，R1為氨基時稱為“s”，R1為氫時稱為“s’”。A可以是N，也可以是CH。A為N的二氮雜物表述為例如“Ds”、“Dv”、“Dm”。A為CH時，表述為例如“DDs”、“DDv”、“DDm”。在本申請說明書中，例如，“Ds類似物”包括“DDs”等。進一步，根據上下文，有時將“DDs”、“Ds類似物”統稱表述為“Ds”。并非限定，優選式1的堿基選自以下基團A1)7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds)；A2)7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Dv)；A3)7-(1H-2-咪唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；A4)5-氨基-7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds)；A5)5-氨基-7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Dv)；A6)5-氨基-7-(1H-2-咪唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；A7)4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基(DDs)；A8)4-(2-噻唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基(DDv)；A-9)4-(1H-2-咪唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；A-10)6-氨基-4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基(DDs)；A-11)6-氨基-4-(2-噻唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基(DDv)；及A-12)6-氨基-4-(1H-2-咪唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基。上述堿基中，A1和A4為Ds，A7和A10為DDs。A2和A5為Dv，A8和A11為DDv。A3和A6為“Dm”，A9和A12為“DDm”。更優選的是A1)7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds)、A2)7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Dv)、A4)5-氨基-7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds)、或A5)5-氨基-7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Dv)。最優選的是7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds)(實施例I的化合物10或14)。本發明式1的堿基及包含該堿基的核苷、核苷酸可以采用公知方法合成。具體的，例如，本申請說明書的實施例I-3中公開了從2-氨基-3-硝基-4-氯吡啶(實施例I的化合物1)(非專利文獻41)開始合成7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds)的核苷5’-三磷酸及5’-γ-三磷酸酰胺(實施例I的化合物10或14)的方法。此外，實施例II-1公開了合成7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5]吡啶(實施例II的化合物4)(Dv)的核苷5’-三磷酸的方法。進一步，實施例II-3公開了合成4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(DDs)及4-(2-噻唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(DDv)的核苷5’-三磷酸的方法。此外，其它具有本發明式1的堿基的核苷、核苷酸、5’-γ-三磷酸酰胺也可以采用與本申請說明書具體公開的方法相同的方法及/或本領域技術人員已知的方法來合成。在本發明式2的堿基中，R3為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基團。上述烷基、烯基或炔基等可以進一步被用獨立地選自低級烷基、鹵素基、羥基、氨基、烷基氨基、及芳香族雜環中的一種或多種基團取代。或者，上述烷基、烯基或炔基等可以進一步被生物素或熒光分子取代。生物素又稱輔酶R，其是B族維生素中的1種。已知生物素可以與存在于卵清中的一種糖蛋白質即抗生物素蛋白特異性結合，形成復合體。因而，具有生物素作為取代基的核苷等可以與抗生物素蛋白特異性結合。因此，含有結合了生物素的核苷等的核酸能夠與結合了抗生物素蛋白的載體結合，所以能夠對核酸進行固定化、分離，而如果固定化結合特定分子的核酸(適體等)，則可以用于例如特定物質的檢測、分離，此外還可以用作診斷試劑。為了在式2堿基中的R3的烷基、烯基或炔基等上導入生物素，可以通過氨基直接結合生物素，也可以通過接頭來結合。熒光分子可以利用公知的熒光分子，優選從下組中選擇5-羧基熒光素(5-FAM)、6-羧基熒光素(6-FAM)、5-羧基四甲基羅丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基羅丹明(6-TAMRA)、5-二甲基氨基-1-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯熒光素(5-HEX)、6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯熒光素(6-HEX)、5-羧基-2’，4，7，7’-四氯熒光素(5-TET)、6-羧基-2’，4，7，7’-四氯熒光素(6-TET)、5-羧基-X-羅丹明(5-ROX)、6-羧基-X-羅丹明(6-ROX)和它們的衍生物。熒光素及羅丹明一般以開環型及螺環型兩種形式表示。例如，FAM的吸收極大波長為493nm、熒光極大波長為522nm。此外，TAMRA的吸收極大波長為553nm、熒光極大波長為578nm。DANSYL的吸收極大波長為335nm、熒光極大波長為518nm。HEX的吸收極大波長為535nm、熒光極大波長為556nm。TET的吸收極大波長為521nm、熒光極大波長為536nm。5-ROX的吸收極大波長為567nm、熒光極大波長為591nm。6-ROX的吸收極大波長為570nm、熒光極大波長為590nm。具有具有用熒光分子取代的R3的式2的堿基的核苷或核苷酸，可以根據熒光分子的種類進行核酸的檢測。因而，包含具有在式2的堿基中R3的烷基、烯基或炔基等被熒光分子取代的堿基的核苷酸的核酸，可以作為標記核酸而用作檢測與該核酸相互作用的物質的探針。此外，因各熒光分子不同而熒光顏色不同，還可以用于多重染色。為了在式2堿基中R3的烷基、烯基或炔基等上導入熒光分子，可以通過氨基直接結合熒光分子，也可以通過接頭來結合。而且，當通過接頭在式2堿基中R3的烷基、烯基或炔基等上結合生物素或熒光分子時，對接頭的種類沒有特殊限制，本領域技術人員能夠適當地采用。并非限定，但接頭優選從下述的化學式I和II中選擇化學式17[式I中、n為選自1～5的整數]及化學式18[式II中、m及1為獨立地選自1～5的整數]。R4為甲酰基或硝基。在式2的堿基中，當R4為甲酰基時，在本說明書中根據上下文稱作“Pa”或“Pa類似物”。當R4為硝基時，在本說明書根據上下文稱作“Pn”或“Pn類似物”。有些情況下，將“Pa”、“Pa類似物”、“Pn”、「Pn類似物”等統稱為“Pa”。并非限定，優選式2的堿基選自下組B1)2-甲酰基-1H-吡咯-1-基(Pa)；B2)2-甲酰基-4-碘-1H-吡咯-1-基；B3)2-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-1-基；B4)2-甲酰基-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；B5)2-甲酰基-4-(2-取代氨基乙烯基)-1H-吡咯-1-基；B6)2-甲酰基-4-(3-取代氨基-1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；B7)2-硝基-1H-吡咯-1-基(Pn)；B8)2-硝基-4-碘-1H-吡咯-1-基；B9)2-硝基-4-甲基-1H-吡咯-1-基；B10)2-硝基-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；B11)2-硝基-4-(2-取代氨基乙烯基)-1H-吡咯-1-基；及B12)2-硝基-4-(3-取代氨基-1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基。在上述堿基中，B1-B6為“Pa”或“Pa衍生物”，B7-B12為“Pn”或“Pn衍生物”。更優選的是B1)2-甲酰基-1H-吡咯-1-基(Pa)(實施例I的化合物19)、或B4)2-甲酰基-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基(實施例I的化合物20)。具有本發明式2的堿基的核苷、核苷酸可以采用公知方法合成。例如，Pa的起始原料例如吡咯-2-甲醛，可以從例如Aldrich公司[1003-29-8]、Merck公司[807574]購買。此外，Pa衍生物基本上是從Pa衍生合成。例如Pa的4位導入了丙炔的衍生物在Bioorg.Med.Chem.Lett.，13，p.4515-4518(2003)(非專利文獻28)中有所描述。本說明書實施例I的實施例I-3-(12)中，由吡咯-2-甲醛合成了1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(化合物17)。此外，在(13)中，由4-丙炔基-2-吡咯甲醛(化合物16)(非專利文獻40)合成了4-丙炔基-1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(化合物18)。而且，合成了這些核苷5’-三磷酸及5’-γ-三磷酸酰胺(化合物19及20)。此外，在本說明書的實施例II-2中，由2-硝基吡咯(化合物1)(非專利文獻49)合成了2-硝基吡咯(化合物1)(Pn)的核苷5’-三磷酸。本發明提供具有式1的堿基的核苷酸與具有式2的堿基的核苷酸形成了堿基對的核酸。在本說明書中，“核酸”是指多于1個的核苷酸、沿5’→3’方向結合而形成的核酸鏈分子。本發明的核酸包括單鏈或雙鏈的RNA或DNA。雙鏈可以是DNA/DNA、RNA/RNA、或DNA/RNA。此外，DNA包括以RNA為模板逆轉錄而成的cDNA。或者，核酸可以形成3鏈、4鏈等。本發明人等以進一步擴展核酸的功能為目標，開展了具有非天然型堿基的核苷或核苷酸的創造。作為新開發的人工堿基對的方案，包括具有式1的堿基的核苷酸與具有式2的堿基的核苷酸的堿基對。無論是具有式1的堿基的核苷酸還是具有式2的堿基的核苷酸，均能夠在復制和/或轉錄機制中，作為底物和/或模板高效率及/或高選擇性地發揮功能。盡管式1的堿基和式2的堿基之間例如，Ds和Pa之間不存在顯著的氫鍵相互作用(非氫鍵Ds-Pa堿基對)，但形成Ds-Pa堿基對的效率和選擇性卻與形成天然型堿基對的效率和選擇性同樣程度地高。該Ds-Pa堿基對顯示出比先前開發的親水性s-z堿基對更高的效率。可以認為Ds與Pa的互補形狀彼此匹配，但與天然型嘌呤類及嘧啶類的形狀不同。這種特異性立體化學匹配排除了與天然型堿基之間的不希望的堿基配對，其結果是，在復制和轉錄中得到了Ds-Pa的高選擇性。這樣，形狀-互補性對于復制、轉錄中的特異性堿基對形成起到了重要作用。本發明的、具有式1的堿基的核苷酸與具有式2的堿基的核苷酸，可以存在于不同的2條核酸上，通過堿基對形成雙鏈。或者，兩核苷酸可以存在于同一條核酸上。此時，單鏈可以通過堿基對形成環結構。本發明的具有式1的堿基的核苷酸及具有式2的堿基的核苷酸能夠通過復制、轉錄或逆轉錄反應摻入DNA或RNA等核酸。或者，可以與具有天然型堿基的核苷或核苷酸一樣，通過化學合成摻入DNA或RNA。復制、轉錄或逆轉錄反應可以按照公知方法進行。并非限定，例如，轉錄反應可以使用T7RNA聚合酶(Takara等)，復制反應可以使用克列諾片段(KF)，逆轉錄反應可以使用AMVReverseTranscriptaseXL(AMV-RT)(LifeScience公司)。并非限定，在一類方案中，本發明的核酸在核酸的復制、轉錄、或逆轉錄步驟中形成堿基對。當本發明的核酸在轉錄步驟形成堿基對時，可以是這樣的具有式1的堿基的核苷酸是DNA的一部分，具有式2的堿基的核苷酸是RNA的一部分，或者與此相反，具有式2的堿基的核苷酸是DNA的一部分，具有式2的堿基的核苷酸是RNA的一部分。本發明的非天然型堿基對系統的概要示于圖1c。本發明的系統在復制中的效果例如圖2b-e、圖3b-i、圖8～圖20所示。本發明的系統在轉錄中的效果例如圖4c-e、圖5a-c所示。核酸的制備方法本發明還提供制備包含具有以下式1表示的堿基的核苷酸的核酸的方法式1化學式19[此處，R1為氫或氨基，R2為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且A為N或CH]，該方法包括，以包含具有以下式2表示的堿基的核苷酸的核酸為模板進行轉錄、逆轉錄或復制，在所述具有式2的堿基的核苷酸的互補位置摻入所述具有式1的堿基的核苷酸式2化學式20[此處，R3為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基團，而且R4為甲酰基或硝基]。本發明還提供制備包含具有以下式2表示的堿基的核苷酸的核酸的方法式2化學式21此處，R3為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基團，而且R4為甲酰基或硝基，該方法包括，以包含具有以下式1表示的堿基的核苷酸的核酸為模板進行轉錄、逆轉錄或復制，在所述具有式1的堿基的核苷酸的互補位置摻入所述具有式2的堿基的核苷酸式1化學式22[此處，R1為氫或氨基，R2為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且A為N或CH]。關于具有式1表示的堿基的核苷酸、及具有式2表示的堿基的核苷酸的定義，如本說明書前面的“基于本發明的人工堿基對的核酸”一項中所述。本發明的目的還在于提供采用上述本發明的方法制備的、包含具有式1及/或式2的堿基的核苷酸的核酸。摻入了本發明的核苷酸的核酸可以用作tRNA、mRNA、反義DNA或RNA、核酶或適體。反義DNA或RNA是指抑制指定的基因表達的DNA或RNA。其因與目標基因序列(正義鏈)的全長或部分序列互補而得名。其可以用作人工調節基因表達的方法。摻入了本發明的核苷酸的反義DNA或RNA因為含有非天然型堿基，所以能夠創造出對于目標的互補性與只使用天然型堿基的時候不同的產品。核酶是以RNA為構成成分的催化劑的總稱。適體是通過體外篩選法獲得的、具有與蛋白質等一定分子結合功能的核酸。此外，摻入了本發明的核苷酸的核酸(DNA或RNA)(例如mRNA、合成RNA)也可以編碼蛋白質、肽的全體或其一部分。本發明的核酸可以用作基因片段和探針等。本發明中還包含天然基因的一部分或全部用本發明的核酸替代的方案，向天然基因中加入1個或者多個本發明的核苷酸的產物，或者這些情況的組合。此外，摻入了本發明的具有非天然堿基的核苷酸的核酸還可以用于RNA干涉(RNAinterference、RNAi)。RNA干涉是指如下現象通過雙鏈RNA(dsRNA)序列特異性地使mRNA分解，其結果抑制基因表達。RNA干涉的典型實例是屬于RNA酶III家族的切丁酶將dsRNA加工成3’末端具有2個堿基左右的突出端的約21堿基-23堿基的siRNA(shortinterferingRNA)。siRNA插入稱為RISC的siRNA-蛋白質復合體，序列特異性地分解mRNA。RNA干涉是在哺乳動物(人、小鼠等)、線蟲、植物、果蠅、真菌等廣泛的物種之間保守的現象。摻入了本發明的具有非天然堿基的核苷酸的核酸可以用作RNA干涉中的siRNA，或者將被分解的mRNA的一部分。核糖核苷5’-三磷酸本發明還提供具有以下式1表示的堿基的核糖核苷5’-三磷酸式1化學式23[此處，R1為氫或氨基，R2為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且A為N或CH]。關于取代基等式1的結構，如上述關于脫氧核糖核苷酸的描述。本發明還提供具有以下式2表示的堿基的核糖核苷5’-三磷酸式2化學式24[此處，R3為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基團，而且R4為甲酰基或硝基]。關于取代基等式2的結構，如上述關于脫氧核糖核苷酸的描述。本發明還提供具有以下式3表示的堿基的5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-(2-氰乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)脫氧核糖核苷式3化學式25[此處，R5為氫或取代氨基，R6為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且A為N或CH]。R5的取代氨基包括用甲基、異丁酰基、苯甲酰基等取代的氨基。R6與式1的R2相同。作為式3包含的化合物的例子，在實施例I中合成了化合物8。式3的化合物作為例如，復制及轉錄中的DNA模板的化學合成原料是有用的。此外，還提供具有以下式4表示的堿基的5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-(2-氰乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)脫氧核糖核苷式4化學式26[此處，R7為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基團，而且R8為甲酰基或硝基，但，排除R7為氫或1-丙炔基且R8為甲酰基的情況]。R7與式2的R3相同。R8與式2的R4相同。式4的化合物作為例如，復制及轉錄的DNA模板的化學合成原料是有用的。圖1a圖1a-c顯示了能夠進行特異性復制和轉錄的非天然型堿基對系統。圖1a顯示了非天然型Ds-Pa堿基對和天然型堿基對。圖1b圖1a-c顯示了能夠進行特異性復制和轉錄的非天然型堿基對系統。圖1b顯示了作為PCR和引物延伸的底物的非修飾5’-三磷酸(dNTP)和修飾5’-γ-三磷酸酰胺的結構。圖1c圖1a-c顯示了能夠進行特異性復制和轉錄的非天然型堿基對系統。圖1c顯示了在PCR擴增、引物延伸、DNA測序、和T7轉錄中發揮功能的非天然型堿基對系統。圖2a圖2a-e顯示了使用Ds-Pa堿基對的非天然型堿基對系統的單核苷酸插入和引物延伸實驗。圖2a為用于單核苷酸插入實驗的模板引物雙鏈的序列。圖2b圖2a-e顯示了使用Ds-Pa堿基對的非天然型堿基對系統的單核苷酸插入和引物延伸實驗。圖2b顯示了使用KFexo-時、針對各模板堿基的各非修飾底物(dN’TP)的導入效率。圖2c圖2a-e顯示了使用Ds-Pa堿基對的非天然型堿基對系統的單核苷酸插入和引物延伸實驗。圖2c顯示了使用KFexo-時、針對各模板堿基的各底物(非修飾底物dN’TP、N＝Pa、G、C、和T，以及修飾底物dN’TPN、N＝Ds和A)的導入效率。圖2d圖2a-e顯示了使用Ds-Pa堿基對的非天然型堿基對系統的單核苷酸插入和引物延伸實驗。圖2d顯示了在存在或不存在dDsTP或dDsTPN的情況下，使用dPaTP與天然型底物和含有Ds的模板，用KFexo+進行5分鐘引物延伸反應的結果。圖2e圖2a-e顯示了使用Ds-Pa堿基對的非天然型堿基對系統的單核苷酸插入和引物延伸實驗。圖2e為使用KFexo-或exo+進行的、添加一系列底物(DSN＝dDsTPN和AN＝dATPN)的、使用了含Pa的模板或者天然型模板的3分鐘引物延伸。各反應中不存在dGTP，因此全長產物主要為33-mer。圖3a圖3a-i顯示了含有Ds-Pa堿基對的DNA片段的DNA測序和PCR擴增。圖3a顯示了實驗方案。使用含有Ds和Pa的化學合成的DNA片段(91-mer和81-mer)通過引物延伸制備了雙鏈DNA片段(150-mer、DNA1)。圖3b圖3a-i顯示了含有Ds-Pa堿基對的DNA片段的DNA測序和PCR擴增。圖3b顯示了初始DNA片段(0循環)以及5和10循環后的PCR產物的瓊脂糖凝膠分析。DNA1是使用0.04/μlVENTDNA聚合酶，用下述PCR循環擴增得到的(94℃、0.5分；45℃、0.5分；65℃、4分)。僅含有天然型堿基的DNAcont1是使用0.01單位/μlVENTDNA聚合酶，用下述PCR循環擴增得到的(94℃、0.5分；45℃、0.5分；72℃、1分)。圖3c圖3a-i顯示了含有Ds-Pa堿基對的DNA片段的DNA測序和PCR擴增。圖3c-i顯示了按圖3a及b中說明的要領進行PCR及序列測定的結果。在存在(c-f)或不存在(g-i)dPa’TP的條件下，對使用非天然型堿基對系統進行10(d、g)和10+10(e，h)循環PCR后的、或者僅使用天然型底物進行10循環PCR(f)后的PCR產物，和PCR前的DNA1(c、g)進行測序。圖3c為PCR前(0循環)的dPa’TP存在下的測序結果。第40位的堿基是與模板的Ds的互補位置對應的堿基，測序反應中該位置摻入了Pa’。因而，僅在該部位，A、G、C、T中任何一個的峰均消失。圖3d圖3a-i顯示了含有Ds-Pa堿基對的DNA片段的DNA測序和PCR擴增。圖3c-i顯示了按圖3a及b中說明的要領進行PCR及序列測定的結果。圖3d為10循環PCR后的dPa’TP存在下的測序結果。第40位的堿基是與模板的Ds的互補位置對應的堿基，測序反應中該位置摻入了Pa’。因而，僅在該部位，A、G、C、T中任何一個的峰均消失。圖3e圖3a-i顯示了含有Ds-Pa堿基對的DNA片段的DNA測序和PCR擴增。圖3c-i顯示了按圖3a及b中說明的要領進行PCR及序列測定的結果。圖3e為10+10循環PCR后的dPa’TP存在下的測序結果。第40位的堿基是與模板的Ds的互補位置對應的堿基，測序反應中該位置摻入了Pa’。因而，僅在該部位，A、G、C、T中任何一個的峰均消失。圖3f圖3a-i顯示了含有Ds-Pa堿基對的DNA片段的DNA測序和PCR擴增。圖3c-i顯示了按圖3a及b中說明的要領進行PCR及序列測定的結果。圖3f為僅使用天然型底物而不存在s及Pa底物的條件下的PCR(10循環)后的dPa’TP存在下的測序結果。相當于第40位堿基的、模板DNA1中的Ds-Pa堿基對完全被替換成A-T堿基對(第40位的堿基T)。圖3g圖3a-i顯示了含有Ds-Pa堿基對的DNA片段的DNA測序和PCR擴增。圖3c-i顯示了按圖3a及b中說明的要領進行PCR及序列測定的結果。圖3g為PCR前(0循環)的不存在dPa’TP條件下的測序結果。第40位的堿基為與模板的Ds的互補位置對應的堿基，但因為不存在與Ds形成特異性堿基對的堿基，所以該位置以后的峰基本消失。圖3h圖3a-i顯示了含有Ds-Pa堿基對的DNA片段的DNA測序和PCR擴增。圖3c-i顯示了按圖3a及b中說明的要領進行PCR及序列測定的結果。圖3h為10循環PCR后的不存在dPa’TP條件下的測序結果。第40位的堿基為與模板的Ds的互補位置對應的堿基，但因為不存在與Ds形成特異性堿基對的堿基，所以該位置以后的峰基本消失。然而，還觀察到了堿基的非特異性摻入(通讀)。該通讀的峰隨PCR擴增的循環數增加而略微增大。圖3i圖3a-i顯示了含有Ds-Pa堿基對的DNA片段的DNA測序和PCR擴增。圖3c-iは、顯示了按圖3a及b中說明的要領進行PCR及序列測定的結果。圖3i為10+10循環PCR后的不存在dPa’TP條件下的測序結果。第40位的堿基為與模板的Ds的互補位置對應的堿基，但因為不存在與Ds形成特異性堿基對的堿基，所以該位置以后的峰基本消失。然而，還觀察到了堿基的非特異性摻入(通讀)。該通讀的峰隨PCR擴增的循環數增加而略微增大。圖4a圖4顯示了由Ds-Pa堿基對介導的T7轉錄。圖4a及圖4b為實驗方案。圖4b圖4顯示了由Ds-Pa堿基對介導的T7轉錄。圖4a及圖4b為實驗方案。圖4c圖4顯示了由Ds-Pa堿基對介導的T7轉錄。圖4c顯示了在存在(1mM)或不存在PaTP、Pa’TP或DsTP的條件下、使用天然型NTP(1mM)與模板(N＝Ds、Pa、Pa’、A或C)獲得的轉錄物的凝膠電泳。轉錄物是用[γ-32P]GTP標記的。各轉錄物的收率是通過與天然型轉錄物進行比較來確定的，所述天然型轉錄物是通過由天然型堿基構成的模板(N＝A或C)獲得的。各自的轉錄效率(收率)是3組數據的平均值。圖4d圖4顯示了由Ds-Pa堿基對介導的T7轉錄。圖4d及圖4e顯示了通過轉錄物(17-mer)的核酸酶消化得到的標記核糖核苷酸3’-一磷酸的2D-TLC分析結果。圖4e圖4顯示了由Ds-Pa堿基對介導的T7轉錄。圖4d及圖4e顯示了通過轉錄物(17-mer)的核酸酶消化得到的標記核糖核苷酸3’-一磷酸的2D-TLC分析結果。圖5a圖5顯示了含有非天然型反密碼子的tRNA分子的特異性T7轉錄。圖5a為在Pa’TP(3mM)或DsTP(2mM)的存在下、使用天然型NTP(2或3mM)和模板(DNA11-14和DNAcont4)獲得的tRNA轉錄物的凝膠電泳結果。對轉錄物進行了[α-32P]GTP內部標記。各轉錄物的收率是通過與由DNAcont4獲得的阻抑基因tRNACUA轉錄物相比較來確定的。各自的轉錄效率(收率)是3組數據的平均值。圖5b圖5顯示了含有非天然型反密碼子的tRNA分子的特異性T7轉錄。圖5b及圖5c顯示了由tRNACPa’A和tRNACUDs的轉錄物的核酸酶消化得到的標記核糖核苷3’-一磷酸的2D-TLC分析結果。圖5c圖5顯示了含有非天然型反密碼子的tRNA分子的特異性T7轉錄。圖5b及圖5c顯示了由tRNACPa’A和tRNACUDs的轉錄物的核酸酶消化得到的標記核糖核苷3’-一磷酸的2D-TLC分析結果。圖5d圖5顯示了含有非天然型反密碼子的tRNA分子的特異性T7轉錄。圖5d顯示了大腸桿菌無細胞系統(RTS-100、Roche)中的tRNA轉錄物的氨酰化。將用[α-32P]GTP內部標記的tRNA轉錄物在無細胞系統中于30℃溫育30分鐘，用含0.2MTris-醋酸(pH4.75)和3mMEDTA的10％聚丙烯酰胺凝膠對氨酰化tRNA進行電泳分析。圖6圖6顯示了用于PCR、測序和轉錄實驗的DNA片段的序列。圖7a圖7顯示了化學合成的DNA片段的序列。圖7b圖7顯示了化學合成的DNA片段的序列。圖8圖8顯示了含0-10％DNAcont1的DNA1的不存在dPa’TP條件下的染料終止測序。通過將該峰模式與含有Ds-Pa堿基對的DNA片段的PCR峰模式相比較，可以考察Ds-Pa堿基對在PCR中的保真度。圖9圖9顯示了來自300mM的dDSTPN、dPaTP、dATP、dGTP、dCTP、dTTP與DNA1的PCR產物的染料終止測序。存在(a-c)或不存在(d-f)dPa’TP的條件下，對DNA1的10循環(b、e)或10+10循環(c，f)后的PCR產物、和初始DNA1(a、d)進行測序。使用dATP代替dATPN進行PCR，則保真度明顯降低(e，f)。圖10圖10顯示了使用32P-標記5’-或3’-引物獲得的PCR產物的放射自顯影。使用32P-標記5’-和非標記3’-引物、或32P-標記3’-和非標記5’-引物，在含DNA1(a)或DNAcont1(b)的VentDNA聚合酶用緩沖液(100μl)中進行PCR。從1、3、5、10及15個PCR循環后的各反應溶液中，取出一部分(10μl)在10％聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠上進行分析。使用生物影像分析儀對凝膠上的產物進行分析、定量。各循環各自的效率(Y)是通過使用以下一般曲線擬合的KaleidaGraph計算的。Nf＝N0×(1+Y)n[此處，n為PCR循環數(n＝1、3、5及10)，N0為最初的拷貝數，Nf為n個循環后的產物拷貝數]。Nf由下式確定。Nf＝N0+P0×(Ifull/Itotal)[此處，P0為32P-標記引物數，Ifull為相當于全長產物的條帶的計數(カウント)，Itotal為泳道中的條帶的總計數]。確定的Y值示于下表。表2-2圖11圖11為含有Ds及Pa的化學合成片段的從不同樣品(a-d)制備的DNA2及4片段的PCR產物的不存在dPa’TP條件下的染料終止測序結果。由該結果可知化學合成的含Ds-Pa堿基對的DNA片段的純度影響PCR后的峰模式。即，此前求出的PCR中Ds-Pa堿基對的保真度(99.8％)依賴于化學合成DNA片段的純度，因此，其保真度可以認為比99.8％更高。圖12圖12顯示了通過瓊脂糖凝膠電泳確定的由DNA1、DNA3-10及DNAcont1得到的PCR產物的擴增效率。PCR產物在4％瓊脂糖凝膠上進行檢測，用溴化乙啶染色。而且，使用MolecularImagerFXPro系統及QuantityOne軟件(Bio-Rad)對染色條帶的強度進行了定量。使用下式確定擴增效率(PCR產物的強度)/(用于PCR的輸入DNA的強度)。效率是3-4組數據的平均值。在括號內示出標準偏差。圖13圖13顯示了使用引物2時、由DNA2得到的PCR產物的染料終止測序結果。圖14圖14顯示了使用引物2時、由DNA3得到的PCR產物的染料終止測序結果。圖15圖15顯示了使用引物2時、由DNA4得到的PCR產物的染料終止測序結果。圖16圖16顯示了使用引物1時、由DNA5得到的PCR產物的染料終止測序結果。圖17圖17顯示了使用引物1時、由DNA6得到的PCR產物的染料終止測序結果。圖18圖18顯示了使用引物2時、由DNA7得到的PCR產物的染料終止測序結果。圖19圖19顯示了使用引物2時、由DNA8得到的PCR產物的染料終止測序結果。圖20圖20顯示了使用引物2時、由DNA9得到的PCR產物的染料終止測序結果。圖21圖21顯示了大腸桿菌來源的無細胞翻譯系統中含有非天然型反密碼子的tRNA的氨酰化方案。圖22圖22顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶的核苷衍生物的合成方案。試劑及簡寫(a)二氯雙(三苯基膦)合鈀、2-(三丁基甲錫烷基)噻吩、DMF；(b)碳化鈀、硼氫化鈉、乙醇、乙酸乙酯；(c)甲酸；(d)NaH、2-脫氧-3，5-二-O-p-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖基氯化物(ペントフラノシルクロリド)、CH3CN；(e)NH3、甲醇；(f)及(l)4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷、吡啶；(g)2-氰乙基四異丙基亞磷酰二胺(テトライソプロピルホスホルジアミダイト)、四唑、CH3CN；(h)及(m)乙酸酐、吡啶、然后是二氯醋酸、二氯甲烷；(i)及(n)2-氯-4H-1，3，2，-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿(ベンヅジオキサホスフオリン)-4-酮、二噁烷、吡啶、三丁胺、雙(三丁基銨)焦磷酸鹽、DMF、然后是I2/吡啶、水、NH4OH(5’-三磷酸時)、I2/吡啶、NH4OH(5’-γ-三磷酸酰胺時)；(j)四-O-乙酰-β-D-呋喃核糖、氯醋酸；(k)氨飽和甲醇。Tol甲苯酰、DMT4，4’-二甲氧基三苯甲基、Ac乙酰基圖23圖23顯示了吡咯-2-甲醛、4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷衍生物、及6-氨基-9-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)嘌呤5’-γ-三磷酸酰胺的合成方案。試劑及簡寫(a)NaH、2-脫氧-3，5-二-O-p-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖基氯化物、CH3CN；(b)氨飽和甲醇；(c)4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷、吡啶；(d)2-氰乙基-N，N’-二異丙基氨基氯代亞磷酰胺、二異丙基乙基胺、THF；(e)1，8-雙二甲氨基萘(質子スポンジ)、POCl3、三甲基磷酸、然后是三丁胺、雙(三丁基銨)焦磷酸鹽、DMF；(f)NaH、CH3CN、接著，2，3，5-三-O-芐基-D-呋喃核糖基氯化物；(g)BBr3、二氯甲烷；(h)2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿-4-酮、二噁烷、吡啶、三丁胺、雙(三丁基銨)焦磷酸鹽、DMF、接著，I2/吡啶、水、NH4OH(5’-γ-三磷酸酰胺時)；Tol甲苯酰、DMT4，4’-二甲氧基三苯甲基、Ac乙酰基圖24a圖24顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR譜。圖24a為化合物6及11的1HNMR(270MHz、DMOSO-d6)譜。圖24b圖24顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR譜。圖24b為化合物6及11的1HNMR(270MHz、DMOSO-d6)譜(7.0-9.0ppm)。圖24c圖24顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR譜。圖24c為化合物6的1DNOE譜(DMOSO-d6中)。圖24d圖24顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR譜。圖24d為化合物11的1DNOE譜(DMOSO-d6中)。圖24e圖24顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR譜。圖24e為化合物6的13CNMR(75MHz、DMOSO-d6)譜。圖24f圖24顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR譜。圖24f為化合物6的2DCOSY譜。圖24g圖24顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR譜。圖24g為化合物6的2DNOESY譜。圖24h圖24顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR譜。圖24h為化合物6的2DHSQC譜。圖24i圖24顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR譜。圖24i為化合物6的2DHMBC譜。圖24j圖24顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR譜。圖24j為化合物6的2DHMBC譜(放大)。圖24k圖24顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR譜。圖24k為化合物11的13CNMR(75MHz、DMOSO-d6)譜。圖24l圖24顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR譜。圖241為化合物11的2DCOSY譜。圖24m圖24顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR譜。圖24m為化合物11的2DNOESY譜。圖24n圖24顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR譜。圖24n為化合物11的2DHSQC譜。圖24o圖24顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR譜。圖24o為化合物11的2DHMBC譜。圖24p圖24顯示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR譜。圖24p為化合物11的2DHMBC譜(放大)。圖25a圖25顯示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR譜。圖25a為化合物17的1HNMR(300MHz、DMOSO-d6)譜。圖25b圖25顯示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR譜。圖25b為化合物17的13CNMR(75MHz、DMOSO-d6)譜。圖25c圖25顯示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR譜。圖25c為化合物17的2DCOSY譜。圖25d圖25顯示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR譜。圖25d為化合物17的2DHSQC譜。圖25e圖25顯示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR譜。圖25e為化合物17的2DHMBC譜。圖25f圖25顯示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR譜。圖25f為化合物17的2DNOESY譜。圖25g圖25顯示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR譜。圖25g為化合物18的1HNMR(300MHz、DMOSO-d6)譜。圖25h圖25顯示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR譜。圖25h為化合物18的13CNMR(75MHz、DMOSO-d6)譜。圖25i圖25顯示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR譜。圖25i為化合物18的2DCOSY譜。圖25j圖25顯示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR譜。圖25j為化合物18的2DNOESY譜。圖25k圖25顯示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR譜。圖25k為化合物18的2DHSQC譜。圖251圖25顯示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR譜。圖251為化合物18的2DHMBC譜。圖25m圖25顯示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR譜。圖25m為化合物17的1DNOE譜(DMOSO-d6中)。圖25n圖25顯示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR譜。圖25n為化合物18的1DNOE譜(DMOSO-d6中)。圖26圖26顯示了脫氧腺苷5’-γ-三磷酸酰胺的DEAESephadex離子交換柱洗脫模式。白圈為260nm的結果，黑圈為280nm的結果。圖27圖27為脫氧腺苷5’-γ-三磷酸酰胺的ESI-質譜。圖28a圖28a為脫氧腺苷5’-γ-三磷酸酰胺的1HNMR(270MHz、D2O)譜。圖28b圖28b為脫氧腺苷5’-γ-三磷酸酰胺的1PNMR(109MHz、D2O)譜。圖29a圖29a顯示了7-(2-噻吩基)-3-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)3H-咪唑并[4，5-b]吡啶5’-γ-三磷酸酰胺(上)與5’-三磷酸(下)的1HNMR(270MHz、D2O)譜。圖29b圖29b顯示了7-(2-噻吩基)-3-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)3H-咪唑并[4，5-b]吡啶5’-γ-三磷酸酰胺(上)與5’-三磷酸(下)的1PNMR(109MHz、D2O)譜。圖30a圖30a顯示了7-(2-噻吩基)-3-(β-D-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶5’-三磷酸(化合物14)的1HNMR(300MHz、D2O)譜。圖30b圖30b顯示了1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(化合物19)的1HNMR(270MHz、D2O)譜。圖30c圖30c顯示了4-丙炔基-1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(化合物20)的1HNMR(270MHz、D2O)譜。圖31a圖31a顯示了7-(2-噻吩基)-3-(β-D-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶5’-三磷酸(化合物14)的31PNMR(109MHz、D2O)譜。圖31b圖31b顯示了1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(化合物19)的31PNMR(109MHz、D2O)譜。圖31c圖31c顯示了4-丙炔基-1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(化合物20)的31PNMR(109MHz、D2O)譜。圖32圖32顯示了C35H40O17P2S的電噴霧離子化質譜(ESI-MS)結果。C35H40O17P2S計算值924.17(1-)；461.58(2-)測定值924.02(1-)；461.70(2-)圖33圖33顯示了7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶的核苷衍生物的合成方案。試劑及簡寫(a)二氯雙(三苯基膦)合鈀、2-(三丁基甲錫烷基)噻唑、DMF；(b)碳化鈀、硼氫化鈉、乙醇、乙酸乙酯；(c)甲酸；(d)NaH、2-脫氧-3，5-二-O-p-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖基氯化物、CH3CN；(e)氨飽和甲醇；(f)4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷、吡啶；(g)2-氰乙基-N，N-二異丙基氨基氯代亞磷酰胺、二異丙基乙基胺，THF；(h)乙酸酐、吡啶、然后是二氯醋酸、二氯甲烷；(i)2-氯-4H-1，3，2，-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿-4-酮、二噁烷、吡啶、三-正丁基胺、雙(三丁基銨)焦磷酸鹽、I2/吡啶、水、NH4OH。Tol甲苯酰、DMT4，4’-二甲氧基三苯甲基、Ac乙酰基圖34圖34顯示了2-硝基吡咯(化合物1)的核苷衍生物的合成方案。試劑及簡寫(a)NaH、2-脫氧-3，5-二-O-p-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖基氯化物、CH3CN；(b)氨飽和甲醇；(c)4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷、吡啶；(d)2-氰乙基-N，N’-二異丙基氨基氯代亞磷酰胺、二異丙基乙基胺、THF；(e)乙酸酐、吡啶、接著，二氯醋酸、二氯甲烷；(f)2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿-4-酮、二噁烷、吡啶、三-正丁基胺、雙(三丁基銨)焦磷酸鹽、I2/吡啶、水、NH4OH。Tol甲苯酰、DMT4，4’-二甲氧基三苯甲基、Ac乙酰基圖35圖35顯示了4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(DDs)及4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(DDv)的核苷衍生物的合成方案。試劑及簡寫(a)mCPBA、EtOAc、接著，甲磺酰氯、DMF；(b)NaI、CH3COCl、CH3CN；(c)NaH、2-脫氧-3，5-二-O-p-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖基氯化物、CH3CN；(d)二氯雙(三苯基膦)合鈀、2-(三丁基甲錫烷基)噻吩或2-(三丁基甲錫烷基)噻唑、DMF；(e)氨飽和甲醇；(f)4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷、吡啶；(g)2-氰乙基-N，N-二異丙基氨基氯代亞磷酰胺、二異丙基乙基胺，THF；(h)乙酸酐、吡啶、然后是二氯醋酸、二氯甲烷；(i)2-氯-4H-1，3，2，-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿-4-酮、二噁烷、吡啶、三-正丁基胺、雙(三丁基銨)焦磷酸鹽、I2/吡啶、水、NH4OH。Tol甲苯酰、DMT4，4’-二甲氧基三苯甲基、Ac乙酰基圖36圖36顯示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-生物素酰胺-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物28)的合成方案。試劑和簡寫(a)NaH、CH3CN、然后是2，3，5-三-O-芐基-D-呋喃核糖基氯化物；(b)BBr3、二氯甲烷；(c)3-(二氯乙酰胺)-1-丙炔、四(三苯基膦)鈀、CuI、三乙胺、DMF；(d)4，4’-二甲基三苯甲基氯化物、吡啶；(e)乙酸酐、吡啶、接著，二氯醋酸、二氯甲烷；(f)2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿-4-酮、二噁烷、吡啶、三-正丁基胺、雙(三丁基銨)焦磷酸鹽、DMF、接著，I2/吡啶、水、NH4OH；(g)生物素-N-羥基琥珀酰亞胺(ヒドロキシスクシンイミド)、DMF、碳酸鈉緩沖液(pH8.6)、然后是NH4OH。DMTr4，4’-二甲氧基三苯甲基、Ac乙酰基。圖37圖37顯示了4-碘吡咯-2-甲醛的核糖核苷的1HNMR(500MHz、DMSO-d6)譜。圖38a圖38顯示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物24)的NMR譜。圖38a為化合物24的1HNMR(300MHz、DMSO-d6)譜。圖38b圖38顯示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物24)得NMR譜。圖38b為化合物24的13CNMR(75MHz、DMSO-d6)譜。圖38c圖38顯示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物24)的NMR譜。圖38c為化合物24的2DCOSY譜。圖38d圖38顯示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物24)的NMR譜。圖38d為化合物24的2DNOESY譜。圖38e圖38顯示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物24)的NMR譜。圖38e為化合物24的2DHMQC譜。圖38f圖38顯示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物24)的NMR譜。圖38f為化合物24的2DHMBC譜。圖38g圖38顯示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物24)的NMR譜。圖38g為化合物24的2DHMBC譜(放大)。圖39圖39顯示了1-[5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物25)的1HNMR(500MHz、DMSO-d6)譜。圖40圖40顯示了1-(2，3-二-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物26)的1HNMR(500MHz、DMSO-d6)譜。圖41圖41顯示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-氨基-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物27)和1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-生物素酰胺-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物28)的DEAESephadex離子交換柱洗脫模式。圖42圖42顯示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-氨基-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物27上譜)和1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-生物素酰胺-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物28下譜)的ESI質譜。圖43a圖43顯示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-生物素酰胺-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物28)的NMR譜。圖43a為化合物28的1HNMR(300MHz、D2O)譜。圖43b圖43顯示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-生物素酰胺-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物28)的NMR譜。圖43b為化合物28的2DCOSY譜。圖43c圖43顯示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-生物素酰胺-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物28)的NMR譜。圖43c為化合物28的31PNMR(109MHz、D2O)譜。圖44a圖44a顯示了生物素化的PaTP(Bio-PaTP化合物28)的化學結構。圖44b圖44b顯示了關于RNA分子部位特異性生物素化的轉錄和轉錄物分析實驗方案，所述RNA分子的部位特異性生物素化利用了使用Ds-Pa堿基對的T7轉錄。圖44c圖44c為RNA分子部位特異性生物素化實驗所得的轉錄物的凝膠電泳照片，所述RNA分子部位特異性生物素化利用了使用Ds-Pa堿基對的T7轉錄。泳道1-4為使用通過連接得到的模板時的結果、泳道5-12為使用PCR擴增的模板時的結果。使用DNA6(泳道1、2、5、6、9、10)作為模板，并且使用DNAcont2(泳道3、4、7、8、11、12)作為對照，在存在(2mM)或不存在Bio-PaTP的條件下，與天然型NTPs(2mM)一起進行轉錄反應。轉錄物用[γ-32P]GTP標記。圖44d圖44d為照片，其顯示用于生物素化轉錄物分析的凝膠電泳遷移測定(ゲルシフトアツセイ)的結果。將使用Bio-PaTP由通過連接而得的模板即DNA6和PCR擴增(20循環)出的模板即DNAcont2轉錄的152-merRNA、以及使用生物素化UTP(Bio-UTP)由通過連接而得的模板即DNAcont5和DNAcont6轉錄的152-merRNA與鏈霉菌抗生物素蛋白混合。在7％聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠上分離生物素化RNA-鏈霉菌抗生物素蛋白復合體與單獨的RNA，然后根據條帶的強度確定復合體的比例(收率)。圖44e圖44e為照片，其顯示了在第59位含有Bio-Pa或A的152-mer轉錄物的序列分析結果。將5’末端用32P的標記的轉錄物用RNaseT1(T1)或堿(AL)部分消化。將一部分用堿部分消化的轉錄物用鏈霉菌抗生物素蛋白磁珠處理，捕捉含Bio-Pa的RNA片段(AL+SA)，其余的進行電泳。各消化片段在10％聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠上進行分析。圖45圖45顯示了2-硝基吡咯的4位修飾核苷衍生物的合成方案。試劑及簡寫(a)N-碘琥珀酰亞胺、CH3CN；(b)丙炔基-1-三丁基錫、Pd(PPh3)2Cl2、DMF或N-(2-丙炔基)-二氯乙酰胺、Pd(PPh3)4、CuI、三乙胺、DMF；(c)4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷、吡啶；(d)2-氰乙基-N，N-二異丙基氨基氯代亞磷酰胺、二異丙基乙基胺、THF；(e)乙酸酐、吡啶、然后是二氯醋酸、二氯甲烷；(f)2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿-4-酮、二噁烷、吡啶、三-正丁基胺、雙(三丁基銨)焦磷酸鹽、I2/吡啶、水、NH4OH。DMTr4，4’-二甲氧基三苯甲基、Ac乙酰基。圖46圖46顯示了NH2-hx-dPnTP、ROX-hx-dPnTP及FAM-hx-dPnTP的合成方案。試劑及簡寫(a)CuI、Pd[P(C6H5)3]4、DMF、三乙胺、室溫、接著，N-(2-丙炔基)-6-三氟乙酰胺基己酰胺(N—(2—プロピニル)—6—トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド)；(b)DMTr-Cl、吡啶、室溫；(c)乙酸酐、吡啶、室溫、接著，二氯醋酸、二氯甲烷、0℃；(d)2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿-4-酮/二噁烷、吡啶、三-正丁基胺、三(三正丁銨)焦磷酸、DMF、接著，I2/吡啶、水、NH4OH、室溫；(e)R-N-羥基琥珀酰亞胺酯(R＝FAM或ROX)/DMF，0.1MNaHCO3-Na2CO3緩沖液(pH8.5)、室溫、8小時、接著，NH4OH。圖47圖47顯示了NH2-hx-PaTP、FAM-hx-PaTP及TAMRA-hx-PaTP的合成方案。試劑及簡寫(a)CuI，Pd[P(C6H5)3]4、DMF、三乙胺、室溫、接著，N-(2-丙炔基)-6-三氟乙酰胺基己酰胺；(b)DMTr-Cl、吡啶、室溫；(c)乙酸酐、吡啶、室溫、接著，二氯醋酸、二氯甲烷、0℃；(d)2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿-4-酮/二噁烷、吡啶、三-正丁基胺、雙(三正丁銨)焦磷酸、DMF、接著，I2/吡啶、水、NH4OH、室溫；(e)R-N-羥基琥珀酰亞胺酯(R＝FAM或TAMRA)/DMF，0.1MNaHCO3-Na2CO3緩沖液(pH8.5)、室溫、8小時、接著，NH4OH。圖48圖48顯示了利用使用克列諾片段的復制將結合有氨基、熒光染料的底物Pn導入DNA(55-mer)中的方案及其結果。圖49圖49顯示了利用使用T7RNA聚合酶的轉錄將結合有熒光染料的底物Pa導入RNA(17-mer)中的方案及其結果。實施例以下，通過實施例具體說明本發明，但這些實施例并不是對本發明技術的范圍的限定。本領域技術人員能夠基于本說明書的記載容易地對本發明加以修飾、變更，這些也包含在本發明的技術范圍內。實施例I化學合成-11.一般方法及材料試劑及溶劑購自標準的供應商，不做進一步純化而直接使用。二維薄層色譜(2DTLC)使用含254nm熒光指示劑(Merck)的0.25mm硅膠60板，對轉錄反應進行監測。1HNMR、13CNMR及31PNMR譜在JEOLEX270及BRUKER核磁共振譜儀(300MHz及600MHz)上進行記錄。在具備分離型(分取用)C18柱(WatersMicrobondSphere、150×19mm)的GilsonHPLC系統上進行核苷純化。用DEAE-SephadexA-25柱(300×15mm)及分析型C18柱(SynchropakRPP、250×4.6mm、EichromTechnologies)進行三磷酸衍生物的純化。高分辨率質譜(HRMS)及電噴霧離子化質譜(ESI-MS)分別在具備Waters2690LC系統的JEOLHX-110或JM700質譜儀及WatersMICROMASSZMD4000上進行記錄。熒光測定使用FP-6500熒光光譜儀(JASCO)進行。吡咯-2-甲醛(非專利文獻39)及4-丙炔基吡咯-2-甲醛(非專利文獻40)按已有文獻的記載合成。2.化合物合成的說明7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶的合成通過圖22記載的反應進行。具體地，7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物4)是從2-氨基-3-硝基4-氯吡啶(化合物1)(非專利文獻41)出發經3個步驟合成的(72％)。7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶的脫氧核糖核苷(化合物6)是如下獲得的1-氯-2-脫氧-3，5-二-O-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖(ペントフラノ—ス)(非專利文獻42)與化合物4的鈉鹽反應、然后，通過使用甲醇銨的化合物5的甲苯酰基脫保護，由化合物4以單一產物的形式得到，收率為61％。7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶的核糖核苷(化合物11)是在200℃下，使用催化劑量的氯醋酸，通過四-O-乙酰-β-D-呋喃核糖與4的反應合成的。化合物11是在氨飽和甲醇脫保護及RP-HPLC純化后得到的，其收率為29％。通過NMR及高分辨核磁共振波譜學確認了核苷6及11的結構(1.“一般方法及材料”項中的化合物6及11的NMR譜)。化合物6和化合物11的芳香族質子峰顯示出相同的化學位移。此外，化合物6和化合物11的HMBC及HSQC顯示出在糖C1’與咪唑并[4，5-b]吡啶堿基部分的N-3位之間形成有N-糖苷鍵。進一步，本發明人等通過2DNOESY及2DHMBC譜確認了化合物6及11的噻吩基部分結合在咪唑并[4，5-b]吡啶環的7位。化合物6及11的異頭物結構通過2DNOESY及1DNOE確定為β體。1DNOE實驗的主要結果是H1’質子照射在化合物6及11中分別帶來了H4’信號的2％和3％的增強，以及H2信號的8％及9％的增強。差別NOE實驗中，當照射H2質子時，得到了H1’信號的9％及10％增強、H2’及H3’信號的3-5％增強。因而，基于NOE實驗，將化合物6及11的異頭物結構確定為β結構。采用常規方法將化合物6轉化為亞磷酰胺(アミダイト)，而且通過電噴霧離子化質譜儀(ESI-MS)確認了Tp(6)pT三聚體的生成。參見“吡咯-2-甲醛、4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷衍生物、及6-氨基-9-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)嘌呤5’-γ-三磷酸酰胺”項中的三聚體的質譜)。采用常規方法(非專利文獻43)合成了化合物10及14的核苷5’-三磷酸作為酶反應的底物。吡咯-2-甲醛(化合物15)及4-丙炔基吡咯-2-甲醛(化合物16)的核苷衍生物的合成通過圖23記載的反應實現。化合物15及16的脫氧核苷衍生物的合成已有報導(非專利文獻39及40)。化合物15及16的核糖核苷如下合成2，3，5-三-O-芐基-D-呋喃核糖基氯化物(非專利文獻44)與化合物15或16的鈉鹽反應，然后，通過BBr3處理進行芐基的脫保護。這樣，通過2個步驟分別得到了化合物17(收率15％)及化合物18(收率7％)的核糖核苷。根據NMR(參照圖25中化合物17及18的NMR譜)及高分辨核磁共振波譜學確認了化合物17及18的結構。化合物17及18的HMBC及HSQC譜在C1’碳方面顯示在糖與吡咯堿基部分之間形成有N-糖苷鍵。通過NOE實驗(差別NOE及NOESY譜)確認了化合物17及18的異頭物結構。差別NOESY譜實驗的主要結果如下。H1’質子的照射帶來了H4’信號的3-4％增強。當照射H2’(及/或H3’)質子時，得到了H5信號的9-10％增強。化合物17及18的NOESY譜在H1’與H4’間、H1’與CHO質子間、以及H5與H2’(及/或H3’)間顯示交叉峰。因此，基于NOENMR將化合物17及18的異頭物結構確定為β結構。采用常規方法(非專利文獻45)將化合物17及18的核糖核苷轉化為核糖核苷5’-三磷酸。按現有技術文獻(非專利文獻43及45)中公開的方法合成了核苷5’-三磷酸。5’-γ-三磷酸酰胺的合成按改進的常規方法(非專利文獻43)進行。對于化合物9及21的保護核苷，用2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿-4-酮進行了亞磷酸化。通過偏磷酸處理，將保護的核苷亞磷酸衍生物轉化為P2，P3-二氧代-P1-5’-核苷環三磷酸(ヌクレオシジルシクロ三磷酸)。用碘/水處理后，將所得的5’-三甲基磷酸用濃氨水處理，得到核苷5’-γ-三磷酸酰胺。5’-γ-三磷酸酰胺的純化通過陰離子交換DEAESephadex色譜柱及RP-HPLC進行。脫氧腺苷5’-γ-三磷酸酰胺的DEAE柱洗脫模式及電噴霧離子化質譜如圖(圖26及27)所示。在5’-γ-三磷酸酰胺的合成中，也形成了脫氧腺苷的5’-三磷酸，而且，由級分吸光度的計算值可知5’-γ-三磷酸酰胺與5’-三磷酸的比例為4.8:1。與脫氧腺苷的5’-磷酸(dATP)相比，化合物22先被洗脫，通過DEAE柱純化將其分離。通過ESI-MS譜確認了5’-γ-三磷酸酰胺的分子量。化合物22與dATP的差異為1m/z。通過HPLC進行最終純化，以三乙銨鹽的形式得到了核苷5’-γ-三磷酸酰胺。而且，通過NMR譜學(1H及31PNMR)確認了其結構。脫氧腺苷5’-γ-三磷酸酰胺及化合物6的γ-磷酸信號與化合物6，11、17及18的5’-磷酸的γ-磷酸信號相比，發生了低場位移(低磁埸シフト)(-0.50及-0.52p.p.m)。使用鳥苷的5’-γ-三磷酸酰胺，同樣觀察到了該現象。3.合成的具體說明(1)2-氨基-3-硝基-4-(2-噻吩基)吡啶(化合物2)在氬氣氛圍下，向DMF(50ml)中的2-氨基-3-硝基-4-氯吡啶(化合物1)(非專利文獻41)(1.74g、10mmol)及二氯雙(三苯基膦)合鈀(II)(350mg、0.50mmol)的溶液中添加2-(三丁基甲錫烷基)噻吩(3.82ml、12mmol)。將所得混合物于100℃攪拌4小時。將混合物加到水中(250ml)，并且用乙酸乙酯(250ml×3)抽提。在Na2SO4上干燥，然后減壓下蒸去溶劑。將殘渣填充至使用二氯甲烷:乙酸乙酯(100:1至49:1)作為洗脫劑的快速硅膠色譜柱(フラツシユシリカゲルクロマトグラフイ—)中。得到了2.07g的化合物2(二氯甲烷:乙酸乙酯＝19:1的Rf為0.30)，收率93％。1HNMR(270MHz，CDCl3)δ8.17(d，1H，J＝5.1Hz)，7.4(dd，1H，J＝5.0及1.1Hz)，7.12(dd，1H，J＝3.6及1.1Hz)，7.07(dd，1H，J＝5.0及3.6Hz)，6.77(d，1H，J＝5.1Hz)，5.66(bs，2H)。HRMS(FAB，3-NBA、MATRIX)C9H8N3O2S(M+1)計算值222.0337；觀測值222.0337。(2)2，3-二氨基-4-(2-噻吩基)吡啶(化合物3)于0℃，向130ml乙醇與65ml乙酸乙酯中的、化合物2(2.06g、9.3mmol)與466mg碳化鈀(10重量％)的混合物中，加入28ml的1M硼氫化鈉水溶液。將所得混合物在0℃下攪拌1小時。向混合物中加入43ml的5％氯化銨水溶液。將混合物用硅藻土(セライト)進行過濾。向濾過物中添加500ml的水。蒸發掉乙醇及乙酸乙酯后，用乙酸乙酯抽提混合物(250ml×3)。在Na2SO4上進行干燥，然后蒸去溶劑。對于殘渣，使用二氯甲烷:乙酸乙酯(19:1至93:7)作為洗脫溶劑，用快速硅膠色譜柱進行了純化。得到了1.46g的化合物3(二氯甲烷:乙酸乙酯＝9:1的Rf為0.24)，收率82％。1HNMR(270MHz，CDCl3)δ7.64(d，1H，J＝5.1Hz)，7.40(dd，1H，J＝5.1及1.1Hz)，7.23(dd，1H，J＝3.5及1.1Hz)，7.14(dd，1H，J＝5.1及3.5Hz)，6.74(d，1H，J＝5.1Hz)，4.26(bs，2H)，3.72(bs，2H)。HRMS(FAB，3-NBAMATRIX)C9H10N3S(M+1)計算值192.0595；觀測值192.0588。(3)7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物4)對化合物3(956mg、5.0mmol)的甲酸溶液(15ml)進行12小時回流。于冰浴上，向反應混合物中加入24ml的28％NH4OH。對所得沉淀物進行過濾，用H2O及乙醚清洗，并且于60℃干燥12小時，得到了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(970mg、96％)。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.20(s，1H)，8.48(s，1H)，8.30(m，2H)，7.78(dd，1H，J＝1.0及5.1Hz)，7.54(d，1H，J＝5.1Hz)，7.25(dd，1H，J＝3.8及4.9Hz)。13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ113.12，128.00，128.71，129.24，130.00，131.16，137.60，143.44，144.09，148.66。HRMS(FAB，3-NBAMATRIX)C10H8N3S(M+1)計算值202.0439；觀測值202.0444。(4)7-(2-噻吩基)-3-[2-脫氧-3，5-二-O-(甲苯酰)-β-D-呋喃核糖基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物5)向化合物4(403mg、2.0mmol)的CH3CN常液(32ml)中加入NaH(96mg、2.4mmol、礦物油中60％分散液)。將所得混合物于室溫攪拌1小時。向混合物中加入2-脫氧-3，5-二-O-p-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖基氯化物(933mg、2.4mmol)(非專利文獻42)。室溫下攪拌2.5小時，然后用乙酸乙酯和水分離反應混合物。將有機層用飽和食鹽水清洗3次，在Na2SO4上干燥，減壓下進行蒸餾除去。用硅膠色譜柱(CH2Cl2中、0.5％甲醇)純化產物，得到了化合物5(714mg、65％)。1HNMR(270MHz，CDCl3)δ8.32(d，1H，J＝5.3Hz)，8.26(s，1H)，8.16(dd，1H，J＝3.8及1.2Hz)，7.93(m，4H)，7.50(dd，1H，J＝5.1及1.2Hz)，7.47(d，1H，J＝5.3Hz)，7.22(m，5H)，6.68(dd，1H，J＝8.6及5.8Hz)，5.82(m，1H)，4.69(m，3H)，3.18(ddd，1H，J＝14.2，8.6及6.4Hz)，2.86(ddd，1H，J＝14.2，5.8及2.0Hz)，2.43(s，3H)，2.37(s，3H)。HRMS(FAB，3-NBAMATRIX)C31H28N3O5S(M+1)計算值554.1750；觀測值554.1748。(5)7-(2-噻吩基)-3-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物6)于0℃，向1.33g(2.40mmol)的化合物5加入氨飽和甲醇(120ml)。將溶液在室溫攪拌2小時。反應后，蒸餾除去溶劑，以二氯甲烷:乙醇(97:3至93:7)作為洗脫溶劑，用快速硅膠色譜柱對殘渣進行純化。得到了717mg的化合物6，收率94％。1HNMR(300MHz，DMSQ-d6)δ8.75(s，1H)，8.35(d，1H，J＝5.1Hz)，8.30(d，1H，J＝3.7Hz)，7.83(d，1H，J＝5.1Hz)，7.65(d，1H，J＝5.1Hz)，7.28(t，1H，J＝4.2Hz)，6.54(t，1H，J＝6.9Hz)，5.34(d，1H，J＝4.1Hz)，5.11(t，1H，J＝5.7Hz)，4.46(m，1H)，3.91(m，1H)，3.60(m，2H)，2.80(m，1H)，2.37(m，1H)。13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ147.10，144.04，143.62，137.06，132.00，131.00，129.78，129.06，128.07，113.93，87.88，83.72，70.80，61.74，39.40。HRMS(FAB，3-NBAMATRIX)C15H16N3O3S(M+1)計算值318.0912；觀測值318.0905。UVλmax，311nm；ε＝2.04×104，25mM磷酸鈉緩沖液pH6.8中。(6)7-(2-噻吩基)-3-[2-脫氧-5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物7)用無水吡啶使317mg(1.0mmol)的化合物6共沸3次。向其中加入5.0ml的無水吡啶，再加入二甲氧基三苯基氯甲烷(356mg、1.1mmol)。將混合物于室溫攪拌一晚，然后加水(50ml)，用二氯甲烷(50ml×3)進行抽提。在Na2SO4上干燥，然后減壓下蒸餾除去溶劑。以二氯甲烷:乙酸乙酯(9:1至13:7)作為洗脫溶劑，用快速硅膠色譜柱對殘渣進行純化。得到了550mg的化合物7，收率89％。1HNMR(270MHz，CDCl3)δ8.29(d，1H，J＝5.1Hz)，8.22(s，1H)，8.17(dd，1H，J＝3.8及1.1Hz)，7.49(dd，1H，J＝5.1及1.1Hz)，7.44(d，1H，J＝5.1Hz)，7.37(m，2H)，7.27(m，5H)，7.20(m，3H)，6.78(m，4H)，6.57(dd，1H，J＝6.5及6.2Hz)，4.66(m，1H)，4.12(m，1H)，3.75(s，3H)，3.75(s，3H)，3.42(dd，1H，J＝10.1及4.6Hz)，3.38(dd，1H，J＝10.1及5.4Hz)，2.86(m，1H)，2.56(ddd，1H，J＝13.8，6.5及4.6Hz)，2.06(d，1H，J＝3.5Hz)。HRMS(FAB，3-NBAMATRIX)C36H34N3O5S(M+1)計算值620.2219；觀測值620.2230。(7)7-(2-噻吩基)-3-[2-脫氧-5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶2-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺(化合物8)用無水吡啶使化合物7(425mg、0.69mmol)共沸3次，接著，用無水乙腈使其共沸3次。將其溶于無水乙腈(4.6ml)中，加入262μl(0.82mmol)的2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺、及0.45M四唑的乙腈溶液(1.68ml)。將該混合物于室溫攪拌1小時。向混合物中加入90μl的無水甲醇，然后，將混合物加到水中(50ml)，用含1％三乙胺(v/v)的二氯甲烷(50ml×3)抽提。在Na2SO4上干燥后，減壓下蒸餾除去溶劑。以含2％三乙胺(vv)的己烷:乙酸乙酯(4:1至3:2)作為洗脫溶劑，用快速硅膠色譜柱對殘渣進行純化。得到了490mg的化合物8，收率87％。1HNMR(270MHz，DMSO-d6)δ8.65(m，1H)，8.27(m，1H)，8.23(m，1H)，7.81(m，1H)，7.62(m，1H)，7.26(m，3H)，7.18(m，7H)，6.75(m，4H)，6.54(m，1H)，4.81(m，1H)，4.13(m，1H)，3.84-3.45(m，10H)，3.21(m，3H)，2.82-2.48(m，3H)1.13(m，12H)。31PNMR(109MHz，DMSO-d6)δ148.76ppm及148.14ppm。HRMS(FAB，3-NBAMATRIX)C45H51N5O6SP(M+1)計算值820.3298；觀測值820.3325。(8)7-(2-噻吩基)-3-(2-脫氧-3-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物9)用無水吡啶使化合物7(124mg、0.20mmol)共沸3次。將其用無水吡啶(2.0ml)溶解，再添加38μl(0.40mmol)的乙酸酐。將所得混合物于室溫攪拌2日。將混合物加到水(50ml)中，用二氯甲烷(50ml×3)抽提。在Na2SO4上干燥，然后，減壓下蒸餾除去溶劑。將殘渣溶于20ml的無水二氯甲烷，于0℃向其中添加200μl的二氯醋酸。將混合物于2℃攪拌15分鐘，然后，將其添加到8ml的飽和碳酸氫鈉水溶液中，再向其中加入42ml的水，用二氯甲烷(50ml×3)抽提。在Na2SO4上干燥，然后、減壓下蒸餾除去溶劑。以二氯甲烷:乙酸乙酯(9:1至3:2)為洗脫溶劑，用快速硅膠色譜柱對殘渣進行純化。得到了65mg的化合物9，收率88％。1HNMR(270MHz，CDCl3)δ8.29(d，1H，J＝5.4Hz)，8.18(dd，1H，J＝3.8及1.1Hz)，8.13(s，1H)，7.53(dd，1H，J＝5.0及1.1Hz)，7.50(d，1H，J＝5.4Hz)，7.20(dd，1H，J＝5.0及3.8Hz)，6.69(m，1H)，6.37(dd，1H，J＝10.1及5.4Hz)，5.58(m，1H)，4.28(m，1H)，3.96(m，2H)，3.32(ddd，1H，J＝15.9，10.1及5.9Hz)，2.41(m，1H)，2.12(s，3H)。HRMS(FAB，3-NBAMATRIX)C17H18N3O4S(M+1)計算值360.1018；觀測值360.0993。(9)7-(2-噻吩基)-3-(β-D-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物11)將化合物4(80mg、0.4mmol)、四-O-乙酰-β-D-呋喃核糖(130mg、0.4mmol)及氯醋酸(2mg)的混合液于200℃加熱5分鐘。向所得暗色漿液中加入甲醇氨(40ml)，于室溫處理18小時。減壓下蒸餾除去溶劑，向殘渣中加入30％CH3CN水溶液，然后，利用反相HPLC純化產物，得到了化合物11(39mg、29％、2步驟)。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.78(s，1H)，8.36(d，1H，J＝5.2Hz)，8.31(dd，1H，J＝1.0及3.7Hz)，7.84(dd，1H，J＝0.9及5.1Hz)，7.66(d，1H，J＝5.2Hz)，7.28(dd，1H，J＝3.7及5.0Hz)，6.08(d，1H，J＝5.8Hz)，5.49(d，1H，J＝6.0Hz)，5.26(t，1H，J＝6.5Hz)，5.20(d，1H，J＝4.9Hz)，4.67(q，1H，J＝5.8Hz)，4.20(q，1H，J＝4.9Hz)，4.00(m，1H)，3.71(m，1H)，3.59(m，1H)。13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ147.29，144.07，143.91，137.00，132.13，131.08，129.86，129.14，128.10，114.02，87.76，85.57，73.48，70.43，61.43。HRMS(FAB，3-NBAMATRIX)C15H16N3O4S(M+1)計算值334.0862；觀測值334.0871。(10)7-(2-噻吩基)-3-[5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物12)用無水吡啶使化合物11(99mg、0.29mmol)共沸3次，然后將其溶解在吡啶(3.0ml)中。向該溶液中加入4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(106mg、0.31mmol)，將混合物于室溫攪拌2小時。將反應混合物添加到5％NaHCO3水溶液中，然后用乙酸乙酯抽提。將有機層用飽和食鹽水清洗3次，用Na2SO4干燥，然后減壓下蒸餾除去溶劑。用硅膠色譜柱純化產物(1％甲醇-CH2Cl2)，得到了化合物12(131mg、71％)。1HNMR(600MHz，CDCl3)δ8.39(s，1H)，8.28(d，1H，J＝5.2Hz)，8.25(d，1H，J＝3.4Hz)，7.52(t，2H，H＝5.7Hz)，7.22(m，2H)，7.14(m，7H)，6.69(m，5H)，6.04(d，1H，J＝6.2Hz)，4.77(m，1H)，4.48(m，1H)，4.34(d，1H，J＝4.6Hz)，3.70(s，6H)，3.46(dd，1H，J＝3.4及10.5Hz)，3.23(dd，1H，J＝2.9及10.5Hz)。HRMS(FAB，3-NBAMATRIX)C36H34N3O6S(M+1)計算值636.2168；觀測值636.2173。(11)7-(2-噻吩基)-3-(2，3-二-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物13)用無水吡啶使化合物12(120mg、0.19mmol)共沸3次。將其溶于無水吡啶(1.9ml)，再加入72μl(0.76mmol)的乙酸酐。將該混合物在室溫攪拌7小時。將混合物添加到5％NaHCO3(50ml)及乙酸乙酯(50ml)中。將有機層用飽和食鹽水清洗1次。用Na2SO4干燥有機層后，減壓下蒸餾除去溶劑。殘渣用甲苯共沸2次，然后，將其溶于CH2Cl2(19ml)，于0℃加入190μl的二氯醋酸。將該反應混合物于0℃攪拌15分鐘。將混合物添加到5％NaHCO3中，用CH2Cl2抽提。將有機層用飽和食鹽水清洗1次，并且用Na2SO4干燥有機層，然后，減壓下蒸餾除去溶劑。以2％甲醇-二氯甲烷溶液為溶劑，用快速硅膠色譜柱對產物進行純化。得到了77mg的化合物13，收率93％。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.79(s，1H)，8.37(d，1H，J＝5.2Hz)，8.29(dd，1H，J＝1.2及3.7Hz)，7.84(dd，1H，J＝1.1及5.1Hz)，7.68(d，1H，J＝5.2Hz)，7.27(dd，1H，J＝3.7及5.1Hz)，6.38(d，1H，J＝6.8Hz)，6.02(dd，1H，J＝5.6及6.6Hz)，5.54(m，2H)，4.26(m，1H)，3.71(m，2H)，2.14(s，3H)，1.98(s，3H)。13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ169.55，169.22，146.98，144.39，143.85，136.74，132.50，131.02，130.11，129.32，128.14，114.36，85.20，83.63，72.34，71.23，61.05，20.44，20.13。HRMS(FAB，3-NBAMATRIX)C19H20N3O6S(M+1)計算值418.1073；觀測值418.1049。(12)1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(化合物17)向吡咯-2-甲醛(330mg、3.5mmol)的CH3CN溶液(18ml)中加入NaH(60％油分散液、152mg、3.8mmol)，于室溫攪拌45分鐘。接著，向其中加入2，3，5-三-O-芐基-D-呋喃核糖基氯化物(3.1mmol)(非專利文獻44)的CH3CN溶液(18ml)。將反應混合物于室溫攪拌4小時。用乙酸乙酯及水分離產物，并且，將有機層用飽和食鹽水清洗3次，用Na2SO4干燥，然后，減壓下蒸餾除去溶劑。用硅膠色譜柱(用己烷中的20％乙酸乙酯洗脫)對殘渣進行純化，得到了粗品1-(2，3，5-三-O-芐基-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(カルボキシアルデヒド)(506mg)。粗品1-(2，3，5-三-O-芐基-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(506mg、1-0mmol)用甲苯共沸后，向殘渣中加入CH2Cl2(17ml)。向該溶液中于-78℃加入BBr3(1M溶液、3.0ml)，攪拌2.5小時，然后加入50％甲醇-CH2Cl2溶液(25ml)。將溶液于-78℃攪拌10分鐘后，添加28％的NH4OH(0.5ml)。接著，攪拌反應混合物直至其升至室溫。用CH2Cl2及H2O分離產物，并且將水層用CH2Cl2清洗3次，減壓下蒸餾除去溶劑。產物用反相C18HPLC純化，得到了1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(108mg、15％、2步驟)。1HNMR(270MHz，DMSO-d6)δ9.54(s，1H)，7.74(s，1H)，7.06(dd，1H，J＝1.6及4.0Hz)，6.39(d，1H，J＝4.3Hz)，6.30(dd，1H，J＝3.0及4.0Hz)，5.27(d，1H，J＝5.6Hz)，5.05(d，1H，J＝4.9Hz)，5.00(t，1H，J＝5.3Hz)，4.02(m，2H)，3.85(m，1H)，3.52(m，2H)。13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ179.41，131.68，128.24，124.94，110.23，89.34，84.33，75.64，69.50，60.82。HRMS(FAB，3-NBAMATRIX)C10H14NO5(M+1)計算值228.0872；觀測值228.0863。(13)4-丙炔基-1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(化合物18)4-丙炔基-1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(化合物18)是采用與化合物17的合成方法一樣的方法，由4-丙炔基-2-吡咯甲醛(化合物16)(非專利文獻40)(266mg、2.0mmol)合成的。用RP-HPLC進行純化，得到了化合物18(39mg、7％、2步驟)。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.50(s，1H)，7.91(s，1H)，7.09(d，1H，J＝1.8Hz)，6.32(d，1H，J＝3.6Hz)，5.32(d，1H，J＝5.5Hz)，5.07(t，1H，J＝5.2Hz)，5.05(d，1H，J＝4.2Hz)，4.01(m，1H)，3.86(m，1H)，3.66(ddd，1H，J＝3.4、5.3及11.9Hz)，3.55(ddd，1H，J＝3.6、4.9及12.1Hz)，1.97(s，3H)。13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ179.60，131.15，130.43，126.13，106.22，89.62，85.26，84.49，75.86，73.17，69.30，60.53，3.79。HRMS(FAB，3-NBAMATRIX)C13H16NO5(M+1)計算值266.1028；觀測值266.1023。(14)7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶的核苷5’-三磷酸的合成用吡啶使保護的核苷(0.1mmol、化合物9或13)共沸，干燥之。將殘渣溶解在吡啶(100μl)-二噁烷(300μl)混合溶劑中。向其中加入1M2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿-4-酮-二噁烷溶液(110μl、0.11mmol)。10分鐘后，快速地將0.5M雙(三丁基銨)焦磷酸鹽-三乙胺(10μl)DMF(300μl、0.15mmol)混合溶液添加到反應混合物中。將混合液于室溫攪拌10分鐘。接著，向其中加入1％碘-吡啶水(98/2、v/v)(2.0ml)混合溶液。15分鐘后，加入150μl的5％NaHSO3水性溶液，再向其中加入5.0ml的水。將溶液于室溫攪拌30分鐘，然后，加入20ml的濃氨水，于室溫氨解2小時。減壓下蒸餾除去溶劑，將產物用DEAESephadex(A-25)色譜柱(利用50mM至1MTEAB的線性梯度洗脫)純化，然后用C18-HPLC柱(利用0％至30％的CH3CN-100mM醋酸三乙銨溶液的線性濃度梯度洗脫)純化，得到了核苷5’-三磷酸。7-(2-噻吩基)-3-(2-脫氧-β-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶5’-三磷酸(化合物10)1HNMR(270MHz，D2O)δ8.51(s，1H)，8.09(d，1H，J＝5.3Hz)，7.78(d，1H，J＝3.6Hz)，7.56(d，1H，J＝4.9Hz)，7.36(d，1H，J＝5.3Hz)，7.12(t，1H，J＝4.9Hz)，6.41(t，1H，J＝7.3Hz)，4.16(m，1H)，4.04(m，2H)，3.01(q，18H，J＝7.3Hz)，2.72(m，1H)，2.46(m，1H)，1.09(t，27H，J＝7.3Hz)。31PNMR(109MHz，D2O)δ-9.94(d，1P，J＝20.1Hz)，-10.72(d，1P，J＝20.1Hz)，-22.58(t，1P，J＝20.1Hz)。電噴霧離子化質譜學(ESI-MS)C15H18N3O12P3S；計算值555.97(M-H)-；觀測值555.69(M-H)-。7-(2-噻吩基)-3-(β-D-呋喃核糖基)一H-咪唑并[4，5-b]吡啶5’-三磷酸(化合物14)1HNMR(300MHz，D2O)δ8.74(s，1H)，8.32(d，1H，J＝5.4Hz)，8.01(d，1H，J＝3.5Hz)，7.68(dd，1H，J＝1.1及5.1Hz)，7.64(d，1H，J＝5.1Hz)，7.25(dd，1H，J＝3.5及5.1Hz)，6.25(d，1H，J＝6.0Hz)，4.82(m，1H)，4.57(m，1H)，4.36(m，1H)，4.20(m，2H)，3.11(q，18H，J＝7.3Hz)，1.19(t，27H，J＝7.3Hz)。31PNMR(109MHz，D2O)δ-9.80(d，1P，J＝20.1Hz)，-11.03(d，1P，J＝18.9Hz)，-22.78(t，1P，J＝20.1及18.9Hz)。電噴霧離子化質譜學(ESI-MS)C15H18N3O13P3S；計算值571.97(M-H)-；測定值571.74(M-H)-。(15)腺嘌呤或7-(2-噻吩基)-咪唑并[4，5-b]吡啶(非專利文獻43、47、48)的核苷5’-γ-三磷酸酰胺的合成用吡啶使保護的核苷(0.1mmol、化合物21(非專利文獻46)或化合物9)共沸，干燥之。將殘渣溶解在吡啶(100μl)-二噁烷(300μl)混合溶液中。向其中加入1M2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿-4-酮的二噁烷溶液(110μl、0.11mmol)。10分鐘后、將0.5M雙(三丁基銨)焦磷酸鹽(300μl、0.15mmol)-三乙胺(10μl)的DMF溶液快速地加入到反應混合物中，于室溫攪拌10分鐘。接著，添加1％碘-吡啶/水(98/2、v/v)混合溶液(2.0ml)。15分鐘后，添加150μl的5％NaHSO3水性溶液。減壓下蒸餾除去溶劑，然后，向殘渣中加入20ml的28％氨水。于60℃氨解5小時(對于脫氧腺苷的5’-γ-三磷酸酰胺)、或于室溫氨解2小時(對于化合物6的5’-γ-三磷酸酰胺)。減壓下蒸餾除去溶劑，然后，將產物用DEAESephadex(A-25)色譜柱(利用50mM至1MTEAB的線性濃度梯度洗脫)純化，再用C18-HPLC柱(利用0％至30％的CH3CN-100mM醋酸三乙銨溶液的線性濃度梯度洗脫)純化，得到了核苷5’-γ-三磷酸酰胺。6-氨基-9-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)嘌呤5’-γ-三磷酸酰胺(化合物22)1HNMR(270MHz，D2O)δ8.35(s，1H)，8.11(s，1H)，6.37(t，1H，J＝6.9Hz)，4.16(m，1H)，4.03(m，2H)，3.05(q，18H，J＝7.3Hz)，2.70(m，1H)，2.48(m，1H)，1.13(t，27H，J＝7.3Hz)。31PNMR(109MHz，D2O)δ-0.50(d，1P，J＝19.5Hz)，-10.77(d，1P，J＝19.5Hz)，-22.14(t，1P，20.1Hz)。電噴霧離子化質譜學(ESI-MS)C10H17N6O11P3；計算值489.01(M-H)-；觀測值488.98(M-H)-。7-(2-噻吩基)-3-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶5’-γ-三磷酸酰胺(化合物10的γ-三磷酸酰胺)1HNMR(270MHz，D2O)δ8.57(s，1H)，8.16(d，1H，J＝5.3Hz)，7.85(d，1H，J＝3.6Hz)，7.58(d，1H，J＝4.9Hz)，7.45(d，1H，J＝5.3Hz)，7.15(t，1H，J＝4.6Hz)，6.48(t，1H，J＝6.9Hz)，4.18(m，1H)，4.05(m，2H)，3.03(q，18H，J＝7.3Hz)，2.75(m，1H)，2.50(m，1H)，1.11(t，27H，J＝7.3Hz)。31PNMR(109MHz，D2O)δ-0.52(d，1P，J＝20.1Hz)，-10.75(d，1P，J＝19.5Hz)，-22.14(t，1P，J＝20.8Hz)。電噴霧離子化質譜學(ESI-MS)C15H19N4O11P3S；計算值554.99(M-H)-；觀測值555.01(M-H)-。(16)吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛(非專利文獻45)的核苷5’-三磷酸向含1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(0.1mmol)(化合物17)或4-丙炔基-1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(0.1mmol)(化合物18)和1，8-雙二甲氨基萘(33mg、0.15mmol)的磷酸三甲酯溶液(500μl)中，于0℃添加POCl3(12μl、0.13mmol)，0℃下攪拌2小時。向反應混合物中添加三-正丁基胺(120μl、0.5mmol)，接著，向其中添加0.5M雙(三丁基銨)焦磷酸鹽(1.0ml、0.5mmol)的DMF溶液。5分鐘后，添加0.5M碳酸氫三乙銨水溶液(TEAB、500μl)，終止反應。所得粗產物用DEAESephadex(A-25)色譜柱(1.5cm×30cm、利用50mM至1MTEAB的線性梯度洗脫)純化，再用C18-HPLC柱(SynchropakRPP、EichromTechnologies、利用0％至30％的CH3CN-100mM醋酸三乙銨溶液的梯度洗脫)純化。1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(化合物19)1HNMR(270MHz，D2O)δ9.28(s，1H)，7.64(s，1H)，7.08(d，1H，J＝3.9Hz)，6.45(d，1H，J＝4.1Hz)，6.32(m，1H)，4.32(m，2H)，4.10(m，3H)，3.03(q，18H，J＝7.3Hz)，1.11(t，27H，J＝7.3Hz)。31PNMR(109MHz，D2O)δ-10.51(d，1P，J＝19.5Hz)，-11.3(d，1P，J＝20.1Hz)，-22.91(t，1H，J＝20.1Hz)。電噴霧離子化質譜學(ESI-MS)C10H16NO14P3計算值465.97(M-H)-；測定值465.85(M-H)-。4-丙炔基-1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(化合物20)1HNMR(270MHz，D2O)δ9.28(s，1H)，7.70(s，1H)，7.08(s，1H)，6.40(d，1H，J＝4.0Hz)，4.30(m，2H)，4.13(m，3H)，3.06(q，18H，J＝7.3Hz)，1.86(s，3H)，1.14(t，27H，J＝7.3Hz)。31PNMR(109MHz，D2O)δ-10.10(d，1P，J＝19.5Hz)，-11.02(d，1P，J＝19.5Hz)，-22.82(t，1P，J＝20.1Hz)。電噴霧離子化質譜學(ESI-MS)C13H18NO14P3計算值503.99(M-H)-；觀測值503.94(M-H)-。實施例II化學合成-21.7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物4)(Dv)的核苷衍生物的合成(圖33)按圖22所示的7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(實施例I的化合物4)(Ds)的核苷衍生物的合成方法進行，不同的是在噻唑基的導入反應(a)中使用了2-(三丁基甲錫烷基)噻唑。關于亞磷酰胺合成(g)，在實施例I-3(7)的7-(2-噻吩基)-3-[2-脫氧-5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶2-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺(化合物8)的合成中使用的是2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺、及0.45M四唑的乙腈溶液，而在本實施例中使用的是2-氰乙基-N，N-二異丙基氨基氯代亞磷酰胺、二異丙基乙基胺、THF。雖然試劑不同，但生成的亞磷酰胺相同。2.2-硝基吡咯(化合物1)(Pn)的核苷衍生物的合成(圖34)(1)1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯(化合物3)的合成將2-硝基吡咯(化合物1)(非專利文獻49)(224mg，2.0mmol)溶解在乙腈(20ml)中，添加NaH(80mg，60％油分散液，2.0mmol)。室溫下攪拌30分鐘，然后，添加2-脫氧-3，5-二-O-p-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖基氯化物(855mg，2.2mmol)，室溫下攪拌2小時。用乙酸乙酯和水清洗反應溶液，用水和飽和食鹽水清洗有機層。將有機層用無水硫酸鈉干燥后，濃縮，用硅膠柱純化，得到了722mg(78％)的化合物2。向化合物2(722mg)中添加甲醇氨(メタノリツクアンモニウム)(50ml)，室溫下進行甲苯酰基的脫保護12小時，用硅膠柱純化后，再用HPLC進行最終純化，得到了291mg(82％)的化合物3。化合物31HNMR(270MHz，DMSO-d6)δ7.76(bs，1H)，7.26(dd，1H，J＝1.6及3.6Hz)，6.59(t，1H，J＝5.9Hz)，6.30(t，1H，J＝3.6Hz)，5.27(d，1H，J＝4.3Hz)，5.03(t，1H，J＝5.3Hz)4.23(m，1H)，3.85(m，1H)，3.59(m，2H)，2.42(m，1H)，2.19(m，1H)。電噴霧離子化質譜學(ESI-MS)C9H11O5N2；計算值227.07(M-H)-；測定值227.03(M-H)-，C9H13O5N2；計算值229.08(M+H)+；測定值229.06(M+H)+。(2)1-[2-脫氧-5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-2-硝基吡咯2-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺(化合物5)的合成用吡啶使化合物3(228mg，1.0mmol)共沸后，添加吡啶(10ml)，添加4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(373mg，1.1mmol)，室溫下攪拌1小時。將反應溶液用乙酸乙酯和5％NaHCO3水溶液清洗，將有機層用飽和食鹽水清洗。將有機層用無水硫酸鈉干燥后，濃縮，用硅膠柱純化，得到了493mg(93％)的化合物4。用吡啶使化合物4(265mg，0.5mmol)共沸后，添加THF(2.5ml)和二異丙基乙基胺(131μl，0.75mmol)，再向溶液中添加2-氰乙基-N，N-二異丙基氨基氯代亞磷酰胺(123μl，0.55mmol)，室溫下攪拌1小時。向反應溶液中添加甲醇(50μl)，用乙酸乙酯:水(20:1，v/v)稀釋，添加5％NaHCO3水溶液，清洗。將有機層用飽和食鹽水清洗，用無水硫酸鈉干燥，濃縮，然后用硅膠柱純化，得到了315mg(86％)的化合物5。(3)1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯5’-三磷酸(化合物7)的合成用吡啶使化合物4(159mg，0.3mmol)共沸后，添加吡啶(3ml)，在添加乙酸酐(57μl，0.6mmol)，將反應溶液在室溫下攪拌12小時。將反應溶液用乙酸乙酯和5％NaHCO3清洗，再用5％NaHCO3水溶液清洗。將有機層用無水硫酸鈉干燥后，濃縮，用甲苯共沸，然后將其溶解于二氯甲烷30ml。于0℃向該反應溶液中添加二氯醋酸(300μl)，0℃下攪拌15分鐘。向反應溶液中添加5％NaHCO3水溶液，清洗，將有機層用5％NaHCO3清洗。將有機層用無水硫酸鈉干燥，濃縮，然后用硅膠柱純化，得到了73mg(91％)的化合物6。用吡啶使化合物6(41mg，0.15mmol)共沸后，添加吡啶(150μl)和二噁烷(450μl)，然后添加2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿-4-酮(180μl，1M二噁烷溶液)，室溫下攪拌10分鐘。向反應溶液中添加三-正丁基胺(150μl)和雙(三丁基銨)焦磷酸鹽(450μl，0.5MDMF溶液)，攪拌10分鐘。添加I2/吡啶(3.0ml，吡啶中1％碘H2O，98:2，v/v)，攪拌15分鐘，然后添加5％NaHSO3水溶液(225μl)，濃縮反應溶液。添加H2O(7.5ml)，室溫下攪拌30分鐘，然后添加28％氨水30ml，室溫下攪拌2小時。濃縮反應溶液，冷凍干燥，然后用DEAESephadexA-25純化(50mM至1.0mMTEAB線性梯度)，用HPLC進行最終純化，得到了作為目標的化合物7。化合物7電噴霧離子化質譜學(ESI-MS)C9H14O14N2P3；計算值，466.97(M-H)-；測定值，466.70(M-H)-。3.4-(噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(DDs)及4-(噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(DDv)的核苷衍生物的合成(圖35)(1)4-碘-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(化合物3)的合成將1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(化合物1)(5.3g，45mmol)溶解在乙酸乙酯(45ml)中，在0℃下、用1小時的時間，一邊攪拌一邊滴加溶解于乙酸乙酯(30ml)中的間氯過氧苯甲酸(14g，54mmol)溶液。滴加后，室溫下攪拌3小時，然后0℃下靜置。過濾結晶，用乙酸乙酯清洗，然后減壓下干燥。將其溶解于水(30ml)中，然后添加30％K2CO3直至pH為10，室溫下靜置1小時，0℃下靜置1小時，然后過濾沉淀，用醚清洗，得到了3.5g(58％)的N-氧化物(N-オキシド)。將N-氧化物(3.0g，22mmol)溶解在DMF(16ml)中，于50℃加熱。于70℃滴加甲磺酰氯(メタンスルホニルクロリド)(4.7ml，60mmol)的DMF(6.4ml)溶液，將反應溶液在75℃下攪拌2小時。將反應溶液置于冰上，然后于0℃下用10N的NaOH中和。室溫下攪拌1小時，過濾生成的沉淀，用水清洗，然后于60℃減壓干燥，得到了2.7g(80％)的作為目標的化合物2。將化合物2(2.7g，18mmol)、NaI(13g，88mmol)溶解在乙腈(28ml)中，室溫下邊攪拌邊添加CH3COCl(3.5ml，50mmol)。將反應溶液于85℃加熱12小時。反應溶液恢復室溫后、依次添加10％Na2CO3水溶液(28ml)和10％NaHSO3水溶液(28ml)，室溫下攪拌15分鐘。添加乙酸乙酯，清洗，將有機層用飽和食鹽水進一步清洗。將有機層用無水硫酸鈉干燥，濃縮，然后用硅膠柱純化，得到了4-碘-1-N-乙酰-吡咯并[2，3-b]吡啶(2.0g)以及4-碘-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(化合物3)(2.3g)。4-碘-1-N-乙酰-吡咯并[2，3-b]吡啶(2.0g，7.0mmol)溶于乙醇(70ml)中，添加甲醇中的28％甲醇鈉(1.4ml，7.0mmol)，加熱回流1小時。濃縮反應溶液，然后用乙酸乙酯和飽和氯化銨水溶液進行分液，將有機層用飽和氯化銨水溶液清洗。將有機層用無水硫酸鈉干燥，濃縮，然后與先前得到的化合物3(2.3g)混合，用乙醇重結晶，得到了化合物3(4.0g，92％)。(2)1-[2-脫氧-3，5-二-O-(甲苯酰)-β-D-呋喃核糖基]-4-碘-吡咯并[2，3-b]吡啶(化合物4)的合成向化合物3(950mg，3.9mmol)的乙腈(39ml)溶液中添加NaH(156mg，60％油分散液，3.9mmol)。室溫下攪拌1小時后，添加2-脫氧-3，5-二-O-p-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖基氯化物(1.8g，1.2當量)，室溫下攪拌1.5小時。將反應溶液用乙酸乙酯和飽和氯化銨水溶液清洗，將有機層用飽和氯化銨水溶液和飽和食鹽水分液。將有機層用無水硫酸鈉干燥，然后濃縮，用硅膠柱純化，得到了1.8g(77％)的化合物4。(3)1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(2-噻吩基)-吡咯并[2，3-b]吡啶(化合物7)和1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(2-噻唑基)-吡咯并[2，3-b]吡啶(化合物8)的合成向化合物4(715mg，1.2mmol)和二氯雙(三苯基膦)合鈀(42mg，0.06mmol)的DMF(12ml)溶液中添加2-(三丁基甲錫烷基)噻吩(601μl，1.8mmol)，100℃下攪拌1小時。將反應溶液用乙酸乙酯和水分液，將有機層用水清洗，再用飽和食鹽水清洗。將有機層用無水硫酸鈉干燥，然后濃縮，用硅膠柱純化，得到了586mg(88％)的化合物5。向化合物5(580mg)中添加氨飽和甲醇(50ml)，室溫下進行12小時的甲苯酰基的脫保護，用硅膠柱純化，然后用HPLC進行最終純化，得到了304mg(91％)的化合物7。化合物6和化合物8的合成按同一方式進行，不同的是使用了2-(三丁基甲錫烷基)噻唑。合成從化合物4(600mg，1.0mmol)開始，得到了化合物6(449mg，81％)、化合物8(245mg，97％)。化合物71HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.27(d，1H，J＝5.1Hz)，7.87(d，1H，J＝3.8Hz)，7.83(d，1H，J＝3.6Hz)，7.79(d，1H，J＝5.1Hz)，7.41(d，1H，J＝5.0Hz)，7.28(dd，1H，J＝3.7及5.0Hz)，6.93(d，1H，J＝3.8Hz)，6.76(dd，1H，J＝6.0及8.2Hz)，5.28(d，1H，J＝4.1Hz)，5.02(t，1H，J＝5.6Hz)，4.39(m，1H)，3.85(m，1H)，3.56(m，2H)，2.57(m，1H)，2.26(m，1H)。化合物81HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.38(d，1H，J＝5.1Hz)，8.13(d，1H，J＝3.2Hz)，8.01(d，1H，J＝3.2Hz)，7.96(d，1H，J＝3.7Hz)，7.72(d，1H，J＝5.1Hz)，7.15(d，1H，J＝3.7Hz)，6.79(dd，1H，J＝6.1及8.0Hz)，5.29(d，1H，J＝4.0Hz)，4.50(t，1H，J＝5.5Hz)，4.40(m，1H)，3.86(m，1H)，3.57(m，2H)，2.58(m，1H)，2.26(m，1H)。(4)1-[2-脫氧-5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-4-(2-噻吩基)-吡咯并[2，3-b]吡啶2-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺(化合物11)及1-[2-脫氧-5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-4-(2-噻唑基)-吡咯并[2，3-b]吡啶2-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺(化合物12)的合成用吡啶使化合物7(300mg，0.9mmol)共沸后，添加吡啶(9ml)，再添加4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(386mg，1.1mmol)，室溫下攪拌1小時。將反應溶液用乙酸乙酯和5％NaHCO3水溶液分液，將有機層用飽和食鹽水清洗。將有機層用無水硫酸鈉干燥，然后濃縮，用硅膠柱純化，得到了570mg(97％)的化合物9。用吡啶使化合物9(290mg，0.47mmol)共沸后，添加THF(2.4ml)和二異丙基乙基胺(123μl，0.7mmol)，向該溶液中添加2-氰乙基-N，N-二異丙基氨基氯代亞磷酰胺(11μl，0.52mmol)，室溫下攪拌1小時。向反應溶液中添加甲醇(50μl)，用乙酸乙酯水(201，v/v)稀釋，添加5％NaHCO3水溶液，分液。將有機層用飽和食鹽水清洗，用無水硫酸鈉干燥，濃縮，然后用硅膠柱純化，得到了345mg(90％)的化合物11。同樣地，化合物10和化合物12的合成是從化合物8(220mg，0.7mmol)開始，得到了化合物10(424mg，99％)、化合物12(227mg，86％)。(5)1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(2-噻吩基)-吡咯并[2，3-b]吡啶5’-三磷酸(化合物15)和1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(2-噻唑基)-吡咯并[2，3-b]吡啶5’-三磷酸(化合物16)的合成用吡啶使化合物9(247mg，0.4mmol)共沸后，添加吡啶(4ml)，再添加乙酸酐(75μl，0.8mmol)，將反應溶液在室溫下攪拌12小時。將反應溶液用乙酸乙酯和5％NaHCO3水溶液分液，將有機層用5％NaHCO3水溶液清洗。將該有機層用無水硫酸鈉干燥，然后濃縮，用甲苯共沸，然后將殘渣溶解在二氯甲烷40ml中。于0℃向該反應溶液中添加二氯醋酸，0℃攪拌15分鐘。向反應溶液中添加5％NaHCO3水溶液，分液，將有機層用5％NaHCO3水溶液清洗。將有機層用無水硫酸鈉干燥，濃縮，然后用硅膠柱純化，得到了125mg(87％)的化合物13。用吡啶使化合物13(36mg，0.1mmol)共沸，然后添加吡啶(100μl)和二噁烷(300μl)，再添加2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿-4-酮(110μl，1M二噁烷溶液)，室溫下攪拌10分鐘。向反應溶液中添加三-正丁基胺(100μl)和雙(三丁基銨)焦磷酸鹽(300μl，0.5MDMF溶液)，攪拌10分鐘。添加I2/吡啶(2.0ml，吡啶中1％碘H2O，98:2，v/v)攪拌15分鐘，然后添加5％NaHSO3水溶液(150μl)，濃縮反應溶液。添加H2O(5ml)，室溫下攪拌30分鐘，然后添加28％氨水20ml，室溫下攪拌2小時。將反應溶液濃縮、凍干，然后用DEAESephadexA-25純化(50mM至1.0mMTEAB線性梯度)，用HPLC進行最終純化，得到了作為目標的化合物15。同樣地，化合物14和化合物16的合成是從化合物10(210mg，0.34mmol)開始的，得到了化合物14(108mg，89％)、化合物16(0.1mmol合成級)。化合物15電噴霧離子化質譜學(ESI-MS)C16H18O12N2P3S；計算值，554.98(M-H)-；測定值，554.73(M-H)-。化合物16電噴霧離子化質譜學(ESI-MS)C15H17O12N3P3S；計算值，555.97(M-H)-；測定值，555.82(M-H)-。實施例III生物學實驗1.方法本實施例中，如無另行說明，采用以下方法。使用了KFexo-的單核苷酸插入實驗單核苷酸插入實驗根據文獻進行(非專利文獻30-32)。將5’-末端用6-羧基熒光素標記的引物(20-mer)與模板DNA(35-mer)在含20mMMgCl2、2mMDTT和0.1mg/ml牛血清白蛋白的100mMTris-HCl(pH7.5)緩沖液中通過下述方式退火升溫至95℃再緩慢冷卻至4℃。將引物-模板雙鏈溶液(10μM、5μl)與缺失外切核酸酶活性的克列諾片段(KFexo-、AmershamUSB)的酶溶液(2μl)混合。將混合物溫育2分鐘，接著，將各dNTP溶液(3μl)添加到該溶液中，于37℃開始反應。調節所使用的酶量(5-50nM)、反應時間(1-35分)和dNTP的梯度濃度(0.3-1500μM)，在產生25％以下的生成物的條件下進行測定。將反應用10μl的終止溶液(95％甲酰胺和20mMEDTA)終止，并將混合物立即在75℃加熱3分鐘。使用裝備有GeneScan軟件(版本3.0)的自動ABI377DNA測序儀對稀釋產物進行分析(非專利文獻32)。用反應范圍(反応の範囲)除以反應時間計算出比速度(比速度)(v0)，并對所使用的各酶濃度進行酶濃度的標準化(20nM)。由相對于[dNTP]的[dNTP]/v0的Hanes-Woolf作圖得到了動力學參數(KM和Vmax)。各參數是3～8組數據的平均值。使用KF的引物延伸反應將5’-32P-標記引物(23-mer)和模板DNA(35-mer)的雙鏈在含14mMMgCl2和0.2mMDTT的20mMTris-HCl(pH7.5)緩沖液中退火。將雙鏈溶液(400nM，5μl)在冰上與5xdNTP溶液(2μl)混合，接著，向其中添加含KFexo-(1單位)或KFexo+(1單位)(TAKARA)的酶溶液(3μl)，從而開始反應。將反應溶液在37℃下溫育3或5分鐘，然后添加含89mMTris-硼酸鹽、2mMEDTA、10M尿素和0.05％BPB的染料溶液(10μl)終止反應。將該溶液立即在75℃加熱3分鐘，然后在15％聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠上電泳。使用生物影像分析儀(型號BAS2500、Fuji)對凝膠上的產物進行了分析。DNA測序雙脫氧-循環測序反應(20μl)在存在或不存在1nmoldPa’TP的條件下、使用含有0.3pmol模板和4pmol引物1或引物2的8μl的ReadyReactionMix(BigDye1.1，AppliedBiosystems)在PTC-100ProgramThermalController(MJReseach)上進行。25循環的PCR(96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分)之后，用Centri-SeqTM離心旋轉柱(スピンカラム)(AppliedBiosystems)從反應溶液中除去殘存的染料終止劑，然后，于55℃在減壓下對該溶液進行干燥。將殘留物用甲酰胺溶液(4μl)重懸，然后用裝備有6％聚丙烯酰胺-6M尿素凝膠的ABI377DNA測序儀進行分析。序列數據用AppliedBiosystemsPRISM測序分析v3.2軟件進行了分析。PCR擴增使用PTC-100Controller，在10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、2mMMgSO4、0.1％TritonX-100、0.3mM各dNTP(N＝Pa，G，C，和T)與dNTPN(N＝Ds和A)、1μM各引物1和引物2、2.3nM雙鏈DNA片段、以及0.04單位/μlVentDNA聚合酶(NewEnglandBioLabs)的20mMTris-HCl緩沖液(pH8.8)中進行反應。PCR循環如下進行94℃、0.5分；45℃、0.5分；65℃、4分。在對照PCR中使用的是0.2mM各天然型dNTP和0.01單位/μl的VentDNA聚合酶，并且延伸反應步驟為72℃、1分鐘。在4％瓊脂糖凝膠上對PCR產物進行溴化乙啶染色，使用MoleCularImagerFXProsystem和QuantityOne軟件(Bio-Rad)對染色條帶的強度進行了定量。為了進行測序分析，將PCR產物預先用凝膠電泳(7％聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠)或過濾(MicroconYM-30和Micropure-EZ)的方法進行了純化。T7轉錄轉錄(20μl)在含24mMMgCl2、2mM亞精胺、5mMDTT、0.01％TritonX-100、1-3mM各天然型NTP、0-3mMPa’TP、0-3mMDsTP、10mMGMP、2μM模板DNA(用于17-mer轉錄物的合成)或0.5μM模板DNA(用于tRNA轉錄物合成)、和2.5單位/μlT7RNA聚合酶(TAKARA)的40mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)中進行。為了考察轉錄效率，在17-mer轉錄物的合成中，添加了2μCi[γ-32P]GTP(PerkinElmer、代替GMP)，而在tRNA轉錄物的合成中添加了[α-32P]GTP(Amersham)，進行了轉錄。于37℃溫育3小時(17-mer合成時)或6小時(tRNA合成時)后，添加含尿素的染料溶液終止反應。將該溶液于75℃加熱3分鐘，然后進行15或20％(17-mer)或10％(tRNA)聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠電泳，用生物影像分析儀對產物進行了分析。在分析轉錄產物中的核苷酸組成時(非專利文獻17，33)，將轉錄物用2μCi[α-32P]UTP或[α-32P]ATP(Amersham)進行了內部標記。轉錄后、將產物在10μl的15mM醋酸鈉緩沖液(pH4.5)中用0.75單位的RNaseT2于37℃消化2小時。在17-ner的分析中，在消化反應溶液中添加了0.05A260單位的大腸桿菌tRNA(Sigma)。用2D-TLC(HPTLC板、100x100mm、Merck)對消化產物進行了分析。第一維展開溶劑為異丁酸-氨-水(66:1:33v/v/v)，第二維展開溶劑為異丙醇-HCl-水(70:15:15v/v/v或用于Pa’轉錄物的75:15:10v/v/v)。使用生物影像分析儀對TLC板上的標記核苷酸的點進行了分析。DNA2-9的PCR擴增產物的雙脫氧-循環測序各DNA的PCR是使用PTC-100Controller在含10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、2mMMgSO4、0.1％TritonX-100、0.3mM的各dNTP(N＝Pa、G、C及T)及dNTPN(N＝Ds及A)、1μM的各引物1及引物2、2.3M的雙鏈DNA片段(DNA2-9)、及0.04單位/μl的VentDNA聚合酶(NewEnglandBioLabs)的Tris-HCl緩沖液(pH8.8)中進行的。PCR的循環如下進行94℃、0.5分鐘；45℃、0.5分鐘；65℃、4分鐘。為了測序，將PCR產物預先通過凝膠電泳(7％聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠)或過濾(MicroconYM-30及Micropure-EZ)進行了純化。在存在或者不存在dPa’TP的條件下進行測序，使用裝備有6％聚丙烯酰胺-6M尿素凝膠的ABI377DNA測序儀測定了序列。通過比較在存在或不存在dPa’TP的條件下的測序中所獲得的兩者的峰模式，能夠確認DNA片段中的非天然型堿基的位置。大腸桿菌無細胞翻譯系統中含有非天然型反密碼子的tRNA的氨酰化按修改過的生產商的規程在快速翻譯系統(RTS-100、Roche)中考察了tRNA轉錄產物的氨酰化。將用[α-32P]進行了分子內標記的tRNA轉錄產物(0.4μM)于30℃在系統(25μl)中溫育30分鐘。用醋酸鈉(pH4.5)飽和的苯酚抽提tRNA，然后在含0.2MTris-醋酸及3mMEDTA的酸性緩沖液(pH4.75)中于4℃用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳進行了分析(圖5d、圖21)。2.含有Ds的DNA片段的測序采用利用了雙脫氧核苷酸鏈終止的測序方法(非專利文獻33)確認了DNA片段中的Ds-Pa堿基對的位置，所述雙脫氧核苷酸鏈終止中添加了修飾Pa即4-丙炔基吡咯-2-甲醛(Pa’)核苷的三磷酸衍生物(dPa’TP)(非專利文獻34)。使用KFexo-時，與針對模板中的Ds的dPaTP的導入效率(Vmax/KM＝5.7×104)相比，針對模板中的Ds的dPa’TP的導入效率(Vmax/KM＝2.2×105)高，為其3.9倍(表1及2)。因此，含Ds鏈的測序是添加dPa’TP、并使用TaqDNA聚合酶的測序試劑盒即BigDye1.1(appliedBiosystems)進行的。為了測序和其后的實驗，通過對化學合成的DNA片段進行引物延伸或連接制備了含有Ds-Pa堿基對的雙鏈DNA片段(150-mer和174-mer、DNA1-14)(圖6)。在含有5’-CDsA/3’-GPaT的DNA1的測序中，通過添加0.05mMdPa’TP使得不針對模板中的Ds導入天然型堿基的染料終止劑，因此，僅在對應于模板中的Ds的部位，A，G，C，T的峰均消失(圖3c)。即，在該測序中，不出現峰而被認定為空位(ギヤツプ)的位置表示非天然型堿基的位置。除DNA1以外，在其它含有非天然型堿基周圍不同的序列的DNA中，也有一些在dPa’TP存在下的測序中未顯示出明顯的空位模式(圖13-20)。但是，在不存在dPa’TP的條件下的測序中，模板Ds的位置以后的峰基本上消失(圖3g)，因此，通過比較存在或不存在dPa’TP的條件下各自的測序的峰模式，能夠確認DNA中的非天然型堿基的位置(例如，圖3c和3g)。3.含有Ds-Pa堿基對的DNA片段的PCR擴增含有Ds-Pa堿基對的DNA1-14(圖6)(150-mer或174-mer、2.3nM)的PCR擴增是使用具有3’→5’外切核酸酶活性的耐熱性DNA聚合酶(0.04單位/μl、VENTDNA聚合酶，NewEnglandBioLabs)與dDsTPN、dPaTP、dATPN、dGTP、dCTP和dTTP的底物混合物(各0.3mM)進行的。PCR循環如下進行94℃、30秒，45℃、30秒，和65℃、4分。本發明人等首先測試了DNA1的擴增的選擇性和效率(圖3a)。10循環的PCR后(圖3b)、通過共存或者不共存dPa’TP條件下的測序，對產物進行了分析(圖3d和3h)。而且，進一步的10循環PCR(共10+10循環)是使用10循環PCR產物的一部分進行的(圖3e和3i)。10循環和10+10循環的PCR產物的dPa’TP存在下的測序顯示出與最初的DNA1的測序相類似的峰模式。在dPa’TP非共存下的測序中(圖3g-3i)，DNA1中非天然型堿基位置之后的通讀(read-through)的峰隨PCR循環數的增加稍微增大。因此，通讀峰的高度可以用來確定PCR擴增中Ds-Pa堿基對變為天然型堿基對的變異率。變異率是通過比較以下兩個通讀峰的高度而確定的含有1-10％的A-T來代替Ds-Pa堿基對的對照DNA片段的dPa’TP非共存下測序中所得的通讀峰的高度(圖8)，與PCR產物的通讀峰的高度(圖3g-3i)。10循環和10+10循環后的DNA1中Ds-Pa堿基對的變異率分別為約1％和3-4％。通過該方法可知A的γ-三磷酸酰胺的使用增加了PCR中Ds-Pa堿基對的選擇性。不使用dATPN、而使用dDsTPN、dPaTP和天然型dNTP的DNA1的PCR擴增的變異率上升。10和10+10循環后，Ds-Pa堿基對的變異率分別為約5％和約10％(圖9)。此外，在不存在dDsTPN和dPaTP的條件下的10循環PCR中，DNA1中的Ds-Pa堿基對被完全替換成了A-T堿基對(圖3f)。DNA1的擴增效率如下進行評價通過用染料對凝膠上的PCR產物染色、或者、使用了各標記引物的產物的放射自顯影，由條帶的強度來評價。其結果(圖3b)為DNA1在10循環的PCR中擴增了15倍，天然型DNA片段(DNAcont1)在10循環的PCR中擴增了37倍。更為準確的效率是使用5’-或3’-32P標記引物、通過PCR產物的放射自顯影獲得的(圖10)。使用式Nf＝N0(1+Y)n，確定各循環的延伸效率(Y)。此處，Nf為產物的最終拷貝數，N0為最初拷貝數，n為PCR循環數(非專利文獻35)。使用DNA1的1至10循環的PCR的效率(Y)對于從5’引物開始的延伸為0.38，對于從3’引物開始的延伸為0.29。而在常規條件下PCR擴增DNAcont1時，Y值分別為0.43和0.35。因此，非天然型堿基對系統中PCR的每循環的效率為傳統天然型堿基對系統中的76-88％。從以上獲得的PCR產物的擴增效率和由DNA測序確定的Ds-Pa堿基對的變異率，可以計算出DNA1中的Ds-Pa堿基對在PCR中的保真度(DNA1被二倍擴增時)為99.8％以上。然而，可知PCR擴增中Ds-Pa堿基對的選擇性相比，該保真度更依賴于化學合成的最初的DNA片段的純度(圖11)。因此，可以認為非天然型堿基對系統的選擇性相當高，甚至為99.8％以上。本發明人等還研究了含Ds-Pa堿基對周圍不同的序列的其它DNA片段(DNA2-14)的擴增。10循環PCR后，各DNA片段被擴增了16至30倍(圖12)，各DNA的Ds-Pa堿基對的變異率為1-3％(圖13-圖20)。其中例外的是含有5’-X(A)n-3’序列的DNA10-14的擴增。此處，X＝Ds或Pa，而且n＝2。這些DNA片段的10循環PCR后的擴增效率不到5倍。這樣的低效率在繼A的γ-三磷酸酰胺的摻入后，Ds或Pa底物被連續地摻入時中會有發生。因此，除5’-DsAA-3’和5’PaAA-3’序列外，含有非天然型堿基的所有序列能夠用于DNA擴增。4.Ds-Pa堿基對介導的T7轉錄Ds-Pa和Ds-Pa’堿基對以互補的方式介導利用T7RNA聚合酶將DsTP、PaTP和Pa’TP部位特異性地導入RNA。使用含Ds、Pa或Pa’的模板DNA(35-mer)，研究了轉錄(圖4a和4b)。添加非天然型堿基的核糖核苷三磷酸進行3個小時的轉錄后，在凝膠上對32P標記的轉錄物進行了分析(圖4c)。與使用天然型堿基構成的模板DNA的僅使用天然型堿基的轉錄物(圖4c泳道9)的收率相比，各含有Pa、Pa’和Ds的全長轉錄物(17-mer)的收率為28-91％(圖4c泳道1，2，5，和7)。在含非天然型堿基的模板DNA的轉錄中，不添加非天然型堿基底物時的轉錄物的收率顯著減少(圖4c泳道3，6和8)。通過分析內部32P標記轉錄物的核苷酸組成(非專利文獻17，33)確認了T7轉錄中Ds-Pa和Ds-Pa’堿基對的高選擇性(圖4d和4e、以及表3)。表3.T7轉錄物的核苷酸組成分析表3a表3ba如圖4及5所示的、被摻入到A(條目1-13及24-31)或U(條目14-23及32-39)的5’末端側的核苷酸的組合物bNp＝Pap、Pa’p、或Dspc該值通過下式確定化學式27(各核苷酸的放射活性)/[全部核苷酸(3’-磷酸)的總放射活性]×([α-P32]NTP的5’近旁的核苷酸的總數)d各核苷酸的理論值標在方括號內。e標準偏差標在圓括號內。f未檢出。將內部32P標記的轉錄物用RNaseT2消化，用2D薄層色譜(2D-TLC)對生成的標記核苷3’-一磷酸進行了分析。在使用含非天然型堿基的模板的轉錄物中，與Ds和Pa對應的各點出現在2D-TLC上，而且沒觀察到任何對應于與非天然型堿基形狀類似的天然型底物的錯誤導入(例如，CTP和UTP相對于PaTP、以及ATP和GTP相對于DsTP)的點(圖4d、N＝Ds和圖4e、N＝Pa)。在使用完全由天然型堿基構成的模板的轉錄物中，未觀察到與Pa或Ds對應的點(圖4d、N＝A和G、以及圖4e、N＝T和C)。2D-TLC上各核苷酸的點的定量值極其接近根據產物序列預測的理論值(表3、條目1-23)，由這些結果可以認為轉錄中Ds-Pa或Ds-Pa’堿基對的選擇性為95％以上。作為應用例，本發明人等通過T7轉錄制備了含有非天然型反密碼子即CUPa，、CPa’A、CUDs、和CDsA的tRNA分子(85-mer)。這里采用了大腸桿菌抑制tRNATyr的序列。向PaTP或Pa’TP的17-mer轉錄物轉錄的轉錄效率比較低，但含有Pa’的更長tRNA(85-mer)的轉錄顯示出高效率；85-mer的收率與具有CUA反密碼子的tRNA轉錄物的收率相比，為88-93％(圖5a)。為了核苷酸組成分析，將轉錄物用[α-32P]ATP或[α-32P]UTP進行了內部標記。因為非天然型核苷酸位于A的5’末端側，所以各非天然型核苷酸的3’-一磷酸僅用[α-32P]ATP標記。因此，僅當轉錄物用[α-32P]ATP標記時，通過2D-TLC檢測到了對應于非天然型核苷酸的點(圖5b和5c)。針對模板中的Ds導入Pa’、以及針對模板中的Pa導入Ds的選擇性為96％以上(表3、條目24-39)。使用所得的tRNA轉錄物，本發明人等研究了大腸桿菌抽提液中的氨酰化(RTS100E.coliHYkit、RocheDiagnostics)。具有CPa’A和CDsA反密碼子的tRNA完全未氨酰化，可知其不被大腸桿菌來源的氨酰tRNA合成酶識別(圖5d泳道7-10)。此外，具有CUPa’和CUDs反密碼子的tRNA被氨酰化(圖5d泳道1-4)。具有這些非天然型反密碼子的tRNA的氨酰化選擇性，與大腸桿菌tRNATyr與其酪氨酰tRNA合成酶間的識別選擇性(非專利文獻36，37)相當一致。由以上結果可以確認非天然型堿基部位特異性地導入tRNA。實施例IV生物素化PaTP的合成根據圖36所示的方案合成了生物素化PaTP(1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-生物素酰胺-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯化合物28、Bio-PaTP)。(1)1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物24)的合成(圖36的方案中的反應(a)-(c))于-78℃向含2，3，5-三-O-芐基-D-呋喃核糖(1.0g、2.3mmol)和CCl4(344μl、3.6mmol)的THF溶液(4.6ml)中添加六甲基磷酰三胺(ヘキサメチルホスホラストリアミド)(562μl、3.0mmol)。將該溶液在-78℃攪拌2小時，然后在室溫攪拌30分鐘(溶液A)。在CH3CN(25mL)中，向4-碘-吡咯-2-甲醛(化合物23)(830mg、3.7mmol)添加NaH(60％油分散液、150mg、3.7mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌30分鐘。接著，添加THF中的2，3，5-三-O-芐基-D-呋喃核糖基氯化物(溶液A)。將反應混合物在室溫下攪拌12小時。將生成物用乙酸乙酯和水進行分液。有機層用飽和NH4Cl清洗3次，用Na2SO4干燥，然后減壓下濃縮。生成物用硅膠色譜柱(用二氯甲烷中的1％甲醇洗脫)純化，得到了1-(2，3，5-三-O-芐基-D-呋喃核糖基)-4-碘吡咯-2-甲醛。于-78℃，向1-(2，3，5-三-O-芐基-D-呋喃核糖基)-4-碘吡咯-2-甲醛的二氯甲烷(15ml)溶液中添加BBr3(1M溶液、8.5ml)。將反應混合物攪拌2小時，然后添加CH2Cl2中的50％甲醇(30ml)。將該溶液于-78℃攪拌10分鐘后，添加28％NH4OH(4ml)，然后攪拌反應混合物，直至其至室溫。將該溶液添加到CH2Cl2和H2O中。水層用CH2Cl2分液并清洗3次，然后減壓下濃縮殘渣。將生成物用反相C18HPLC純化，得到了1-(β-D-呋喃核糖基)]-碘吡咯-2-甲醛(330mg)。用吡啶及甲苯使1-(β-D-呋喃核糖基)-4-碘吡咯-2-甲醛(176mg、0.5mmol、含α異頭物)共沸。向1-(β-D-呋喃核糖基)-4-碘吡咯-2-甲醛(176mg)、四(三苯基膦)鈀(29mg、0.025mmol)、CuI(15mg、0.08mmol)和三乙胺(105μl、0.75mmol)的DMF(1.8ml)溶液中添加3-(二氯乙酰胺)-1-丙炔(0.75mmol)的1MDMF溶液(750μl)。將反應物在室溫下攪拌12小時。生成物用EtOAc/H2O進行分液，有機層用Na2SO4干燥，減壓下濃縮。生成物用硅膠色譜柱(二氯甲烷中10％甲醇)和RP-HPLC純化，以β異構體的形式得到了化合物24(123mg、26％、3步的總收率)。通過NMR(圖38)和高分辨率質譜分析確認了化合物24的結構。化合物24的HMQC譜(圖38e)和HMBC譜(圖38f和圖38g)顯示在C1’碳上，糖和吡咯堿基部位之間形成有N-糖苷鍵。此外，化合物24的NOESY譜(圖38d)的交叉峰與化合物18(圖25j)類似，而且顯示出H1’和H4’質子間的交叉峰，因此，將化合物24的芳香族立體構型鑒定為β。化合物241HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.54(d，1H，J＝0.8Hz)，9.10(t，1H，J＝5.2Hz)，8.01(s，1H)，7.18(d，1H，J＝1.8Hz)，6.49(s，1H)，6.34(d，1H，J＝3.5Hz)，5.35(d，1H，J＝5.6Hz)，5.10(m，2H)，4.17(d，2H，J＝5.4Hz)，4.02(m，2H)，3.88(m，1H)，3.68(ddd，1H，J＝3.4，5.3，12.1Hz)，3.57(ddd，1H，J＝3.5，5.0，12.1Hz).13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ180.28，163.78，131.88，131.49，126.85，105.23，90.23，85.26，85.04，76.83，76.41，69.75，67.01，60.96，30.20.HRMS(FAB，3-NBAMATRIX)C15H17N2O6Cl2(M+1)計算值，391.0464；實測值，391.0462.(2)1-(2，3-二-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物26)的合成(圖36方案中的反應(d)-(e))。用吡啶使化合物24(118mg，0.3mmol)共沸3次。向吡啶(3.0ml)中的殘渣中添加4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(113mg、0.33mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時，然后將其添加到EtOAc和5％NaHCO3中。將有機層用飽和NaCl清洗，在Na2SO4上干燥，然后在減壓下濃縮。生成物用硅膠色譜柱(二氯甲烷中、1％甲醇)純化，得到了197mg的化合物25，收率95％。用吡啶使化合物25(188mg、0.27mmol)共沸3次。向吡啶(2.7ml)中的殘渣添加乙酸酐(103μl、1.1mmol)。將混合物在室溫下攪拌，然后將其添加到EtOAc和5％NaHCO3中。有機層用飽和NaCl清洗，在Na2SO4上干燥，然后減壓下濃縮。于0℃，向二氯甲烷(27ml)中的殘渣添加二氯醋酸(270μl)。將混合物在0℃下攪拌15分鐘，添加到5％水性碳酸氫鈉水溶液中，用二氯甲烷抽提。在Na2SO4上干燥后，減壓下濃縮溶液。生成物用硅膠色譜柱(二氯甲烷中、1％甲醇)純化，得到了118mg的化合物26，收率92％。化合物251HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ9.56(s，1H)，9.05(t，1H，J＝5.0Hz)，7.72(s，1H)，7.38-7.20(m，10H)，6.87(d，4H，J＝7.1Hz)，6.47(s，1H)，6.34(d，1H，J＝3.3Hz)，5.47(d，1H，J＝5.3Hz)，5.13(d，1H，J＝5.7Hz)，4.12-4.00(m，5H)，3.73(s，6H)，3.22(m，2H).HRMS(FAB，3-NBAMATRIX)C36H35N2O8Cl2(M+1)計算值，693.1770；實測值，693.1721.化合物261HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ9.50(s，1H)，9.10(bs，1H)，8.06(s，1H)，7.24(d，1H，J＝1.3Hz)，6.64(d，1H，J＝5.0Hz)，6.48(s，1H)，5.43(t，1H，J＝5.0Hz)，5.35(t，1H，J＝5.2Hz)，5.32(t，1H，J＝4.8Hz)，4.17(m，3H)，3.73(m，1H)，3.62(m，1H)，2.07(s，3H)，2.01(s，3H).HRMS(FAB，3-NBAMATRIX)C19H21N2O8Cl2(M+1)計算值，475.0675；實測值，475.0687.(3)1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-生物素酰胺-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物28)的合成(圖36方案中的反應(f)-(g))。將保護的核苷26(47mg、0.1mmol)溶解于吡啶中，減壓下濃縮。將殘渣溶解在吡啶(100μl)和二噁烷(300μl)中。添加二噁烷中的2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿-4-酮的1M溶液(110μl、0.11mmol)。10分鐘后，將三-正丁基胺(100μl)和DMF中的0.5M雙(三丁基銨)焦磷酸鹽(300μl、0.15mmol)迅速地添加到反應混合物中。將混合物在室溫下攪拌10分鐘。接著，添加吡啶/水(98/2，v/v)中的1％碘溶液(2.0ml)。15分鐘后，添加NaHSO3的5％水性溶液(150μl)。蒸餾除去揮發性成分，然后向殘渣加水(5.0ml)。將混合物在室溫下攪拌30分鐘，然后用濃氨水(20ml)在室溫下處理12小時。減壓下濃縮溶液，然后將生成物用DEAESephadex(A-25)色譜柱(用50mM至1MTEAB的線性梯度洗脫)純化，再用C18-HPLC(通過100mM醋酸三乙銨中0％至30％CH3CN的梯度洗脫)純化，得到了核苷5’-三磷酸酯27。凍干后，使0.1MNaHCO3-Na2CO3緩沖液(5ml、pH8.6)中的化合物27與生物素-N-羥基琥珀酰亞胺(900μl、DMF溶液中0.14M)在室溫下反應3小時。將混合物用28％NH4OH(2ml)處理1小時。將生成物用DEAESephadex(A-25)色譜柱(通過50mM至1MTEAB的線性梯度洗脫)純化，再用C18-HPLC(通過100mM醋酸三乙銨中、0％至30％CH3CN的梯度洗脫)純化，由化合物26得到了核苷5’-三磷酸酯28，收率14％。通過1HNMR(圖43a和b)、31PNMR(圖43c)和質量分析(圖42)確認了化合物28的結構。化合物28生物素部分的質子信號與以前合成的生物素化yTP的質子信號相同，D2O中的31PNMR譜顯示與核苷酸5’-三磷酸酯對應的典型的磷的信號。化合物27電噴霧離子化-質譜學(ESI-MS)C13H19O14N2P3計算值，519.00(M-H)-；實測值，518.98(M-H)-.化合物281HNMR(300MHz，D2O)δ9.36(d，1H，J＝0.9Hz)，7.86(s，1H)，7.20(d，1H，J＝1.7Hz)，6.44(d，1H，J＝4.1Hz)，4.39-4.33(m，3H)，4.23-4.15(m，4H)，4.06(d，2H，J＝3.7Hz)，3.18(m，1H)，3.12(q，24H，J＝7.3Hz)，2.82(dd，1H，J＝4.9和13.1Hz)，2.60(d，1H，J＝13.0Hz)，2.23(t，2H，J＝7.0Hz)，1.60(m，4H)，1.32(m，2H)，1.20(t，36H，J＝7.3Hz).31PNMR(107MHz，D2O)δ-8.96(d，1P，J＝16.5Hz)，-10.67(d，1H，J＝20.1Hz)，-22.36(t，1P，J＝20.1Hz).電噴霧離子化-質譜學(ESI-MS)C23H33O16N4P3S計算值，745.07(M-H)-；實測值，745.07(M-H)-.UV-可見光譜(10mM磷酸鈉緩沖液中，pH7.0)，λmax＝258nm(ε＝1.1×104)，308nm(ε＝9.5×103).實施例V利用介導Ds-Pa人工堿基對的T7轉錄的RNA的部位特異性生物素化為了對轉錄和PCR擴增中的Ds-Pa人工堿基對的選擇性和可能性進行更詳細的測試，進行了152-merRNA分子的部位特異性生物素化。RNA的部位特異性生物素化(152-mer)轉錄(20μl)是使用3μCi[γ-32P]GTP、2mM各天然型NTP、0-4mMBio-PaTP(生物素化Pa底物按實施例IV的記載化學合成)和30nM模板(對于DNA6和DNAcont2(圖6參照)分別使用連接獲得的模板和PCR擴增的模板)，于37℃進行6小時。在使用通過連接獲得的DNAcont5和DNAcont6(圖6參照)的對照反應中，轉錄是在存在下或不存在2mMBio-UTP(生物素-16-尿苷-5’-三磷酸酯、Roche·Applied·Science)的條件下，僅與2mMATP、GTP和CTP一起進行的。將生成物在7～10％聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠上進行分析及純化。生物素化RNA轉錄物通過使用鏈霉菌抗生物素蛋白的凝膠電泳遷移測定進行了檢測。將2pmol32P-標記轉錄物和100pmol鏈霉菌抗生物素蛋白(Promega)的混合物(10μl)在含50mMNaCl和10mMEDTA的10mMTris-HCl緩沖液(pH7.6)中20℃溫育1小時。將生物素化RNA-鏈霉菌抗生物素蛋白復合體通過7％聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠上的電泳進行了分析。為了確定Bio-Pa的導入位置，將各RNA(152-mer)用小牛腸來源的堿性磷酸酶(Takara)進行5’-末端脫磷酸化后，再用[γ-32P]ATP(PerkinElmer)標記。將標記的RNA用RNaseT1在含4.7M尿素、0.7mMEDTA和0.17mg/ml大腸桿菌tRNA的13.3mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0)中，于55℃部分消化12分鐘，并且用堿在含0.6mMEDTA的32mM碳酸鈉緩沖液(pH9.1)中，于90℃部分消化15分鐘。將堿消化的RNA溶液(9μl)與含150mMNaCl的20mMTris-HCl緩沖液(pH7.6)(11μl)混合，然后將混合物(10μl)與鏈霉菌抗生物素蛋白磁珠(0.4mg)(NewEnglandBioLabs)一起在室溫下溫育5分鐘，捕捉了生物素化的RNA。將一部分上清(5μl)與其它消化的樣品一起在10％聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠上進行了分析。結果使用連接得到的模板和PCR擴增的模板，通過介導Ds-Pa堿基對的T7轉錄，將生物素偶聯的Pa(Bio-Pa)導入了RNA。為了分析針對RNA分子(152-mer)的Bio-Pa導入，使用DNA6和DNAcont2模板(圖6參照)，在天然型底物NTP(2mM)和Bio-PaTP(2或4mM)存在下進行了T7轉錄。與使用僅含天然型堿基的DNA片段即DNAcont2時(圖44c、泳道3、7和11)相比，有Ds-Pa堿基對時的轉錄效率為47-85％(圖44c、泳道2、6和10)。在使用連接得到的DNA6模板和PCR擴增的DNA6模板的轉錄中，在不存在Bio-PaTP的條件下，全長產物的量顯著低下(圖44c、泳道1、5和9)。這些結果顯示在PCR擴增DNA6時，基本上未引起Ds-Pa堿基對替換為天然型堿基對。使用鏈霉菌抗生物素蛋白，通過生物素化轉錄物的凝膠電泳遷移測定評價了對RNA的Bio-Pa導入選擇性。鏈霉菌抗生物素蛋白與生物素之間的結合非常強且特異性，因而可以認為凝膠電泳遷移的轉錄物的比例與轉錄中的生物素導入率(即，生物素化轉錄物的收率)基本相同。在使用與天然型底物等量的2mMBio-PaTP、和通過連接得到的DNA6模板的轉錄中，90％的轉錄物被生物素化(圖44d、泳道2)，而且增加Bio-PaTP濃度(4mM)，導入率提高到96％(圖44d、泳道4)。關于針對天然型堿基的Bio-PaTP的錯誤導入，在采用2或4mMBio-PaTP存在下的使用DNAcont2為模板的轉錄實驗進行評價時，生物素化轉錄物的收率分別為9和16％(圖44d、泳道6和7)。相對于152-mer轉錄物的1個堿基的位置，這些錯誤導入大致僅為0.06％(總計9％)和0.12％(總計16％)。在使用PCR擴增(20循環)的模板的轉錄中，Bio-Pa的導入率減少至3-4％(圖44d、泳道9和11)。該值與通過序列分析(圖3i)得到的Ds-Pa堿基對部位的變異率(3-4％)一致。有趣的是，針對天然型堿基的Bio-Pa錯誤導入，在天然型和人工堿基底物存在下的使用PCR擴增(20循環)的DNAcont2模板的轉錄中，并未增加(圖44d、泳道13和14)。因此，可以認為針對天然型堿基的Ds和Pa的錯誤導入在PCR擴增中是非常低的。此外，比較了Ds-Pa堿基對在T7轉錄中的選擇性與天然型的A-T(U)堿基對的選擇性。為了評價針對模板鏈中的堿基G、C和T的Bio-UTP的錯誤導入，合成了在模板鏈的編碼區中僅含1個A的對照DNA(DNAcont5)和不含A的對照DNA(DNAcont6)(圖6參照)。在使用DNAcont5和DNAcont6作為模板的轉錄中，按與Ds-Pa堿基對相同的系統和條件進行，不同的是使用了0或2mMBio-UTP和其它天然型底物(2mMATP，GTP和CTP)。在DNAcont5的轉錄中，通過針對A導入Bio-U，轉錄物被完全生物素化(圖44d、泳道16)。然而，在DNAcont6的轉錄中，由于針對模板鏈中的堿基G、C和T的Bio-U的錯誤導入，有21％的轉錄物被生物素化(圖44d、泳道18)。因此，可知針對天然型堿基的Bio-PaTP錯誤導入的比例(9％和16％、分別為圖44d、泳道6和7)，比針對天然型堿基的生物素偶聯UTP(Bio-UTP)的錯誤導入比例(21％)更低。值得一提的是該Bio-U錯誤導入比例(21％)即使在相對于天然型底物存在2mol當量的Bio-PaTP的條件下，仍然比Bio-Pa相對于天然型堿基的錯誤導入比例(16％)要高。因而，針對Ds的Bio-Pa導入比針對A的Bio-U導入的效率稍差，而在T7轉錄中，排除針對模板鏈中的天然型堿基部位的Bio-Pa錯誤導入的選擇性比排除針對模板鏈中的堿基G、T和C部位的Bio-U錯誤導入的選擇性高。為了確定轉錄物中Bio-Pa的導入部位，分析了生物素化轉錄物的序列。如果針對模板中的Ds、Bio-Pa被正確地導入到轉錄物中，則轉錄物的第59位被生物素化。用堿或RNaseT1部分消化5’末端經32P標記的轉錄物，用電泳對其產物進行了分析。在含Bio-Pa的轉錄物的序列梯(ラダ—)中，對應于大于59-mer的片段的條帶發生了移動(圖44e、泳道2和8)。此外，用鏈霉菌抗生物素蛋白處理堿消化的片段，捕捉生物素化片段，其余的進行電泳，這種情況下，大于59-mer的片段基本上消失(圖44e、泳道2和9)。這些結果顯示轉錄物第59位的部位特異性Bio-Pa導入。進一步，使用PCR擴增(20循環)的模板的轉錄物(圖44e、泳道7-12)與使用連接獲得的模板獲得的轉錄物(圖44e、泳道1-6)產生相同的模式。因此，利用該方法的RNA部位特異性生物素化可以用于RNA分子的固定，而不破壞RNA的活性。用生物素這樣的大基團修飾的人工堿基Pa能夠有效地摻入RNA中，因此，熒光團偶聯的Pa等一系列功能性4-修飾Pa堿基同樣能夠摻入RNA中。實施例VI2-硝基吡咯的4位修飾核苷衍生物的合成2-硝基吡咯的4位修飾核苷衍生物按圖45所示方案合成。(1)1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(圖45的化合物1)的合成將1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯(700mg、3.1mmol)溶解于CH3CN(12ml)中，添加N-碘琥珀酰亞胺(1.38g、6.1mmol)，室溫下攪拌12小時。反應溶液用乙酸乙酯和水進行分液，將有機層用水清洗2次。將有機層用無水硫酸鈉干燥后，濃縮，用硅膠柱(CH2Cl2MeOH＝501、v/v)和HPLC(25％-40％CH3CN、10分鐘、40％-50％CH3CN、5分鐘)純化，得到了607mg(56％)的化合物1。未反應回收原料219mg(31％)。化合物11HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ7.90(d，1H，J＝2.1Hz)，7.40(d，1H，J＝2.1Hz)，6.54(t，1H，J＝5.6Hz)，5.27(d，1H，J＝4.5Hz)，5.10(t，1H，J＝5.2Hz)，4.23(m，1H)，3.83(m，1H)，3.65(m，1H)，3.56(m，1H)，2.40(m，1H)，2.23(m，1H).HRMS(FAB，3-NBAmatrix)C9H12IN2O5(M+1)計算值354.9791；測定值354.9784.(2)1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-丙炔基-2-硝基吡咯(化合物2)的合成將1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(化合物1)(280mg、0.79mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(56mg、0.08mmol)溶解在DMF(7.9ml)中，添加三丁基(1-丙炔基)錫(481μl、1.6mmol)。將反應溶液于100℃加熱1.5小時，將溶液濃縮后，用硅膠柱(CH2Cl2:MeOH、50:1、v/v)和HPLC(34％-35％CH3CN、13分鐘)純化，得到了125mg(60％)的化合物2。化合物21HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.92(d，1H，J＝2.2Hz)，7.27(d，1H，J＝2.2Hz)，6.55(t，1H，J＝5.7Hz)，5.28(d，1H，J＝4.5Hz)，5.11(t，1H，J＝5.2Hz)，4.24(m，1H)，3.85(m，1H)，3.67(ddd，1H，J＝3.6，5.3，12.1Hz)，3.57(m，1H)，2.43(m，1H)，2.23(m，1H)，1.99(s，3H).13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ136.21，129.17，117.08，105.29，88.74，88.30，86.75，72.91，69.21，60.83，42.58，4.29.HRMS(FAB，3-NBAmatrix)C12H15N2O5(M+1)計算值267.0981；測定值267.0991.(3)1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(二氯乙酰胺1-丙炔基)-2-硝基吡咯(化合物3)的合成將1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(化合物1)(354mg、1.0mmol)、Pd(PPh3)4(58mg、0.05mmol)、CuI(30mg、0.16mmol)、三乙胺(209μl、1.5mmol)溶解在DMF(3.5ml)中，添加N-(2-丙炔基)-二氯乙酰胺的1MDMF溶液(1.5ml、1.5mmol)，室溫下攪拌12小時。將反應溶液用乙酸乙酯和水進行分液，將有機層用水清洗3次。將有機層用無水硫酸鈉干燥后，濃縮，用硅膠柱(CH2Cl2:MeOH、20:1、v/v)和HPLC(34％-35％CH3CN、12分)純化，得到了317mg(81％)的化合物3。化合物31HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.01(t，1H，J＝5.3Hz)，7.98(d，1H，J＝2.1Hz)，7.33(d，1H，J＝2.1Hz)，6.54(t，1H，J＝5.8Hz)，6.47(s，1H)，5.27(d，1H，J＝4.5Hz)，5.10(t，1H，J＝5.2Hz)，4.23(m，1H)，4.17(d，2H，J＝5.4Hz)，3.84(m，1H)，3.66(ddd，1H，J＝3.5，5.2，12.1Hz)，3.56(dt，1H，J＝4.6，12.2Hz)，2.43(m，1H)，2.23(m，1H).電噴霧離子化質譜學(ESI-MS)C14H15O6N3Cl2；計算值390.03(M-H)-；測定值389.85(M-H)-.(4)1-[2-脫氧-5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-4-丙炔基-2-硝基吡咯2-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺(化合物6)的合成用吡啶使化合物2(200mg，0.75mmol)共沸后，添加吡啶(7.5ml)，再添加4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(280mg，0.83mmol)，室溫下攪拌1小時。將反應溶液用乙酸乙酯和5％NaHCO3進行分液，將有機層用飽和食鹽水清洗。將有機層用無水硫酸鈉干燥后，濃縮，用硅膠柱純化(CH2Cl2:MeOH，200:1，v/v)，得到了365mg(86％)的化合物4。用吡啶使化合物4(190mg，0.33mmol)共沸后，添加THF(1.7ml)和二異丙基乙基胺(87μl，1.5當量)，向溶液中添加2-氰乙基-N，N-二異丙基氨基氯代亞磷酰胺(82μl，0.37mmol)，室溫下攪拌1小時。向反應溶液中添加甲醇(50μl)，用乙酸乙酯:水(20:1，v/v)進行稀釋，添加5％NaHCO3，分液。將有機層用飽和食鹽水清洗，用無水硫酸鈉干燥，然后濃縮，用硅膠柱(CH2Cl2:己烷，1:4，v/v，2％三乙胺)純化，得到了223mg(87％)的化合物6。化合物41HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.65(d，1H，J＝2.2Hz)，7.41-7.23(m，10H)，6.89(d，4H，J＝8.8Hz)，6.59(t，1H，J＝5.3Hz)，5.37(d，1H，J＝5.0Hz)，4.30(m，1H)，3.97(m，1H)，3.75(s，6H)，3.21(d，2H，J＝4.1Hz)，2.48-2.32(m，2H)，1.92(s，3H).HRMS(FAB，3-NBAmatrix)C33H33N2O7(M+1)計算值569.2288；測定值569.2246.化合物61HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.62及7.55(d及d，1H，J＝2.2Hz)，7.48-7.44(m，2H)，7.39-7.22(m，8H)，6.87(m，4H)，6.68(m，1H)，4.56(m，1H)，4.25(m，1H)，3.88-3.35(m，6H)，3.82(s及s，6H)，2.85-2.72(m，1H)，2.63(t，1H，J＝6.4Hz)，2.46(t，1H，J＝6.4Hz)，2.36-2.25(m，1H)，1.95及1.93(s及s，3H)，1.20-1.08(m，12H).HRMS(FAB，3-NBAmatrix)C42H50N4O8P(M+1)計算值769.3366；測定值769.3166.(5)1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-丙炔基-2-硝基吡咯5’-三磷酸(化合物9)的合成用吡啶使化合物4(160mg，0.28mmol)共沸后，添加吡啶(2.8ml)，再添加乙酸酐(53μl，0.56mmol)，將反應溶液在室溫下攪拌12小時。將反應溶液用乙酸乙酯和5％NaHCO3分液，用5％NaHCO3清洗。將有機層用無水硫酸鈉干燥后，濃縮，用甲苯共沸后，溶解在二氯甲烷28ml中。0℃下向該反應溶液中添加二氯醋酸(280μl)，0℃攪拌15分鐘。向反應溶液中添加5％NaHCO3，分液，將有機層用5％NaHCO3清洗。將有機層用無水硫酸鈉干燥，濃縮，然后用硅膠柱純化，得到了78mg(90％、2步驟)的化合物7。將化合物7(31mg，0.1mmol)用吡啶共沸后，添加吡啶(100μl)和二噁烷(300μl)，然后添加2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿-4-酮(110μl，二噁烷的1M溶液)，室溫下攪拌10分鐘。向反應溶液中添加三-正丁基胺(100μl)和雙(三丁基銨)焦磷酸鹽(300μl，DMF中的0.5M溶液)，攪拌10分鐘。添加I2/吡啶(2.0ml，吡啶中的1％碘:H2O，98:2，v/v)，攪拌15分鐘，然后添加5％NaHSO3(150μl)，濃縮反應溶液。添加H2O(5.0ml)，室溫下攪拌30分鐘，然后添加28％氨水20ml，室溫下攪拌2小時。將反應溶液濃縮、凍干，然后用DEAESephadexA-25純化(50mM-1.0mMTEAB線性梯度)，得到了作為目標的化合物9。化合物71HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.90(d，1H，J＝2.1Hz)，7.30(d，1H，J＝2.1Hz)，6.60(t，1H，J＝6.4Hz)，5.22(m，2H)，4.13(m，1H)，3.65(m，2H)，2.62(ddd，1H，J＝3.0，6.0，14.3Hz)，2.43(m，1H)，2.08(s，3H)，2.00(s，3H).HRMS(FAB，3-NBAmatrix)C14H17N2O6(M+1)計算值309.1087；測定值309.1066.化合物9電噴霧離子化質譜學(ESI-MS)C12H17O14N2P3；計算值504.98(M-H)-；測定值505.95(M-H)-.(6)1-(2-脫氧-3-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-4-(二氯乙酰胺1-丙炔基)-2-硝基吡咯(化合物8)的合成將化合物3(305mg，0.78mmol)用吡啶共沸后，添加吡啶(7.8ml)，再添加4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(291mg，0.86mmol)，室溫下攪拌1小時。將反應溶液用乙酸乙酯和5％NaHCO3分液，將有機層用飽和食鹽水清洗。將有機層用無水硫酸鈉干燥，然后濃縮，用硅膠柱(CH2Cl2:EtOAc，9:1，v/v)純化，得到了526mg(97％)的化合物5。將化合物5(515mg，0.74mmol)用吡啶共沸后，添加吡啶(7.4ml)，再添加乙酸酐(280μl，3.0mmol)，將反應溶液在室溫下攪拌12小時。將反應溶液用乙酸乙酯和5％NaHCO3進行分液，用5％NaHCO3清洗。將有機層用無水硫酸鈉干燥，然后濃縮，用甲苯共沸后，溶解在二氯甲烷74ml中。0℃下向該反應溶液添加二氯醋酸(740μl)，0℃下攪拌15分鐘。向反應溶液添加5％NaHCO3，分液，將有機層用5％NaHCO3清洗。將有機層用無水硫酸鈉干燥，濃縮，然后用硅膠柱(CH2Cl2:MeOH，50:1，v/v)純化，得到了289mg(90％，2步驟)的化合物8。化合物51HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.07(t，1H，J＝5.3Hz)，7.67(d，1H，J＝2.2Hz)，7.41-7.21(m，10H)，6.89(dd，4H，J＝1.7，8.9Hz)，6.59(t，1H，J＝5.4Hz)，6.48(s，1H)，5.38(d，1H，J＝4.9Hz)，4.29(m，1H)，4.12(d，2H，J＝4.4Hz)，3.99(m，1H)，3.74(s，6H)，3.17(m，2H)，2.46-2.33(m，2H).HRMS(FAB，3-NBAmatrix)C35H34N3O8Cl2(M+1)計算值，694.1723；測定值694.1729.化合物81HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.12(t，1H，J＝5.3Hz)，7.96(d，1H，J＝2.2Hz)，7.36(d，1H，J＝2.2Hz)，6.61(t，1H，J＝6.3Hz)，6.49(s，1H)，5.23(m，2H)，4.18(d，2H，J＝5.4Hz)，4.13(m，1H)，3.68(m，2H)，2.63(ddd，1H，J＝3.0，6.0，14.3Hz)，2.44(m，1H)，2.07(s，3H).HRMS(FAB，3-NBAmatrix)C16H18N3O7Cl2(M+1)計算值434.0522；測定值434.0549.實施例VIINH2-hx-dPnTP、ROX-hx-dPnTP、FAM-hx-dPnTP的合成本實施例中，作為dPnTP相關的衍生物，按圖46所示的合成方案合成了NH2-hx-dPnTP、ROX-hx-dPnTP、FAM-hx-dPnTP。這些衍生物能夠在例如復制(PCR、引物延伸)中導入DNA中。氨基衍生物可以用于導入后DNA的修飾，氨基以外的熒光基團偶聯的各衍生物可以用于DNA的熒光標記以及FRET等。(1)1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯(圖46的步驟(a))在50mL茄形燒瓶中，用無水乙腈使1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(354mg、1mmol、含α異頭物)共沸2次。添加碘化銅(31mg、160μmol))、四三苯基膦鈀(0)(58mg、50μmol)，將其溶解在無水DMF(5mL)中，室溫下一邊攪拌一邊添加三乙胺(210μL，1.5mmol)，避光條件下室溫下攪拌。向其中滴加N-(2-丙炔基)-6-三氟乙酰胺基己酰胺(396mg、1.5mmol)的DMF(4mL)溶液，室溫下攪拌一晚。減壓下濃縮反應溶液，將所得粗生成物用硅膠色譜柱(5-10％CH3OH、CH2Cl2中)和C18-HPLC(39-41％CH3CN、H2O中、15分鐘)純化，以無定形狀物質的形式得到了目的物(408mg，收率83％)。1HNMR(270MHz，DMSO-d6)δ9.38(brs，1H)，8.28(t，1H，J＝5.3Hz)，7.95(d，1H，J＝2.0Hz)，7.30(d，1H，J＝2.0Hz)，6.54(t，1H，J＝5.6Hz)，5.29(d，1H，J＝4.0Hz)，5.20-5.05(m，1H)，4.30].20(m，1H)，4.05(d，2H，J＝5.3Hz)，3.83(q，1H，J＝4.0Hz)，3.70-3.50(m，2H)，3.14(t，2H，J＝7.3Hz)，2.50-2.36(m，1H)，2.30-2.17(m，1H)，2.08(t，2H，J＝7.3Hz)，1.58-1.40(m，4H)，1.28-1.16(m，2H).HRMS(FAB，3-NBAmatrix)C20H26F3N4O7(M+1)計算值491.1754；測定值491.1761.(2)1-(2-脫氧-3-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯(步驟(b)、(c))在50mL茄形燒瓶中，將1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯(394mg、803μmol)用無水吡啶共沸3次。將其溶解在無水吡啶(4mL)中，添加二甲氧基三苯基氯甲烷(286mg、844μmol)，室溫下攪拌1.5小時。將反應溶液加到乙酸乙酯/水中，除去水層。將有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液清洗，用硫酸鎂干燥，然后蒸餾除去溶劑。將所得粗生成物用硅膠色譜柱(0-0.5％CH3OH、CH2Cl2中)純化，以無定形狀物質的形式得到了三苯甲基化物。在30mL茄形燒瓶中，用無水吡啶使1-(2-脫氧-5-O-二甲氧基三苯甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯(542mg、684μmol)共沸3次。將其溶解在無水吡啶(7mL)中，添加醋酸酐(169μL，1.79mmol)，室溫下攪拌一晚。將反應溶液用乙酸乙酯稀釋，將有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水清洗，在硫酸鎂上干燥，然后蒸餾除去溶劑。將所得粗生成物溶解在無水二氯甲烷(68mL)中，0℃下一邊攪拌一邊添加二氯醋酸(680μL)，攪拌15分鐘。將反應溶液添加到飽和碳酸氫鈉水溶液中，用二氯甲烷抽提水層，將合并的有機層在硫酸鎂上干燥，然后蒸餾除去溶劑。將所得油狀物質用硅膠色譜柱(2％CH3OH、CH2Cl2中)純化，以無定形狀物質的形式得到了目的物(328mg、77％，2步驟收率)。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.39(brs，1H)，8.30(t，1H，J＝5.4Hz)，7.94(d，1H，J＝2.2Hz)，7.33(d，1H，J＝2.2Hz)，6.61(t，1H，J＝6.3Hz)，5.30-5.18(m，2H)，4.20-4.10(m，1H)，4.06(d，2H，J＝5.4Hz)，3.75-3.55(m，2H)，3.16(t，2H，J＝7.0Hz)，2.62(ddd，1H，J＝3.0，6.0，14.2Hz)，2.50-2.35(m，1H)，2.15-2.05(m，2H)，2.07(s，3H)，1.60-1.40(m，4H)，1.30-1.20(m，2H).HRMS(FAB，3-NBAmatrix)C22H28F3N4O8(M+1)計算值533.1859；測定值533.1907.(3)1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-氨基己酰胺)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯5’-三磷酸(NH2-hx-dPnTP)(步驟(d))在10mL茄形燒瓶中，用無水吡啶使1-(2-脫氧-3-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯(53mg、100μmol)共沸3次，然后用氬氣充滿反應容器。向其中添加無水吡啶(100μL)和無水二噁烷(300μL)使之溶解，添加2-氯-4H-1，2，3-二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿(ジオキサホスホリン)-4-酮的1M二噁烷溶液(110μL、110μmol)，室溫下攪拌10分鐘，然后添加三-正丁基胺(100μL)和雙(三正丁銨)焦磷酸的0.5MDMF溶液(300μL)，攪拌10分鐘。添加1％碘/水/吡啶溶液(2mL)，室溫下攪拌15分鐘，添加5％亞硫酸氫鈉水溶液(150μL)，然后減壓濃縮反應溶液。向所得油狀物質加水(5mL)，室溫下攪拌30分鐘，然后添加濃氨水(20mL)攪拌8小時。將其用DEAESephadexA-25色譜柱(1.5x30cm，濃度線性梯度；TEAB的50mM—1M溶液)和C18-HPLC(濃度梯度；x％—xx％乙腈的0.1M醋酸三乙銨緩沖液，pH7.0)進行純化，得到了目的物。1HNMR(300MHz，D2O)δ7.79(s，1H)，7.31(s，1H)，6.68(t，1H，J＝5.6Hz)，4.60-4.50(m，1H)，4.30-4.00(m，5H)，3.13(q，18H，J＝7.3Hz)，2.90(t，2H，J＝7.5Hz)，2.62-2.52(m，1H)，2.46-2.30(m，1H)，2.24(t，2H，J＝7.0Hz)，1.63-1.55(m，4H)，1.38-1.16(m，29H).31PNMR(121MHz，D2O)δ-8.26，-10.51，-22.05.MS(ESI)C18H28N4O15P3[M-H]-計算值633.08；測定值633.00.(4)1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-[6-(熒光素-5-羧酰胺基(カルボキサミド))己酰胺]-1-丙炔基]-2-硝基吡咯5’-三磷酸(FAM-hx-dpnTP)(步驟(e))將NH2-hx-dPnTP(6μmol)溶解在0.1M碳酸氫鈉水溶液(pH8.5，0.72mL)中，添加5-羧基熒光素N-羥基琥珀酰亞胺酯(FAM-SE)(3.7mg，7.8μmol)的DMF溶液(500μL)，一邊不時地振蕩一邊在避光條件下于室溫反應8小時。向其中添加濃氨水(0.5mL)，不時振蕩下反應5分鐘。將其凍干后，用DEAESephadexA-25色譜柱(1.5x30cm，濃度線性梯度；TEAB的50mM—1M溶液)和C18-HPLC(濃度梯度；0％—50％乙腈的0.1M醋酸三乙銨緩沖液，pH7.0)進行純化，得到了目的物。1HNMR(300MHz，D2O)δ8.29(s，1H)，8.04(d，1H，J＝7.5Hz)，7.58(brs，1H)，7.26(d，1H，7.5Hz)，7.00-6.60(m，7H)，6.39(brs，1H)，4.50-4.35(m，1H)，4.40-3.90(m，5H)，3.50-3.30(m，2H)，3.12(q，18H，J＝7.3Hz)，2.41-2.10(m，4H)，1.75-1.50(m，4H)，1.45-1.10(m，29H).31PNMR(121MHz，D2O)δ-10.86，-10.86，-23.13.MS(ESI)C39H38N4O21P3[M-H]-計算值991.12；測定值990.56(5)1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-[6-(羅丹明-X-5-羧酰胺)己酰胺]-1-丙炔基]-2-硝基吡咯5’-三磷酸(ROX-hx-dPnTP)(步驟(e))將NH2-hx-dPnTP(6μmol)溶解在0.1M碳酸氫鈉水溶液(pH8.5，0.85mL)溶解中，添加5-羧基-X-羅丹明N-羥基琥珀酰亞胺酯(ROX-SE)(5mg、7.92μmol)的DMF溶液(1mL)，不時振蕩下在避光條件下于室溫反應18小時。向其中添加濃氨水(0.5mL)，不時振蕩下反應5分鐘。將其凍干后，用DEAESephadexA-25色譜柱(1.5x30cm濃度線性梯度；TEAB的50mM—1M溶液)和C18-HPLC(濃度梯度；12.5％—50％乙腈的0.1M醋酸三乙銨緩沖液，pH7.0)進行純化，得到了目的物。1HNMR(300MHz，D2O)δ8.28(s，1H)，8.03(d，1H，J＝8.9Hz)，7.47(s，1H)，7.19(d，1H，J＝7.7Hz)，6.68(brs，1H)，6.55(brs，1H)，6.43(brs，1H)，6.09(brs，1H)，4.40-4.25(m，1H)，4.15-3.70(m，5H)，3.60-3.27(m，10H)，3.12(q，18H，J＝7.3Hz)，2.95-2.70(m，4H)，2.65-2.40(m，4H)，2.40-2.15(m，3H)，2.05-1.70(m，9H)，1.60-1.50(m，4H)，1.50-1.15(m，29H).31PNMR(121MHz，D2O)δ-10.90，-11.59，-23.27.MS(ESI)C51H56N6O19P3[M-H]-計算值1149.28；測定值1148.77實施例VIIINH2-hx-PaTP、FAM-hx-PaTP、TAMRA-hx-PaTP的合成本實施例中，作為rPaTP相關的衍生物，按圖47所示的合成方案合成了NH2-hx-PaTP、FAM-hx-PaTP、TAMRA-hx-PaTP。這些衍生物可以在例如轉錄中導入到RNA中。氨基衍生物可以用于導入后的RNA的修飾，其以外的熒光基團偶聯的各衍生物可以用于RNA的熒光標記以及FRET等。(1)1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(圖47的步驟(a))在10mL茄形燒瓶中，用無水乙腈使1-(β-D-呋喃核糖基)-4-碘吡咯-2-甲醛(177mg、500μmol，含α異頭物)共沸2次。添加碘化銅(15mg、80μmol))、四三苯基膦鈀(0)(29mg，25μmol)，將其溶解在無水DMF(2.5mL)中，室溫下一邊攪拌一邊添加三乙胺(105μL，750μmol)，避光條件下室溫下攪拌。向其中滴加N-(2-丙炔基)-6-三氟乙酰胺基己酰胺(198mg、750μmol)的DMF(2mL)溶液，室溫下攪拌一晚。減壓下濃縮反應溶液，將所得粗生成物用硅膠色譜柱(10％CH3OH、CH2Cl2中)和C18-HPLC(22-24％CH3CN、H2O中、15分鐘)純化，以無定形狀物質的形式得到了目的物(126mg、收率51％)。1HNMR(270MHz，DMSO-d6)δ9.52(d，1H，J＝0.66Hz)，9.38(brs，1H)，8.27(t，1H，J＝5.3Hz)，7.96(s，1H)，7.13(d，1H，J＝1.6Hz)，6.32(d，1H，J＝3.6Hz)，5.42-5.32(brs，1H)，5.18-5.05(m，2H)，4.08-3.95(m，4H)，3.90-3.84(m，1H)，3.70-3.50(m，2H)，3.20-3.10(m，2H)，2.08(t，2H，J＝7.3Hz)，1.55-1.40(m，4H)，1.30-1.15(m，2H).HRMS(FAB，3-NBAmatrix)C21H27F3N3O7(M+1)計算值490.1801；測定值490.1815.(2)1-(2，3-二-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(步驟(b)、(c))在10mL茄形燒瓶中，用無水吡啶使1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(122mg，250μmol)共沸3次。將其溶解在無水吡啶(4mL)中，添加二甲氧基三苯基氯甲烷(89mg、263μmol)，室溫下攪拌2.5小時。將反應溶液加到乙酸乙酯/水中，除去水層。將有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液清洗，用硫酸鎂干燥后，蒸餾除去溶劑。將所得粗生成物用硅膠色譜柱(0-0.5％CH3OH、CH2Cl2中)純化，以無定形狀物質的形式得到了三苯甲基化物(150mg)。在10mL茄形燒瓶中，用無水吡啶使1-(5-O-二甲氧基三苯甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(149mg、188μmol)共沸3次。將其溶解在無水吡啶(2mL)中，添加醋酸酐(53μL，565μmol)，室溫下攪拌一晚。將反應溶液用乙酸乙酯稀釋，將有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水清洗，在硫酸鎂上干燥，然后蒸餾除去溶劑。將所得粗生成物溶解在無水二氯甲烷(19mL)中，0℃下一邊攪拌一邊添加二氯醋酸(280μL)，攪拌15分鐘。將反應溶液加到飽和碳酸氫鈉水溶液中，用二氯甲烷抽提水層，將合并的有機層在硫酸鎂上干燥，然后蒸餾除去溶劑。將所得油狀物質用硅膠色譜柱(1-2.5％CH3OH、CH2Cl2中)純化，以無定形狀物質的形式得到了目的物(90mg、63％，2步驟收率)。1HNMR(270MHz，DMSO-d6)δ9.49(s，1H)，9.39(brs，1H)，8.28(t，1H，J＝5.3Hz)，8.03(s，1H)，7.21(d，1H，J＝1.6Hz)，6.63(d，1H，J＝5.3Hz)，5.44(brs，1H)，5.40-5.28(m，3H)，4.20-4.15(m，1H)，4.05(d，2H，J＝5.3Hz)，3.80-3.56(m，2H)，3.20-3.10(m，2H)，2.14-1.98(m，8H)，1.55-1.40(m，4H)，1.30-1.15(m，2H).HRMS(FAB，3-NBAmatrix)C25H31F3N3O9(M+1)計算值574.2012；測定值574.2061.(3)1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-氨基己酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(NH2-hx-PaTP)(步驟(d))在10mL茄形燒瓶中，用無水吡啶使1-(2，3-二-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(57mg、100μmol)共沸3次，然后用氬氣充滿反應容器。向其中添加無水吡啶(100μL)和無水二噁烷(300μL)，使之溶解，添加2-氯-4H-1，2，3-二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿-4-酮的1M二噁烷溶液(110μL、110μmol)，室溫下攪拌10分鐘，然后添加三-正丁基胺(100μL)和雙(三正丁銨)焦磷酸的0.5MDMF溶液(300μL)，攪拌10分鐘。添加1％碘/水/吡啶溶液(2mL)，室溫下攪拌15分鐘，添加5％亞硫酸氫鈉水溶液(150μL)，然后減壓濃縮反應溶液。向所得油狀物質加水(5mL)，室溫下攪拌30分鐘，然后添加濃氨水(20mL)，攪拌8小時。將其用DEAESephadexA-25色譜柱(1.5x30cm，濃度線性梯度；TEAB的50mM—1M溶液)和C18-HPLC(濃度梯度；0％—50％乙腈的0.1M醋酸三乙銨緩沖液，pH7.0)純化，得到了目的物。MS(ESI)C19H29N3O15P3[M-H]-計算值632.08；測定值632.00(4)1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-(熒光素-5-羧酰胺)己酰胺]-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(FAM-hx-PaTP)(步驟(e))將1/3量的上述合成的NH2-hx-PaTP溶解在0.1M碳酸氫鈉水溶液(pH8.5、2.5mL)中，添加5-羧基熒光素N-羥基琥珀酰亞胺酯(9mg、19μmol)的DMF溶液(200μL)，不時振蕩下避光條件下于室溫反應9小時。向其中添加濃氨水(1mL)，不時振蕩下反應1小時。將其凍干后，用DEAESephadexA-25色譜柱(1.5x30cm，濃度線性梯度；TEAB的50mM—1M溶液)和C18-HPLC(濃度梯度；0％—50％乙腈的0.1M醋酸三乙銨緩沖液，pH7.0)純化，得到了目的物。1HNMR(300MHz，D2O)δ9.07(s，1H)，8.20(s，1H)，7.93(d，1H，J＝7.9Hz)，7.62(brs，1H)，7.13(d，1H，J＝7.9Hz)，7.00-6.60(m，7H)，6.10(d，1H，J＝3.2Hz)，4.25-3.80(m，7H)，3.40-3.20(m，2H)，3.04(q，18H，J＝7.3Hz)，2.16(t，2H，J＝6.4Hz)，1.65-1.45(m，4H)，1.40-1.00(m，29H).31PNMR(121MHz，D2O)δ-10.90，-11.38，-23.25.MS(ESI)C40H39N3O21P3[M-H]-計算值990.13；測定值989.78.(5)1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-(四甲基羅丹明-5-羧酰胺)己酰胺]-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(TAMRA-hx-PaTP)(步驟(e))將1/3量的上述合成的NH2-hx-PaTP溶解在0.1M碳酸氫鈉水溶液(pH8.5，2.5mL)中，添加5-羧基四甲基羅丹明N-羥基琥珀酰亞胺酯(TAMRA-SE)(10mg、19μmol)的DMF溶液(1mL)，不時振蕩下避光條件下于室溫反應9小時。向其中添加濃氨水(1mL)，不時振蕩下反應8小時。將其凍干后，用DEAESephadexA-25色譜柱(1.5x30cm，濃度線性梯度；TEAB的50mM—1M溶液)和C18-HPLC(濃度梯度；12.5％—50％乙腈的0.1M醋酸三乙銨緩沖液，pH7.0)純化，得到了目的物。1HNMR(300MHz，D2O)δ9.07(s，1H)，8.26(s，1H)，8.02(d，1H，J＝7.9Hz)，7.69(s，1H)，7.35(d，1H，J＝7.9Hz)，7.10(d，1H，J＝9.4Hz)，7.01(d，1H，J＝9.4Hz)，6.88-6.70(m，3H)，6.39(d，2H，J＝9.2Hz)，6.06(d，1H，J＝3.5Hz)，4.20(t，1H，J＝4.9Hz)，4.10-3.80(m，6H)，3.55-3.30(m，2H)，3.25-3.00(m，30H)，2.25(t，2H，J＝6.3Hz)，1.75-1.55(m，4H)，1.40-1.10(m，29H).31PNMR(121MHz，D2O)δ-10.84，-11.56，-23.22.MS(ESI)C44H49N5O19P3[M-H]-計算值1044.22；測定值1044.09.實施例IX通過使用克列諾片段的復制將氨基、熒光染料偶聯的底物Pn導入DNA(55-mer)中在本實施例中，使用通過接頭結合了氨基、熒光染料(FAM)的底物Pn(NH2-hx-dPnTP、FAM-hx-dPnTP)(實施例VII中制備的)，考察了復制中這些底物向DNA中的摻入。具體地，采用了以下實驗方法。在包含下述雙鏈的溶液(10μl)中混合滅菌水稀釋的脫氧核苷三磷酸溶液(5μl)和缺失3’-5’外切核酸酶活性的克列諾片段(2U、5μl)，進行引物延伸反應(20μl規模)，其中，所述雙鏈由在各種位置在含有Ds的模板鏈DNA(Template，55-mer；1Ds，2Ds，3Ds，4Ds，5Ds(序列番號33-37)或對照(序列番號38))與用熒光素熒光標記的引物(Primer，20-mer)構成。反應是在50mMTris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、1mMDTT、0.05mg/mlBSA中，使用200nM模板-引物、100μM或200μMdNTPs(N＝A，G，C，T)、10μMNH2-hx-dPnTP或FAM-hx-dPnTP、0.1μU/μl克列諾片段(GEHealthcare)進行的。37℃反應5分鐘后，向該溶液中添加10M尿素(20μl)，終止反應。將該溶液于75℃加熱3分鐘，然后，將反應產物用10％聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠電泳進行了分析。利用熒光影像分析儀(MolecularImager、BioRad、FAM檢測型)檢測了反應產物的條帶。結果如圖48B及C所示。與不存在Pn的修飾底物時相比，當存在NH2-hx-dPnTP(圖48B及C)或FAM-hx-dPnTP(圖48C)時，全長產物的量增加，因此可知這些修飾dPnTP與模板鏈DNA中的Ds互補，從而摻入到DNA中。實施例XT7通過使用RNA聚合酶的轉錄將熒光染料偶聯的底物Pa導入RNA(17-mer)中本實施例中，使用通過接頭與熒光染料(FAM或者TAMRA)結合的底物Pa(FAM-hx-PaTP，TAMRA-hx-PaTP)(實施例VIII制備的)，考察了轉錄中這些底物向RNA中的摻入。具體地，采用了以下實驗方法。在含10mMNaCl的10mMTris-HCl緩沖液(pH7.6)中，進行模板DNA(35-mer，10μM)與其啟動子部分的互補鏈DNA(21-mer、10μM)的退火。轉錄反應是在40mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)、24mMMgCl2、2mM亞精胺、5mMDTT、0.01％TritonX-100中，使用2μCi[γ-32P]GTP、1mMNTPs、1mMFAM-，或TAMRA-hx-PaTP、2μM模板DNA、和50單位T7RNA聚合酶(Takara)進行的。37℃反應3小時后，向該溶液中添加10M尿素(20μL)終止反應。將該溶液于75℃加熱3分鐘，然后，用20％聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠電泳分析了轉錄物。結果如圖49。只在使用含Ds的模板DNA時，電泳上、轉錄物(17-mer)條帶的移動速度變慢，因此可知這些修飾PaTP與模板中的Ds互補，從而被導入到RNA中。在轉錄效率方面，與僅有天然型的對照實驗(圖49中右側的None泳道)相比，FAM-hx-PaTP為14％、TAMRA-hx-PaTP為10％。工業實用性本發明人等開發了在復制和轉錄中具有實用水平的高選擇性的非天然型堿基對系統，這使得創造一種新的生物技術來擴展遺傳字母表成為可能。疏水性Ds-Pa堿基對能夠PCR擴增含有它的DNA片段。進一步，利用Ds-Pa堿基對，能夠在通常的T7轉錄中將Ds和Pa部位特異性地導入到RNA中。因此，該系統提供了制造新功能性人工DNA和RNA的新型技術。而且，在科學上，修飾底物和疏水性堿基對對于復制和轉錄機制的進一步闡明同樣是重要的。在復制中，為了防止形成Ds-Ds、天然型-非天然型堿基對等不希望的堿基配對，本發明人等通過5’-γ-三磷酸酰胺和常規5’-三磷酸的組合實現了非天然型堿基配對的高選擇性。5’-γ-三磷酸酰胺作為識別配對堿基間的正確互補性的DNA聚合酶的底物是有用的。最近，有報道稱另一種5’-γ-修飾三磷酸即5’-γ-P-氨基萘-5-磺化(スルフオネ—ト)三磷酸改善了逆轉錄的保真度(非專利文獻38)。這些發現提示對于DNA聚合酶識別γ-修飾三磷酸來說，與通常的三磷酸底物的幾何學匹配相比，配對堿基間的正確幾何學匹配更為必要。5’-γ-三磷酸酰胺和3’→5’具有外切核酸酶活性的聚合酶的組合對其它非天然型堿基對同樣適用。Ds-Pa堿基對提供了疏水性堿基對在轉錄中發揮功能的第一個例子，這提示正如已經在復制中顯示的那樣，疏水性堿基對在轉錄中，配對堿基間的形狀互補性也是重要的。Ds-Pa堿基對系統對于創造新型功能性RNA分子是非常有用的。4-丙炔基吡咯-2-甲醛(Pa’)同樣可以與模板中的Ds互補性地、部位特異性地導入到RNA中，因此，4位修飾的一系列Pa堿基衍生物同樣可以導入到RNA中。此時，模板DNA可以通過含Ds-Pa堿基對的DNA片段的PCR擴增獲得。因此，Ds-Pa堿基對系統是制造在任意位置導入了功能性人工元件的核酸的強有力工具。權利要求1.核酸的復制方法，其特征在于在復制反應中，使用γ位磷酸的羥基被選自氨基、甲氨基、二甲氨基、巰基及氟基的基團替代的脫氧核糖核苷5’-三磷酸作為底物。2.權利要求1的方法，其中，所述替代基團為氨基。3.權利要求1或2的方法，其中，在復制反應中使用具有外切核酸酶活性的DNA聚合酶。4.權利要求1～3任一項的方法，其中，所述具有外切核酸酶活性的聚合酶選自具有3’→5’外切核酸酶活性的克列諾片段、T4DNA聚合酶及嗜熱菌來源的DNA聚合酶。5.權利要求1～4任一項的方法，其中，作為底物的脫氧核糖核苷5’-三磷酸具有非天然型堿基。6.權利要求1～4任一項的方法，其中，作為底物的脫氧核糖核苷5’-三磷酸具有天然型堿基。7.權利要求1～5任一項的方法，其中，作為底物的脫氧核糖核苷5’-三磷酸具有用式1表示的堿基化學式1.此處，R1為氫或氨基，R2為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且，A為N或CH。8.權利要求1～5任一項的方法，其中，作為底物的脫氧核糖核苷5’-三磷酸具有用式2表示的堿基化學式2.此處，R3為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3的烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基團，而且，R4為甲酰基或硝基。9.一種脫氧核糖核苷5’-三磷酸，其γ位磷酸的羥基已被選自氨基、甲氨基、二甲氨基、巰基及氟基的基團替代。10.一種脫氧核糖核苷5’-三磷酸，其γ位磷酸的羥基已被選自氨基、甲氨基、二甲氨基、巰基及氟基的基團替代，且其具有非天然型堿基。11.一種脫氧核糖核苷5’-三磷酸，其γ位磷酸的羥基已被選自氨基、甲氨基、二甲氨基、巰基及氟基的基團替代，且其具有天然型堿基。12.γ位磷酸的羥基被選自氨基、甲氨基、二甲氨基、巰基及氟基的基團替代了的脫氧核糖核苷5’-三磷酸的應用，其在權利要求1～8任一項的核酸的復制方法中用作底物。13.一種核酸，其中具有用式1表示的堿基的核苷酸與具有用式2表示的堿基的核苷酸形成堿基對式1化學式3.此處，R1為氫或氨基，R2為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且，A為N或CH；式2化學式4.此處，R3為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基團，而且，R4為甲酰基或硝基。14.權利要求13的核酸，其中，式1的堿基選自下組A1)7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；A2)7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；A3)7-(1H-2-咪唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；A4)5-氨基-7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；A5)5-氨基-7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；A6)5-氨基-7-(1H-2-咪唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；A7)4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；A8)4-(2-噻唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；A-9)4-(1H-2-咪唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基A-10)6-氨基-4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；A-11)6-氨基-4-(2-噻唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；及A-12)6-氨基-4-(1H-2-咪唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基。15.權利要求13的核酸，其中式2的堿基選自下組B1)2-甲酰基-1H-吡咯-1-基；B2)2-甲酰基-4-碘-1H-吡咯-1-基；B3)2-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-1-基；B4)2-甲酰基-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；B5)2-甲酰基-4-(2-取代氨基乙烯基)-1H-吡咯-1-基；B6)2-甲酰基-4-(3-取代氨基-1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；B7)2-硝基-1H-吡咯-1-基；B8)2-硝基-4-碘-1H-吡咯-1-基；B9)2-硝基-4-甲基-1H-吡咯-1-基；B10)2-硝基-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；B11)2-硝基-4-(2-取代氨基乙烯基)-1H-吡咯-1-基；及B12)2-硝基-4-(3-取代氨基-1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基。16.權利要求13～15任一項的核酸，其中在轉錄、逆轉錄、復制或翻譯步驟中形成堿基對。17.包含具有用式1表示的堿基的核苷酸的核酸的制備方法，其中，以包含具有用式2表示的堿基的核苷酸的核酸作為模板，進行轉錄、逆轉錄或復制，在所述具有式2的堿基的核苷酸的互補位置摻入所述具有式1的堿基的核苷酸式1化學式5.此處，R1為氫或氨基，R2為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且，A為N或CH；式2化學式6.此處，R3為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基團，而且，R4為甲酰基或硝基。18.包含具有式2表示的堿基的核苷酸的核酸的制備方法，其中，以包含具有式1表示的堿基的核苷酸的核酸作為模板，進行轉錄、逆轉錄或復制，在所述具有式1的堿基的核苷酸的互補位置摻入所述具有式2的堿基的核苷酸式2化學式7.此處，R3為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基團，而且，R4為甲酰基或硝基；式1化學式8.此處，R1為氫或氨基，R2為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且，A為N或CH。19.包含具有式1及/或式2的堿基的核苷酸的核酸，其是采用權利要求17或18的方法制備的。20.權利要求19的核酸，其為tRNA、mRNA、反義DNA或RNA、核酶、適體或siRNA。21.具有式1表示的堿基的核糖核苷5’-三磷酸式1化學式9.此處，R1為氫或氨基，R2為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且，A為N或CH。22.具有式2表示的堿基的核糖核苷5’-三磷酸式2化學式10.此處，R3為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基團，而且，R4為甲酰基或硝基。23.具有式3表示的堿基的5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-(2-氰乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)脫氧核糖核苷式3化學式11.此處，R5為氫或取代的氨基，R6為取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且，A為N或CH。24.具有式4表示的堿基的5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-(2-氰乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)脫氧核糖核苷式4化學式12此處，R7為選自氫、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基團，而且，R8為甲酰基或硝基，但不包括R7為氫或1-丙炔基且R8為甲酰基的情況。25.采用權利要求18的方法制備的、包含具有式2表示的堿基的核苷酸的核酸，其中，式2的取代基R3為用生物素或熒光分子取代的C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。26.權利要求22的核糖核苷5’-三磷酸，其中，R3為用生物素或熒光分子取代的C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。27.權利要求24的5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-(2-氰乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)脫氧核糖核苷，其中，R7為用生物素或熒光分子取代的C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。全文摘要本發明涉及核酸的復制方法及新型人工堿基對。本發明的核酸的復制方法的特征在于在復制反應中使用了γ位磷酸羥基已被選自氨基、甲氨基、二甲氨基、巰基及氟基的基團替代的脫氧核糖核苷5’-三磷酸作為底物。本發明的新型人工堿基對的特征在于7-(2-噻吩基)-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)或其類似物與吡咯-2-甲醛(Pa)或其類似物形成堿基對。文檔編號C12P19/34GK101365791SQ20068005259公開日2009年2月11日申請日期2006年12月7日優先權日2005年12月9日發明者平尾一郎,橫山茂之申請人:獨立行政法人理化學研究所