專利名稱：：蛋白質作為燃料中消泡劑成分的用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及至少一種疏水蛋白或其衍生物在添加劑組合物或燃料中作為消泡劑的用途、燃料消泡的方法、含有至少一種疏水蛋白或其衍生物和至少一種另外的燃料添加劑的添加劑和燃料組合物，和生產至少一種燃料組合物的方法。
背景技術：
：烴混合物可作為燃料使用，燃料也可以包括芳香族、粗柴油和煤油，這些化合物具有不好的特性，當將其轉移到儲藏容器(例如儲藏桶和機動車輛的燃料箱)時，它們結合空氣而產生泡沫。這導致轉移操作阻滯和不令人滿意的容器充填。因此通常向柴油機燃料中添加消泡劑。這些消泡劑應該在最小濃度下有活性，并且它們在柴油機燃料在發動機中燃燒的過程中一定不能形成任何有害殘渣、或對燃料的燃燒產生不利影響。本專利文獻中描述了相應的活性消泡劑。例如，基于硅元素的防沫劑和消泡劑是公知的。例如，DE10313853A公開了有機功能修飾的聚硅氧烷和其用于消除液體燃料(尤其是柴油機燃料)的泡沫的用途。GB-B2173510涉及消除柴油機燃料和噴氣式發動機燃料的泡沫的方法，其中向燃料中加入了基于硅聚醚共聚物的防沫劑。消泡劑的一個公知的缺點是其對含水柴油機燃料的消泡能力弱。含水柴油燃料應理解為包含約250ppm的水的柴油機燃料。這些水可能是在儲藏桶中進入燃料的凝結水，或在油車運輸過程中因為罐中的水未完全排空而引入燃料中的。US5542960也公開酚衍生物(更優選丁香酚)呈現對含水柴油機燃料相對較好的消泡能力。所述消泡劑和從現有技術已知的更多柴油機燃料的消泡劑具有多種缺點。例如，通常聚硅氧烷-聚氧化烯共聚物的硅含量為重量的10-15%、或甚至20-25%。由于有如此高的硅含量的化合物在燃燒過程中會導致在發動機中產生不希望的二氧化硅沉淀，因而需要具有減少硅成分的消泡劑用于柴油機燃料，或者至少改良的防泡和消泡能力以能夠減少這些添加劑的使用濃度。已知消泡劑的另一個缺點是它們同添加劑包的匹配性(可混合性)通常很低，這些添加劑被加入粗制柴油中從而提高燃料品質。添加劑包應理解為不同添加劑的均勻混合物，例如含有提高燃燒性能的物質、減少煙霧形成的物質、減少有害廢氣形成的物質、減少發動機及其部件腐蝕的抑制劑、界面活性物質、潤滑油等等。例如，在JP-05132682、GB-2248068和雜志Mineral61technik，37(4)，20中描述了此類添加劑包。添加劑包中的添加劑都被溶解于有機溶劑中形成濃縮儲藏液，使用時直接加入到粗制柴油機燃料中。而帶有極性基團的消泡劑通常不能均勻摻入這些添加劑包或在儲存過程中分離出來。一個可能的方案是具有理想性質的天然存在的添加劑。存在合適品種的物質，例如蛋白質。蛋白質是由氨基酸形成的大分子。這些多肽鏈的長度范圍可以從低于50個(例如10個)氨基酸，直到大于1000個氨基酸。關于蛋白質的作用模式，它們的三維結構是十分重要的。蛋白質的結構可以用一級結構、二級結構、三級結構和四級結構來描述。一級結構指在多肽鏈內單個氨基酸的排列順序。二級結構指蛋白質氨基酸的三維排列。三級結構是多肽鏈的超二級結構的三維排列。其由氨基酸殘基(即側鏈)之間的作用力和鍵決定。如果三維排列中多數分子形成超級功能單位，即稱為四級結構。兩個主要蛋白質組之間存在區別，球狀蛋白質的三級或四級結構具有4近似球形或梨形的形狀，其通常易溶于水或鹽溶液，而纖維狀蛋白質具有絲狀或纖維狀結構，其通常不可溶并屬于支持和骨架物質。疏水蛋白是約100-150個氨基酸的小蛋白質，其為絲狀真菌(例如普通裂褶菌(^^&印/^//附co/w附朋e))的特征蛋白質。它們通常含有8個半胱氨酸單位。疏水蛋白對于接觸面有顯著的親和力，因此適合用于包,皮表面，從而通過形成兩親的膜來改變界面性質。例如，通過用疏水蛋白包被聚四氟乙烯樹脂(Teflon)來獲得親水表面。可以從天然來源中分離疏水蛋白。疏水蛋白及其衍生物的制備方法同樣是公知的。例如DE102005007480.4公開了制備疏水蛋白及其衍生物的方法。由于疏水蛋白用于包被表面的特殊性質，這些蛋白質很可能用于多種工業應用。現有技術提出疏水蛋白用于多種應用的用途。WO96/41882提出了疏水蛋白作為乳化劑、濃縮劑、表面活性物質、以及用于使疏水表面親水、改良親水物質的抗水性、制備水包油乳劑或油包水乳劑的用途。也提出了其在制藥(例如生產軟膏或乳膏)中的應用，還有在化妝品(例如護膚或生產洗發香波或洗發劑)中的應用。WO96/41882另外要求了包含疏水蛋白的組合物，尤其是藥物應用的組合物的權利。EP-A1252516公開了用包含疏水蛋白的溶液在3O-80°C包被窗戶、隱形眼鏡、生物傳感器、醫藥器械、用于進行實驗或儲存的器皿、船外殼、固體微粒或載客運輸工具的框架或底盤。WO03/53383公開了疏水蛋白用于處理化妝品應用中的角蛋白材料的用途。WO03/10331公開疏水蛋白具有表面活性的性質。例如，公開了疏水蛋白包被的傳感器(例如測試電極)，該傳感器上非共價連有其他物質，如電活性物質、抗體或酶。WO2004/000880同樣公開了用疏水蛋白或者疏水蛋白類物質包#皮表面。也公開了添加疏水蛋白能夠穩定水包油或者油包水乳劑。WO01/74864涉及疏水蛋白類蛋白質，也公開了它們可以用于穩定分散體和乳劑。EP05007208.1指出蛋白質(尤其是疏水蛋白或其衍生物)作為反乳化劑的用途。
發明內容基于現有技術，本發明的目標是提供具有好的消泡活性并且硅含量低的消泡劑。本發明的另一個目標是提供不僅具有好的消泡活性、而且還廉價的消泡劑。本發明的另一個目標是提供不僅具有好的消泡活性、而且還廉價和與環境相匹配的消泡劑。根據本發明，通過在添加劑組合物或燃料中使用至少一種疏水蛋白或其衍生物作為消泡劑來實現該目標。使用疏水蛋白或其衍生物的優點在于它們是可生物降解的天然存在的物質，因此不會導致環境污染。而且，其降解形式幾乎不產生任何可導致在發動;f幾內沉淀的物質。根據本發明，疏水蛋白或其衍生物被用作消泡劑，即減少燃料或燃料組合物的泡沫形成。根據本發明，可以向燃料中單獨加入至少一種疏水蛋白或其衍生物作為消泡劑。然而，同樣可以將至少一種疏水蛋白或其衍生物與至少另一種用作消泡劑的化合物組合4吏用。同樣可以將不同的疏水蛋白或其衍生物組合使用。在本發明的上下文中，疏水蛋白或其衍生物應理解為疏水蛋白或修飾的疏水蛋白。例如，修飾的疏水蛋白可以是疏水蛋白融合蛋白質或者與疏水蛋白的多肽序列至少有60%、例如至少70%、尤其至少80%、更優選至少90%、尤其優選至少95%同一性的蛋白質，并且其滿足疏水蛋白生物學性質的程度達到50%、例如60%、尤其70%、更優選80%的蛋白質，所述性質尤其是通過用這些蛋白質包被改變表面特性，即在用這些蛋白質包被玻璃表面之前和之后使水滴的接觸角增加至少20。、優選至少25。、尤其至少30°。令人驚訝的，疏水蛋白或其衍生物用作消泡劑時展現良好的結果。關于疏水蛋白的定義，關鍵是疏水蛋白的結構特異性而不是序列特異性。盡管成熟疏水蛋白的氨基酸序列非常多樣化，但是它們都具有8個保守半胱氨酸殘基的高度特征性模式。這些殘基形成四個分子內二硫鍵。其N末端和C末端可以在相對大的范圍變化。這就允許借助本領域才支術人員已知的分子生物學技術加上長度為10-500個氨基酸的融合配偶體蛋白質。而且，在本發明的上下文中，疏水蛋白及其衍生物也可理解為具有相似結構和同等功能的蛋白質。在本發明中，術語"疏水蛋白"在下文應該理解為具有通用結構式(I)的多肽，其中X可能是任意的20個天然存在的氨基酸(苯丙氨酸Phe,亮氨酸Leu、絲氨酸Ser、酪氨酸Tyr、半胱氨酸Cys、色氨酸Trp、脯氨酸Pro、組氨酸His、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、異亮氨酸Ile、甲硫氨酸Met、蘇氨酸Thr、天冬酰胺Asn、賴氨酸lys、纈氨酸Val、丙氨酸Ala、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly)。在公式中，X可能在各情況下是相同或不同的。X旁邊的指數表示各情況下的氨基酸數，C是半胱氨酸、丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或蘇氨酸，其中C表示的殘基中至少4個是半胱氨酸，并且指數n和m表示不依賴于彼此的0-500、優選15-300之間的自然數。公式(I)的多肽也通過該特征來表征，即，在室溫、包被玻璃表面之后，與相同大小的水滴和未包被的玻璃表面形成的接觸角相比，其可使水滴接觸角增加至少200、優選至少25°和更優選30°。指定為d至cs的氨基酸優選為半胱氨酸；但是可以用具有相似空間7充填的其它氨基酸代替它們，優選丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、曱硫氨酸或甘氨酸。然而，d至CS中至少4個、優選至少5個、更優選至少6個和尤其至少7個位點應該由半胱氨酸組成。在本發明的蛋白質中，半胱氨酸可以是還原形式者彼此形成二硫鍵。尤其優選形成分子內C-C橋，尤其具有至少1個、優選2個、更優選3個和最優選4個分子內二石克鍵。對于上述以具有相似空間充填的氨基酸代替半胱氨酸的情況，這樣的在能互相形成分子內二硫鍵的配對中C位點是有利于代替的。如果半胱氨酸、絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、曱硫氨酸或蘇氨酸也被應用于X所指定的位點，那么在通用結構式中單個C位點的數目可以相應的改變。本發明優選應用具有通式(II)的疏水蛋白進行，Xn畫C、X3-25-C2-Xo-2-C3曙Xs-5(rC4-X2陽35"C5-X2-l5-C6匿Xo-2陽C7曙X3-35-C8畫Xn！(II)其中X、C及X和C旁邊的指數與上述定義一致，指數n和m在0-300之間，而且還根據上述接觸角的改變來區分蛋白質，并且至少6個指定為C的殘基為半胱氨酸。更優選所有C殘基都是半胱氨酸。尤其優選應用具有通式(III)的疏水蛋白Xn-Cl-X5-9-C2-C3-Xn-39_C4-X2-23_C5-X5-9-C6_C7-X6.l8-C8-Xm(III)其中X、C及X旁邊的指數與上述定義一致，指數n和m是在0-200之間的各個自然數，而且蛋白質的額外特征是上述說明的接觸角的變化。Xn和Xm殘基可能是天然連接于疏水蛋白的肽序列。然而，也可能其各自或兩者都不是天然連接于疏水蛋白的肽序列。這也理解為意指那些Xn和/或Xm殘基，其中疏水蛋白中天然存在的肽序列由非天然存在于疏水蛋白中的肽序列而延長。如果xn和/或xm不是天然連接于疏水蛋白的肽序列，此類序列通常長度為至少20個氨基酸，優選至少35個，更優選至少50個和最優選至少100個氨基酸。此類非天然連接于疏水蛋白的殘基也指下文中的融合配偶體。這是為了說明所述蛋白質可能由至少一個疏水蛋白部分和一個融合配偶體部分組成，自然條件下它們并不以這種形式共同存在。融合配偶體部分可能選自多種蛋白質。對于多數融合配偶體，其也可能連接一個疏水蛋白部分，例如連接于所述疏水蛋白部分的氨基端(Xn)和羧基端(XJ。然而，也可能例如兩個融合配偶體連接于本發明蛋白質的一個位點(Xn或Xm)。尤其合適的融合配偶體是在微生物、特別是大腸桿菌(ECO/i)或枯草芽孢桿菌(5fl"7/附S"6說l》中天然存在的蛋白質。此類融合配偶體的實例M列yaad(SEQIDNO:15和16)、yaae(SEQIDNO:17和18)、和石克氧還蛋白。同樣高度適用的是這些序列的片段或衍生物，其只含有所述序列的部分、優選70-99%、更優選80-98%,或相對于所述序列其中個別氨基酸或核苷酸發生了改變，在各情況中所述百分比基于氨基酸數。還可以例如通過糖基化、乙酰化或其它通過化學交聯(例如用戊二醛交聯)另外修飾根據本發明作為疏水蛋白或其衍生物使用的蛋白質的多肽序列。根據本發明使用的疏水蛋白或其衍生物的一個特征是當使用所述蛋白包被表面時，該表面性質改變。例如通過測量用蛋白質包被表面前后的水滴接觸角并確定兩次測量之差，可以試驗性確定表面特性的改變。接觸角的測量原則上是本領域技術人員所公知的。測量基于室溫和5ji1的小水滴。用于測量接觸角的合適方法的實例的精確實驗條件在實驗部分說明。在其中所述的條件下，與未包被的玻璃表面和同樣大小水滴的接觸角相比，根據本發明使用的蛋白質具有增加接觸角至少20。，優選至少25°，更優選至少30。的特性。目前已知的疏水蛋白或其衍生物中，疏水蛋白部分的極性和非極性氨基酸的位置是保守的，導致特征性的疏水性圖譜。根據生物物理學性質和疏水性的差異將目前已知的疏水蛋白分為兩類，I類和II類(Wessels等人1994，Ann.Rev.Phytopathol"32，413-437)。I類疏水蛋白組裝的膜高度不可溶(即使是升高溫度在1%的十二烷基硫酸鈉(SDS)中也是如此)，并且只能通過濃縮的三氟乙酸(TFA)或甲酸而再次解離。與之相反，II類疏水蛋白的組裝形式較不穩定。它們通過60%濃度的乙醇或1%SDS(在室溫)即可再次解離。氨基酸序列的比較揭示，在II類疏水蛋白中C3和C4半胱氨酸之間區域的長度明顯小于I類疏水蛋白。II類疏水蛋白還比I類疏水蛋白具有更多帶電荷的氨基酸。實施本發明尤其優選的疏水蛋白是dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basfl、basf2型疏水蛋白，下文的序列表對其進行了結構表征。它們也可能僅為所述類型的部分或其衍生物。也可能將多個相同或不同結構的疏水蛋白部分(優選2個或3個)一起連接于并非天然連接疏水蛋白的相應適宜多肽序列上。實施本發明尤其適合的還有具有SEQIDNO:20、22、24中所示多肽序列的融合蛋白質及其編碼核酸序列，尤其是根據SEQIDNO:19、21、23的序列。尤其優選的實施方案還包括由SEQIDNO:20、22或24所示多肽序列起始，通過取代、插入或缺失至少l個至多10個、優選5個、更優選所有氨基酸的5%而衍生的蛋白質，所述蛋白質仍然具有起始蛋白質至少50%的生物學特性。此處蛋白質的生物學特性指上述接觸角至少改變20。。合適的融合配偶體是導致由此產生的融合蛋白質能夠包被表面和同時抵抗去污劑處理的蛋白質。融合配偶體的實例是例如大腸桿菌中的yaad和yaae，以及石克氧還蛋白。已經發現通過此種途徑產生的融合蛋白質有功能上的活性，并且如文中所述，該疏水蛋白不必被解離而是通過三氟乙酸或甲酸將其激活。包含這些融合蛋白質、或將融合蛋白質剪切以后僅包含疏水蛋白的溶液適合直接用于包被表面。在C-或N-末端融合的親和標簽(例如His6、HA、鈣調節蛋白-BD、GST、MBD、幾丁質-BD、鏈霉親和素-BD-Avi-標簽、Flag-標簽、T7等等)有利于快速和有效的純化。相應的標準方法可以從親和標簽供應商那里獲得。可以利用疏水蛋白和融合配偶體之間的切割位點，從而以非衍生形式釋放純化的疏水蛋白(例如通過在甲硫氨酸的BrCN切割、Xa因子切割、腸激酶切割、凝血酶切割、TEV切割等等)。也可以從連接一種融合配偶體(例如yaad或yaae)和甚至不同序列的多種疏水蛋白(例如DewA-RodA或Sc3-DewA、Sc3-RodA)產生融合蛋白質。同樣可以使用具有高達70。/。同源性的疏水蛋白片段(例如N-或C-末端截短)或突變體。在各情況下，根據特定用途(即要消泡的燃料)來選擇最佳構建體。可以通過已知的肽合成方法化學，例如通過Merrifield固相合成來制備根據本發明使用的多肽或存在于本發明組合物中的多肽。可以通過合適的手段將天然存在的疏水蛋白從天然來源分離出來。例如可見Wiisten等人，Eur.JCellBio.63，122-129(1994)或WO96/41882。優選通過基因工程方法制備融合蛋白質，其中一個編碼融合配偶體的核酸序列(特別是DNA序列)與一個編碼疏水蛋白部分的核酸序列組合，從而通過組合核酸序列的基因表達在宿主生物體中產生所需要的蛋白質。例如在DE102005007480.4中公開了此類制備方法。此處用于所述制備方法的合適的宿主生物體(生產生物體)可以是原核生物(包括古細菌(/4rc/^ea))或真核生物，尤其是細菌包括嗜鹽桿菌(/^/Mflcten'fl)和甲烷球菌(附e^""oo^d)，真菌，昆蟲細胞，植物細胞和哺乳動物細胞，更優選大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(5fl"7/附附^^m'M附)、米曲霉ofyz—、構巢曲霉(Js/^fg///"^"'V/"/a"s)、黑曲霉045^1^///附"/^|0、巴斯德畢赤酵母(尸/cA/a/;做toWs)、假單胞菌屬物種(i^e"^/o柳o""51spec.)、乳酸桿菌(/"cto6flc////)、多形漢遜酵母(H"附efiw/a/w(V附or/^")、里氏木霉(7y7^W^7mi"Mei)、SF9(或相關細胞)等等。在此方法中，使用在調控核酸序列的遺傳控制下的、包含編碼根據本發明使用的多肽的核酸序列的表達構建體，和包含至少一個這些表達構建體的載體。所用構建體優選包含特定編碼序列的5'上游啟動子和3，下游終止序列，適用的情況下還包含各自與編碼序列有效連接的其他常用調控元件。在本發明中，"有效連接"應理解為啟動子、編碼序列、終止子和適用情況下的其他調控元件的有序排列，從而使每個調控元件能夠實現其表達編碼序列所需的功能。有效連接序列的實例為尋乾序列以及增強子、多腺苷酸化信號等等。其它調控元件包含可選標記、擴增信號、復制起點等等。合適的調控序列在例如Goeddel，基因表達技術酶學方法185，學術出版社，SanDiego,CA(19卯)中描述。除這些調控序列以外，可能在實際結構基因的上游仍存在對這些序列的天然調控，且適用的情況下可對之進行遺傳修飾，從而通過關閉天然調控而增強基因表達。優選的核酸構建體最好還包含一個或多個與啟動子功能性連接的所謂"增強子"序列，以增強核酸序列的表達。其他有利的序列，例如其他的調控元件或終止子也可插入到DNA序列的3，末端。構建體中可能具有一個或多個拷貝的核酸。如果為篩選所述構建體所需，構建體也可能包含其他標記，例如抗生素抗性或營養缺陷型補償基因。提出的對制備有利的調控序列為，例如，啟動子如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq曙T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、X-PR或imlambda-P啟動子中，這些啟動子最好在革蘭氏陰性菌中使用。提出的其他有利的調控序列，例如在革蘭氏陽性的啟動子amy和SP02,和酵母或真菌啟動子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。也可以使用合成的啟動子進行調控。為了在宿主生物體中表達的目的，最好將核酸構建體插入例如能夠使基因在宿主細胞中最優表達的載體(例如質粒或噬菌體)。除質粒和噬菌體以外，載體也指本領域技術人員所公知的所有其它載體，例如病毒(如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒)、轉座子、IS元件、噬粒、粘粒和線性或環狀DNA，以及農桿菌系統。這些載體可以在宿主生物體中自主復制或隨染色體復制。合適質粒是例如在大腸桿菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III"3-Bl、tgtll或pBdCI，在鏈霉菌(5^印to附j;c^)中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，在桿菌中的pUB110、pC194或pBD214，在棒狀桿菌(Cw^"WffcteW"附)中的pSA77或pAJ667，在真菌中的pALSl、pIL2或pBB116，在酵母中的2a、pAG-l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23，或在植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述質粒是可能質粒的一小部分選擇。其它質粒是本領域技術人員所公知的，并且能夠在例如《克隆載體》(PouwelsP.H.等人編輯Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444卯4018)中找到。為了表達其它存在的基因，核酸構建體還最好包含3，-末端和/或5，-末端調控序列來增強表達，根據宿主生物和基因或所選的基因來選擇所述調控序列，以達到最佳表達。這些調控序列旨在控制基因和蛋白質的表達。這意味著取決于宿主生物體，例如基因只在誘導后表達或過表達，或者立即表達和/或過表達。優選調控序列或因子具有正面影響，從而增強被引入的基因的表達。因此，使用強轉錄信號(例如啟動子和/或增強子)在轉錄水平增強調控元件是有利的。除此之外，也可能通過例如改良mRNA穩定性來增強翻譯。在載體的另一實施方案中，包含核酸構建體或核酸的載體也可能以線性DNA的形式凈皮有利地引入微生物中，并通過異源或同源重組的方式整合到宿主生物體的基因組中。此線性DNA可能由線性化載體(例如質粒)組成，或僅由核酸構建體或核酸組成。為實現生物中異源基因的最佳表達，最好根據生物中特定的密碼子使用來修飾核酸序列。通過計算機評估所研究生物的其他已知基因，可以確定"密碼子使用"。將合適的啟動子與合適的編碼核苷酸序列和終止信號或多聚腺苷酸信號融合來制備表達盒。為此使用的常規重組和克隆技術見于例如T.Maniatis，E.F.Fritscb和J.Sambrook，分子克隆實驗室操作手冊，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)和T.J.13Silhavy,M丄.Berman和L.W.Enquist，基因融合實驗,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)以及在Ausubel，F.M.等人，現代分子生物學實驗方法，GreenePublishingAssoc.和WileyInterscience(1987)中的描述。為了實現在合適宿主生物體中的表達，最好將重組核酸構建體或基因構建體插入宿主特異性載體中，這可使基因在宿主中最優表達。載體是本領域技術人員所熟知的，并且能夠在例如"克隆載體"(PouwelsP.H.等人編輯，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)中找到。可以利用載體制備例如由至少一個載體轉化的可用于生產本發明所用疏水蛋白或其衍生物的重組微生物。最好將上述重組構建體《1入合適的宿主系統并表達之。優選使用本領域技術人員熟知的克隆和轉染方法，例如共沉淀、原生質體融合、電穿孔法、逆轉錄病毒轉染等等，以引起所述核酸在特定表達系統中表達。合適的系統在例如現代分子生物學實驗方法，F.Ausubel等人編輯,WileyInterscience,NewYork1997，或Sambrook等人，分子克隆實驗室操作手冊，第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989中描述。也可以制備同源重組孩t生物。為此，可制備包括至少一部分所用基因或編碼序列的載體，適用的情況下，向所述編碼序列中引入至少一個氨基酸缺失、添加或取代，從而改變(例如功能性破壞)該序列("敲除"載體)。引入的序列也可為例如相關微生物的同源物或由哺乳動物、酵母或昆蟲來源衍生而來。可選擇地，可設計用于同源重組的載體，從而使內源性基因在同源重組時發生突變或其他改變，但仍然編碼功能性蛋白質(例如改變上游調控區域由此改變內源性蛋白質的表達)。本發明所用的基因的改變的部分位于同源重組載體中。適合同源重組的載體的構建在例如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell51:503中描述。原則上，適合此類核酸或核酸構建體的重組宿主生物體是所有原核或真核生物體。最好^f吏用孩i生物例如細菌、真菌或酵母作為宿主生物體。最好使用革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌，優選來自腸桿菌科(五"teAacte/7Vicefle)、假單胞菌科(/^g"flto附o"flflfaceflc)、才艮瘤菌科(及A&oA/fl""e)、鏈霉菌科(5^e/to附j;ce似ceflre)或i若卡氏菌科(A^awYZ/"ceag)的細菌，更優選埃希氏菌屬(五sc^n'c/^1)、假單胞菌屬、鏈酶菌屬、諾卡氏菌屬、伯克霍爾德菌屬(5"/^Ao/flfenVi)、沙門氏菌屬(5>/附朋6//")、農桿菌屬或紅球菌屬(及/^flto"ccws)的細菌。依據宿主生物體，按本領域技術人員公知的方法生長或培養上述制備融合蛋白質的過程中使用的生物體。微生物通常生長在液體培養基中，其中包含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有機氮源的形式例如酵母提取物，或例如硫酸銨等鹽類)、微量元素(例如鐵鹽、錳鹽和鎂鹽)、以及適用情況下的維生素，生長溫度在0。C到100。C之間，優選10。C到60。C，同時供以氧氣。培養液pH值可以維持在固定值，即在培養過程中可以調節或不調節。可以進行分批發酵、半分批發酵或連續培養。可以在發酵最初開始時引入營養素，或以半連續或連續方式進行隨后加料。可以通過實施例中所描述的方法從生物體中分離酶，或者在反應中使用酶粗提物。可以用重組方法制備本發明使用的蛋白質或其功能生物活性片段，通過培養產生多肽的微生物，適用的情況下誘導表達蛋白質，而且從培養液中分離所述蛋白質。如果需要，也可以通過此種方法在工業上生產蛋白質。可以通過已知方法培養和發酵重組微生物。例如細菌可以在20-40。C，pH6-9條件下，在TB培養基或LB培養基中繁殖。合適的培養條件例如在T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆:實驗室操作手冊，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)中詳細描述。如果蛋白質并非分泌至培養基中，那么就要破壞細胞，通過已知的蛋白質分離方法從溶菌產物中獲得產品。正如所預期的，可以通過高頻超聲、高壓(例如在弗氏壓碎器中)、滲透、使用去污劑、水解酶或有機溶劑、勻漿等手段，或通過多種所列出方法的組合來破壞細胞。可以用已知的層析方法純化蛋白質，例如分子篩層析(凝膠過濾法)，例如Q瓊脂糖層沖斤，離子交換層析和疏水層析，以及使用其它常用方法，例如超濾、結晶、鹽析、透析和非變性凝膠電泳。合適的方法在例如Cooper,F.G"BiochemischeArbdtsmethoden,VerlagWalterdeGruyter，Berlin,NewYork,或在Scopes,R.，蛋白質純化，SpringerVerlag，NewYork,Heidelberg,Berlin中描述。最好通過使用載體系統或寡核苷酸分離重組蛋白質，所述寡核苷酸以某些核苷^列延伸了cDNA，從而編碼改變的多肽或融合蛋白質，其可用于例如簡化純化。此類合適的修飾包含作為錨起作用的"標簽，，，例如六個組氨酸錨的修飾、或能夠作為抗原被抗體識別的表位(例如在Harlow，E.和Lane,D.，1988，抗體:實驗室操作手冊，ColdSpringHarbor(N.Y.)Press中描述)。其它合適的標簽是例如HA、鈣調節蛋白-BD、GST、MBD;幾丁質-BD、鏈霉親和素-BD-Avi-標簽、Flag-標簽、T7等等。這些錨可以用于例如將蛋白質附著在固體載體，例如聚合體基質上，例如可將其填充到層析柱中，或用于孩t孔滴定板或其它載體。可以從商品化的親和標簽供應商那里獲得相應的純化方法。如所述制備的蛋白質可以作為融合蛋白質直接使用或切割和移去融合配偶體后以"純化的"疏水蛋白使用。當需要移除融合配偶體時，推薦在融合蛋白中疏7K蛋白部分和融合配偶體部分之間摻入潛在的切割位點(蛋白酶的特定識別位點)。合適的切割位點具體包括通過生物信息學工具能夠確定的那些否則將既不存在于疏水蛋白部分也不存在于融合配偶體部分中的肽序列。尤其合適的是例如在曱硫氨酸的BrCN切割或蛋白酶介導的Xa因子切割、腸激酶切割、凝血酶切割、或TEV(煙草蝕紋病毒蛋白酶)切割。在本發明中，燃料既指狹義燃料(即內燃機操作中使用的燃料)，也指一般燃料。合適的燃料是中間餾出液和汽油燃料。然而，優選使用中間餾出液。合適的中間餾出液的沸程在120-500。C范圍，并選自例如柴油機燃料、煤油或取暖用油。優選的中間餾出液是柴油機燃料。柴油機燃料是例如沸程通常在100-400。C范圍的原油萃余液。它們1695%的餾出點通常高達360。C或更高。然而，它們也可以是"超低硫磺柴油"或"城市柴油"，其特征在于例如95。/。的餾出點不超過345。C和硫磺含量以重量計不超過0.005%,或者95%的餾出點不超過285'C和硫磺含量以重量計不超過0.001%。除通過精煉獲得的柴油機燃料以外，通過煤的氣化或氣體液化("氣體到液體"(GTL)燃料)獲得的柴油機燃料也是合適的。合適的還有上述柴油機燃料與可更新燃料(例如生物燃料或生物乙醇)的混合物。柴油機燃料優選具有低硫磺含量，即硫磺含量以重量計少于0.05%、優選少于0.02%、尤其少于0.005%和特別優選少于0.001%。燃料油也更優選具有低石克磺含量的，例如硫磺含量以重量計至多為0.1%、優選至多為0.05%、更優選至多為0.005%和尤其至多為0.001%。在另一個實施方案中，本發明因此涉及上述至少一種疏水蛋白或其衍生物作為消泡劑的用途，其中燃料是柴油機燃料。根據本發明，至少一種疏水蛋白或其衍生物優選基于燃料以O.Ol-lOOppm，優選0.15-50ppm，更優選0.2-30ppm或0.3-10ppm的量使用。在本申請中，單位ppm指mg/kg。在另一個實施方案中，本發明因此涉及上述至少一種疏水蛋白或其衍生物用于消泡劑的用途，其中至少一種疏水蛋白或其衍生物基于燃料以O.l-lOOppm的量4吏用。根據本發明，燃料、尤其是柴油機燃料可以通過加入至少一種疏水蛋白或其衍生物來消泡。本發明因此也涉及燃料消泡的方法，包括向燃料中添加至少一種疏水蛋白或其衍生物。在另一個實施方案中，本發明涉及上述給燃料消泡的方法，其中燃料是柴油機燃料。在更優選的實施方案中，本發明涉及上述給燃料消泡的方法，其中至17少一種疏水蛋白或其衍生物基于燃料計以0.1-100ppm的量使用。在本發明中，可能將至少一種疏水蛋白或其^f汙生物直接加入到燃料或燃料組合物中，或以添加劑組合物的形式加入。本發明還涉及添加劑組合物，其中除至少一種另外的燃料添加劑以外，包含至少一種疏水蛋白或其衍生物。本發明可能涉及包含至少一種疏水蛋白或其衍生物和至少一種另外的燃料添加劑的燃料組合物。在另一實施方案中，本發明因此涉及包含至少一種疏水蛋白或其衍生物和至少一種另外的燃料添加劑的添加劑組合物。在另一實施方案中，本發明可能涉及除至少一種燃料作為主要成分以外、包含至少一種疏水蛋白或其衍生物和至少一種另外的燃料添加劑的燃料組合物。除至少一種疏水蛋白或其衍生物以外，添加劑組合物或燃料包含至少一種另外的燃料添加劑，尤其是至少一種去垢劑和/或反乳化劑。合適的去垢添加劑和反乳化劑在下面列出。除多種燃料添加劑(例如載體油)，添加劑組合物和燃料也可以包含防腐劑、抗氧化劑、抗靜電劑、染料標記等等。然而，添加劑組合物或燃料優選包含至少一種去垢劑和/或反乳化劑，和合適情況下的另外不同的燃料添加劑。在更優選的實施方案中，本發明因此涉及上述添加劑組合物或燃料組合物，其中該組合物包含至少一種去垢劑。在更優選的實施方案中，本發明可能涉及上述添加劑組合物或燃料組合物，其中組合物包含至少一種反乳化劑。在下文中舉例列出合適的去垢添加劑。去垢添加劑優選兩親的物質，其具有至少一種平均分子量(Mn)為從85至20000的疏水烴基基團和至少一種極性部分，該極性部分選自(a)具有高達6個氮原子的單氨基或多氨基，其中至少一個氮原子為堿性性質；(b)硝基，合適情況下與羥基結合；(c)與單氨基或多氨基結合的羥基，其中至少一個氮原子為堿性性質;(d)羧基或其堿金屬或其堿土金屬鹽；(e)硫酸基團或其堿金屬或其堿土金屬鹽；(f)聚氧-CV到-C4-亞烷基，其末端為羥基、單氨基或多氨基(其中至少一個氮原子為堿性性質)、或氨基曱酸酯基團；(g)羧酸酯基團；Oi)從琥珀酐衍生的部分，其具有羥基和/或氨基和/或酰氨基和/或亞氨基；和/或(i)通過被取代的酚類與醛和單胺或多胺的曼尼西反應獲得的部分。上述去垢添加劑中的疏水羥基基團的平均分子量(Mn)為從85到20000、特別是從113到10000、尤其從300到5000，其確保燃料足夠的可溶性。通常的疏水羥基基團，尤其是與極性部分(a)、(c)、(h)和(i)相連接的疏水羥基基團，包括聚丙烯基團、聚丁烯基團和聚異丁烯基團，其各自的Mn為從300到5000、特別是從500到2500、尤其從700到2300。上述去垢添加劑基團的實例包括以下包含單氨基或多氨基(a)的添加劑優選聚烯烴單胺或聚烯烴多胺，基于Mn為從300到5000的聚丙烯或常規(即主要具有內部雙鍵)的聚丁烯或聚異丁烯。當主要使用具有內部雙鍵(通常在p和y位點)的聚丁烯或聚異丁烯作為在制備添加劑中的起始材料時，可能的制備途徑是通過氯化和隨后的氨基化、或通過用空氣或臭氧氧化雙鍵，從而形成羰基或羧基化合物，然后在還原(氬化)條件下進行氨基化。此處氨基化所用的胺可以是例如氨、單胺或多胺，例如二甲胺基丙胺(dimethylaminopropylamine)、乙二胺(ethylenediamine)、二亞乙基三胺(diethylenetriamine)、三亞乙基四胺(triethylenetetramine)或四亞乙基五胺(tetraethylenepentamine)。相應的基于聚丙烯的添加劑具體在WO94/24231中描述。更優選的包含單氨基(a)的添加劑是聚異丁烯的氫化反應產物，其具有與氧化氮或氧化氮和氧的混合物的聚合P平均程度為從5到100，具體在WO97/03946中描述。更優選的包含單氨基(a)的添加劑是從聚異丁烯環氧化物通過與胺反應和隨后的氨基乙醇的脫水和還原從而獲得的化合物，具體在DE-A19620262中描述。包含硝基(b)的添加劑(合適情況下與羥基組合)，優選聚異丁烯的反應產物，其含有與氧化氮或氧化氮和氧的混合物的聚合P平均程度為從5到100或從10到100，具體在WO96/03367和WO96/03479中描述。這些反應產物通常為純化的硝基聚異丁烯(例如a，p-二硝基聚異丁烯)和混合的羥基硝基聚異丁烯(例如a-硝基-P-羥基聚異丁烯)的混合物。包含與單氨基或多氨基結合的羥基(c)的添加劑尤其是聚異丁烯環氧化物的反應產物，其能夠從具有優選的主要末端雙鍵的聚異丁烯獲得，且Mn從300到5000，具有氨或單胺或多胺，具體在EP-A476485中描述。包含羧基或其堿金屬或其堿土金屬鹽(d)的添加劑優選為Q-C4(r烯烴與順丁烯二酸酐的共聚物，其總摩爾質量為從500到20000，其某些或所有羧基轉變為堿金屬或堿土金屬鹽，而且任意剩余的羧基與乙醇或胺反應。此類添加劑具體由EP-A307815公開。此類添加劑主要用于防止閥門磨損，并且如WO87/01126中所述最好與常用燃料去垢劑(例如聚(異)丁胺或聚醚胺)組合4吏用。包含硫酸基團或其堿金屬或其堿土金屬鹽(e)的添加劑優選為烷基磺基琥珀酸的堿金屬或堿土金屬鹽，具體在EP-A639632中描述。此類添加劑主要用于防止閥門磨損，并且最好與常用燃料去垢劑(例如聚(異)丁胺或聚醚胺)組合4吏用。包含聚氧-C2-C4-亞烷基部分(f)的添加劑優選為聚醚或聚醚胺，其通過CrC6。-鏈烷醇、CVC3。-鏈烷二醇、單-或二-C2-C3。-垸基胺、d-C3Q-烷基環己醇或d-C3。-烷基酚與每個羥基或氨基1-30摩爾的環氧乙烷和/或環氧丙烷和/或環氧丁烷反應獲得，并且在聚醚胺的情況通過隨后的與氨、單胺或多胺的還原氨基化而獲得。此類產物具體在EP-A310875、EP-A356725、EP-A700985和US4877416中描述。對于聚醚的情況，此類產物也具有載體油的性質。常用實例是丁氧基十三垸醇、丁氧基異十三烷醇、丁氧基異壬基酚、和丁氧基聚異丁醇和丙氧基化物、以及與氨的相應反應產物。包含羧酸酯基團(g)的添加劑優選是單-、二-、或三羧酸與長鏈烷基醇或多元醇形成的酯，尤其是在10(TC具有最小粘度2mm2/s的酯，具體在DE-A3838918中描述。所用的單-、二-或三羧酸可以是脂肪族或芳香族酸，尤其合適的乙醇酯或多元醇酯是代表性的例如含有6-24個碳原子的長鏈。通常代表性的酯類是異辛醇、異壬醇、異癸醇和異十三醇的己二酸酯、鄰苯二曱酸酯、間苯二酸酯、對苯二酸酯和偏苯三酸酯。此類產物也具有載體油的特性。包含從琥珀酐衍生的具有羥基和/或氨基和/或酰氨基和/或亞氨基的部分(h)的添加刑優選為聚異丁烯琥珀酐的相應衍生物，其通過具有Mn=300-5000的聚異丁烯與順丁烯二酸酐以熱途徑或含氯的聚異丁烯進行常規反應或強反應而獲得。尤其感興趣的是向衍生物附加脂肪族聚胺，例如乙二胺、二亞乙基三胺、三亞乙基四胺或四亞乙基五胺。具有羥基和/或氨基和/或酰氨基和/或亞氨基的部分是例如羧酸基團、酰胺、二-或聚胺的酰胺(除酰胺功能以外，其還具有游離胺基團)、具有酸和酰胺功能的琥珀酸衍生物、單胺的羧二酰亞胺(carboximide)、二胺或多胺的羧二酰亞胺(除亞胺功能外，還具有游離胺基團)、和二酰亞胺(通過二-或多胺與兩個琥珀酸衍生物反應形成)。此類燃料添加劑具體在US4849572中描述。包含通過取代的酚類與醛和單胺或多胺的曼尼西反應獲得的部分(i)的添加劑優選為聚異丁烯-取代的酚與甲醛和單胺或多胺(例如乙二胺、二亞乙基三胺、三亞乙基四胺、四亞乙基五胺或二甲胺基丙胺)的反應產物。聚異丁烯-取代的酚可以通過具有Mn=300-5000的聚異丁烯的常規反應或強反應而獲得。此類"聚異丁烯-曼尼西堿"具體在EP-A831141中描述。為了更精確地分別詳細定義燃料添加劑，此處明確地參考上述現有技術的公開文件。尤其優選來自(h)組的去垢添加劑。這些具體為聚異丁烯-取代的琥珀酰亞胺，尤其是帶有脂肪族多胺的亞胺。適合本發明的反乳化劑的實例包括如下。乳化劑是^1起乳劑分層的物質。它們可以是在相界面有效的離子型或非離子型物質。相應地，所有表面活性物質原則上是合適的反乳化劑。尤其合適的是選自陰離子活性化合物，例如烷基-取代酚和萘磺酸鹽的堿金屬或堿土金屬鹽、和脂肪酸的堿金屬或堿土金屬鹽，還有不帶電荷的化合物，例如烷氧乙醇例如乙氧基乙醇、烷氧基酚例如乙氧基叔丁酚或乙氧基叔戊酚、脂肪酸、垸基酚、環氧乙烷(EO)和環氧丙烷(PO)的縮合物(例如也以EO/PO的嵌段共聚物)、聚乙烯亞胺或聚硅氧烷的形式。添加劑組合物和燃料又可以與另外的常用成分和添加劑組合。此處應提到，例如沒有標記的去垢劑作用的載體油，它們尤其在使用汽油燃料的情況下使用。然而，它們有時也在中間餾出液中使用。在下述實施例中列出合適的載體油。合適的礦物載體油是在原油加工過程中獲得的部分，例如具有例如SN500-2000級粘度的光亮油或基礎油；還有芳香族烴、石蠟族烴和烷氧基鏈烷醇。同樣有用的是在礦物油精制的過程中獲得的部分，已知為"加氫裂化油"(具有沸程在約360-500。C范圍的真空餾分，獲自在高壓下催化氫化反應和異構化和去石蠟化的天然礦物油)。同樣合適的是上述礦物載體油的混合物。用于本發明的合成載體油的實例選自聚烯烴(聚-a-烯烴或聚內烯烴)、(聚)酯、(聚)烷氧基酯、聚醚、脂肪族聚醚胺、烷基酚-起始的聚醚、烷基酚-起始的聚醚胺和長鏈烷基醇的羧酸酯。合適的聚烯烴的實例是Mi^400-1800的烯烴聚合物，尤其是基于聚丁烯或聚異丁烯(氫化或非氫化的)。合適的聚醚或聚醚胺優選為包含聚氧-C2-C4亞烷基部分的化合物，通過CVC6。-鏈烷醇、OC3。-鏈烷二醇、單-或二-CrC3。-烷基胺、Q-C3。-烷基環己醇或CrC3。-烷基酚與每個羥基或氨基1-30摩爾的環氧乙烷和/或環氧丙烷和/或環氧丁烷反應獲得，并且在聚醚胺的情況通過隨后的與氨、單胺或多胺的還原氨基化而獲得。此類產物具體在EP-A310875、EP-A356725、EP-A700985和US4,877,416中描述。例如，所用的聚醚胺可以是聚-CrCV環氧烷胺或其功能性衍生物。其常用實例是丁氧基十三烷醇、丁22氧基異十三烷醇、丁氧基異壬基酚、和丁氧基聚異丁醇和丙氧基化物、以及與氨的相應反應產物。長鏈烷基醇的羧酸酯的實例具體是單-、二-、或三羧酸與長鏈烷基醇或多元醇形成的酯，具體在DE-A3838918中描述。所用的單-、二-或三羧酸可以是脂肪族酸或芳香族酸；合適的乙醇酯或多元醇酯特別是代表性長鏈，例如具有6-24個碳原子。通常代表性的酯類是異辛醇、異壬醇、異癸醇和異十三醇的己二酸酯、鄰苯二曱酸酯、間苯二酸酯、對苯二酸酯和偏苯三酸酯。更合適的載體油系統在例如DE-A3826608、DE-A4142241、DE-A4309074、EP-A0452328和EP-A0548617中描述，它們明確地在此引用作為參考。尤其合適的合成載體油的實例是乙醇一起始的聚醚，其具有約5-35、例如約5-30個C3-CV環氧烷單位，例如選自環氧丙烷、環氧丁烷和l，l-二甲基環氧乙烷單位、或其混合物。合適的起始乙醇的非限制性實例是長鏈烷基醇或以長鏈烷基取代的酚，其中長鏈烷基基團具體為直鏈或分支的CVd8-烷基基團。優選的實例包括十三烷醇和壬烷基酚。更合適的合成載體油是如DE-A10102913.6中所述的烷氧基烷基酚。合適的情況下，本發明的組合物可以包含其它共添加劑。更常用的添加劑是改良燃料寒冷性質的添加劑，例如成核劑、流動改良劑、石蠟介軟劑和其混合物，例如乙烯-醋酸乙烯酯共聚物；防腐劑，例如基于有機羧酸的銨鹽，所述鹽易形成薄片，或在有色金屬防腐的情況下基于雜環芳香族；去濁劑(dehazers);消泡劑，例如某些硅氧烷化合物；十六烷改良劑(點火改良劑)；助燃劑；抗氧化劑或穩定劑，例如基于胺例如(對)-苯二胺、二環己基胺或其衍生物，或基于酚例如2，4-二叔丁基酚或3,5-二叔丁基-4-羥基苯丙酸；抗靜電劑；茂金屬例如二茂絡鐵；三羰基甲基環戊二烯錳；潤滑性改良劑，例如特定脂肪酸、烯基琥珀酸酯、雙(羥烷基)脂肪胺、羥基乙酰胺或蓖麻油；和染料(標記)。合適情況也加入胺從而降低燃料的pH。當使用去垢添加劑(例如具有極性部分(a)到(i))時，其通常以重量計10-5000ppm，尤其是以重量計50-1000ppm，更優選以重量計25-500ppm的量加入燃料中。當使用反乳化劑時，通常以以重量計0.1-100ppm，尤其是以重量計0.2-10ppm的量加入到燃料中。如果需要，其它所述成分和添加劑以所用目的的常用量加入。當本發明的添加劑組合物包含去垢添加劑時，其優選以基于組合物總重計1-60%，優選以重量計1-50%，更優選以重量計1-40%,尤其是以重量計1-15%的量存在。當本發明的添加劑組合物包含反乳化劑時，其優選以基于組合物總重量計0.01-5%,更優選以重量計0.01-2.5%和尤其是以重量計0.01-1%的量存在。合適的情況，本發明的組合物也可以包含溶劑或稀釋劑。合適的溶劑或稀釋劑是例如芳香族烴和脂肪族烴，例如Cs-d。-烴，例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、它們的結構異構體和混合物；石油醚，芳香族例如苯、曱苯、二甲苯和溶劑石腦油；具有3-8個碳原子的烷基醇，例如丙醇、異丙醇、正丁醇、仲丁醇、異丁醇等等，與烴溶劑組合；和烷氧基烷基醇。合適的稀釋劑還有例如原油加工過程中獲得的組分，例如煤油、石腦油或光亮油。在中間餾出液、特別是在柴油機燃料和燃料油的情況優選使用的稀釋劑是石腦油、煤油、柴油機燃料、芳香族烴例如重溶劑石腦油、Solvesso或Shellsof，還有這些溶劑和稀釋劑的混合可以將各成分分別加入燃料、或加入常規燃料組合物中、或作為預先制備的濃縮劑(添加劑包；添加劑組合物)。本發明還涉及生產至少一種燃料組合物的方法，其中燃料或燃料組合物是(a)與至少一種疏水蛋白或其衍生物和至少一種其它燃料添加劑混合，或24(b)與上述添加劑組合物混合。疏水蛋白或其衍生物在燃料消泡方面有很好的特性。本發明在下文以實施例說明。實施例實施例1克隆vaad-His^/vaaE-His^的準備工作用寡核普酸Hal570和Hal571(Hal572/Hal573)進行多聚酶鏈式反應。所使用的模板DNA是枯草芽孢桿菌基因組DNA。獲得的PCR片段包含枯草芽孢桿菌yaaD/yaaE基因的編碼序列，和分別在其末端的Ncol和BglII限制性切割位點。純化PCR片段，并用限制性內切酶NcoI和BglII切割。此DNA片段用作插入片段克隆到來自Qiagen的載體pQE60中，該載體預先用限制性內切酶Ncol和BglII線性化。這樣獲得的載體pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5可以用于表達含有YAAD::HIS6或YAAE::HIS6的蛋白質。Hal570:gcgcgcccatggctcaaacaggtactgaHal571:gcagatctccagccgcgttcttgcatacHal572:ggccatgggattaacaataggtgtactaggHal573:gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc實施例2vaad疏水蛋白DewA-His^的克隆用寡核苷酸KaM416和KaM417進行多聚酶鏈式反應。所使用的模板DNA是構巢曲霉基因組DNA。獲得的PCR片段包含疏水蛋白基因dewA的編碼序列，和N-末端因子Xa蛋白酶切割位點。純4匕PCR片段，并用限制性內切酶BamHI切割。此DNA片段用作插入片段克隆到載體pQE60YAAD#2中，該載體預先用限制性內切酶BglII線性化。這樣獲得的載體#508用于表達含有YAAD::Xa::dewA::HIS6的融合蛋白質。KaM416:GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGCKaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC實施例3vaad疏7jc蛋白RodA-His^的克隆質粒#513的克隆類似于質粒#508，4吏用寡核苷酸KaM434和KaM435。KaM434:GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGCKaM435:CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG實施例4vaad疏水蛋白BASF1-His6的克隆質粒#507的克隆類似于質粒#508,使用寡核苷酸KaM417和KaM418。使用的模板DNA是人工合成DNA序列(疏水蛋白BASF1)(見附錄SEQIDNO.11和12)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG實施例5vaad疏水蛋白BASF2-His6的克隆質粒#506的克隆類似于質粒#508，^f吏用寡核苷酸KaM417和KaM418。使用的模板DNA是人工合成DNA序列(疏水蛋白BASF2)(見附錄SEQIDNO.13和14)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG實施例6vaad疏水蛋白SC3-His^的克隆質粒#526的克隆類似于質粒#508，使用寡核苷酸KaM464和KaM465。使用的模板DNA是裂褶菌(Schyzophyllumcommune)的cDNA(見附錄SEQIDNO.9和10)。KaM464:CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGCKaM465:GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT實施例7vaad疏水蛋白DewA-His[重組大腸桿菌菌株的發酵將含有表達yaad疏水蛋白DewA-His6的大腸桿菌菌林的3mlLB液體培養基接種于15mlGreiner管中。于37。C在振蕩器上以200rpm培養8小時。將1ml此預培養液各自接種于2個1升的有塞子錐形瓶中的250mlLB培養基中(+100ng/ml氨芐青霉素)，在37。C以180rpm振蕩培養9小時。將0.5升的預培養液(相對于水測量OD6。一1:10)接種于13.5升的LB培養基(+100ng/ml氨芐青霉素)中，置于20升的發酵罐。在OD6()。nm約3.5時添加140ml的100mMIPTG。3小時以后，將發酵罐冷卻到10。C，并通過離心除去發酵液。將細胞沉淀用于進一步的純化。實施例8重組疏水蛋白融合蛋白的純化(帶有C-末端His6標簽的疏水蛋白融合蛋白的純化)100g的細胞沉淀(100-500mg的疏水蛋白)用50mMpH7.5的磷酸鈉緩沖液補足到總體積為200ml，并將沉淀重懸。懸浮液用T25型高速分散器Ultraturrax(Janke和Kunkel;IKA-Labortechnik)處理10分鐘，隨后為了降解核酸，再與500單位Benzonase核酸酶(Merck，Darmstadt;orderNo.1.01697.0001)在室溫培育1小時。在破壞細胞之前使用玻璃萃取柱(P1)進行過濾。為了破壞細胞和剪斷剩余的基因組DNA，用勻漿器在1500巴進行2個勻漿循環(MicrofluidizerM-110EH;MicrofluidicsCorp.)。將勻漿液離心(SorvallRC-5B，GSA轉子，250ml離心筒，60分鐘，4。C，12000rpm，23000g)，上清置于冰上，用100mlpH7.5的磷酸鈉緩沖液重懸沉淀。重復3次離心和重懸，在第3次重復時磷酸鈉緩沖液中包含1%SDS。重懸以后，將混合物攪拌l小時，然后進行最終離心(SorvallRC-5B,GSA轉子，250ml離心筒，60分鐘，4。C，12000rpm，23000g)。根據SDS-PAGE分析，疏水蛋白存在于最終離心后的上清液部分(圖1)。實驗顯示疏水蛋白可能以包涵體的形式存在于相應大腸桿菌中。將50ml含疏水蛋白的上清液應用于以50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液平衡的50ml鎳-瓊脂糖高性能17-5268-02柱(安瑪西亞公司(Amersham))。用50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液洗柱，隨后用包含200mM咪唑的50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液洗脫疏水蛋白。為了去除咪唑，溶液用50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液透析。圖1描述所制備的疏水蛋白的純化A泳道應用于鎳-瓊脂糖柱的溶液(l:10稀釋)B泳道流出液=清洗步驟的洗脫液C-E泳道洗脫級分的OD280峰(WP1、WP2、WP3)F泳道顯示所用的標記。圖1的疏水蛋白分子量約為53kD。一些較小條帶代表疏水蛋白的降解產物。實施例9性能測試疏水蛋白改變水滴在玻璃上接觸角的特性基質玻璃(窗玻璃，SiiddeutscheGlas，Mannheim):-疏水蛋白濃度100pg/ml醋酸鈉+0.1%吐溫20中培育過夜(溫度80。C)-隨后在蒸餾水中清洗包被-然后于80'C在1。/。十二烷基石克酸鈉(SDS)的蒸餾水溶液中培育10分鐘-在蒸餾水中清洗樣品在空氣中干燥，且測定5pl水滴的接觸角(以度為單位)。用Dataphysics接觸角系統OCA15+儀器，軟件為SCA20.2.0.(2002年11月)測量接觸角。根據制造商的說明書進行測量。未處理的玻璃接觸角為30±5°，以根據實施例8的功能性疏水蛋白(yaad-dewA國his6)包被的玻璃接觸角為75±5。。實施例10疏水蛋白濃縮物(KmfZ-i/gM^-及^)作為消泡劑的用途通過如下的手搖泡沫測試來對消泡進行改良-將100ml燃料或添加劑燃料引入到250ml密封的有蓋玻璃瓶中；-將樣品振蕩2分鐘；-然后立即放下樣品，測定泡沫體積(ml)和泡沫分解時間(秒)。為實驗的目的，使用疏水蛋白濃縮物(1^/-^^^-丑&({,作為溶解于NaH2PO4緩沖液(50mmol/L，pH7.5)的溶液)。起始樣品疏水蛋白濃度為6.1mg/ml。將2mL起始樣品補至100ml(Hyd.sol.1)，將3mL得到的溶液加入97mL燃料(EN590燃料)中。在下面的表中給出重復過的實驗結果。用量DK根據R印sol的泡沫體積破壞時間無添加劑9761018Hyd.sol23mL97600在添加疏水蛋白濃縮物的情況下，泡沫的量和泡沫分解時間比不包含任何疏水蛋白的柴油機燃料低。在序列表中DNA和多肽序列的序列命名<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>權利要求1.至少一種疏水蛋白或其衍生物在添加劑組合物或燃料中用作消泡劑的用途。2.根據權利要求l的用途，其中該燃料是柴油機燃料。3.根據權利要求1和2的任一項的用途，其中至少一種疏水蛋白或其衍生物以基于燃料從0.1到100ppm的量使用。4.燃料消泡的方法，其包括向燃料中添加至少一種疏水蛋白或其衍生物。5.根據權利要求4的用途，其中該燃料是柴油機燃料。6.根據權利要求4和5的任一項的方法，其中至少一種疏水蛋白或其衍生物以基于燃料從0.1到100ppm的量使用。7.添加劑組合物，其包含至少一種疏水蛋白或其衍生物和至少一種另外的燃料添加劑。8.燃料組合物，其在包含除至少一種燃料作為主要成分之外，還包含至少一種疏水蛋白或其衍生物和至少一種另外的燃料添加劑。9.根據權利要求7和8的任一項的添加劑組合物或燃料組合物，其中該組合物包含至少一種去垢劑。10.根據權利要求7到9的任一項的添加劑組合物或燃料組合物，其中該組合物包含至少一種反乳化劑。11.產生至少一種燃料組合物的方法，其中燃料或燃料組合物是與以下混合(a)至少一種疏水蛋白或其衍生物和至少一種另外的燃料添加劑，或(b)根據權利要求7、9或10的添加劑組合物。全文摘要本發明涉及疏水蛋白或其衍生物在添加劑組合物或燃料中作為消泡劑的用途、燃料消泡的方法、含有疏水蛋白或其衍生物和至少一種另外的燃料添加劑的添加劑和燃料組合物，和制備燃料組合物的方法。文檔編號C10L1/24GK101326271SQ200680046091公開日2008年12月17日申請日期2006年10月9日優先權日2005年10月12日發明者D·波塞爾特,H-G·勒邁爾,J·卡爾,M·考羅什,S·哈默,T·薩布科夫斯基申請人:巴斯福股份公司