官能團與蛋白質的共價束縛的制作方法

專利名稱：官能團與蛋白質的共價束縛的制作方法
技術領域：
本發明涉及生化檢測和試劑領域。更具體地說，本發明涉及共價連接(束縛(tethered))一個或多個官能團的突變蛋白及其使用方法。
背景技術：
分子特異性檢測是了解該分子在細胞中作用的關鍵。例如與目標分子共價連接的標記物使得可以快速檢測復雜混合物中的該分子。標記物可以通過體外化學合成添加或通過例如重組技術體內附著。例如，傳統上在蛋白純化后通過體外化學修飾將熒光或其它標記物附著于蛋白上(Hermanson，1996)。至于標記物的體內連接，可將得自維多利亞水母(Aequorea victoria)的綠色熒光蛋白(GFP)與眾多宿主蛋白遺傳融合，原位產生熒光嵌合體(Tsien，1998；Chalfie等，1998)。但是，盡管基于GFP的指示劑目前用于各種測定，例如檢測pH(Kneen等，1998；Llopis等，1998；Miesenb_ck等，1998)、Ca2+(Miyawaki等，1997；Rosomer等，1997)和膜電位(Siegel等，1997)，但內源標記蛋白如GFP的熒光受限于蛋白結構特性，例如有限的熒光顏色范圍和相對較低的固有亮度(Cubitt等，1995；Orm_等，1996)。
為克服GFP原位標記的缺陷，Griffen等(1998)合成了一對緊密結合的分子組分由少至6個天然氨基酸組成的小型受體域和可連接至各種光譜探針或交聯劑的小型(＜700道爾頓)合成配體。受體域在α螺旋的i、i+1、i+4和i+5位包含4個半胱氨酸，而配體為4′，5′-雙(1，3，2-二硫雜砷雜環戊烷-2-基)熒光素(FLASH)。Griffen等公開所述配體在非轉染哺乳動物細胞中的結合位點較少，可透過膜，直至其高親和且特異性地結合重組蛋白中的四半胱氨酸域才有熒光，從而熒光標記(“FLASH”標記)細胞，其解離常數為納摩爾或更低。但是，考慮到細胞中的本底結合，Stroffekova等(2001)公開了FLASH-EDT2非特異性結合內源性富半胱氨酸蛋白。此外，熒光團的可用范圍限制了用FLASH標記蛋白。
受體介導的靶向方法使用基因工程編碼的靶向序列將熒光團定位于幾乎任一細胞位點，前提是靶標蛋白能夠正確折疊。例如，Farinas等(1999)公開了使用cDNA轉染將單鏈抗體(sFv)靶向細胞中的特定位點。Farinas等公開了半抗原(4-乙氧基亞甲基-2-苯基-2-噁唑啉-5-酮，phOx)和熒光探針(例如BODIPY F1、四甲基羅丹明和熒光素)的綴合物高親和性(約5nM)結合活體中國倉鼠卵巢細胞中sFv的亞細胞位點，表明靶向抗體作為可穿透細胞的半抗原-熒光團綴合物的高親和性受體。不過，功能性sFv表達在還原性條件下非常低。
因此，需要改進標記目的蛋白的方法。
發明概述本發明提供了例如通過共價鍵或其它穩定鍵使一個或多個官能團和本發明蛋白或包含本發明蛋白的融合蛋白(嵌合體)束縛(連接)的方法、組合物和試劑盒。本發明的蛋白在結構上與野生型(天然)水解酶相關，但與對應的野生型水解酶相比含有至少一個氨基酸置換，并結合對應的野生型水解酶的底物，但與對應的野生型水解酶相比缺少或降低了催化活性(其突變蛋白在本文稱為突變水解酶)。前述束縛發生在例如溶液或懸浮液中、細胞中、固相支持體上或溶液/表面交界面，使用包含反應基并被修飾以包含一個或多個官能團的水解酶底物。本文使用的“底物”包括含反應基和任選具有一個或多個官能團的底物。含一個或多個官能團的的底物在本文一般稱為本發明底物。本文使用的“官能團”是可檢測或能夠檢測的分子(例如發色團、熒光團或發光團)，或者是可結合或附著于另一種分子(例如生物素、半抗原或交聯基團)的分子，或者是包含一個或多個氨基酸(例如肽或多肽，包括抗體或受體)、一個或多個核苷酸、脂質(包括脂雙層)、固相支持體(例如沉降顆粒)等的分子。官能團可具有一種以上的特性，例如可檢測和結合另一個分子。本文使用的“反應基”是底物中最少數目的原子，其被特定的野生型水解酶或本發明的突變水解酶特異性識別。底物中的反應基和野生型水解酶相互作用產生產物，并使所述野生型水解酶再生。底物(例如本發明的底物)還可以任選地包含連接基團，例如可裂解的連接基團。
用于本發明的底物特異性結合突變水解酶，優選與突變水解酶的氨基酸如活性殘基形成一種鍵，該鍵比所述底物和對應的野生型水解酶氨基酸形成的鍵更穩定。盡管突變水解酶特異性結合可與對應的野生型水解酶特異性結合的底物，但在對應的野生型水解酶和底物反應形成產物的條件下，突變水解酶和底物相互作用沒有或基本沒有形成產物，例如低2、10、100或100倍。突變水解酶未形成產物或形成的產物量減少的原因是突變水解酶中至少有一個置換，該置換導致突變水解酶與底物形成的鍵比對應的野生型水解酶和底物形成的鍵更穩定。在對應的野生型水解酶形成產物的條件下，突變水解酶和本發明底物所形成鍵的半衰期(即t1/2)優選是對應的野生型水解酶和底物所形成鍵的t1/2的至少2倍，更優選至少4倍甚至10倍，直到100、1000或10,000倍。優選突變水解酶和底物形成的鍵其t1/2為至少30分鐘，優選至少4小時，直到至少10小時，并抗清洗、蛋白變性和/或高溫的破壞，例如該鍵對在SDS中煮沸穩定。
在一個實施方案中，所述底物為脫鹵素酶底物或絲氨酸β-內酰胺酶底物，所述脫鹵素酶例如為鹵代烷脫鹵素酶或裂解脂肪族或芳族鹵化底物中碳-鹵素鍵的脫鹵素酶，所述脫鹵素酶底物例如為紅球菌(Rhodococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、假單胞菌(Pseudomonas)、伯克氏菌(Burkholderia)、土壤桿菌(Agrobacterium)或黃色桿菌(Xanthobacter)脫鹵素酶底物。在一個實施方案中，本發明底物任選包括將底物中一個或多個官能團與反應基物理分隔的連接基團。例如，對于某些突變水解酶，即具有較深催化袋的突變水解酶，本發明底物可包括足夠長度和結構的連接基團，以使本發明底物的一個或多個官能團不擾亂水解酶(野生型和突變型)的3-D結構。例如，本發明脫鹵素酶底物的一個實例包含如(CH2)2-3X(其中X是鹵化物)的反應基和如四甲基羅丹明(TAMRA)的官能團，例如TAMRA-C14H24O4-Cl。
在一個實施方案中，連接基團優選為12-30個原子長。所述連接基團可以不總是存在于本發明底物中，但在某些實施方案中，可能需要物理分隔反應基和官能團，以使反應基可與突變水解酶中的活性殘基相互作用而形成共價鍵。優選當所述連接基團存在時，相對于對應的沒有所述連接基團的底物和野生型或突變水解酶的特異性或反應性，其基本上不改變(例如削弱)具有所述連接基團的底物和野生型或突變水解酶的特異性或反應性。而且，所述連接基團的存在優選基本上不改變(例如削弱)官能團的一種或多種特性(例如功能)。
因此，本發明提供一種式(I)R-連接基團-A-X的化合物，其中R是一個或多個官能團，其中連接基團是含C、N、S或O的多原子直鏈或支鏈，其中A-X為脫鹵素酶底物，而其中X為鹵素。在一個實施方案中，烷基鹵化物共價連接至連接基團L，L是共價連接一個或多個官能團的一個或多個基團，以形成脫鹵素酶底物。如本文所述，突變脫鹵素酶DhaA.H272F結合DhaA底物，該底物包括5-(和6-)羰基熒光素(FAM)，例如FAM-Cl4H24O4-Cl；TAMRA，例如TAMRA-C14H24O4-Cl；以及生物素，例如生物素-C18H32O4-Cl，此結合對FAM或TAMRA熒光或鏈霉抗生物素蛋白與生物素的結合沒有顯著的猝滅作用。又如本文所述，突變脫鹵素酶，例如DhaA.D106C和DhaA.D106E以及DhaA.D106CH272F和DhaA.D106EH272F，結合FAM-C14H24O4-Cl和/或TAMRA-C14H24O4-Cl。在一個實施方案中，所述底物為R-(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2O(CH2)6Cl，其中R為官能團。為制備這種底物，可將官能團與NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2O(CH2)6Cl這種分子反應。
在一個實施方案中，本發明底物可穿透細胞的質膜。例如，如本文所述，TAMRA-C14H24O4-Cl和生物素-C18H32O4-Cl可穿透原核細胞(大腸桿菌)和真核細胞(CHO-K1)的質膜，在沒有突變水解酶的情況下可將這些底物快速有效地輸入和洗出細胞。當存在突變水解酶時，可防止至少一部分底物洗出細胞。因此，結合部分的底物可用作標記物或捕獲突變水解酶或其融合體的方法。
本發明進一步提供制備水解酶底物的方法，該底物被修飾以包含一個或多個官能團。用于本發明的示例性官能團包括但不限于氨基酸、蛋白質(例如酶、抗體或其它免疫原性蛋白)、放射性核素、核酸分子、藥物、脂質、生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、磁珠、固相支持體、電子不透明分子、發色團、MRI造影劑、染料，例如呫噸染料、鈣敏染料如1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羥基-3-氧基-9-呫噸基)苯氧基]-2-(2′-氨基-5′-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(Fluo-3)，鈉敏染料如1，3-苯二甲酸、4，4′-[1，4，10，13-四氧雜-7，16-二氮雜環十八烷-7，16-二基雙(5-甲氧基-6，2-苯并呋喃二基)]雙(PBFI)，NO敏染料如4-氨基-5-甲基氨基-2′，7′-二熒光素或其它熒光團。在一個實施方案中，所述官能團為免疫原性分子，即與其特異性抗體結合的分子。在一個實施方案中，所述官能團不是放射性核素。
本發明還包括一種突變水解酶，其相比于對應的野生型水解酶包含至少一個氨基酸置換，該置換使所述突變水解酶能夠與對應水解酶的底物(例如本發明底物)形成鍵(例如共價鍵)，該鍵比對應的野生型水解酶和底物形成的鍵更穩定。
在一個實施方案中，本發明的突變水解酶在殘基中包含至少一個氨基酸置換，該殘基在野生型水解酶中與活化水分子有關，例如催化三聯體中的殘基或輔助殘基，其中活化水分子裂解野生型水解酶中催化殘基與水解酶底物形成的鍵。本文使用的“輔助殘基”是改變另一個殘基活性的殘基，例如其增強活化水分子的殘基的活性。屬于本發明范圍的活化水分子的殘基包括但不限于參與酸堿催化作用的殘基，例如組氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。在另一個實施方案中，本發明的突變水解酶在殘基中包含至少一個氨基酸置換，該殘基在野生型水解酶中通過底物對水解酶的親核攻擊而形成酯中間體。
例如，野生型脫鹵素酶DhaA裂解鹵代烴(鹵代C3-鹵代C10)中的碳-鹵素鍵。DhaA的催化中心是典型的催化三聯體，包含親核殘基、酸性殘基和組氨酸殘基。三聯體中的氨基酸位于DhaA催化袋(長約10_，橫切面約20_2)內的底部。DhaA鹵化底物中的鹵素原子，例如Cl-烷烴底物中的氯原子，位于DhaA催化中心附近。DhaA結合底物，可能形成ES復合物，DhaA的Asp106(編號是基于DhaA的蛋白序列)受到底物親核攻擊形成酯中間體(

圖1)。DhaA的His272隨后活化水，活化的水水解中間體，由催化中心釋放出產物。如本文所述，突變DhaA，例如可能保持了三維結構(根據計算機建模研究)和野生型DhaA(DhaA.WT)基本物理化學特征的DhaA.H272F突變體，不能水解野生型酶的一種或多種底物，例如就Cl-烷烴而言，不能釋放出野生型酶釋放的對應醇。如本文進一步描述，突變絲氨酸β-內酰胺酶，例如blaZ.E166D突變體、blaZ.N170Q突變體和blaZ.E166DN170Q突變體，不能水解野生型絲氨酸β-內酰胺酶的一種或多種底物。
因此，在本發明的一個實施方案中，突變水解酶是含有至少一個氨基酸置換的突變脫鹵素酶，所述置換位于野生型脫鹵素酶中與活化水分子相關的殘基上，例如催化三聯體中的殘基或輔助殘基，其中所述活化的水分子裂解野生型脫鹵素酶中催化殘基與脫鹵素酶底物形成的鍵。在一個實施方案中，至少一個置換所在的殘基對應于紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA的殘基272。“對應殘基”是指在一種野生型蛋白中相對對照野生型蛋白具有相同活性(功能)的殘基，在比對兩種蛋白的一級序列時任選在相同的相對位置。例如，在一種酶中形成催化三聯體部分并活化水分子的殘基可能是該酶的殘基272，此殘基272對應于另一個酶的殘基73，其中殘基73形成催化三聯體部分并活化水分子。因此，在一個實施方案中，本發明的突變脫鹵素酶在對應于紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA殘基272的位置具有苯丙氨酸殘基。在本發明的另一個實施方案中，突變水解酶為在對應于紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA殘基106的殘基中含至少一個氨基酸置換的突變脫鹵素酶。例如，本發明的突變脫鹵素酶在對應于紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)DhaA殘基106的位置具有半胱氨酸或谷氨酸殘基。在再一個實施方案中，突變水解酶為含至少兩個氨基酸置換的突變脫鹵素酶，一個置換位于對應于紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA殘基106的殘基，一個置換位于對應于紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)DhaA殘基272的殘基。在再另一個實施方案中，突變水解酶為突變絲氨酸β-內酰胺酶，其在對應于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)PCl的絲氨酸β-內酰胺酶殘基l66或殘基170的殘基中含至少一個氨基酸置換。
突變水解酶可以為融合蛋白，例如由編碼突變水解酶和至少一種目標蛋白的重組DNA表達的融合蛋白或化學合成形成的融合蛋白。例如，所述融合蛋白可包含突變水解酶和目標酶(例如螢光素酶、RNA酶蛋白抑制劑或RNA酶)和/或通道蛋白、受體、膜蛋白、胞質蛋白、核內蛋白、結構蛋白、磷蛋白、激酶、信號蛋白、代謝蛋白、線粒體蛋白、受體相關蛋白、熒光蛋白、酶底物、轉錄因子、轉運蛋白和/或將突變水解酶(例如融合蛋白)導向特定位置的靶向序列，例如十四烷基化序列、線粒體定位序列或核內定位序列。目標蛋白可融合至突變水解酶的N-末端或C-末端。在一個實施方案中，所述融合蛋白在突變水解酶的N-末端包含目標蛋白，而在突變水解酶的C-末端包含另一種蛋白，例如不同的蛋白。例如，目標蛋白可以為熒光蛋白或抗體。融合體中的蛋白任選由連接序列分隔，例如優選具有至少2個氨基酸殘基的連接序列，例如具有13-17個氨基酸殘基的連接序列。相比于各個體蛋白的功能，本發明融合蛋白中存在的連接序列未顯著改變融合體中任一種蛋白的功能。因此，對于突變脫鹵素酶和海腎(Renilla)熒光素酶的融合體，連接序列的存在未顯著改變突變脫鹵素酶和其底物所形成鍵的穩定性或熒光素酶的活性。對于融合體中蛋白的任何具體組合，可以使用各種連接序列。在一個實施方案中，所述連接序列為酶識別的序列，例如可裂解的序列。例如，連接序列可為由胱天蛋白酶識別的序列如DEVD(SEQ IDNO64)，或為可光裂解的序列。
在一個實施方案中，所述融合蛋白可在突變水解酶的N-末端包含目的蛋白，并優選在突變水解酶的C-末端包含不同的目的蛋白。如本文所述，突變DhaA與GST(在N-末端)、Flag序列(在C-末端)和海腎熒光素酶(在N-末端或C-末端)的融合體對突變DhaA和包含官能團的野生型DhaA底物形成的鍵沒有可檢測的影響。而且，Flag序列和DhaA.H272F的融合體可通過鏈霉抗生物素蛋白-生物素-C18H32O4-DhaA.H272F橋附著于固相支持體(SFlag-ELISA實驗)。此外，海腎熒光素酶(R.Luc)和DhaA.H272F的融合體可附著于用包含官能團的野生型DhaA底物包被的MagnesilTM顆粒上。另外，附著的含R.Luc融合體顯示有酶活性。
示例性目的蛋白包括但不限于免疫原性蛋白、熒光蛋白、選擇標記蛋白、膜蛋白、胞質蛋白、核內蛋白、結構蛋白、RNA酶等酶、酶底物、受體蛋白、轉運蛋白、轉錄因子、通道蛋白如離子通道蛋白、磷蛋白、激酶、信號蛋白、代謝蛋白、線粒體蛋白、受體相關蛋白、核酸結合蛋白、胞外基質蛋白、分泌蛋白、受體配體、血清蛋白或具有活性半胱氨酸的蛋白。
本發明還包括組合物和試劑盒，其包括含連接基團的水解酶底物、含一個或多個官能團并任選含連接基團的水解酶底物、具有一個或多個官能團的連接基團、沒有一個或多個官能團并任選含連接基團的水解酶底物、連接基團或突變水解酶，或其任意組合。例如，本發明包括含本發明底物的固相支持體、含本發明底物的試劑盒、含本發明脫鹵素酶編碼載體的試劑盒或含本發明絲氨酸β-內酰胺酶編碼載體的試劑盒。
本發明還提供含水解酶編碼核酸序列的分離的核酸分子(多核苷酸)。在一個實施方案中，所述分離的核酸分子包含為在至少一種選擇宿主中表達而優化的核酸序列。優化序列包括密碼子優化(即在一種生物中比在另一種生物(例如相關遠的生物)中更經常使用的密碼子)的序列，以及修飾以加入或修飾Kozak序列和/或內含子和/或去除不需要的序列(例如潛在的轉錄因子結合位點)。在一個實施方案中，所述多核苷酸包括編碼脫鹵素酶的核酸序列，該核酸序列為在選擇的宿主細胞中表達進行了優化。在一個實施方案中，優化多核苷酸不再與對應的非優化序列雜交，例如在中等或高嚴格條件下不與非優化序列雜交。在另一個實施方案中，所述多核苷酸與對應的非優化序列的核酸序列一致性低于90％，例如低于80％，任選其編碼多肽與非優化序列編碼多肽的氨基酸序列一致性至少為80％，例如至少85％、90％或更高。本發明還提供構建物(例如表達盒)和包含分離核酸分子的載體以及含分離的核酸分子、構建物或載體的試劑盒。
本發明進一步提供表達本發明突變水解酶的方法。該方法包括將編碼本發明突變水解酶的重組核酸分子導入宿主細胞中，以表達突變水解酶。在一個實施方案中，所述突變水解酶可分離自細胞。突變水解酶可瞬時或穩定表達、組成型表達或在組織特異性或藥物調節啟動子控制下表達等等。本發明還提供含編碼本發明突變水解酶的重組核酸分子的分離宿主細胞。
在一個實施方案中，本發明提供檢測或測定突變水解酶的存在或量的方法。該方法包括使突變水解酶與含一個或多個官能團的水解酶底物接觸。相比于對應的野生型水解酶，所述突變水解酶包含至少一個氨基酸置換，其中所述至少一個氨基酸置換導致突變水解酶與底物形成的鍵比對應的野生型水解酶和底物形成的鍵更穩定，其中所述在突變水解酶中的至少一個氨基酸置換為在對應的野生型水解酶中與活化水分子相關的氨基酸殘基上的置換，所述水分子裂解對應的野生型水解酶和底物形成的鍵，或者所述置換為在對應的野生型水解酶中與底物形成酯中間體的氨基酸殘基上的置換。檢測或測定官能團的存在或量，由此檢測或測定突變水解酶的存在或量。在一個實施方案中，所述突變水解酶在細胞中或在細胞表面上。在另一個實施方案中，所述突變水解酶在細胞裂解物中。
本發明還提供突變水解酶和包含一個或多個官能團的對應水解酶底物的使用方法，例如分離分子或檢測或測定細胞中某些分子的存在或量、位置(例如胞內、亞細胞或胞外位置)或移動的方法。在一個實施方案中，提供分離樣品中目標分子的方法。所述方法包括使具有融合蛋白的樣品與含一個或多個官能團的水解酶底物接觸，所述融合蛋白含突變水解酶和結合目標分子的蛋白。相比于對應的野生型水解酶，所述突變水解酶包含至少一個氨基酸置換，其中所述至少一個氨基酸置換導致突變水解酶與底物形成的鍵比對應的野生型水解酶和底物形成的鍵更穩定，其中所述在突變水解酶中的至少一個氨基酸置換為在對應的野生型水解酶中與活化水分子相關的氨基酸殘基上的置換，所述水分子裂解對應的野生型水解酶和底物形成的鍵，或者所述置換為在對應的野生型水解酶中與底物形成酯中間體的氨基酸殘基上的置換。在一個實施方案中，至少一個官能團為固相支持體或結合固相支持體的分子。在一個實施方案中，所述樣品含完整的細胞，而在另一個實施方案中，所述樣品為細胞裂解物或亞細胞組分。然后分離目標分子。
例如，本發明包括分離目標蛋白的方法。該方法包括使含突變水解酶和目標蛋白的融合蛋白與含至少一個官能團的水解酶底物接觸。相比于對應的野生型水解酶，所述突變水解酶包含至少一個氨基酸置換，其中所述至少一個氨基酸置換導致突變水解酶與底物形成的鍵比對應的野生型水解酶和底物形成的鍵更穩定，其中所述在突變水解酶中的至少一個氨基酸置換為在對應的野生型水解酶中與活化水分子相關的氨基酸殘基上的置換，所述水分子裂解對應的野生型水解酶和底物形成的鍵，或者所述置換為在對應的野生型水解酶中與底物形成酯中間體的氨基酸殘基上的置換。在一個實施方案中，至少一個官能團為固相支持體或結合固相支持體的分子。然后分離目標蛋白。
在另一個實施方案中，本發明包括一種物質鑒定方法，所述物質改變目標蛋白與推測與目標蛋白相互作用的分子的相互作用。該方法包括使至少一種物質與推測與目標蛋白相互作用的分子、含突變水解酶和目標蛋白的融合蛋白以及含一個或多個官能團的水解酶底物接觸。相比于對應的野生型水解酶，所述突變水解酶包含至少一個氨基酸置換，其中所述至少一個氨基酸置換導致突變水解酶與底物形成的鍵比對應的野生型水解酶和底物形成的鍵更穩定，其中所述在突變水解酶中的至少一個氨基酸置換為在對應的野生型水解酶中與活化水分子相關的氨基酸殘基上的置換，所述水分子裂解對應的野生型水解酶和底物形成的鍵，或者所述置換為在野生型水解酶中與底物形成酯中間體的氨基酸殘基上的置換。在一個實施方案中，至少一個官能團為固相支持體或結合固相支持體的分子。然后測定所述物質是否改變目標蛋白與推測與目標蛋白相互作用的分子的相互作用。
而且，結合固相支持體的本發明底物或結合固相支持體的突變水解酶可用于生成蛋白陣列、細胞陣列、囊泡/細胞器陣列和細胞膜陣列。
本發明因此提供監測細胞中蛋白表達、定位和/或移動(運輸)以及監測細胞中微環境變化的方法。在一個實施方案中，本發明突變水解酶和底物的應用使得可以對蛋白(例如離子通道)進行功能分析。在另一個實施方案中，兩對突變水解酶/底物的應用使得可以進行多重同步檢測以及基于FRET-或BRET的測定。例如，在催化三聯體不同殘基上具有置換的突變脫鹵素酶可每個都優選結合本發明的某些底物，但其它酶或突變脫鹵素酶不能結合，而可利用突變β-內酰胺酶及其各自的底物，因此允許多重檢測。其它應用包括在固體底物上捕獲突變水解酶與對應的本發明底物接觸產生的穩定復合物，用于分析或工業目的(例如研究束縛酶的動力學參數、生成酶鏈/陣列、代謝工業組分等)，以檢測蛋白-蛋白相互作用、測定不同化合物/藥物對含目標蛋白和突變水解酶的融合蛋白與其它分子的相互作用的影響、分離或純化結合與突變水解酶融合的目標蛋白的分子，或分離或純化細胞、細胞器或其片段。例如，目標蛋白可與突變水解酶融合，然后通過官能團與存在于固相支持體上的接受基團的特異性相互作用連接至固相支持體，其中所述官能團為接受基團的配體，存在于本發明的底物中。這種底物可與融合蛋白接觸，然后與固相支持體接觸；可與固相支持體接觸，然后與融合蛋白接觸；或者同時與融合蛋白和固相支持體接觸。這類系統可使獲得的復合物用于檢測或分離結合目標蛋白的分子。結合分子可以為蛋白，例如結合蛋白和官能團的融合體，所述官能團例如為GFP、螢光素酶、抗體(如綴合辣根過氧化物酶(HRP)的抗體)、堿性磷酸酶(AP)或熒光團。
為分離、分揀或純化細胞，可在細胞外表面表達突變水解酶(例如通過與質膜蛋白融合)。為分離、純化或分隔細胞器，在目標細胞器的胞質面上表達突變水解酶。在另一個實施方案中，為創造培養不同細胞的最佳平臺，將突變水解酶與胞外基質組分或外膜蛋白融合，并束縛至三維細胞培養物或平臺用于組織工程。作為實例，可在所述平臺上培養初級神經元或胚胎干細胞，以形成飼養層。
其它應用包括檢測或標記細胞。因此，使用本發明突變水解酶和對應的底物可檢測細胞，例如檢測植入或注射入動物后的體外或體內細胞遷移(例如血管生成/趨化性測定、植入神經元的遷移、植入/注射入動物中的正常、惡性或重組修飾細胞的遷移，等等)，以及活細胞造影后的免疫細胞化學。在另一個實施方案中，本發明提供標記新合成蛋白的方法。例如，含本發明突變水解酶或其融合體表達載體的細胞與沒有官能團的水解酶底物接觸。然后使細胞與基因表達誘導劑等物質以及含一個或多個官能團的水解酶底物接觸。然后檢測或測定突變水解酶或其融合體的存在、量或位置。突變水解酶或其融合體的存在、量或位置是由于新合成的突變水解酶或其融合體。或者，含本發明突變水解酶或其融合體表達載體的細胞與具有官能團(例如綠色熒光團)的水解酶底物接觸，然后與具有不同官能團(例如紅色熒光團)的物質和底物接觸。在一個實施方案中，所述突變水解酶與膜定位信號融合，所以可用于監測膜中或膜附近的事件。
因此，本發明提供一種標記細胞的方法。該方法包括使含突變水解酶的細胞與含一個或多個官能團的水解酶底物接觸。相比于對應的野生型水解酶，突變水解酶包含至少一個氨基酸置換，其中所述至少一個氨基酸置換導致突變水解酶與底物形成的鍵比對應的野生型水解酶和底物形成的鍵更穩定，其中所述在突變水解酶中的至少一個氨基酸置換為在對應的野生型水解酶中與活化水分子相關的氨基酸殘基上的置換，所述水分子裂解對應的野生型水解酶和底物形成的鍵，或者所述置換為在野生型水解酶中與底物形成酯中間體的氨基酸殘基上的置換。然后檢測或測定官能團的存在或量。
使用表達選擇標記蛋白(例如編碼新霉素、潮霉素或嘌呤霉素抗性的蛋白質)的細胞穩定轉化具外源DNA的細胞。期望觀測哪些細胞含選擇標記蛋白以及熒光標記分子。例如，優選可用熒光分子標記選擇標記蛋白，將其由外部加入到活細胞中。利用此方法，選擇標記蛋白僅在需要時通過加入熒光團成為可見的，隨后當選擇標記蛋白通過細胞代謝自然再生時熒光消失。因此，在一個實施方案中，本發明提供標記表達選擇標記蛋白的細胞的方法。該方法包括提供含表達盒的細胞，該表達盒含編碼融合蛋白的核酸序列。融合蛋白含一種選擇標記蛋白(例如賦予至少一種抗生素抗性的蛋白)和另一種能夠穩定和任選不可逆結合底物或其部分的蛋白，所述底物或其部分包含光學可檢測分子。例如，所述蛋白可為將烷基和光學可檢測分子由底物不可逆轉移至其自身的烷基轉移酶，由此標記烷基轉移酶，例如O6-烷基鳥嘌呤DNA烷基轉移酶等烷基轉移酶。用于本發明該實施方案的示例性蛋白包括但不限于烷基轉移酶、肽基甘氨酸-α-酰胺化單加氧酶、I型拓撲異構酶、水解酶如絲氨酸和環氧化物水解酶以及本文描述的突變水解酶、氨基轉移酶、細胞色素P450單加氧酶、酰基轉移酶、脫羧酶、氧化酶如單胺氧化酶、還原酶如核糖核苷酸還原酶、合成酶如環ADP核糖合成酶或胸苷酸合成酶、脫氫酶如醛脫氫酶、合酶如一氧化氮合酶(NOS)、內酰胺酶、胱硫醚γ-裂合酶、肽酶如羧肽酶A、芳香化酶、蛋白酶如絲氨酸蛋白酶、木聚糖酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶和脫甲基酶以及其它蛋白，包括與一種或多種底物形成不可逆或其它穩定鍵的野生型蛋白，例如能夠機制型失活的酶。因此，在此實施方案中，穩定鍵，即底物和野生型酶或突變酶形成的鍵，其t1/2至少為30分鐘，優選至少4小時，直到至少10小時，并抗清洗、蛋白變性和/或高溫的破壞，例如該鍵對在SDS中煮沸穩定。
表達融合蛋白的細胞與底物接觸，以便標記細胞。在一個實施方案中，所述細胞固定后接觸底物。在另一個實施方案中，所述底物和固定劑同時與細胞接觸。在再另一個實施方案中，在細胞與底物接觸后將固定劑加入到細胞中。在一個實施方案中，融合蛋白與底物形成酯鍵。在另一個實施方案中，融合蛋白與底物形成硫酯鍵。本發明還提供編碼融合蛋白的融合基因以及表達融合蛋白的細胞。
當對細胞進行圖象分析時，期望用通常保持細胞結構大多數特征的防腐劑(固定劑)如多聚甲醛、丙酮或甲醇固定細胞。然后經常通過加入熒光染色劑或熒光標記抗體分析這些固定細胞，以揭示細胞中的特定結構。另一個熒光標記細胞的方法是在固定化前在細胞中表達熒光蛋白如GFP。不幸的是，這些蛋白的有效熒光依賴于可被防腐劑破壞的蛋白結構，因此降低了這些細胞中成象的有效性。
因此，本發明提供用官能團如熒光團標記細胞的方法。該方法包括提供表達本發明突變水解酶或其融合體的細胞，使細胞與包含至少一個官能團的水解酶底物接觸。在一個實施方案中，所述細胞固定后接觸底物。在另一個實施方案中，底物和固定劑同時與細胞接觸。在再另一個實施方案中，在細胞與底物接觸后將固定劑加入到細胞中。然后檢測或測定細胞中突變水解酶或其融合體存在或定位。在一個實施方案中，突變水解酶與底物形成酯鍵，而在另一個實施方案中，突變水解酶與底物形成硫酯鍵。
本發明還提供本文公開的用于制備本發明化合物、組合物、核酸、蛋白或其它物質的方法和中間體。
附圖簡述圖1是紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)脫鹵素酶的催化三聯體與鹵代烷底物反應的示意圖。
圖2顯示了野生型DhaA紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)脫鹵素酶和4種突變DhaA(H283Q、G、A或F)的三維模型。青色帶是基于該蛋白晶體結構的DhaA.WT 3-D模型(Newman等，1999)(圖A)。紫色帶為H272Q、H272H和H272A突變體的3-D模型(圖2A)或H272F突變體的3-D模型(圖2B)。通過計算分子概率密度函數生成三維模型，接著進行幾步包括約束模擬退火分子動力學(MD)方法的優化。在使用軟件InsightII(USA)的Silicon Graphics計算機工作站上進行3-D建模。
圖3顯示了野生型和突變DhaA蛋白的純化。發現GST-DhaA.WT-Flag(奇數泳道)和GST-DhaA.H272F-Flag(偶數泳道)融合蛋白是可溶的，并在GSS-Sepharose 4FF上有效純化(泳道3和4粗大腸桿菌上清液；泳道5和6清洗液；泳道7-10純化蛋白)。用Xa因子處理融合蛋白導致形成兩種蛋白GST和DhaA(野生型或突變型；分別為泳道11和12)。而且，在GSS-Sepharose 4FF上有效去除GST(野生型或突變型；分別為泳道13和14)。所有蛋白都具有預計的分子量。
圖4圖示野生型DhaA和突變DhaA對1-Cl-丁烷的水解。
圖5顯示了用各種濃度的(NH4)2SO4沉淀DhaA.WT和DhaA.H272F/A/G/Q突變體。泳道1、5和90％(NH4)2SO4；泳道2、6和1010％(NH4)2SO4；泳道3、7和1110-45％(NH4)2SO4；泳道4、8和1245-70％(NH4)2SO4。圖A泳道1-4，DhaA.WT；泳道5-8，DhaA.H272G；和泳道9-12，DhaA.H272Q。圖B泳道1-4，DhaA.WT；泳道5-8，DhaA.H272F；和泳道9-12，DhaA.H272A。
圖6描述了野生型DhaA的底物特異性。使用基于酚紅的測定(E558)，在加入酶后的首個60秒以4次15秒讀數測定反應初速度。
圖7顯示了包含官能團(例如5-(和6-)-羧基熒光素(FAM)、Anth(蒽)或生物素)和連接基團的DhaA底物。
圖8A顯示了野生型DhaA水解FAM-C14H24O4-Cl的產物的HPLC分離。
圖8B顯示了野生型DhaA水解FAM-C14H24O4-Cl隨時間變化產生的產物(以底物百分比表示)的HPLC分析。
圖9顯示了野生型DhaA(圖A中的泳道1、3和5以及圖B中的泳道1-8)和突變DhaA(DhaA.H272F)(圖A中的泳道2、4和6以及圖B中的泳道9-14)與TAMRA-C14H24O4-Cl(圖A中的泳道1和2)、ROX-C14H24O4-Cl(圖A中的泳道3和4)、FAM-C14H24O4-Cl(圖A中的泳道5和6)或生物素-C18H32O4-Cl(圖B)結合的SDS-PAGE分析。圖B中生物素-C18H32O4-Cl的濃度為0μM(泳道1和8)、125μM(泳道2和9)、25μM(泳道3和10)、5μM(泳道4和11)、1μM(泳道5和12)、0.2μM(泳道6和13)和0.04μM(泳道7和14)。
圖10圖示用底物生物素-C18H32O4-Cl預處理突變DhaA阻斷與另一種底物的結合。DhaA.WT泳道1和2；DhaA.H272突變體F，泳道3和4；G，泳道5和6；A，泳道7和8；Q，泳道9和10。樣品2、4、6、8和10用生物素-C18H32O4-Cl預處理。
圖11顯示了酶底物復合物的MALDI-TOF分析、與FAM-C14H24O4-Cl溫育的GST-DhaA.WT或GST-DhaA.H272F的質譜。
圖12顯示了在殘基106具有置換的DhaA突變體和在殘基106和272具有置換的DhaA突變體與TAMRA-C14H24O4-Cl結合特性的SDS-PAGE分析。將2μg蛋白和25μM TAMRA-C14H24O4-Cl的32μl溶液于室溫溫育1小時。將10μl的各反應物加至每個泳道。泳道1DhaA.D106C；泳道2DhaA.D106CH272F；泳道3DhaA.D106E；泳道4DhaA.D106EH272F；泳道5DhaA.D106Q；泳道6DhaA.D106QH272F；泳道7DhaA.WT和泳道8DhaA.H272F。用570nm濾光片對凝膠成像。
圖13圖示了含熒光素酶和突變DhaA融合體的樣品中海腎熒光素酶活性分析，所述融合體束縛至固相支持體(鏈霉抗生物素蛋白包被平板)。使用DhaA底物(即生物素-C18H32O4-Cl)實現對融合體的捕獲。在具有海腎熒光素酶和野生型DhaA融合體的組分中未測到活性。
圖14顯示了用生物素-C18H32O4-Cl(圖A)或TAMRA-C12H24O4-Cl(圖B)體內處理的大腸桿菌兩倍連續稀釋液的SDS-PAGE分析，所述大腸桿菌表達野生型DhaA(DhaA.WT-Flag，各圖的泳道1-4)或突變DhaA.H272F(DhaA.H272F-Flag，各圖的泳道5-7)。箭頭標示蛋白的Mr(相對分子質量)對應于DhaA-Flag的Mr。
圖15顯示了TAMRA-C12H24O4-Cl與真核細胞蛋白的體內結合。用TAMRA-C12H24O4-Cl處理表達DhaA.WT-Flag(泳道1-4)或DhaA.H272F-Flag(泳道5-8)的CHO-K1細胞其蛋白的兩倍連續稀釋液。箭頭標示蛋白的Mr對應于DhaA-Flag的Mr。
圖16圖示了TAMRA-C12H24O4-Cl對CHO-K1細胞的透過性。用TAMRA-C12H28O4-Cl(25μM，37℃，5分鐘)處理CHO-K1細胞(A，亮視野圖象)，并用PBS快速清洗(圖B)。圖C顯示了清洗步驟后的細胞。
圖17顯示了GFP-連接基團-DhaA.WT-Flag或GFP-連接基團-DhaA.H272F-Flag轉染細胞的圖像。用GFP-連接基團-DhaA.WT-Flag(圖A-C)或GFP-連接基團-DhaA.H272F-Flag(圖D-F)編碼DNA轉染CHO-K1細胞，并用TAMRA-C12H28O4-Cl處理。圖A、D亮視野；圖B、EGFP濾光片單元；和圖C、FTAMRA濾光片單元。
圖18顯示了GFP-連接基團-DhaA.WT-Flag(泳道1-4)或GFP-連接基團-DhaA.H272F-Flag(泳道5-8)轉染細胞其蛋白的蛋白質印跡分析。用GFP-連接基團-DhaA.WT-Flag或GFP-連接基團-DhaA.H272F-Flag轉染CHO-K1細胞，然后用TAMRA-C14H24O4-Cl(25μM)處理0、5、15或60分鐘，用PBS(4×1.0ml)清洗，并用SDS-樣品緩沖液收集。用SDS-PAGE分離樣品，用熒光成像儀分析。泳道1-4，GFP-連接基團-DhaA.WT-Flag，分別處理0、5、15或60分鐘。泳道5-8，GFP-連接基團-DhaA.H272F-Flag，分別處理0、5、15、60分鐘。箭頭標示蛋白的Mr對應于GFP-連接基團-DhaA.H272F-Flag的Mr。
圖19圖示了選擇的CHO-K1細胞底物(圖A，TAMRA和圖B，ROX)的毒性。
圖20圖示了絲氨酸β-內酰胺酶的反應流程。反應以形成共價前遭遇絡合物(precovalent encounter complex)開始(圖19A)，經高能酰化四面體中間體(圖20B)形成瞬時穩定酰化酶中間體，通過催化殘基Ser70形成酯(圖19C)。隨后，酰化酶受到水解水攻擊(圖19D)，形成高能脫酰化中間體(圖19E)(Minasov等，2002)，其崩潰形成水解產物(圖20F)。然后排出產物，再生游離酶。
圖21顯示了GST-blaZ水解FAP隨時間的變化。
圖22顯示了BOCELLIN與GST和blaZ.E166D、blaZ.N170Q或blaZ.E166DN170Q的融合體的結合。泳道1染料/無blaZ；泳道2blaZ.WT；泳道3blaZ.E166D；泳道4blaZ.N170Q；和泳道5blaZ.E166DN170Q。
圖23顯示了CCF2與GST和blaZ.E166D、blaZ.N170Q或blaZ.E166DN170Q的融合體的結合。泳道1染料/無blaZ；泳道2GST-blaZ.WT；泳道3GST-blaZ.E166D；泳道4GST-blaZ.N170Q和泳道5GST-blaZ.E166DN170Q。
圖24提供了用GFP-連接基團-DhaA.H272F-NLS3編碼構建物轉染并用TAMRA-C14H24O4-Cl染色的活CHO-K1細胞的熒光和DIC圖像。TAMRA濾光片頂部左側；GFP濾光片頂部右側；“A”和“B”重疊底部左側；圖像“C”和細胞DIC圖像的重疊底部右側。NLS3＝SV40T抗原核定位序列的串聯重復。
圖25顯示了用GFP-β-抑制蛋白2編碼構建物轉染的活CHO-K1細胞熒光圖像(左側)和用DhaA.H272F-β-抑制蛋白2編碼構建物(右側)轉染并用TAMRA-C14H24O4染色的活CHO-K1細胞熒光圖像。
圖26顯示了在大腸桿菌中表達的DhaA的SDS-PAGE分析。泳道1分子量標準；2野生型DhaA粗裂解物；3野生型DhaA無細胞裂解物；4DhaA.H272F粗裂解物；5DhaA.H272F無細胞裂解物；6載體對照粗裂解物；7載體對照無細胞裂解物；8DhaA.E130Q C1突變體粗裂解物；9DhaA.E130Q C1突變體無細胞裂解物；10DhaA.E130L A5突變體粗裂解物；11DhaA.E130L A5突變體無細胞裂解物；12DhaA.E130A A12突變體粗裂解物；13DhaA.E130A A12突變體無細胞裂解物；14分子量標準。箭頭表示DhaA蛋白的位置。-s離心前的裂解物；+s離心后的裂解物。
圖27顯示了含DhaA裂解物的免疫印跡分析。泳道1野生型DhaA粗裂解物；2野生型DhaA無細胞裂解物；3DhaA.H272F粗裂解物；4DhaA.H272F無細胞裂解物；5載體對照粗裂解物；6載體對照無細胞裂解物；7分子量標準；8DhaA.E130Q C1突變體粗裂解物；9DhaA.E130Q C1突變體無細胞裂解物；10DhaA.E130L A5突變體粗裂解物；11DhaA.E130L A5突變體無細胞裂解物；12DhaA.E130A A12突變體粗裂解物；13DhaA.E130AA12突變體無細胞裂解物；14分子量標準。箭頭表示DhaA蛋白的位置。
圖28提供了體外共價烷基-酶形成的熒光成像分析。泳道1熒光分子量標準；2DhaA野生型；3DhaA.H272F突變體；4DhaA-(僅作為對照的載體)；5DhaA.E130Q突變體；6DhaA.E130L突變體；7DhaA.E130A突變體。箭頭指示熒光酶-烷基共價中間體的位置。
圖29提供了全細胞中共價烷基-酶形成的熒光成像分析。泳道1熒光分子量標準；2DhaA野生型；3DhaA.H272F突變體；4DhaA-(僅作為對照的載體)；5DhaA.E130Q突變體；6DhaA.E130L突變體；7DhaA.E130A突變體；8熒光分子量標準。箭頭指示熒光酶-烷基共價中間體的位置。
圖30A-B顯示了鏈霉抗生物素蛋白(SA)包被珠上捕獲的DhaA-Flag的蛋白質印跡分析。用(A)或不用(B)生物素-C18H32O4-Cl(25μM、0.1％DMSO、60分鐘、37℃)處理瞬時表達DhaA.H272F-Flag的CHO-K1細胞。洗去過量的生物素-C18H32O4-Cl，裂解細胞，將10μl細胞裂解物與5μl SA包被珠(Pierce)于室溫(RT)溫育60分鐘。在SDS-PAGE上分離細胞裂解物(泳道1)、未結合珠的蛋白(泳道2)和結合珠的蛋白(泳道3)，將其轉移至硝酸纖維素膜，用抗-Flag抗體(Sigma)探測。
圖30C-D圖示了SA包被珠上捕獲的hR.Luc-DhaA的分析。用或不用生物素-C18H32O4-Cl(25μM、0.1％DMSO、60分鐘、37℃)處理瞬時表達hR.Luc-連接基團-DhaA.H272F-Flag的CHO-K1細胞。裂解細胞，將10μl細胞裂解物與5μl SA包被珠(Pierce)于室溫溫育60分鐘。洗去未結合的物質，使用Promega的“海腎熒光素酶測定系統”(C)測定hR.Luc活性或通過蛋白質印跡(D)分析捕獲的hR.Luc。C)柱1用生物素-C18H32O4-Cl處理細胞，洗去過量的生物素-C18H32O4-Cl；柱2未處理的細胞；柱3用生物素-C18H32O4-Cl處理但沒有洗去過量生物素-C18H32O4-Cl的細胞。D)在SDS-PAGE上分離細胞裂解物(泳道1)、未結合珠的蛋白(泳道2)和結合珠的蛋白(泳道3)，將其轉移至硝酸纖維素膜，用抗-R.Luc抗體(Chemicon)探測。
發明詳述定義“親核體”是提供電子的分子。
“選擇標記蛋白”編碼的酶活性賦予細胞在沒有否則是必需營養素的物質的培養基中生長的能力(例如酵母細胞中的TRP1基因)，或在具有抗生素或其它藥物的培養基中生長的能力，即在細胞中表達選擇標記蛋白編碼基因相比于對應的沒有該基因的細胞，賦予該細胞對抗生素或藥物的抗性。當宿主細胞必須表達選擇標記以在選擇性培養基中生長時，所述標記稱為正選擇標記(例如賦予在適當抗生素存在下生長能力的抗生素抗性基因)。選擇標記還可用于反選含特定基因的宿主細胞(例如sacB基因，如果其表達，將殺死在含5％蔗糖的培養基中生長的細菌宿主細胞)；以此方式應用的選擇標記稱為負選擇標記或反-選擇標記。常用的選擇標記基因序列包括抗生素抗性序列，所述抗生素例如為氨芐青霉素、四環素、卡那霉素、嘌呤霉素、博來霉素、鏈霉素、潮霉素、新霉素、ZeocinTM等。選擇性營養缺陷型基因序列包括例如在組氨醇存在下允許在無組氨酸培養基中生長的hisD。合適的選擇標記基因包括博來霉素抗性基因、金屬硫蛋白基因、潮霉素B-磷酸轉移酶基因、AURI基因、腺苷脫氨酶基因、氨基糖苷磷酸轉移酶基因、二氫葉酸還原酶基因、胸苷激酶基因、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因等。
本文使用的“核酸”是共價連接的核苷酸序列，其中一個核苷酸戊糖的3′位通過磷酸二酯基團與下一個核苷酸戊糖的5′位相接，其中核苷酸殘基(堿基)以特定的順序連接，即核苷酸的線性順序。本文使用的“多核苷酸”是序列長度超過約100個核苷酸的核酸。本文使用的“寡核苷酸”或“引物”是短多核苷酸或多核苷酸的一部分。本文使用的術語“寡核苷酸”或“寡”定義為含2個或多個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，優選多于3個、通常超過10個但少于250個、優選少于200個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。所述寡核苷酸可以任何方式產生，包括化學合成、DNA復制、擴增如聚合酶鏈反應(PCR)、逆轉錄(RT)或其組合。“引物”是指在置于啟動引物延伸的條件下能夠作為核酸合成起點的寡核苷酸。選擇引物以在其3′末端具有與靶序列(模板)的特定序列大致互補的區域。為使引物延伸，引物必須互補得足以和靶序列雜交。引物序列不需要反映出靶序列的確切序列。例如，可將非互補的核苷酸片段連接至引物的5′末端，引物序列的剩余部分與靶序列大致互補。可將非互補堿基或長序列散布在引物中，前提是引物序列與靶序列的互補性足夠雜交，由此形成復合物用于合成引物的延伸產物。與基因序列匹配或互補的引物可用于擴增反應、RT-PCT等。
一般認為核酸分子具有“5′-末端”和“3′-末端”，因為核酸磷酸二酯鍵出現在取代單核苷酸戊糖環的5′碳和3′碳上。新鍵在此應連至5′碳的多核苷酸末端為其5′末端核苷酸。新鍵在此應連至3′碳的多核苷酸末端為其3′末端核苷酸。本文使用的末端核苷酸為3′-或5′-末端終點位置的核苷酸。
一般認為DNA分子具有“5′末端”和“3′末端”，因為單核苷酸以下述方式反應生成寡核苷酸一個單核苷酸戊糖環的5′磷酸通過磷酸二酯鍵以一個方向連接至其相鄰核苷酸的3′氧。因此，如果寡核苷酸末端的5′磷酸未連接至單核苷酸戊糖環的3′氧，則稱其為“5′末端”，同樣，如果寡核苷酸末端的3′氧未連接至后一單核苷酸戊糖環的5′磷酸，則稱其為“3′末端”。
本文使用的核酸序列即使內部達到較大的寡核苷酸或多核苷酸，也可以認為具有5′和3′末端。在線性或環狀DNA分子中，不連續元件稱為“下游”或3′元件的“上游”或5′。該術語反映出轉錄沿著DNA鏈以5′至3′方式進行的事實。通常，控制連鎖基因(例如可讀框或編碼區)轉錄的啟動子和增強子元件一般位于編碼區的5′或上游。但是，增強子元件甚至在位于啟動子元件和編碼區的3′時也可發揮其作用。轉錄終止和多腺苷酸化信號位于編碼區的3′或下游。
本文使用的術語“密碼子”是基本遺傳編碼單位，由三個核苷酸序列組成，指定摻入多肽鏈的具體氨基酸或起始或終止信號。術語“編碼區”當用于結構基因時指核苷酸序列，其編碼存在于mRNA分子翻譯所得初生多肽中的氨基酸。通常，編碼區以編碼起始密碼子甲硫氨酸的核苷酸三聯體“ATG”界定5′側，以終止密碼子(例如TAA、TAG、TGA)界定3′側。在某些情況下，已知編碼區還由核苷酸三聯體“TTG”開始。
本文使用的術語“分離的和/或純化的”是指核酸分子、多肽、肽或蛋白的體外制備、分離和/或純化，使其與體內物質無關。因此，術語“分離的”當用于核酸時，同“分離的寡核苷酸”或“分離的多核苷酸”一樣，指鑒定并與在其來源中與其通常關聯的至少一種污染物分離的核酸序列。分離的核酸以不同于其天然存在的形式或狀態存在。相反，非分離核酸(例如DNA和RNA)被發現為其天然存在的狀態。例如，給定的DNA序列(例如基因)發現于宿主細胞染色體上接近于鄰近基因的位置；RNA序列(例如編碼具體蛋白的具體mRNA序列)作為和編碼多種蛋白的眾多其它mRNA一起的混合物發現于細胞中。因此，關于“分離的核酸分子”，其包括基因組多核苷酸、cDNA或合成起點或其某些組合，“分離的核酸分子”(1)與“分離的核酸分子”天然發現于其中的多核苷酸的全部或部分無關，(2)有效連接至天然不與其連接的多核苷酸，或(3)不以較大序列的部分天然存在。分離的核酸分子可以單鏈或雙鏈形式存在。當核酸分子用于表達蛋白時，核酸分子最低要含有義或編碼鏈(即可為單鏈的核酸)，但可同時含有義和反義鏈(即可為雙鏈的核酸)。
本文使用的術語“野生型”是指具有分離自天然來源的該基因或基因產物特征的基因或基因產物。野生型基因最常見于群體中，因此人為地命名為“野生型”基因。相反，術語“突變體”是指與野生型基因或基因產物相比，表現出序列和/或功能特性改變(即改變的特征)的基因或基因產物。要注意的是，可分離天然存在的突變體；通過與野生型基因或基因產物相比它們具有改變特征的事實對其進行鑒別。
術語“重組DNA分子”是指含至少兩個通常天然不一起發現的核苷酸序列的雜種DNA序列。術語“載體”用于指DNA片段可插入或克隆入其中的核酸分子，其可用于將DNA節段轉移入細胞中，并能夠在細胞中復制。載體可來源于質粒、噬菌體、病毒、粘粒等。
本文使用的術語“重組載體”、“表達載體”或“構建物”是指DNA或RNA序列，其含所需編碼序列，以及在具體宿主生物中表達有效連接的編碼序列所必須的合適DNA或RNA序列。原核表達載體包括啟動子、核糖體結合位點、在宿主細胞中自主復制的復制起點和可能的其它序列，例如任選的操縱子序列、任選的限制酶位點。啟動子定義為指導RNA聚合酶結合DNA和啟動RNA合成的DNA序列，真核表達載體包括啟動子、任選的聚腺苷酸化信號和任選的增強子序列。
具有“編碼肽、蛋白或多肽”的核苷酸序列的多核苷酸是指含基因編碼區的核酸序列或其片段，所述片斷編碼的基因產物與對應的全長肽、蛋白或多肽相比具有大致相同的活性。編碼區可以cDNA、基因組DNA或RNA形式存在。當以DNA形式存在時，寡核苷酸可為單鏈(即有義鏈)或雙鏈。如果需要使轉錄正確啟動和/或初級RNA轉錄物正確加工，可將合適的控制元件如增強子/啟動子、剪接點、聚腺苷酸化信號等置于接近基因編碼區的位置。或者，用于本發明表達載體的編碼區可包含內源增強子/啟動子、剪接點、間插序列、聚腺苷酸化信號等。在再一個實施方案中，所述編碼區可包含內源和外源控制元件的組合。
術語“轉錄調節元件”或“轉錄調節序列”是指控制核酸序列表達的某些方面的遺傳元件或序列。例如，啟動子是促進有效連接的編碼區轉錄開始的調節元件。其它的調節元件包括但不限于轉錄因子結合位點、剪接信號、聚腺苷酸化信號、終止信號和增強子元件。
真核細胞中的轉錄控制信號包括“啟動子”和“增強子”元件。啟動子和增強子由與參與轉錄的細胞蛋白特異性相互作用的短列DNA序列組成。已從各種真核細胞來源中分離出啟動子和增強子元件，包括酵母、昆蟲和哺乳動物細胞基因。還從病毒中分離出啟動子和增強子元件，而類似的控制元件如啟動子也存在于原核細胞中。具體啟動子和增強子的選擇取決于用于表達目標蛋白的細胞類型。某些真核啟動子和增強子具有廣泛的宿主范圍，而另一些則在有限的細胞亞類中有功能。例如，SV40早期基因增強子在許多哺乳動物物種的眾多細胞類型中非常有效，并廣泛用于在哺乳動物細胞中表達蛋白。在大范圍哺乳動物細胞類型中有效的兩個其它啟動子/增強子元件實例是來自人延伸因子1基因(Uetsuki等，1989；Kim等，1990；和Mizushima和Nagata，1990)和勞斯肉瘤病毒長末端重復序列(Gorman等，1982)以及人巨細胞病毒(Boshart等，1985)的啟動子/增強子元件。
術語“啟動子/增強子”表示含能夠同時提供啟動子和增強子功能(即由上述的啟動子元件和增強子元件提供的功能)的序列的DNA節段。例如，逆轉錄病毒的長末端重復序列同時具有啟動子和增強子功能。啟動子/增強子可為“內源”或“外源”或“異源”。“內源”啟動子/增強子與基因組中的給定基因天然連接。“外源”或“異源”啟動子/增強子通過遺傳操作方法(即分子生物學技術)與基因并列放置，以使基因轉錄受控于連接的啟動子/增強子。
表達載體上存在“剪接信號”經常使真核宿主細胞中的重組轉錄物高水平表達。剪接信號介導由初級RNA轉錄物中去除內含子，由剪接供體和接受位點組成(Sambrook等，1989)。常用的剪接供體和接受位點是SV40 16S RNA的剪接點。
重組DNA序列在真核細胞中有效表達需要控制所獲轉錄物有效終止和聚腺苷酸化的信號表達。轉錄終止信號一般發現于聚腺苷酸化信號下游，長度為數百個核苷酸。本文使用的術語“聚腺苷酸化位點”或“聚腺苷酸化信號”表示同時控制新生RNA轉錄物終止和聚腺苷酸化的DNA序列。期望重組轉錄物有效聚腺苷酸化，因為沒有聚腺苷酸尾的轉錄物不穩定且快速降解。用于表達載體的聚腺苷酸化信號可為“異源”或“內源”。內源聚腺苷酸化信號天然存在于基因組中給定基因編碼區的3′末端。異源聚腺苷酸化信號分離自一個基因并定位于另一基因的3′。常用的異源聚腺苷酸化信號是SV40聚腺苷酸化信號。SV40聚腺苷酸化信號包含在237bp的BamHI/BclI限制性片段中，同時控制終止和聚腺苷酸化(Sambrook等，1989)。
真核表達載體也可以含有“病毒復制子”或“病毒復制起點”。病毒復制子是允許載體在表達合適復制因子的宿主細胞中染色體外復制的病毒DNA序列。含SV40或多瘤病毒復制起點的載體在表達合適病毒T抗原的細胞中以高拷貝數(高達104拷貝/細胞)復制。相反，含牛乳頭瘤病毒或EB病毒復制子的載體以低拷貝數(約100拷貝/細胞)在染色體外復制。
術語“體外”是指人工環境和人工環境中發生的過程或反應。體外環境包括但不限于試管和細胞裂解物。術語“原位”指細胞培養物。術語“體內”指天然環境(例如動物或細胞)和天然環境中發生的過程或反應。
術語“表達系統”指任何測定(例如檢測)目的基因表達的試驗或系統。分子生物學領域的技術人員應當理解，可使用各種表達系統中的任一種。大范圍的合適哺乳動物細胞可得自廣泛來源(例如美國典型培養物保藏中心，Rockland，MD)。轉化或轉染方法和表達載體的選擇取決于選擇的宿主系統。轉化或轉染方法描述于例如Sambrook等，1989。表達系統包括體外基因表達測定，在該測定中目的基因(例如報告基因)連接至調節序列，在用抑制或誘導基因表達的物質處理后監測基因表達。可通過任何合適的方法檢測基因表達，這些方法包括但不限于檢測表達的mRNA或蛋白(例如可檢測的報告基因產物)，或者通過目標基因表達細胞表型的可檢測變化檢測基因表達。表達系統還可以包含檢測裂解事件或其它核酸或細胞變化的測定。
術語“基因”指DNA序列，其含有由該DNA序列生產多肽必須的編碼序列和任選的控制序列。所述多肽可由全長編碼序列或任何部分編碼序列編碼，只要所述部分編碼的基因產物和全長多肽具有大致相同的活性。
已知核酸包含不同類型的突變。“點”突變是指在核苷酸序列中單個堿基位置上對野生型序列的改變。突變還可以指一個或多個堿基的插入或缺失，以使核酸序列不同于參照序列，例如野生型序列。
本文使用的術語“雜交”是指互補序列與靶核酸的退火，即兩種含互補序列的核酸多聚物(多核苷酸)通過堿基配對退火的能力。術語“退火”和“雜交”在全文中可互換使用，包括互補序列和靶核酸之間的任何特異性、可重復的相互作用，包括僅具部分互補性的區域結合。本發明的核酸可包含某些通常不存在于天然核酸中的堿基，包括例如肌苷和7-脫氮鳥嘌呤。核酸技術領域的技術人員可根據經驗考慮一系列變量確定雙鏈體的穩定性，這些變量包括例如互補序列長度、寡核苷酸的堿基組成和序列、離子強度和錯配堿基對的發生率。核酸雙鏈體的穩定性可通過解鏈溫度或“Tm”檢測。在具體條件下具體核酸雙鏈體的Tm是平均一半的堿基對解離的溫度。
術語“嚴格性”用于指溫度、離子強度和存在其它化合物的條件，在該條件下進行核酸雜交。在“高嚴格性”條件下，核酸堿基配對僅在具有高頻率互補堿基序列的核酸片段之間發生。因此，想讓互相之間不完全互補的核酸一起雜交或退火，經常要求“中”和“低”嚴格條件。本領域周知可使用眾多等同條件以構成中或低嚴格條件。雜交條件的選擇對本領域技術人員來說一般是顯而易見的，通常以雜交目的、雜交類型(DNA-DNA或DNA-RNA)、序列之間期望的相關性水平為指引(例如Sambrook等，1989；Nucleic AcidHybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington D.C.，1985對所述方法的一般性論述)。
已知核酸雙鏈體的穩定性隨著錯配堿基數的增加而降低，此外，降低程度的大或小取決于在雜種雙鏈體中錯配的相對位置。因此，雜交嚴格性可用于最大化或最小化此類雙鏈體的穩定性。可通過調節雜交溫度、調節雜交混合物中螺旋去穩定物質(例如甲酰胺)的百分比以及調節漂洗溶液的溫度和/或鹽濃度改變雜交嚴格性。對于濾膜雜交，經常以用于雜交后漂洗的鹽濃度和/或溫度確定最終的雜交嚴格性。
“高嚴格條件”當用于指核酸雜交時，包括等同于以下的條件當使用的探針長度為約500個核苷酸時，在由5×SSPE(43.8g/lNaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH將pH調節至7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt試劑和100μg/ml變性鮭精DNA組成的溶液中于42℃結合或雜交，接著用含0.1×SSPE、1.0％SDS的溶液于42℃漂洗。
“中嚴格條件”當用于指核酸雜交時，包括等同于以下的條件當使用的探針長度為約500個核苷酸時，在由5×SSPE(43.8g/lNaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH將pH調節至7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt試劑和100μg/ml變性鮭精DNA組成的溶液中于42℃結合或雜交，接著用含1.0×SSPE、1.0％SDS的溶液于42℃漂洗。
“低嚴格條件”包括等同于以下的條件當使用的探針長度為約500個核苷酸時，在由5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH將pH調節至7.4)、0.1％SDS、5×Denhardt試劑[50×Denhardt每500ml含5g Ficoll(400型，Pharmacia)、5g BSA(Fraction V；Sigma)]和100g/ml變性鮭精DNA組成的溶液中于42℃結合或雜交，接著用含5×SSPE、0.1％SDS的溶液于42℃漂洗。
“肽”、“蛋白”和“多肽”是指任意氨基酸鏈，與長度或翻譯后修飾(例如糖基化或磷酸化)無關。除非另有說明，否則所述術語可互換使用。本發明的核酸分子編碼天然(野生型)蛋白或其片段的變異體(突變體)，所述片斷與全長突變蛋白具有大致相同活性。優選這種突變蛋白的氨基酸序列與對應野生型蛋白氨基酸序列的一致性至少85％，優選90％，最優選95％或99％。
一般認為多肽分子具有“氨基末端”(N-末端)和“羧基末端”(C-末端)，因為在第一個氨基酸殘基的氨基骨架和第二個氨基酸殘基的羧基骨架之間存在肽鍵。術語“N-末端”和“C-末端”用于多肽序列時分別指包括多肽N-末端和C-末端區域部分的多肽區域。包括多肽N-末端區域部分的序列包括主要來自多肽鏈N-末端一半的氨基酸，但不限于這種序列。例如，N-末端序列可包括多肽序列內部部分，包括多肽N-末端和C-末端一半的堿基。這同樣也適用于C-末端區域。N-末端和C-末端區域可以但不是必須包括分別確定多肽的N-末端和C-末端的氨基酸。
術語“分離的”當用于指多肽時，同“分離的蛋白”或“分離的多肽”一樣，是指鑒定并與在其來源中通常與其關聯的至少一種污染物分離。因此，分離的多肽(1)與天然發現的蛋白無關，(2)無相同來源的其它蛋白，例如無人類蛋白；(3)由不同物種的細胞表達；或(4)天然不存在。相反，非分離多肽(例如蛋白和酶)以其天然存在的狀態發現。術語“分離的多肽”、“分離的肽”或“分離的蛋白”包括由cDNA或重組RNA(包括合成來源)或其某些組合編碼的多肽、肽或蛋白。
本文使用的術語“重組蛋白”或“重組多肽”指由重組DNA分子表達的蛋白分子。相反，本文使用的術語“天然蛋白質”表示分離自天然(例如非重組)來源的蛋白質。可使用分子生物學技術生產重組形式的蛋白，其與天然形式的該蛋白相比具有相同特性。
本文使用的術語“融合多肽”是指含與不同蛋白(例如突變水解酶)相連的目標蛋白(例如熒光素酶、親和標記或靶向序列)的嵌合蛋白。
本文使用的術語“抗體”是指具有基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的一種或多種多肽的蛋白。公認的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區基因，以及無數的免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，它們再分別確定免疫球蛋白類型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
已知基本的免疫球蛋白(抗體)結構單位包含四聚體。每種四聚體都由兩對等同的多肽鏈組成，每對都具有一條“輕”鏈(約25kD)和一條“重”鏈(約50-70kD)。每條鏈的N-末端確定了約100-110或更多氨基酸的可變區，其主要負責抗原識別。術語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指這些輕鏈和重鏈。
抗體可作為完整的免疫球蛋白存在，或者以各種修飾形式存在，包括FabFc2、Fab、Fv、Fd、(Fab′)2、例如僅含輕鏈和重鏈可變區的Fv片段；含可變區和部分恒定區的Fab或(Fab′)2片段；單鏈抗體，例如scFv、CDR-嫁接抗體等。Fv的重鏈和輕鏈可得自相同或不同的抗體，由此產生嵌合Fv區。抗體可以為動物(尤其是小鼠或大鼠)或人類來源，或者可以為嵌合或人源化的。本文使用的術語“抗體”包括這些不同形式。
本文使用的術語“細胞”、“細胞系”、“宿主細胞”可互換使用，所有這種名稱都包括這些名稱的后代或潛在后代。“轉化細胞”指已將本發明的核酸分子導入其中(或其祖先中)的細胞。任選可將本發明核酸分子導入合適細胞系中，以產生能夠生產所述核酸分子編碼蛋白或多肽的穩定轉染細胞系。載體、細胞和構建這些細胞系的方法在本領域眾所周知。術語“轉化體”或“轉化細胞”包括衍生自原始轉化細胞的初級轉化細胞，而不考慮傳代數。所有后代在DNA含量方面可能不完全相同，原因是有意或無意的突變。盡管如此，但由原始轉化細胞中篩選的具有相同功能的突變后代也包含在轉化體定義中。
術語“同源性”是指互補程度。可以存在部分同源性或完全同源性(即一致性)。同源性經常使用序列分析軟件(例如威斯康星大學生物技術中心遺傳學計算機工作組的序列分析軟件包，1710University Avenue.Madison，WI53705)檢測。該軟件通過對各種置換、缺失、插入和其它修飾分配同源性程度，匹配相似序列。保守置換通常包括以下各組內的置換甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。
術語“純化的”或“純化”指任何由目的組分(例如蛋白或核酸)中去除某些雜質的過程結果。樣品中純化組分的百分比因此增加。
本文使用的術語“有效連接”指核酸序列以下述方式連接，產生能夠控制給定基因轉錄和/或目的蛋白分子合成的核酸分子。該術語還指氨基酸編碼序列以下述方式連接，產生功能性(例如酶活性、能夠結合結合配偶體、能夠抑制等)蛋白或多肽或其前體(例如蛋白或多肽的前-或前原形式)。
本文鑒別的所有氨基酸殘基都是天然L-構型。為與標準多肽命名法保持一致，氨基酸殘基的縮寫如以下的對應表所示。
對應表單字母 三字母氨基酸YTyr L-酪氨酸GGly L-甘氨酸FPhe L-苯丙氨酸MMet L-甲硫氨酸AAla L-丙氨酸SSer L-絲氨酸IIle L-異亮氨酸LLeu L-亮氨酸TThr L-蘇氨酸VVal L-纈氨酸PPro L-脯氨酸KLys L-賴氨酸HHis L-組氨酸QGln L-谷氨酰胺EGlu L-谷氨酸WTrp L-色氨酸RArg L-精氨酸DAsp L-天冬氨酸NAsn L-天冬酰胺CCys L-半胱氨酸本文使用的術語“聚組氨酸束”或(His標簽指含2-10個組氨酸殘基的分子，例如5-10個殘基的聚組氨酸束。聚組氨酸束使得可以在固定化金屬(例如鎳、鋅、鈷或銅)螯合柱上或通過與另一種分子(例如與His標簽反應的抗體)的相互作用親和純化共價連接的分子。
本文使用的“純”表示目標種類為主要存在種類(即以摩爾為基準，在組合物中其比任何其它單個種類都更豐富)，優選大致純的組分是其中目標種類占存在全部大分子種類的至少約50％(以摩爾為基準)的組合物。一般來說，“大致純”的組合物占組合物中存在的全部大分子種類的約80％以上，更優選約85％、約90％、約95％和約99％以上。最優選目標種類純化至基本同質(不能通過常規檢測方法檢測出組合物中的雜質種類)，其中組合物基本上由單一大分子種類組成。
I.突變水解酶及其融合體本發明范圍內的突變水解酶包括但不限于經重組技術(例如定點誘變或循環誘變(recursive mutagenesis))制備的突變水解酶，其包含一個或多個使突變水解酶能夠與對應非突變(野生型)水解酶的底物(例如經修飾含一個或多個官能團的底物)形成穩定(例如共價)鍵的氨基酸置換。本發明范圍內的水解酶包括但不限于肽酶、酯酶(例如膽固醇酯酶)、糖苷酶(例如葡糖淀粉酶(glucosamylase))、磷酸酶(例如堿性磷酸酶)等。例如，水解酶包括但不限于作用于酯鍵的酶，如羧酸酯水解酶、硫酯水解酶、磷酸單酯水解酶、磷酸二酯水解酶、三磷酸單酯水解酶、硫酸酯水解酶、二磷酸單酯水解酶、磷酸三酯水解酶、產生5′-磷酸單酯的外切脫氧核糖核酸酶、產生5′-磷酸單酯的外切核糖核酸酶、產生3′-磷酸單酯的外切核糖核酸酶、作用于核糖核酸或脫氧核糖核酸的外切核酸酶、產生5′-磷酸單酯的內切脫氧核糖核酸酶、產生非5′-磷酸單酯的內切脫氧核糖核酸酶、改變堿基特異性的位點特異性內切脫氧核糖核酸酶、產生5′-磷酸單酯的內切核糖核酸酶、生產非5′-磷酸單酯的內切核糖核酸酶、作用于核糖核酸或脫氧核糖核酸的內切核酸酶、作用于核糖核酸或脫氧核糖核酸糖基化酶的內切核糖核酸酶；糖苷酶，例如水解O-和S-糖基以及水解N-糖基化合物的酶；作用于醚鍵的酶如三烷基锍水解酶或醚水解酶；作用于肽鍵的酶(肽水解酶)，如氨基肽酶、二肽酶、二肽基肽酶和三肽基肽酶、肽基二肽酶、絲氨酸型羧肽酶、金屬羧肽酶、半胱氨酸型羧肽酶、ω肽酶、絲氨酸內肽酶、半胱氨酸內肽酶、精氨酸內肽酶、金屬內肽酶、蘇氨酸內肽酶和未知催化機制的內肽酶；作用于肽鍵以外的碳-氮鍵的酶，例如線性酰胺、環酰胺、線性脒、環脒、腈或其它化合物中的碳-氮鍵；作用于酸酐的酶，如含磷酐和含磺酰酐中的酸酐；作用于酸酐的酶(催化跨膜移動)；作用于酸酐或參與細胞和亞細胞移動的酶；作用于碳-碳鍵(例如酮物質中的碳-碳鍵)的酶；作用于鹵化物鍵(例如C-鹵化化合物中的鹵化物鍵)的酶；作用于磷-氮鍵的酶；作用于硫-氮鍵的酶；作用于碳-磷鍵的酶；以及作用于硫-硫鍵的酶。作用于鹵化物鍵的示例性水解酶包括但不限于鹵烷酶、2-鹵代酸脫鹵素酶、鹵代乙酰脫鹵素酶、甲狀腺素脫碘酶、鹵代烷脫鹵素酶、4-氯苯甲酸脫鹵素酶、4-氯苯甲酰-輔酶A脫鹵素酶和莠去津氯水解酶。作用于環酰胺中碳-氮鍵的典型水解酶包括但不限于巴比妥酸酶、二氫嘧啶酶、二氫乳清酸酶、羧甲基乙內酰脲酶、尿囊素酶、β-內酰胺酶、咪唑啉酮丙酸酶、5-氧代脯氨酸酶(ATP-水解)、肌酸酐酶、L-賴氨酸-內酰胺酶、6-氨基已酸-環-二聚體水解酶、2，5-二氧代哌嗪水解酶、N-甲基乙內酰脲酶(ATP-水解)、氰尿酸氨基水解酶、順丁烯二酰亞胺水解酶。本文使用的“β-內酰胺酶”包括A類、B類、C類和D類β-內酰胺酶，以及D-丙氨酸羧肽酶/轉肽酶、酯酶EstB、青霉素結合蛋白2X、青霉素結合蛋白5和D-氨基酸肽酶。所述β-內酰胺酶優選為絲氨酸β-內酰胺酶，例如在對應于金黃色葡萄球菌(S.aureus)PCl絲氨酸β-內酰胺酶殘基70的位置上具有催化性絲氨酸殘基、在對應于金黃色葡萄球菌(S.aureus)PCl絲氨酸β-內酰胺酶殘基166的位置上具有谷氨酸殘基、任選在對應于金黃色葡萄球菌(S.aureus)PCl β-內酰胺酶殘基73的位置上具有賴氨酸殘基以及還任選在對應于金黃色葡萄球菌(S.aureus)PCl β-內酰胺酶殘基234的位置上具有賴氨酸殘基的絲氨酸β-內酰胺酶。
在一個實施方案中，所述突變水解酶為鹵代烷脫鹵素酶，例如發現于利用鹵代烷的革蘭氏陰性(Keuning等，1985)和革蘭氏陽性(Keuning等，1985；Yokota等，1987；Scholtz等，1987；Sallis等，1990)細菌中的鹵代烷脫鹵素酶。鹵代烷脫鹵素酶，包括自養黃色桿菌(Xanthobacter autotrophicus)GJ10(Janssen等，1988，1989)DhlA和紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA，催化對應的烴水解脫鹵素化。經歷轉化的鹵化脂肪烴包括C2-C10飽和脂肪烴，它們具有一個或多個連接的鹵素基團，其中至少兩個鹵素在相鄰碳原子上。這種脂肪烴包括揮發性氯化脂肪(VCA)烴。VCA包括例如二氯乙烷、1，2-二氯丙烷、1，2-二氯丁烷和1，2，3-三氯丙烷等脂肪烴。本文使用的術語“鹵化烴”是指鹵化脂肪烴。本文使用的術語“鹵素”包括氯、溴、碘、氟、砹等。優選的鹵素是氯。
如本文所述，本發明包括含突變水解酶和目標蛋白氨基酸序列的融合蛋白，所述氨基酸序列例如為標記蛋白或親和標記物序列(例如熒光素酶、GFP或聚組氨酸序列)、核酸結合蛋白、胞外基質蛋白、分泌性蛋白、受體配體、血清蛋白、免疫原性蛋白、熒光蛋白、具有活性半胱氨酸的蛋白、受體蛋白(如MDA受體)、通道蛋白(如鈉、鉀或鈣敏性通道蛋白，包括HERG通道蛋白)或轉運蛋白(如EAAT1-4谷氨酸轉運蛋白)，以及靶向信號(如質粒靶向信號、核定位信號或肉豆蔻酸化序列)。
II.優化的水解酶序列，以及編碼水解酶的載體和宿主細胞任選優化含水解酶或其融合體編碼核酸序列的核酸分子，以在具體宿主細胞中表達，還任選與轉錄調節序列(例如一個或多個增強子、啟動子、轉錄終止序列或其組合)有效連接，以形成表達盒。
在一個實施方案中，通過用在具體(選擇)細胞中優先使用的密碼子替換野生型或突變水解酶序列中的密碼子，優化編碼水解酶或其融合體的核酸序列。優選密碼子在選擇的細胞中具有較高密碼子使用頻率，優選其導入導致導入較少選擇宿主細胞中存在的轉錄因子的轉錄因子結合位點以及較少的其他不需要的結構特征。因此，優化的核酸產物由于提高了密碼子使用頻率而使表達水平提高，并由于不需要的轉錄調節序列數量下降而降低了不適宜轉錄行為的風險。
本發明分離和優化核酸分子的密碼子組成與對應野生型核酸序列的密碼子組成可有30％、35％、40％以上或45％以上如50％、55％、60％或以上的密碼子不同。用于本發明的優選密碼子比用于具體生物中相同氨基酸的至少一種其它密碼子更經常使用，更優選在該生物和用于克隆或篩選核酸分子表達的生物中也不是使用低的密碼子。而且，某些氨基酸(即具有三個或更多密碼子的氨基酸)的優選密碼子可包括比其它(非優選)密碼子更經常使用的兩個或更多密碼子。所述核酸分子中存在的密碼子在一種生物中比在另一種生物中更經常使用，這導致核酸分子在導入更經常使用這些密碼子的生物細胞時，其在這些細胞中的表達水平比這些細胞中野生型或父代核酸序列的表達水平高。
在本發明的一個實施方案中，不同的密碼子是在哺乳動物中更經常使用的密碼子，而在另一個實施方案中，不同的密碼子是在植物中更經常使用的密碼子。不同生物的優選密碼子是本領域已知的，參見例如www.kazusa.or.jp./codon/。具體類型的哺乳動物，例如人，可具有不同于其它類型哺乳動物的優選密碼子組。同樣，具體類型的植物可具有不同于其它類型植物的優選密碼子組。在本發明的一個實施方案中，大部分不同的密碼子是目的宿主細胞中優選的密碼子。包括哺乳動物(例如人)和植物的生物的優選密碼子是本領域已知的(例如Wada等，1990；Ausubel等，1997)。例如，優選的人密碼子包括但不限于CGC(Arg)、CTG(Leu)、TCT(Ser)、AGC(Ser)、ACC(Thr)、CCA(Pro)、CCT(Pro)、GCC(Ala)、GGC(Gly)、GTG(Val)、ATC(Ile)、ATT(Ile)、AAG(Lys)、AAC(Asn)、CAG(Gln)、CAC(His)、GAG(Glu)、GAC(Asp)、TAC(Tyr)、TGC(Cys)和TTC(Phe)(Wada等，1990)。因此，在一個實施方案中，本發明合成核酸分子由于具有增加數量的優選人密碼子如CGC、CTG、TCT、AGC、ACC、CCA、CCT、GCC、GGC、GTG、ATC、ATT、AAG、AAC、CAG、CAC、GAG、GAC、TAC、TGC、TTC或其任意組合，而具有不同于野生型核酸序列的密碼子組成。例如，相對于野生型核酸序列，本發明的核酸分子可具有增加數量的CTG或TTG亮氨酸編碼密碼子、GTG或GTC纈氨酸編碼密碼子、GGC或GGT甘氨酸編碼密碼子、ATC或ATT異亮氨酸編碼密碼子、CCA或CCT脯氨酸編碼密碼子、CGC或CGT精氨酸編碼密碼子、AGC或TCT絲氨酸編碼密碼子、ACC或ACT蘇氨酸編碼密碼子、GCC或GCT丙氨酸編碼密碼子，或其任意組合。在另一個實施方案中，優選的秀麗線蟲(C.elegans)密碼子包括但不限于UUC(Phe)、UUU(Phe)、CUU(Leu)、UUG(Leu)、AUU(Ile)、GUU(Val)、GUG(Val)、UCA(Ser)、UCU(Ser)、CCA(Pro)、ACA(Thr)、ACU(Thr)、GCU(Ala)、GCA(Ala)、UAU(Tyr)、CAU(His)、CAA(Gln)、AAU(Asn)、AAA(Lys)、GAU(Asp)、GAA(Glu)、UGU(Cys)、AGA(Arg)、CGA(Arg)、CGU(Arg)、GGA(Gly)，或其任意組合。在再另一個實施方案中，優選的果蠅(Drosophilia)密碼子包括但不限于UUC(Phe)、CUG(Leu)、CUC(Leu)、AUC(Ile)、AUU(Ile)、GUG(Val)、GUC(Val)、AGC(Ser)、UCC(Ser)、CCC(Pro)、CCG(Pro)、ACC(Thr)、ACG(Thr)、GCC(Ala)、GCU(Ala)、UAC(Tyr)、CAC(His)、CAG(Gln)、AAC(Asn)、AAG(Lys)、GAU(Asp)、GAG(Glu)、UGC(Cys)、CGC(Arg)、GGC(Gly)、GGA(gly)，或其任意組合。優選的酵母密碼子包括但不限于UUU(Phe)、UUG(Leu)、UUA(Leu)、CCU(Leu)、AUU(Ile)、GUU(Val)、UCU(Ser)、UCA(Ser)、CCA(Pro)、CCU(Pro)、ACU(Thr)、ACA(Thr)、GCU(Ala)、GCA(Ala)、UAU(Tyr)、UAC(Tyr)、CAU(His)、CAA(Gln)、AAU(Asn)、AAC(Asn)、AAA(Lys)、AAG(Lys)、GAU(Asp)、GAA(Glu)、GAG(Glu)、UGU(Cys)、CGU(Trp)、AGA(Arg)、CGU(Arg)、GGU(Gly)、GGA(Gly)，或其任意組合。同樣，具有增加數量的在植物中更經常使用的密碼子的核酸分子，由于具有增加數量的植物密碼子，而與野生型或父代核酸序列具有不同的密碼子組成，所述植物密碼子包括但不限于CGC(Arg)、CTT(Leu)、TCT(Ser)、TCC(Ser)、ACC(Thr)、CCA(Pro)、CCT(Pro)、GCT(Ser)、GGA(Gly)、GTG(Val)、ATC(Ile)、ATT(Ile)、AAG(Lys)、AAC(Asn)、CAA(Gln)、CAC(His)、GAG(Glu)、GAC(Asp)、TAC(Tyr)、TGC(Cys)、TTC(Phe)，或其任意組合(Murray等，1989)。不同類型植物的優選密碼子可以不同(Wada等，1990)。
在一個實施方案中，編碼水解酶或其融合體的優化核酸序列與編碼對應水解酶或其融合體的非優化核酸序列的核酸序列一致性低于100％，例如低于90％或低于80％。例如，編碼DhaA的優化核酸序列與編碼對應DhaA的非優化(野生型)核酸序列的核酸序列一致性低于約80％，由優化核酸序列編碼的DhaA與對應野生型DhaA的氨基酸序列一致性任選至少為85％。在一個實施方案中，由優化核酸序列編碼的DhaA的活性是非優化序列編碼的DhaA活性的至少10％，例如50％或更高，例如，由優化核酸序列編碼的突變DhaA結合底物的效力與由非優化核酸序列編碼的突變DhaA結合相同底物的效力大致相同，即至少50％、80％、100％或更高。
可將核酸分子或表達盒導入任選包含選擇標記基因的載體中，例如質粒或病毒載體，并將載體導入目的細胞中，例如原核細胞，如大腸桿菌、鏈霉菌(Streptomyces spp.)、芽孢桿菌(Bacillus spp.)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)等，以及真核細胞，包括植物(雙子葉或單子葉)、真菌、酵母(如畢赤酵母(Pichia)、酵母(Saccharomyces)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces))或哺乳動物細胞。優選的哺乳動物細胞包括牛、山羊、綿羊、犬、貓、非人靈長類如猿以及人細胞。優選的哺乳動物細胞系包括但不限于CHO、COS、293、Hela、CV-1、SH-SY5Y(人成神經細胞瘤細胞)、HEK293和NIH3T3細胞。
可通過任何能夠在原核細胞或真核細胞中表達的啟動子控制編碼突變水解酶的表達。優選的原核啟動子包括但不限于SP6、T7、T5、tac、bla、trp、gal、lac或麥芽糖啟動子。優選的真核啟動子包括但不限于組成型啟動子，例如病毒啟動子如CMV、SV40和RSV啟動子，以及可調節啟動子，例如可誘導或可抑制的啟動子，如tet啟動子、hsp70啟動子和CRE調節的合成啟動子。優選的細菌表達載體包括pGEX-5X-3，優選的真核表達載體包括pCIneo-CMV。
本發明的核酸分子、表達盒和/或載體可通過任何方法導入細胞中，所述方法包括但不限于鈣介導轉化、電穿孔、微注射、脂轉染、粒子轟擊等。
III.官能團用于本發明底物和方法的官能團是可檢測或能夠檢測的分子。本發明范圍內的官能團能夠共價連接至雙功能連接基團或水解酶底物的一個活性取代基，并且作為本發明底物的一部分，與不與天然底物連接的官能團具有大致相同的活性，并能夠與突變水解酶形成穩定復合物。因此，官能團具有一種或多種特性，這些特性有利于檢測和任選分離具有該官能團的底物和突變水解酶形成的穩定復合物。例如，官能團包括具有以下特性的官能團電磁光譜特性如發射或吸收、磁力、電子自旋共振、電容、介電常數或電導率，以及包括具鐵磁性、順磁性、反磁性、發光性、電化學發光性、熒光性、磷光性、發色性、抗原性或不同質譜的官能團。官能團包括但不限于核酸分子，即DNA或RNA，例如寡核苷酸或核苷酸；蛋白，例如發光蛋白；肽，例如配體識別的表位，如生物素或鏈霉抗生物素蛋白；半抗原；氨基酸；脂質；脂質雙層；固相支持體；熒光團；發色團；報告分子；放射性核素、電子不透明分子；MRI造影劑，例如錳、釓(III)或氧化鐵顆粒；等等。檢測具體官能團的方法是本領域已知的。例如，可通過雜交、擴增、結合核酸分子特異性核酸結合蛋白、酶測定(例如如果核酸分子是核酶)檢測核酸分子，或者如果核酸分子自身含有可檢測或能夠檢測的分子，例如放射性標記或生物素，則可通過適于該分子的測定對其進行檢測。
示例性官能團包括半抗原，例如用于增強匙孔_血藍蛋白(KLH)免疫原性的分子；可裂解標記物，例如可光裂解生物素；以及熒光標記，例如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)修飾的香豆素和琥珀酰亞胺或磺酰琥珀酰亞胺修飾的BODIPY(其可通過UV和/或可見光激發的熒光檢測測定)、羅丹明如R110、對甲氨基酚、CRG6、Texas Metyl Red(TAMRA)、Rox5、FAM或熒光素、香豆素衍生物如7-氨基香豆素和7-羥基香豆素、2-氨基-4-甲氧基萘、1-羥基芘、試鹵靈、phenalenone或benzphenalenone(美國專利第4,812,409號)、吖啶酮(美國專利第4,810,636號)、蒽和α-和β-萘酚衍生物、氟化呫噸衍生物，包括氟化熒光素和對甲氨基酚(例如美國專利第6,612,931號)，以及生物發光分子，例如螢光素酶或GFP。依靠連接至對應野生型水解酶底物而連接至突變水解酶的熒光(或生物發光)官能團，可用于實時感知系統變化，例如磷酸化。而且，本發明底物中的熒光分子，例如金屬離子化學傳感器，如用于Cu2+的9-羰基蒽修飾的甘氨酰-組氨酰-賴氨酸(GHK)，可用于標記結合底物的蛋白。生物發光或熒光官能團如BODIPY、羅丹明綠、GFP或紅外染料，也發現可用作官能團，并可例如用于使用例如BRET、FRET、LRET或電泳的相互作用研究。
另一類官能團是與含接受基團的分子相互作用的分子(“親和”分子)。因此，由于親和分子和另一種生物或非生物來源的分子(例如接受分子)的選擇性相互作用，所以含所述親和分子的水解酶底物可促進具有所述底物和突變水解酶的復合物分離。例如，與親和分子相互作用的具體分子(稱為接受分子)可以為小有機分子、化學基團如巰基(-SH)或大生物分子如抗體或親和分子的其它天然配體。結合一般為化學性質，可能涉及共價或非共價鍵的形成或相互作用，如離子鍵或氫鍵鍵合。接受分子在溶液中可以是游離的，或者其自身結合固體或半固體表面、多聚物基質，或者存在固體或半固體底物的表面上。所述相互作用還可以通過外部因子如光、溫度、壓力或加入起催化劑作用的化學或生物分子觸發。由于親和分子和接受分子之間的相互作用(一般是一類結合)，所以可檢測和/或分離反應混合物中的復合物。
親和分子的實例包括例如免疫原性分子，如蛋白、肽、糖或脂質表位，即可用于制備該分子特異性抗體的任何分子；生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白及其衍生物；金屬結合分子；以及這些分子的片段或組合。典型的親和分子包括His5(HHHHH)(SEQ IDNO19)、HisX6(HHHHHH)(SEQ ID NO20)、C-myc(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO21)、Flag(DYKDDDDK)(SEQ ID NO22)、SteptTag(WSHPQFEK)(SEQ ID NO23)、HA Tag(YPYDVPDYA)(SEQ IDNO24)、硫氧還蛋白、纖維素結合域、幾丁質結合域、S-肽、T7肽、鈣調蛋白結合肽、C-末端RNA標記物、金屬結合域、金屬結合反應基、氨基酸反應基、內含肽、生物素、鏈霉抗生物素蛋白和麥芽糖結合蛋白。例如，使含生物素的水解酶底物與突變水解酶接觸。突變水解酶和底物復合物中存在生物素使得該復合物可選擇性結合抗生物素蛋白分子，例如包被在如珠、微孔、硝酸纖維素等表面上的鏈霉抗生物素蛋白分子。合適的表面包括用于色譜分離的樹脂、塑料如組織培養表面或結合平板、微量滴定碟和珠、陶瓷和玻璃、顆粒包括磁性顆粒、聚合物和其它基質。用例如磷酸緩沖鹽水(PBS)漂洗處理的表面，以去除無生物素的分子，并分離含生物素的復合物。在某些情況下，這些材料可能是生物分子感應裝置(例如光學纖維、化學敏感場效應管(chemfet)和胞質基因檢測器)的一部分。
親和分子的另一個實例是丹磺酰賴氨酸。與丹磺酰環相互作用的抗體有市售(Sigma Chemical；St.Louis，MO)，或者可使用如AntibodiesA Laboratory Manual，Harlow and Lane，1988中描述的已知方法制備。例如，將抗丹磺酰基抗體固定在色譜柱填料上。該親和柱層析法實現分離的原因是由于突變水解酶和本發明底物的復合物與固定化抗體相互作用，所以其保留在柱上，而其它分子經過柱。然后，通過破壞抗體-抗原相互作用釋放復合物。具體的層析柱填料如離子交換或親和Sepharose、Sephacryl、Sephadex和其它層析樹脂有市售(Sigma Chemical；St.Louis，MO；Pharmacia Biotech；Piscataway，N.J.)。丹磺酰賴氨酸由于其熒光特性而可以方便地檢測。
當使用抗體作為接受分子時，可通過其它生化分離方法進行分離，例如免疫沉淀和將抗體固定在濾膜或其它表面上，如珠、平板或樹脂。例如，可用親和分子特異性抗體或水解酶特異性抗體包被的磁珠分離突變水解酶和本發明底物的復合物。可使用磁場反復地將珠由混合物中分離出來。
另一類功能分子包括使用電磁輻射可檢測的分子，包括但不限于呫噸熒光團、丹磺酰基熒光團、香豆素和香豆素衍生物、熒光吖啶鎓部分、基于苯并芘的熒光團以及7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑和3-N-(7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑-4-基)-2，3-二氨基-丙酸。所述熒光分子優選在不同于天然氨基酸的波長上具有高量子產率熒光，更優選具有可在光譜的可見光部分或UV和可見光兩個部分中激發的高量子產率熒光。在預先選擇的波長發射時，所述分子于低濃度即可目測或者使用常規的熒光檢測法進行檢測。可在飛摩爾或以下范圍檢測電化學發光分子，如釕螯合物及其衍生物，或氮氧氨基酸(nitroxide aminoacid)及其衍生物。
除了熒光分子以外，可使用各種物理特性基于分子與電磁場和輻射的相互作用和反應的分子檢測突變水解酶和本發明底物的復合物。這些特性包括在電磁譜的UV、可見以及紅外區域有吸收、存在具Raman活性并可通過共振Raman光譜學進一步增強的發色團、順磁共振活性和核磁共振以及分子量，例如通過質譜測定。
檢測和/或分離具有親和分子的復合物的方法包括層析技術，包括凝膠過濾層析、中低壓(fast-pressure)或高壓液相層析、反相層析、親和層析和離子交換層析。其它的蛋白分離方法也可用于突變水解酶和本發明底物復合物的檢測以及隨后的分離，例如電泳、等電聚焦和質譜。
IV.連接基團術語“連接基團”也用符號‘L’表示，表示將一個或多個官能團共價連接至反應基或含反應基的底物的一個或多個基團。本文使用的連接基團不是單個共價鍵。連接基團的結構不是至關重要的，只要生成底物可結合其靶酶。在一個實施方案中，所述連接基團可為分隔官能團(R)和反應基約5埃至約1000埃(包含5埃和1000埃)長度的二價基團。其它合適的連接基團包括分隔R和反應基約5埃至約100埃的連接基團，以及分隔R和底物約5埃至約50埃、約5埃至約25埃、約5埃至約500埃或約30埃至約100埃的連接基團。
在一個實施方案中，所述連接基團為氨基酸。
在另一個實施方案中，所述連接基團為肽。
在另一個實施方案中，所述連接基團為含約2至約30個碳原子的二價直鏈或支鏈碳鏈，該鏈任選包含一個或多個(例如1、2、3或4個)雙鍵或三鍵，該鏈任選由一個或多個(例如2、3或4個)羥基或氧代(＝O)取代，其中所述鏈上的一個或多個(例如1、2、3或4個)碳原子任選由非過氧化物-O-、-S-或-NH-替換。
在另一個實施方案中，所述連接基團為式-W-F-W-的二價基團，其中F是(C1-C30)烷基、(C2-C30)烯基、(C2-C30)炔基、(C3-C8)環烷基或(C6-C10)芳基，其中W是-N(Q)C(＝O)-、-C(＝O)N(Q)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(Q)-、-C(＝O)-或直接鍵；其中每個Q都獨立地為H或(C1-C6)烷基。
在另一個實施方案中，所述連接基團為含約2至約30個碳原子的二價直鏈或支鏈碳鏈，該鏈任選包含一個或多個(例如1、2、3或4個)雙鍵或三鍵，該鏈任選由一個或多個(例如2、3或4個)羥基或氧代(＝O)取代。
在另一個實施方案中，所述連接基團為含約2至約30個碳原子的二價直鏈或支鏈碳鏈，該鏈任選包含一個或多個(例如1、2、3或4個)雙鍵或三鍵。
在另一個實施方案中，所述連接基團為含約2至約30個碳原子的二價直鏈或支鏈碳鏈。
在另一個實施方案中，所述連接基團為含約2至約20個碳原子的二價直鏈或支鏈碳鏈，該鏈任選包含一個或多個(例如1、2、3或4個)雙鍵或三鍵，并且該鏈任選由一個或多個(例如2、3或4個)羥基或氧代(＝O)取代。
在另一個實施方案中，所述連接基團為含約2至約20個碳原子的二價直鏈或支鏈碳鏈，該鏈任選包含一個或多個(例如1、2、3或4個)雙鍵或三鍵。
在另一個實施方案中，所述連接基團為含約2至約20個碳原子的二價直鏈或支鏈碳鏈。
在另一個實施方案中，所述連接基團為-(CH2CH2O)-1-10。
在另一個實施方案中，所述連接基團為-C(＝O)NH(CH2)3-、-C(＝O)NH(CH2)5C(＝O)NH(CH2)-、-CH2OC(＝O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)-、-C(＝O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3-、-CH2OC(＝O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3-、-(CH2)4C(＝O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3-、-C(＝O)NH(CH2)5C(＝O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3-；具體地說，(C1-C30)烷基可以是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、戊基、3-戊基、己基、庚基、辛基、壬基或癸基；(C3-C8)環烷基可以是環丙基、環丁基、環戊基或環己基；(C2-C30)烯基可以是乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基或癸烯基；(C2-C30)炔基可以是乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基或癸炔基；而(C6-C30)芳基可以是苯基、茚基或萘基。
術語“氨基酸”當用于指連接基團時，包含D或L型天然氨基酸(例如Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Hyl、Hyp、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)，以及非天然氨基酸(例如磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸、磷酸酪氨酸、羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、馬尿酸、八氫吲哚-2-甲酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸(statine)、1，2，3，4-四氫異喹啉-3-甲酸、青霉胺、鳥氨酸、瓜氨酸、α-甲基-丙氨酸、對苯甲酰苯丙氨酸、苯基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、肌氨酸和四丁基甘氨酸)。該術語還包括攜帶常規氨基保護基(例如乙酰基或芐氧基羰基)的天然和非天然氨基酸，以及在羧基末端保護(例如為(C1-C6)烷基、苯基或芐基酯或酰胺)的天然和非天然氨基酸。其它合適的氨基和羧基保護基是本領域技術人員已知的(參見例如Greene，Protecting Groups In Organic Synthesis；WileyNew York，1981以及其中引用的參考文獻)。氨基酸可通過羧基末端、氨基末端或任何其它方便的連接點(例如通過半胱氨酸的硫)連接至另一個分子。
術語“肽”當用于指連接基團時，描述的是2-25個氨基酸(例如以上定義的氨基酸)或肽基殘基的序列。所述序列可為線性或環狀。例如，可制備環狀肽，或者可由序列中兩個半胱氨酸形成二硫鍵獲得環狀肽。肽可通過羧基末端、氨基末端或任何其它方便的連接點(例如通過半胱氨酸的硫)連接至另一個分子。肽優選含有3-25或5-21個氨基酸。可根據美國專利號4,612,302、4,853,371和4,684,620的公開內容制備肽衍生物。對于本文具體提出的肽序列，氨基末端寫在左側，而羧基末端寫在右側。
在一個實施方案中，本發明的脫鹵素酶底物具有式(I)的連接基團R-連接基團-A-X (I)其中，R是一個或多個官能團(例如熒光團、生物素、發光團，或熒光或發光分子，或者是固相支持體，包括微球、膜、玻璃珠等)，其中所述連接基團是含C、N、S或O的多原子直鏈或支鏈，其中A-X是脫鹵素酶底物，其中X是鹵素。在一個實施方案中，A-X是脫鹵素酶的鹵代脂肪族底物或鹵代芳香族底物。在一個實施方案中，所述連接基團是含約12至約30個碳原子的二價直鏈或支鏈碳鏈，該鏈任選包含一個或多個(例如1、2、3或4個)雙鍵或三鍵，并且該鏈任選由一個或多個(例如2、3或4個)羥基或氧代(＝O)取代，其中所述鏈上的一個或多個(例如1、2、3或4個)碳原子任選由非過氧化物-O-、-S-或-NH-替換。在一個實施方案中，A是CH2CH2或CH2CH2CH2。在一個實施方案中，脫鹵素酶如紫紅紅球菌(Rhodococcus)脫鹵素酶底物中的連接基團是含C、N、S或O的多原子直鏈或支鏈，當官能團R含芳環體系或是固相支持體時，優選連接基團含11-30個原子。
在另一個實施方案中，本發明的脫鹵素酶底物具有式(II)的連接基團R-連接基團-CH2-CH2-CH2-X (II)其中X是鹵素，優選為氯。在一個實施方案中，R是一個或多個官能團，例如熒光團、生物素、發光團，或熒光或發光分子，或者是固相支持體，包括微球、膜、玻璃珠等。當R為放射性標記物或可檢測小原子如光譜活性同位素時，所述連接基團可為0-30個原子。
V.示例性底物的合成[2-(2-羥基-乙氧基)-乙基]-氨基甲酸蒽-9-基甲酯。
向9-蒽甲醇(10g，48mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(13.6g，67.5mmol)的200ml CH2Cl2攪拌淤漿中加入三乙胺(6.7ml，0.19mol)。于室溫攪拌獲得的金色溶液16小時。此時加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇(14.4ml，0.144mol)，再繼續攪拌24小時。然后用2％氫氧化鈉(重量)溶液清洗CH2Cl2反應混合物，直至在有機層觀測不到對硝基苯酚。用硫酸鈉干燥二氯甲烷，過濾，減壓蒸發。
用硅膠60通過柱層析進一步純化粗產物，用含1％-3％甲醇的二氯甲烷溶液漸進梯度洗脫。分離出7.6g(58％收率)黃色固體1H NMR(CDCl3)δ8.38(s，H-10)，8.28(d，H-1，8)，7.94(d，H-4，5)，7.44(m，H-2，3，6，7)，6.06(s，CH2-anth)，5.47(t，可交換，NH)，3.53(bs，CH2-OH)3.33(m，3-CH2-)。質譜m/e C20H22NO4+理論值340.15。實測值340.23。C20H21NNaO4+理論值340.15。實測值340.23。
式III的化合物{2-[2-(6-氯-己氧基)-乙氧基]-乙基}-氨基甲酸蒽-9-基甲酯。
在惰性氣氛下，向100ml圓底燒瓶中裝入[2-(2-羥基-乙氧基)-乙基]-氨基甲酸蒽-9-基甲酯(1.12g，3mmol)和新鮮氫化鈉的60％礦物油分散液(360mg，9mmol)。加入20ml無水THF，攪拌反應物30分鐘。然后通過冰/NaCl浴將燒瓶冷卻至-10至-20℃。達到溫度時通過注射器加入1-氯-6-碘己烷(1ml，6mmol)。將反應物保持在冰/NaCl溫度2小時，然后緩慢溫至室溫過夜。此時將硅膠60共吸附到反應混合物上，減壓去除溶劑。首先用庚烷作為洗脫劑，接著用10％、20％和25％乙酸乙酯，開始硅膠層析。由合適級分中分離出總共0.57g產物(41％收率)1H NMR(CDCl3)δ8.48(s，H-10)，8.38(d，H-1，8)，8.01(d，H-4，5)，7.52(dt，H-2，3，6，7)，6.13(s，CH2-anth)，5.29(bs，可交換，NH)，3.74(m，4H)，3.55-3.15(m，8H)，1.84(m，4H)，1.61(m，1H)，1.43(m，1H)，1.25(m，2H)。質譜m/e C26H32ClNO4·H2O理論值475.21(100％)、476.22(29.6％)。實測值475.21、476.52。
式IV的化合物三氟乙酸2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基-銨。
將{2-[2-(6-氯-己氧基)-乙氧基]-乙基}-氨基甲酸蒽-9-基甲酯(0.56g，1.2mmol)溶解在4ml二氯甲烷中，向其中加入2滴苯甲醚。用冰/NaCl浴冷卻反應混合物。10分鐘后加入三氟乙酸(2ml)。一加入反應混合物就轉為黑褐色，對其攪拌30分鐘。在減壓下去除所有揮發物。殘余物再溶解在CH2Cl2中，用水清洗兩次。冷凍水性組分，并過夜凍干。保留油性殘余物，并溶解在無水DMF中，在下一步反應中用作母液。質譜m/e C10H23ClNO2+理論值224.14(100％)、226.14(32％)。實測值224.2、226.2。
式V的化合物報告基團綴合2-[2-(6-氯-己氧基)-乙氧基]-乙胺的一般方法學。
向1當量報告基團琥珀酰亞胺酯的DMF溶液中加入3當量三氟乙酸2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基-銨母液，接著加入二異丙基乙胺。于室溫攪拌反應物8-16小時。以制備規模HPLC或硅膠層析完成純化。
N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-熒光素-5-酰胺。
使用以上方法學制備標題化合物。用制備規模HPLC完成純化。質譜m/e C31H31ClNO8-理論值580.17(100％)、581.18(32％)。實測值580.18、581.31。
式VI的化合物N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-生物素-酰胺。
使用以上方法學制備標題化合物。用硅膠層析完成純化(2％-5％甲醇的二氯甲烷溶液)。質譜m/e C20H37ClN3O4S+理論值450.22(100％)、452.22(32％)。實測值449.95、451.89。
式VII的化合物N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-四甲基羅丹明-5-(和-6)-酰胺。
使用以上方法學制備標題化合物。用制備規模HPLC完成純化。實現了對結構異構體的分離。質譜m/e C35H43ClN3O6+理論值636.28(100％)、637.29(39.8％)、638.28(32.4％)。實測值636.14、637.15、638.14。
式VIII的化合物 式IX的化合物N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-羅丹明R110-5-(和-6)-酰胺。
使用以上方法學制備標題化合物。用制備規模HPLC完成純化。實現了結構異構體的分離。質譜m/e C31H35ClN3O6+理論值580.2(100％)、581.2(35.6％)、582.2(32.4％)。實測值580.4、581.4、582.2。
式X的化合物 式XI的化合物
6-({4-[4，4二氟-5-(噻吩-2-基)-4-硼雜-3a-4a-二氮雜-s-引達省-3-基]-苯氧基}-乙酰氨基)-己酸{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-酰胺。
使用以上方法學制備標題化合物。用硅膠層析完成純化(3％-5％甲醇的二氯甲烷溶液)。質譜m/e C37H47BClF2N4O5S+理論值743.3(100％)。實測值743.4。
式XII的化合物6-({4-[4，4二氟-5-(噻吩-2-基)-4-硼雜-3a-4a-二氮雜-s-引達省-3-基]-苯乙烯基氧基}-乙酰氨基)-己酸{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-酰胺。
使用以上方法學制備標題化合物。用硅膠層析完成純化(3％甲醇的二氯甲烷溶液)。質譜m/e C39H48BClF2N4NaO5S+理論值791.3(100％)。實測值791.3。
式XIII的化合物三乙銨3-[5-[2-(4-叔丁基-7-二乙基氨基-色烯-2-亞基)-亞乙基]-3-(5-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基氨甲酰基}-戊基-2，4，6-三氧代-四氫-嘧啶-1-基}-丙烷-1-磺酸陰離子。
使用以上方法學制備標題化合物。用制備規模HPLC完成純化。質譜m/e C42H62ClN4O10S-理論值849.4(100％)、850.4(48.8％)、851.4(36.4％)。實測值849.6、850.5、851.5。
式XIV的化合物2-叔丁基-4-{3-[1-(5-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基氨甲酰基}-戊基)-3，3-二甲基-5-磺酸根-1，3-二氫-吲哚-2-亞基]-丙基}-7-二乙基氨基-色烯鎓氯。
使用以上方法學制備標題化合物。用制備規模HPLC完成純化。質譜m/e C46H67ClN3O7S-理論值840.4(100％)、841.4(54.4％)。實測值840.5、841.5。
式XV的化合物
N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-3-{4-[5-(4-二甲基氨基-苯基)-噁唑-2-基]-苯磺酰基氨基}-丙酰胺。
使用以上方法學制備標題化合物。用制備規模HPLC完成純化。質譜m/e C30H40ClN4O6S-理論值619.2(100％)、620.2(35％)。實測值619.5、620.7。
式XVI的化合物N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-9′-氯半萘并熒光素-5-(和-6)-酰胺。
使用以上方法學制備標題化合物。用制備規模HPLC完成純化。實現了結構異構體的分離。質譜m/e C35H34Cl2NO8+理論值666.17(100％)、668.16(64％)、667.17(39.8％)。實測值666.46、668.44、667.51。
式XVII的化合物 式XVIII的化合物
N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-半萘并二甲基羅丹明-5-(和-6)-酰胺。
使用以上方法學制備標題化合物。用制備規模HPLC完成純化。質譜m/e C37H38ClN2O7-理論值657.24(100％)、658.24(42％)、659.23(32％)。實測值657.46、658.47、659.45。
式XIX的化合物 式XX的化合物6-(3′，6′-二新戊酰熒光素-5-(和6-)-酰胺基)己酸{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-酰胺。
向含6-(3′，6′-二新戊酰熒光素-5-(和6-)-酰胺基)己酸琥珀酰亞胺酯(0.195g，0.26mmol)的100ml圓底燒瓶中加入2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙胺(約0.44mmol)的25ml Et2O溶液，接著加入2ml吡啶。將反應混合物攪拌過夜。減壓蒸發后，將殘余物上硅膠60柱層析，使用2％-5％甲醇的二氯甲烷溶液作為洗脫劑漸進梯度洗脫。收集合適的級分，真空干燥(0.186g，0.216mmol，84％收率)。質譜m/eC47H60ClN2O11+理論值863.39(100％)、864.39(54.4％)、865.39(34.6％)。實測值862.94、864.07、864.94。
式XXI的化合物 式XXII的化合物6-(熒光素-5-(和6-)-酰胺基)己酸{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-酰胺。
將6-(3′，6′-二新戊酰熒光素-5-(和6-)-酰胺基)己酸{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-酰胺(0.186g，0.216mmol)溶解在5ml甲醇中，并加入0.5ml 2M碳酸鈉(水溶液)。反應混合物攪拌16小時，然后過濾。使用制備規模HPLC完成純化。實現了結構異構體的分離。質譜m/e C37H44ClN2O9+理論值695.27(100.0％)、696.28(42.2％)、697.27(32.3％)。實測值 式XXIII的化合物 式XXIV的化合物{2-[2-(4-氯丁氧基)-乙氧基]-乙基}-氨基甲酸蒽-9-基甲酯。
在惰性氣氛下，用50ml圓底燒瓶盛裝[2-(2-羥基乙氧基)-乙基]-氨基甲酸蒽-9-基甲酯(0.25g，0.74mmol)和新鮮氫化鈉的60％礦物油分散液(150mg，3.75mmol)。加入10ml無水THF，攪拌反應物5分鐘。此時用注射器加入1-氯-4-碘丁烷(180μl，1.5mmol)。將反應物于室溫攪拌24小時。此時將硅膠60共吸附到反應混合物上，減壓去除溶劑。首先用庚烷作為洗脫劑，接著用10％、20％和30％乙酸乙酯，開始硅膠柱層析。由合適級分中分離出總共0.1g產物(32％收率)1H NMR(CDCl3)δ8.50(s，H-10)，8.40(d，H-1，8)，8.03(d，H-4，5)，7.53(dt，H-2，3，6，7)，6.15(s，CH2-anth)，5.19(m，可交換，NH)，3.93-3.32(m，12H)1.69-1.25(m，4H)。質譜m/e C24H28ClNO4·H2O理論值447.18(100.0％)、448.18(27.1％)。實測值447.17、448.41。
式XXV的化合物2-(2-{2-[2-(2-氯乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基)-異吲哚-1，3-二酮。
用Nielsen，J.和Janda，K.D.(MethodsA Companion to Methods inEnzymology 6，361-371(1994))的方法制備2-(2-{2-[2-(2-羥基乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基)-異吲哚-1，3-二酮。向配有回流冷凝器的25ml圓底燒瓶中加入該試劑，并加入約3mmol P/g(0.67g，2mmol)聚苯乙烯載的三苯基膦和6ml四氯化碳。用氬氣對反應體系鼓泡，然后加熱回流2小時。冷卻時，再加入聚苯乙烯載的三苯基膦(0.1g，0.3mmol)，反應物再回流1小時。過濾冷卻的溶液，再用四氯化碳清洗樹脂。蒸發溶劑，獲得0.4g(75.5％收率)的純標題化合物1H NMR(CDCl3)δ7.82(dd，2H)，7.69(dd，2H)，3.88(t，2H)，3.71(q，4H)，3.63-3.56(m，12H)。質譜m/e C16H21ClNO5+理論值342.11(100.0％)、344.11(32.0％)。實測值341.65、343.64。
式XXVI的化合物2-[2-(2-{2-[2-(2-氯乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙基]-異吲哚-1，3-二酮。
按照前述實例制備標題化合物，收率89％1H NMR(CDCl3)δ7.77(dd，2H)，δ7.64(dd，2H)，3.83(t，2H)，3.67(m，4H)，3.60-3.52(m，14H)。質譜m/e C18H25ClNO6+理論值386.14(100.0％)、388.13(32.0％)。實測值385.88、387.83。
式XXVII的化合物2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氯乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-異吲哚-1，3-二酮。
按照2-(2-{2-[2-(2-氯-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基)-異吲哚-1，3-二酮的合成制備標題化合物，收率92％1H NMR(CDCl3)δ7.84(dd，2H)，7.71(dd，2H)，3.90(t，2H)，3.74(q，4H)，3.67-3.58(m，18H)。質譜m/e C20H29ClNO7+理論值430.16(100.0％)。實測值429.85。
式XXVIII的化合物
VI.典型應用方法本發明提供監測細胞中分子表達、定位和/或運輸以及監測細胞內微環境變化的方法。在一個實施方案中，使用突變水解酶和對應的含官能團底物標記細胞(例如生物體或細胞培養物中的細胞)或細胞組分。例如，使細胞與突變水解酶編碼載體，如編碼突變水解酶和核定位信號融合體的載體接觸。所述載體在細胞中的表達可為瞬時表達或穩定表達。然后所述細胞與突變水解酶識別的本發明底物接觸。或者，細胞與載體和底物同時接觸。然后檢測或測定底物官能團在細胞、其裂解物或其亞細胞級分中的存在和定位。
本發明底物優選可溶于水性或大體水性的溶液，包括水和pH約大于或等于6的水性溶液。但是，本發明底物的母液在稀釋入水溶液或緩沖液之前可溶解在有機溶劑中。優選的有機溶劑為非質子極性有機溶劑，例如DMSO、DMF、N-甲基吡咯烷酮、丙酮、乙腈、二噁烷、四氫呋喃和其它可與水完全混溶的非羥基溶劑。一般來說，本發明底物的使用量是在合理時間內，在最小背景或非所需標記的情況下，檢測含突變水解酶或其融合體的樣品中官能團存在所需的最小量。所使用的本發明底物和對應突變水解酶的確切濃度取決于實驗條件和需要的結果。本發明底物的濃度通常在納摩爾至微摩爾的范圍內。通過底物的系統變化測定本發明底物和對應突變水解酶所需要的濃度，直至實現令人滿意的標記。根據本領域已知方法容意測定起始范圍。
在一個實施方案中，使用含光學特性官能團的底物和突變水解酶標記樣品。所述底物與含突變水解酶的目的樣品混合一段時間，使突變水解酶足以結合底物，此后樣品用選擇用于激發官能團光學反應的波長的光照射。任選清洗樣品，以去除殘余、過量或未結合的底物。在一個實施方案中，通過進一步與標準品或預期反應比較光學反應，使用所述標記測定樣品的具體特征。例如，使用突變水解酶結合底物監測樣品具體組分在樣品中的空間和時間分布。或者，使用突變水解酶結合底物檢測或測定某些分子存在或量。在另一個實施方案中，使用突變水解酶結合底物分析樣品中特異性響應官能團的分子的存在。
可檢測的光學反應是指測試系統中通過直接觀察或借助儀器能夠感知的參數變化或出現。這種可檢測反應包括顏色、熒光、反射率、化學發光、光偏振、光散射、X-射線散射的變化或出現。可檢測的反應通常是熒光變化，例如熒光強度、激發或散射波長分布、熒光壽命、熒光極性或其組合的變化。可檢測的光學反應可發生在含突變水解酶或其融合體的樣品的所有部分，或者發生在含突變水解酶或其融合體的樣品的局部部分。與標準反應或預期反應對比光學反應程度，運用該對比測定含突變水解酶或其融合體的樣品是否具有已知特征以及達到何種程度。
在另一個實施方案中，官能團是接受分子的配體。通常，底物包含的官能團是特異性結合對的一員(配體)，互補成員(接受體)固定在固體或半固體表面上，例如聚合物、聚合膜或聚合顆粒(例如聚合珠)。代表性的特異性結合對包括生物素和抗生物素蛋白(或鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素)、IgG和A蛋白或G蛋白、藥物和藥物受體、毒素和毒素受體、糖和凝集素或糖受體、肽和肽受體、蛋白和蛋白受體、酶底物和酶、有義DNA或RNA和反義(互補)DNA或RNA、激素和激素受體，以及離子和螯合劑。存在天然受體的配體包括天然和合成蛋白，包括抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白、抗體、酶和激素；核苷酸和天然或合成寡核苷酸，包括RNA以及單鏈和雙鏈DNA的引物；脂質；多糖和糖；以及各種藥物，包括治療性藥物及濫用藥物和殺蟲劑。當官能團為鈣、鈉、鎂、鉀或其它生物學重要的金屬離子的螯合劑時，含這種官能團的底物起離子指示劑作用。或者，這種底物可起pH指示劑作用。離子指示劑的可檢測光學反應是熒光變化。
含突變水解酶或其融合體的樣品通常以被動方法標記，即與底物溫育。但是，任何將底物引入到含突變水解酶或其融合體的樣品中的方法，例如將底物微注射入細胞或細胞器中，都可用于將底物引入到含突變水解酶或其融合體的樣品中。本發明底物在使用濃度中一般來說對活細胞或其它生物組分無毒。
含突變水解酶或其融合體的樣品在與本發明底物接觸后可立即觀測。含突變水解酶或其融合體的樣品在標記過程中任選與其它溶液混合，包括清洗溶液、透化和/或固定化溶液以及其它含另外的檢測試劑的溶液。在與底物接觸后進行清洗一般可改善對光學反應的檢測，因為在清洗后非特異性本底下降。使用低標記濃度而不清洗有可能獲得令人滿意的影像。許多固定劑和固定化條件是本領域已知的，包括甲醛、多聚甲醛、福爾馬林、戊二醛、冷甲醇和3∶1的甲醇乙酸。固定化通常用于保存細胞形態學，并在使用病原樣品的工作中降低生物危害。所選實施方案的底物完好地保留在細胞中。按照本領域周知的方法，固定化任選在透化之后或和透化一起，所述透化例如用丙酮、乙醇、DMSO或其它變性劑，以使大量本發明底物穿越細胞膜。底物的使用任選與其它檢測試劑的使用組合，所述其它檢測試劑由于在含突變水解酶或其融合體的樣品中存在特定細胞組分、胞內物質或細胞環境而產生可檢測反應。在所述其它檢測試劑和底物的光譜特性不同時，有可能應用多色性。
在與含光學特性官能團的底物接觸之后或過程中的任何時間，用產生可檢測光學反應的波長的光照射含突變水解酶或其融合體的樣品，并用檢測光學反應的方法觀測。盡管某些底物可使用環境光以比色法檢測，但其它底物通過母體熒光團的熒光特性檢測。在用例如紫外或可見波長發射燈、弧光燈、激光乃至日光或普通室內光照射時，包括結合互補性特異性結合對成員的底物在內的底物，表現出強烈的可見吸收以及熒光發射。選擇用于照射本發明底物的設備包括但不限于手持式紫外燈、汞弧光燈、氙燈、氬激光器、激光器二極管和YAG激光器。這些發光源任選整合到激光掃描器、熒光微量培養板讀數器、標準或小型熒光計或色譜檢測器中。任選通過目測、或應用任一種以下設備CCD照相機、攝影機、感光膠片、激光掃描儀、熒光計、光電二極管、量子計數器、落射熒光顯微鏡、掃描顯微鏡、流式細胞器、熒光微量培養板讀數器、或通過放大信號如光電倍增管，檢測該比色吸收或熒光發射。在使用流式細胞器、熒光顯微鏡或熒光計檢測含突變水解酶或其融合體的樣品時，這些設備任選用于辨別和區分含官能團(為熒光團)的底物和具有可檢測的不同光學特征的第二熒光團，通常通過辨別底物和第二熒光團的熒光反應。在使用流式細胞器檢測含突變水解酶或其融合體的樣品時，含突變水解酶或其融合體的樣品的檢測任選包括使用分選儀，根據底物熒光反應分離含突變水解酶或其融合體的樣品中的顆粒。
在一個實施方案中，可使用本發明突變水解酶的融合體監測胞內移動。例如，β-抑制蛋白是G蛋白偶聯受體的調節劑，其激活時由胞質向細胞膜移動。含突變水解酶和β-抑制蛋白融合體的細胞和本發明底物使得可以檢測β-抑制蛋白由胞質向細胞膜的移動，因為其與活化的G蛋白偶聯受體相關。
在另一個實施方案中，FRET可與突變水解酶和熒光蛋白(例如GFP)的融合體一起使用，或與結合熒光分子的蛋白(例如O-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶(AGT))的融合體(Keppler等，2003)一起使用。或者，可使用突變水解酶和目標蛋白的融合體以及熒光蛋白和推測與目標蛋白相互作用的分子的第二種融合體研究目標蛋白與所述分子的相互作用，例如使用FRET。一種細胞可包含突變水解酶和目標蛋白的融合體，而另一種細胞可包含熒光蛋白和推測與目標蛋白相互作用的分子的第二種融合體。具有這兩種細胞的群體可與底物和物質(例如藥物)接觸，此后監測細胞，以檢測物質給予對兩個群的影響。
在再另一個實施方案中，突變水解酶與熒光蛋白融合。因此可通過檢測熒光蛋白或通過將細胞與本發明底物接觸并檢測底物中的官能團，檢測細胞中的融合蛋白。熒光蛋白的檢測可在官能團檢測之前進行。或者，官能團的檢測可在熒光蛋白檢測之前進行。而且，這些細胞可與其它底物接觸，例如具有不同官能團的底物，并檢測細胞中的不同官能團，所述官能團共價連接至第一種底物先前未結合的突變水解酶。
在再另一個實施方案中，可使用突變水解酶和轉錄因子的融合體監測轉錄激活途徑的激活。例如，突變水解酶與以失活形式存在于胞質中但激活時可轉運至細胞核的轉錄因子(例如NFκβ)融合，可監測轉錄激活途徑。
在另一個實施方案中，使用生物素作為底物中的官能團，融合體包含融合至推測與細胞中另一種分子(例如蛋白)相互作用的目標蛋白的突變水解酶。使用這種反應物使得可以捕獲與細胞中融合至突變水解酶的蛋白相互作用的其它分子，由此鑒定和/或捕獲(分離)相互作用分子。
在一個實施方案中，突變水解酶融合至分泌性蛋白。使用該融合體和本發明底物可檢測和/或監測所述分泌性蛋白。同樣，當突變水解酶融合至在不同囊泡腔之間轉運的膜蛋白時，在底物存在的情況下，可檢測這些腔體中的蛋白加工。在再另一個實施方案中，當突變水解酶融合至離子通道或轉運蛋白或緊密結合通道或轉運蛋白的蛋白時，在含離子敏感型熒光團的本發明底物存在的情況下，可監測離子穿越細胞膜或細胞器膜的移動。同樣，當突變水解酶融合至與囊泡或細胞骨架結合的蛋白時，在底物存在的情況下，可容易地檢測蛋白或囊泡沿著細胞骨架結構的轉運。
在另一個實施方案中，所述官能團為藥物或毒素。通過組合具有所述官能團的底物和突變水解酶與靶向分子(如抗體，例如結合具體腫瘤細胞相關抗原的抗體)的融合體，可將藥物或毒素靶向細胞或動物中。或者，所述官能團可以為熒光團，當其存在于底物中并與突變水解酶和靶向分子(如單鏈抗體)的融合體混合時，標記靶向分子，例如用于體外應用如ELISA的標記抗體。
在再另一個實施方案中，細胞表面上的突變水解酶與細胞表面上表達的蛋白融合，當其與本發明底物(例如含熒光團的底物)混合時，可使用其監測體內或體外的細胞遷移(例如癌細胞遷移)。在一個實施方案中，本發明底物對細胞膜的透過性低甚至沒有。或者，可使用這種體系監測不同物質(例如藥物)對不同細胞群的作用。在再另一個實施方案中，突變水解酶融合至HERG通道。在含K+敏感型熒光團的本發明底物存在時，可使用表達這種融合體的細胞監測HERG通道活性，例如監測藥物毒性。
在另一個實施方案中，本發明底物包含用于監測細胞或生物體中疏水區的官能團，例如Nile Red。
因此，所述突變水解酶和本發明底物可用于各種測定，例如噬菌體展示、淘選、ELISA、蛋白質印跡、熒光計微量測定技術(FMAT)以及細胞和亞細胞染色。
本發明將通過以下的非限制性實施例進一步描述。
實施例I一般方法學除非另有說明，否則本文使用的所有技術和科技術語都和分子生物學以及細胞信號轉導和建模領域一般技術人員通常理解的含義相同。一般來說，本文使用的術語和下述光譜學、藥物開發、細胞培養、分子遺傳、塑料生產、聚合物化學、診斷學、氨基酸和核酸化學以及烷烴化學中的步驟在本領域眾所周知并經常使用。標準技術通常用于塑料制備、信號檢測、重組核酸方法、多核苷酸合成以及微生物培養和轉化(例如電穿孔、脂轉染)。
所述技術和步驟一般按照本領域的常規方法和各種一般參考文獻(一般參見Sambrook等，Molecular CloningA laboratory manual，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，和用于熒光技術的Lakowicz，J.R.Principles of FluorescenceSpectroscopy，New YorkPlenum Press(1983)，這些文獻通過引用結合到本文中)以及本文中提供的參考文獻進行。標準技術用于化學合成、化學分析和生物測定。
材料所有的寡核苷酸都由Promega公司(Madison，WI)或衣阿華大學DNA實驗室(Iowa City，Iowa)合成、純化和測序。限制酶和DNA修飾酶得自Promega公司(Madison，WI)、New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)或Stratagene Cloning Systems(La Jolla，CA)，并按照生產商的方法使用。感受態大腸桿菌JM109由Promega公司提供，或購自Stratagene Cloning Systems。使用Qiagen Plasmid Mini Kit(QiagenInc.，Chatsworth，CA)進行小規模的質粒DNA分離。用購自StratageneCloning Systems的預試驗試劑盒進行DNA連接。用購自Qiagen Inc的QIAquick凝膠提取試劑盒或QIAquick PCR純化試劑盒純化DNA片段。
用于產生DhaA突變體及其融合體的載體如下pET21(Invitrogen，Carlsbad，CA)、pRL-null(Promega，Madison，WI)、pGEX-5x-3(Amersham Biosciences；Piscataway，NJ)以及EGFP和DsRED2(都得自CLONTECH，Palo Alto，CA)。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠和相關的緩沖液和染色劑，以及電印跡轉移緩沖液，都得自BioWhittaker Molecular Applications(Rockland，ME)。蛋白分子量標準品購自Invitrogen。
Anti FlagR單克隆抗體抗體(抗FLAGRM2單克隆抗體(小鼠)(F3165))、Anti FlagRM2 HRP綴合物和Anti FlagRM2 FITC綴合物(分別為A8592和F4049)來自Sigma-Aldrich。單克隆抗-海腎熒光素酶抗體(MAB4410)來自Chemicon(Temecula，CA)。HRP-綴合的山羊抗-小鼠IgG和HRP-綴合的鏈霉抗生物素蛋白(分別為W4021和G714)來自Promega公司。
1-Cl-丁烷、1-Cl-己烷、1-Cl-辛烷、1-Cl-癸烷、1-Cl-丁醇、1-Cl-己醇、1-Cl-辛醇和1-Cl-癸醇得自Aldrich或Fluka(USA)。所有的鹽、磷酸二氫鉀、磷酸一氫鉀、咪唑、HEPES、EDTA鈉、硫酸銨和Tris游離堿得自Fisher(Biotech Grade)。
谷胱甘肽Sepharose 4FF、谷胱甘肽、MonoQ和Sephadex G-25預填裝柱得自Amersham Biosciences。
Luria-Broth (“LB”)由Promega公司提供。
方法PCR反應。使用Promega公司提供的標準聚合酶鏈反應緩沖液進行DNA擴增。通常，50μl反應物包含1×濃度的生產商提供的緩沖液、1.5mM MgCl2、125μM dATP、125μM dCTP、125μM dGTP、125μM dTTP、0.10-1.0μM正向和反向引物、5U AmpliTaq_ DNA聚合酶和＜1ng靶DNA。除非另有說明，否則DNA擴增的熱程序是94℃ 0.5分鐘；55℃ 1分鐘以及72℃ 1分鐘，35個循環。
DNA測序。使用雙脫氧末端循環測序法(Sanger等，1977)和Perkin-Elmer 310型DNA測序儀(Foster City，CA)，通過DNA測序驗證所有克隆。
SDS-PAGE。將蛋白溶解在樣品緩沖液(1％SDS、10％甘油和1.0mM β-巰基乙醇，pH 6.8；Promega公司)中，煮沸5分鐘，并在SDS-PAGE(4-20％梯度凝膠；BioWhittaker Molecular Applications)上分離。用考馬斯藍(Promega公司)染色凝膠以進行蛋白質印跡分析，或者用熒光成像儀(Hitachi，Japan)以適于每種待評價熒光團的Eex/Eem分析凝膠。
蛋白質印跡分析。用Xcell II Blot模塊(Invitrogen)，以80mA恒定電流(于4℃)持續2.0小時，在25mM Tris堿/188mM甘氨酸(pH8.3)、20％(體積)甲醇中將蛋白電泳轉移至硝酸纖維素膜(0.2μm，Scheicher & Schuell，Germany)上。用TBST緩沖液(10mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH7.6，含0.05％ Tween20)淋洗所述膜，并于室溫30分鐘或4℃過夜在封閉溶液(3％奶粉或1％BSA的TBST緩沖液)中溫育。然后用50ml TBST緩沖液漂洗膜，并與Anti FlagR單克隆抗體M2(稀釋度1∶5,000)、抗海腎熒光素酶單克隆抗體(稀釋度1∶5,000)或HRP-綴合的鏈霉抗生物素蛋白(稀釋度1∶1,000)于室溫溫育45分鐘。接著用TBST緩沖液(50ml，5分鐘，3次)漂洗膜。然后，將用抗體探測的膜與HRP-綴合的驢抗小鼠IgG溫育(30分鐘，室溫)，接著重復漂洗步驟。用增強的化學發光(ECL)系統(Pharmacia-Amersham)按照生產商的說明顯示蛋白。使用計算機輔助光密度分析法定量蛋白水平。
蛋白濃度。通過Pierce BCA蛋白測定(Pierce，Rockford，IL)的微量滴定方法，使用牛血清白蛋白(BSA)作為標準品，檢測蛋白。
統計分析。以一式四份進行的實驗的平均值+/-S.E.M值表示數據，代表至少3個具有相似結果的獨立實驗。通過t檢驗評價統計顯著性，當p＜0.05時認為顯著。
細菌細胞。含帶有紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)(DhaA)的pET-3a的Dh5α細胞原液由Clifford J.Unkefer博士(Los Alamos國家實驗室，Los Alamos，NM)惠贈(Schindler等，1999；Newman等，1999)。使用Promega公司提供的預混合試劑在LB中培養細菌。使用大腸桿菌BL21(λDE3)pET-3a的冷凍母液(儲存在10％甘油中，-80℃)接種補加氨芐青霉素(50μg/ml)的Luria-Bertani瓊脂平板(Sambrook等，1989)。選擇單一菌落，用其接種兩個10ml含50μg/ml氨芐青霉素的Luria-Bertani培養基。于37℃振蕩(220rpm)培養細胞8小時，此后各使用2ml接種兩個50ml含50μg/ml氨芐青霉素的Luria-Bertani培養基，于37℃過夜振蕩培養。使用各10ml該培養物接種兩個0.5L含氨芐青霉素的Luria-Bertani培養基。當培養物的A600達到0.6時，加入異丙基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷(IPTG)至終濃度為0.5mM，將培養物于30℃再振蕩保持4小時。然后離心收集細胞，用10mM Tris-SO4、1mM EDTA、pH7.5清洗。在裂解細胞之前將細胞沉淀儲存于-70℃。
哺乳動物細胞。用Ham F12營養物和補加10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的Dulbecco改良型極限必須培養基的1∶1混合物，在95％空氣和5％CO2氣氛下于37℃培養CHO-K1細胞(ATCC-CCL61)。
如下所述分離大鼠海馬(E18)初級神經元。簡而言之，分離得自Brewer博士(Southem Illinois University)的在HibernateTME培養基(GIBCO，Invitrogen，Carlsbad，CA)中的胚胎(E18)大鼠海馬碎片，將其接種在聚-D-溶素包被(0.28mg/cm2；Sigma)的玻璃/塑料器皿上，用具有B27添加物的無血清NeurobasalTM培養基(NB27，GIBCO)培養。每2-3天更換全部培養基。
轉染。為研究不同蛋白的瞬時表達，將細胞接種在35mm培養碟或24孔板上。約80-90％鋪滿時，按照生產商(GIBCO)的說明使細胞接觸脂轉染胺試劑/DNA/無抗生素培養基的混合物。第二天，用新鮮培養基更換培養基，使細胞生長不同的時間長度。
熒光。用熒光平板讀數器CytoFluorII(Beckman)，以適于具體熒光團的Eex/Eem(例如TAMRA的Eex/Eem為540/575nm)檢測96孔板中細胞的熒光。
實施例IIDhaA型束縛體系A.野生型和突變DhaA蛋白及其融合體紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)的鹵代烷脫鹵素酶是DhaA基因產物(分子量約33kDa)。該酶裂解脂肪族和芳族鹵化化合物(例如鹵代C3-鹵代C10)中的碳-鹵素鍵。DhaA的催化中心是典型的“催化三聯體”，包含親核殘基、酸性殘基和組氨酸殘基。很可能是底物結合DhaA形成E.S復合物，此后親核攻擊Asp106，形成酯中間體，然后His272活化水解所述中間體的H2O，由催化中心釋放出產物。為測定催化性His272殘基的點突變是否損害酶的酶活性，以便能夠將官能團(FG)共價束縛至該蛋白，制備突變DhaA。
材料和方法為制備突變DhaA載體，使用基于四引物重疊-延伸法的Promega體外誘變試劑盒(Ho等，1989)生產F、A、G或H突變的DhaA。外部引物是寡核苷酸5′-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAG-TCA-3′(SEQ ID NO1)和5′-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGT-AGTCA-3′(SEQ ID NO2)，內部誘變引物如下H272F(5′-CCGGGATTGTTCTACCTCCAGGAAGAC-3′)，SEQ ID NO3)、H272A(5′-CCGGGATTGGCCTACCTCCAGGAAGAC-3′；SEQ ID NO4)、H272G (5′-CCGGGATTGCAGTACCTCCAGGAAGAC-3′；SEQ IDNO5)和H272Q(5′-CCGGGATTGGGCTACCTCCAGGAAGAC-3′；SEQ ID NO6)(突變密碼子加下劃線)。將突變脫鹵素酶基因亞克隆入pET-3a載體。為過表達突變脫鹵素酶，將pET-3a載體轉化入感受態大腸桿菌BL21(DE3)中。通過DNA測序驗證克隆中的DhaA序列。
通過將合適的DhaA編碼區克隆入pGEX5x3載體的SalI/NotI位點，構建GST-DhaA(野生型或H272F/A/G/H突變體)融合表達盒。設計兩種引物(5′-ACGCGTCGACGCCGCCATGTCAGAAATCGGT-ACAGGC-3′和5′-ATAAGAATGCGGCCGCTCAAGCGCTTCAACCG-GTGAGTGCGGGGAGCCAGCGCGC-3′；分別為SEQ ID NO7和8)，以將SalI位點和Kozak共有序列加入到DhaA的5′編碼區，將NotI、EcoR47III和AgeI限制性位點和終止密碼子加入到DhaA的3′編碼區，并由DhaA(野生型或突變型)模板擴增897bp片段。將獲得的片段插入到pGEX5X-3的SalI/NotI位點中，pGEX5X3載體含谷胱甘肽S-轉移酶(GST)基因、Xa因子裂解位點編碼序列和多克隆位點(MCS)，后接終止密碼子。
然后將Flag編碼序列插入到pGEX5X-3載體中的AgeI/EcoR47III限制位點。與6個核苷酸AgeI位點讀框相符的是11個氨基酸肽的序列，其最后的八肽對應于Flag肽(Kodak Imaging Systems，Rochester，NY)。編碼Flag肽(Kodak Imaging Systems，Rochester，NY)的兩種互補寡核苷酸(5′-CCGGTGACTACAAGGACGATGACGACAAGTGAA-GC-3′，有義，SEQ ID NO9，和5′-GCTTCACTTGTCGTCATCGTC-CTTGTAGTCA3′，反義，SEQ ID NO10)退火。退火DNA在5′末端具有AgeI位點，在3′末端具有EcoR47III位點。用AGgeI和EcoR47III消化退火DNA，然后將其亞克隆入GST-DhaA.WT或GST-DhaA.H272F突變體構建物的AgeI和EcoR47III位點。通過DNA測序檢驗所有的基因融合構建物。
為生產GST-DhaA融合蛋白，當培養物600nm光密度達到0.6時加入異丙基-β-D-半乳吡喃糖苷(終濃度為0.5mM)誘導酶表達。將細胞收集在緩沖液A(10mM Tris-SO4、1mM EDTA、1mM β-巰基乙醇和10％甘油，pH7.5)中，并使用Vibra CellTM超聲波儀(Sonics&Materials，Danbury，CT，USA)超聲破碎。以19,800×g離心1小時去除細胞碎片。用GSS-Sepharose 4快速柱(Amersham Biosciences；Piscataway，NJ)按照生產商的說明對粗提物進一步純化。合并含GST-DhaA融合蛋白的洗脫級分，對10mM Tris-SO4緩沖液(含20mMNa2SO4和1mM EDTA-Na2)于4℃過夜透析，并儲存于-20℃，直至使用。為生產DhaA(野生型或突變型)，用Xa因子由融合蛋白上切下GST，用GSS-Sepharose 4(Amersham Biosciences；Piscataway，NJ)按照生產商的說明純化產物。蛋白的均一性通過SDS-PAGE檢驗。在某些實驗中，如Newman等(1999)所述使用45-70％飽和硫酸銨分級分離無細胞提取物。
結果圖3顯示的濃條帶為IPTG誘導產生的GST-DhaA.WT-Flag(泳道1)和GST-DhaA.H272F-Flag(泳道2)融合蛋白。而且，所述蛋白是可溶的，可用GSS-Sepharose 4FF有效純化(泳道5-10，單數泳道對應于GST-DhaA.WT-Flag，而雙數泳道對應于GST-DhaA.H272F-Flag)。用Xa因子處理融合蛋白導致形成兩種蛋白GST和DhaA(野生型或突變型，分別為泳道11和12)，用GSS-Sepharose 4FF有效去除GST(野生型或突變型，分別為泳道13和14)。另外，所有蛋白都具有預計分子量。
B.H272突變對DhaA水解Cl-烷能力的損害酶不能將酶反應產物釋放到周圍介質中是束縛系統必須的。可通過酶水解能力的顯著降低檢測此無能力。
為研究點突變對DhaA(野生型或突變型)水解Cl-烷能力的影響，使用Holloway等(1998)所述的pH-指示劑染料系統。
材料和方法pH-指示劑染料系統的反應緩沖液由1mM HEPES-SO4(pH8.2)、20mM Na2SO4和1mM EDTA組成。加入酚紅至終濃度為25μg/ml。加入鹵化化合物至表觀濃度可確保溶解的底物組分足以滿足脫鹵素反應的最大速度。通過渦旋劇烈混合底物-緩沖溶液30秒，封蓋以防止底物顯著揮發，在1-2小時內使用。在每個動力學測定之前，用標準HCl溶液滴定酚紅，以獲得表觀消除系數。于室溫用BeckmanDu640分光光度計(Beckman Coulter，Fullerton，CA)以558nm測定DhaA的穩態動力學常數。使用計算機程序SigmaPlot由初速度計算動力學常數。1單位酶活性定義為在特定條件下1.0mM底物/分鐘脫鹵素化所需要的量。
結果如圖4所示，使用pH7.0-8.2的0.1mg/ml酶和10mM底物，用4種突變體中的任一種都沒有發現催化活性。在這些條件下，野生型酶對1-Cl-丁烷的活性為5單位/mg蛋白。因此，突變體的活性至少降低700倍。
用濃度遞增的(NH4)2SO4處理得自表達DhaA(野生型或其中一種突變體)的大腸桿菌的等份上清液。使蛋白與各種濃度的(NH4)2SO4接觸2小時(4℃)，離心獲得沉淀，對緩沖液A過夜透析，并用SDS-PAGE分離。
如圖5所示，45-70％的(NH4)2SO4沉淀了大部分的DhaA.WT和DhaA.H272F突變體級分。在低(NH4)2SO4濃度時未觀測到這些蛋白沉淀。相反，DhaA.H272Q、DhaA.H272G和DhaA.H272A突變體可被10％的(NH4)2SO4沉淀。這強有力地表明，DhaA.H272Q、DhaA.H272G和DhaA.H272A突變體的物理化學特性明顯改變。同時，DhaA.H272F突變對這些參數沒有明顯影響。這些數據與突變對DhaA 3-D結構影響的計算機建模結果良好吻合，表明在所測試的全部突變體中，只有DhaA.H272F突變對預測的三維模型沒有顯著影響(參見圖2)。根據這些結果，選擇DhaA.H272F進行下一步的實驗。
為形成共價加合物，Cl-烷的氯原子很可能定位在DhaA(野生型或突變體)的催化氨基酸附近(圖2)。DhaA的晶體結構(Newman等，1999)表明，這些氨基酸位于DhaA催化袋的較深底部(約10_長，橫截面約20_2)。為使含官能團的DhaA底物中的反應基進入DhaA催化袋內部，設計連接基團連接具有官能團的含氯底物，以使官能團位于催化袋外部，即不擾亂/損壞DhaA的3-D結構。
為測定DhaA是否能夠水解長疏水碳鏈的Cl-烷，使DhaA.WT接觸各種Cl-烷醇。如圖6所示，DhaA.WT可水解4-10個碳原子的1-Cl-烷醇。而且，Cl-烷的水解初速度(IRH)與碳鏈長度反相關，盡管長鏈Cl-烷在水性緩沖液中的溶解性差可能影響酶-底物相互作用的效力。實際上，如圖6所示，1-Cl-烷-10-癸醇的IRH遠高于1-Cl-癸烷的IRH。更重要的是，這些數據表明，DhaA可水解含相對極性基團(例如HO-基團)的Cl-烷。
制備具有不同長度和/或疏水性連接基團的FAM修飾Cl-烷(圖7)。如果連接基團為12個或更多個原子長，則DhaA.WT有效水解具有大體積官能團(FAM)的Cl-烷。用任一種測試的Cl-烷都未檢測到DhaA.H272F/A/G/Q突變體的活性(未列出數據)。另外，修飾臨近Cl-原子的(CH2)6區導致DhaA.WT對14個原子連接基團的IRH顯著降低。盡管如此，如果連接基團的長度和結構與水解酶催化位點相匹配，那么在本發明底物中存在的連接基團對反應基本沒有影響。
用自動化HPLC(Hewlett-Packard 1050型)系統分析某些樣品。設置DAD檢測器來記錄200-600nm范圍內的UV-可見光譜。對于FAM-和TAMTA-修飾底物以分別等于480/520nm和540/575nm的Eex/Eem檢測熒光。使用分析型反相C18柱(Adsorbosphere HS，5μ，150×4.6mm；Hewlett-Packard，Clifton，NJ)，在30分鐘內用10mM乙酸銨(pH7.0)∶ACN(乙腈)由25∶75至1∶99(體積)的線性梯度，以1.0ml/分鐘分析Cl-烷或Cl-烷水解產物的乙醇提取物。根據收集峰的積分面積定量分離的化合物。
圖8A顯示了底物和反應產物完全分離。圖8B表明野生型DhaA非常有效地水解FAM-C14H24O4-Cl。使用TAMRA-C14H24O4-Cl或ROX.5-C14H24O4-Cl作為底物時獲得相似的結果(未列出數據)。總之，這些數據證實了基于pH-指示劑染料測定的結果，結果顯示DhaA.H272F突變使DhaA完全失活。
C.官能團與DhaA突變體在體外的共價束縛材料和方法在威斯康星大學生物技術中心使用基質輔助激光解吸/電離飛行時間(MALDI-TOF)質譜儀Bruker Biflex III(Bruker，USA)對蛋白進行MALDI分析。為制備樣品，在有或沒有底物(FAM-C14H24O4-Cl，1.0mM終濃度)時，將100μg純化DhaA(野生型或H272F突變體)或GST-DhaA(野生型或H272F突變體)融合蛋白(純化至約90％均一度)的200μl緩沖液(1mM HEPES-SO4(pH7.4)、20mM Na2SO4和1mM EDTA)于室溫溫育15分鐘。然后將反應混合物對20mM CH3COONH4(pH7.0)于4℃過夜透析，測定蛋白和蛋白底物復合物的M/Z值。
用于制備DhaA.D106突變體的寡核苷酸包括用于DhaA.D106C的寡核苷酸5′-CTTGGGTTTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATCCACTGCTGGGGC-3′(SEQ ID NO13)和5′-TGAGCCCCAGCAGTGGATGACCAGGACGACCTCTTCCAAACC-3′(SEQ ID NO14)；用于DhaA.D106Q的寡核苷酸5′-CTTGGGTTTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATCCACCAGTGGGGC-3′(SEQ ID NO34)和5′-TGAGCCCCACTGGTGGATGACCAGGACGACCTCTTCCAAACC-3′(SEQ IDNO35)；用于DhaA.D106E的寡核苷酸5′-CTTGGGTTTGGAAGA-GGTCGTCCTGGTCATCCACGAATGGGGC-3′(SEQ ID NO52)和5′-TGAGCCCCATTCGTGGATGACCAGGACGACCTCTTCCAAACC-3′(SEQ ID NO53)；以及用于DhaA.D106Y的寡核苷酸5′-CTTGGGTTTGGAAG AGGTCGTCCTGGTCATCCACTACTGGGGC-3′(SEQ ID NO54)和5′-TGAGCCCCAGTAGTGGATGACCAG-GACGACCTCTTCCAAACC-3′(SEQ ID NO55)。退火寡核苷酸在5′末端含StyI位點，在3′末端含BlpI位點。用StyI和BlpI消化退火的寡核苷酸，將其亞克隆入GST-DhaA.WT或GST-DhaA.H272F的StyI和BlpI位點。通過DNA測序檢驗所有突變體。
結果為證實DhaA.H272突變體能夠結合具官能團的Cl-烷，將這些突變體或其GST-融合體以及對應的野生型蛋白或融合體與FAM-C14H24O4-Cl、TAMRA-C14H24O4-Cl、ROX.5-C14H24O4-Cl或生物素-C18H32O4-Cl于室溫下接觸15分鐘。然后用SDS-PAGE分離蛋白。將含蛋白的凝膠與FAM-C14H24O4-Cl、TAMRA-C14H24O4-Cl或ROX.5-C14H24O4-Cl溫育，用熒光成像儀(Hitachi，Japan)以適于各個熒光團的Eex/Eem進行分析。將與生物素-C18H32O4-Cl溫育的含蛋白凝膠轉移至硝酸纖維素膜，用綴合HRP的鏈霉抗生物素蛋白探測。
如圖9所示，TAMRA-C14H24O4-Cl(圖A中的泳道1和2)、FAM-C14H24O4-Cl(圖A中的泳道3和4)和ROX.5-C14H24O4-Cl(圖A中的泳道5和6)結合DhaA.H272F(圖A中的泳道2、4和6)，但不結合DhaA.WT(圖A中的泳道1、3和5)。生物素-C18H34O4-Cl結合DhaA.H272F(圖B中的泳道9-14)，但不結合DhaA.WT(圖B中的泳道1-8)。而且，生物素-C18H34O4-Cl與DhaA.H272F的結合(圖B中的泳道9-14)是劑量依賴性的，可在0.2μM時檢測到。另外，底物和DhaA.H272F之間的鍵非常強，因為用SDS煮沸沒有破壞該鍵。
所有測試的DhaA.H272突變體，即H272F/G/A/Q，都結合TAMRA-C14H24O4-Cl(圖10)。此外，DhaA.H272突變體以高度特異性方式結合底物，因為用其中一種底物(生物素-C18H34O4-Cl)預處理突變體完全封閉了與另一種底物(TAMRA-C14H24O4-Cl)的結合(圖10)。
為測定Cl-烷和DhaA.H272F突變體(或GST-DhaA.H272F突變體融合蛋白)之間鍵的特性，在有和沒有FAM-C14H24O4-Cl時溫育這些蛋白，并用MALDI分析。如圖11所示，DhaA.H272F突變體和FAM-C14H24O4-Cl之間的鍵很強。而且，對E*S復合物的分析表明，底物(例如FAM-C14H24O4-Cl)和DhaA.H272F之間的鍵為共價性質。MALDI-TOF分析也證實，底物/蛋白加合物以1∶1的關系形成。
制備在催化三聯體中的另一個殘基—殘基106突變的DhaA。野生型DhaA的106位殘基為D，D是已知的親核氨基酸殘基之一。用非D親核氨基酸殘基如C、Y和E置換DhaA中殘基106的D，它們可與底物形成的鍵比野生型DhaA和底物形成的鍵更穩定。具體地說，半胱氨酸在基于半胱氨酸的酶中是已知的親核殘基，這些酶已知不活化水。
分析對照突變體DhaA.D106Q、單突變體DhaA.D106C、DhaA.D106Y和DhaA.D106E以及雙突變體DhaA.D106CH272F、DhaA.D106EH272F、DhaA.D106QH272F和DhaA.D106YH272F結合TAMRA-C14H24O4-Cl的情況(圖12)。如圖12所示，TAMRA-C14H24O4-Cl結合DhaA.D106C、DhaA.D106CH272F、DhaA.D106E和DhaA.H272F。因此，TAMRA-C14H24O4-Cl和突變體DhaA殘基106的半胱氨酸或谷氨酸形成的鍵比TAMRA-C14H24O4-Cl和野生型DhaA形成的鍵穩定。單獨或與DhaA中其它殘基置換組合的DhaA106位其它置換可獲得相似的結果。此外，單獨或與DhaA中其它殘基置換組合的DhaA106位某些置換可導致突變DhaA僅與某些底物形成鍵。
實施例III熒光素酶經突變DhaA和本發明底物束縛至固相支持體材料和方法通過將phRLuc編碼區克隆入含豆蔻酸附著肽編碼序列(MAS)的pCIneo載體的NheI/SalI位點，構建phRLuc-連接基團-DhaA.WT-Flag和phRLuc-連接基團-DhaA.H272F-Flag融合表達盒。設計兩種引物(5′-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCA-3′；SEQ ID NO11和5′-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCA-3′；SEQ IDNO12)，以分別將NheI和SalI位點加入到phRLuc的5′和3′編碼區，并由phRLuc模板(pGL3載體，Promega)擴增900bp的片段。然后，用NheI和SalI限制酶切去豆蔻酸附著肽編碼序列，將含phRLuc的擴增片段插入到pCIneo.DhaA.(野生型或H272F)-Flag載體的NheI/SalI限制位點。通過DNA測序檢驗每種構建物的序列。然后使用Promega的TNT_T7Quick系統體外生產融合蛋白。
結果為證明蛋白經DhaA.H272F-Cl-烷橋束縛至固相支持體，制備編碼海腎熒光素酶(hRLuc，融合體的N-末端)、蛋白連接基團(17個氨基酸，參見表I)和DhaA(野生型或H272F突變體)融合蛋白的載體。然后將Flag表位融合至DhaA的C-末端。
表I
SDS-PAGE后蛋白質印跡分析的結果顯示，蛋白具有其預測分子量，被抗-R.Luc和抗FlagRM2抗體識別。另外，所有的融合蛋白都具有海腎熒光素酶活性(用Promega的海腎熒光素酶測定系統在PBS pH7.4緩沖液中測定)。
使用生物素-C18H32O4-Cl作為底物，鏈霉抗生物素蛋白(SA)包被的96孔平板(Pierce，USA)作為固相支持體，顯示蛋白經DhaA.H272F-Cl-烷橋束縛至固相支持體。翻譯蛋白與25μM(終濃度)的生物素-C18H32O4-Cl底物于室溫接觸60分鐘。用Sephadex G-25預填裝柱(Amersham Biosciences)通過凝膠過濾去除未結合的生物素-C18H32O4-Cl。將收集的R.Luc-連接基團-DhaA融合體級分在SA-包被的96孔平板上于室溫放置1小時，洗去未結合的蛋白，檢測熒光素酶活性。
圖13A顯示了捕獲在平板上的海腎熒光素酶活性。分析這些數據表明，僅捕獲了含突變DhaA的融合體。捕獲的效力非常高(加到板上的海腎熒光素酶活性捕獲了50％以上)。相反，對含野生型DhaA以及海腎熒光素酶的融合體的捕獲效力小得可以忽略不計(＜0.1％)。用非生物素化底物(TAMRA-C14H24O4-Cl)預處理R.Luc-連接基團-DhaA.H272F降低捕獲效力約80％。而且，非生物素化底物預處理對捕獲R.Lue-連接基團-DhaA.WT或海腎熒光素酶沒有影響。
總之，這些數據證明，活性酶(例如海腎熒光素酶)可束縛至構成本發明底物(Cl-烷-DhaA.H272F-橋)部分的固相支持體，并保持酶活性。
實施例IV體內突變DhaA和底物系統A.官能團與DhaA突變體的體內共價束縛原核生物和真核生物中材料和方法為研究本發明底物與在原核生物中表達的突變水解酶的結合，用pGEX-5X-3.DhaA.WT-Flag或pGEX-5X-3.DhaA.H272F-Flag轉化大腸桿菌細胞BL21(λDE3)pLys65，在液體培養基中生長，用IPTG誘導。向誘導細胞中加入TAMRA-C14H24O4-Cl或生物素-C18H32O4-Cl(終濃度25μM)。1小時后收獲細胞，用冷PBS(pH7.3)清洗，超聲破碎，以19,800×g離心1小時分離。可溶性組分進行SDS-PAGE。用熒光成像儀分析具有分離自TAMRA-C14H24O4-Cl處理細胞的蛋白的凝膠，而將生物素-C18H32O4-Cl處理細胞的蛋白轉移至硝酸纖維素膜，用HRP綴合的鏈霉抗生物素蛋白探測。
為研究TAMRA-C14H24O4-Cl在哺乳動物細胞中的結合，分別從pGEX-5X-3.DhaA.WT-Flag或pGEX-5X-3.DhaA.H272F-Flag切下DhaA.WT-Flag和DhaA.H272F-Flag編碼區，凝膠過濾，并插入至pCIneo.CMV載體(Promega)的SalI/NotI限制性位點。通過DNA測序驗證所述構建物。
將CHO-K1細胞放置在24孔板(Labsystems)上，用pCIneo-CMV.DhaA.WT-Flag或pCIneo-CMV.DhaA.H272F-Flag載體轉染。24小時后，用含25μM TAMRA-C14H24O4-Cl的新鮮培養基置換培養基，將細胞放置于CO2培養箱中60分鐘。溫育后，去除培養基，用PBS(pH7.4；4次連續清洗1.0ml/cm2；每次5秒)快速清洗細胞，用相同緩沖液(1％SDS、10％甘油等；250μl/孔)溶解細胞。用SDS-PAGE(4-20％梯度凝膠)分離蛋白(10μl/泳道)，用熒光成像儀(Hitachi，Japan)以等于540/575nm的Eex/Eem檢測TAMRA-C14H24O4-Cl的結合。
結果圖14A和B顯示生物素-C18H32O4-Cl(A)和TAMRA-C12H24O4-Cl(B)與大腸桿菌蛋白的體內結合。圖14A上的低分子量條帶是HRP-SA識別的大腸桿菌蛋白，而圖B底部檢測的熒光是游離TAMRA-C14H24O4-Cl的熒光。圖15顯示TAMRA-C12H24O4-Cl與真核細胞蛋白的體內結合。
圖14和圖15的分析顯示，是DhaA.H272F-Flag突變體而不是DhaA.WT-Flag體內結合TAMRA-C14H24O4-Cl或生物素-C18H32O4-Cl。而且，DhaA.H272F-Flag和底物之間的鍵非常強(可能是共價鍵)，因為與SDS煮沸接著SDS-PAGE沒有破壞突變酶和底物之間的鍵。
B.細胞膜對本發明底物的通透性材料和方法以Ham F12營養物和補加10％胎牛血清(FBS)、100U/ml芐青霉素和100mg/ml鏈霉素的Dulbecco改良型極限必須培養基的1∶1混合物，在95％空氣和5％CO2氣氛下于37℃培養CHO-K1細胞(ATCC-CCL61)。
為研究不同底物的攝取，將細胞以30,000細胞/cm2的密度放置在LT-II室(Nunc)或96孔板(Labsystems)中。第二天，用含不同濃度底物的培養基置換培養基，將細胞放置回CO2培養箱中2、5或15分鐘。在溫育結束時，去除含底物的培養基，用PBS(pH7.4；4次連續清洗1.0ml/cm2；每次5秒)快速清洗細胞。然后向細胞中加入新鮮培養基，將細胞放回37℃的CO2培養箱中。用熒光板讀數器CytoFluor II(Beckman)以等于480/520nm和540/575nm的Eex/Eem(分別用于FAM-和TAMRA-修飾的底物)檢測96孔板中的細胞熒光水平。用配有適于檢測FITC和TAMRA的濾光片單元的倒置落射熒光顯微鏡Axiovert-100(Carl Zeiss)獲取細胞的熒光圖像。
結果如圖16所示，TAMRA-C14H28O4-Cl(25μM，37℃，5分鐘)處理的CHO-K1細胞可快速有效地加載TAMRA-C14H28O4-Cl。圖像分析表明，熒光染料穿透了細胞膜。圖16還顯示TAMRA-C14H28O4-Cl可被有效地洗出細胞。總之，這些數據表明，TAMRA-C14H24O4-Cl可穿透CHO-K1細胞的質膜。
相反，即使細胞用高濃度(即100μM)的FAM-C14H24O4-Cl和更長的時間(60分鐘)預處理(未列出數據)，FAM-C14H24O4-Cl也不能穿透CHO-K1細胞的質膜。因此，細胞質膜對本發明各種底物(例如TAMRA-C14H24O4-Cl和FAM-C14H24O4-Cl)的不同通透性提供了用不同熒光團標記細胞表面和細胞內部所表達蛋白的獨特機會，由此使得可以雙線程檢測(biplexing)。
實施例V用于體內細胞成像的基于DhaA的束縛A.GFP和TAMRA-C14H24O4-Cl在活體哺乳動物細胞中的共定位材料和方法通過用DhaA.WT-Flag或DhaA.H272F-Flag編碼區置換編碼GFP-DEVD-Rluc(h)的Packard載體(Packard #6310066)中的海腎熒光素酶編碼區，構建GFP-連接基團-DhaA融合表達盒。設計兩種引物(5′-GGAATGGGCCCTCTAGAGCGACGATGTCA-3′；SEQ ID NO15和5′-CAGTCAGTCACGATGGATCCGCTCAA-3′；SEQ ID NO16)，以分別將ApaI和BamHI位點(加下劃線)加入到DhaA的5′和3′編碼區，并由pGEX-5X-3.DhaA.WT-Flag或pGEX-5X-3.DhaA.H272F-Flag模板擴增980bp的片段。用ApaI和BamHI限制酶切出R.Luc編碼區。然后將含DhaA的980bp片段插入到GFP-DEVE-Rluc(h)編碼載體的ApaI/BamHI位點。基因融合構建物的序列通過DNA測序檢驗。
將瞬時表達GFP-連接基團-DhaA.WT-Flag或GFP-連接基團-DhaA.H272F-Flag融合蛋白的細胞以30,000細胞/cm2的密度置于LT-II室(Nunc)中。第二天，用含25μM TAMRA-C14H24O4-Cl的新鮮培養基置換培養基，將細胞放置回CO2培養箱中60分鐘。在溫育結束時，去除含底物的培養基，用PBS(pH7.4；4次連續清洗1.0ml/cm2；每次5秒)快速清洗細胞，然后向細胞中加入新培養基。將細胞放回CO2培養箱中，60分鐘后用PBS(pH7.4；4次連續清洗1.0ml/cm2；每次5秒)快速清洗細胞。用配有適于檢測GFP和TAMRA的濾光片單元的倒置落射熒光顯微鏡Axiovert-100(Carl Zeiss)獲取細胞的熒光圖像。
結果如圖17的圖象所示，用GFP-連接基團-DhaA.WT-Flag或GFP-連接基團-DhaA.H272F-Flag轉染的細胞顯示出具有GFP光發射特征的蛋白強烈表達。分析用TAMRA-濾光片單元獲取的相同細胞圖象顯示，表達GFP-連接基團-DhaA.WT-Flag的細胞是黑色的，無法與不表達該融合蛋白的細胞區分開來。相反，表達GFP-連接基團-DhaA.H272F-Flag的細胞非常明亮，可清楚識別。
對從用GFP-連接基團-DhaA.WT-Flag或GFP-連接基團-DhaA.H272F-Flag載體轉染的CHO-K1細胞分離的蛋白進行蛋白質印跡分析，結果顯示這些細胞表達的蛋白可由抗-Flag抗體識別，具有融合蛋白的預測分子量(未列出數據)。對含這些蛋白的SDS-PAGE凝膠進行熒光掃描顯示，TAMRA與GFP-連接基團-DhaA.H272F-Flag強/共價結合，但不與GFP-連接基團-DhaA.WT-Flag結合(圖18)。
B.DhaA.WT-Flag和DhaA.H272F-Flag中的DhaA融合部分有功能為測定兩種蛋白的融合體是否導致一種或兩種蛋白活性丟失，制備了幾種在融合體的C-末端或N-末端具有DhaA、并在兩種蛋白之間具有連接基團序列(如具有13-17個氨基酸的連接基團序列)的基于DhaA的融合蛋白(參見表II)。數據顯示融合體中兩種蛋白的功能活性都得到保存。
表II
C.Cl-烷的毒性材料和方法為研究Cl-烷的毒性，將CHO-K1細胞以5,000細胞/孔的密度置于96孔板中。第二天，用含0-100μM濃度Cl-烷的新鮮培養基更換培養基，將細胞放回CO2培養箱中放置不同的時間段。用CellTiter-GloTM發光細胞活力測定(Promega)按照生產商的方法檢測細胞存活率。一般來說，將100μl CellTiter-GloTM試劑直接加入細胞中，使用DYNEX MLX微量滴定板發光計以10分鐘間隔記錄發光。在某些實驗中，為防止熒光/發光干擾，去除含熒光Cl-烷的培養基，用PBS(pH7.4；4次連續清洗1.0ml/cm2；每次5秒)快速清洗細胞，然后加入CellTiter-GloTM試劑。對照實驗表明，該步驟對CellTiter-GloTM測定的敏感性和精確度沒有影響。
結果如圖19所示，TAMRA-C14H24O4-Cl即使在以100μM濃度(最高測試濃度)處理4小時后也顯示出對CHO-K1細胞無毒。處理24小時后，于6.25μM濃度(“最大無毒濃度”)未檢測出毒性。濃度大于6.25μM時，CHO-K1細胞的相對發光以劑量依賴方式降低，IC50約為100μM。即使在以100μM處理24小時后也沒有觀測到生物素-C18H34O4-Cl的毒性。相反，ROX5-C14H24O4-Cl具有顯著的毒性作用，因為在處理1小時后可檢測出CHO-K1細胞中RLU降低。該作用的IC50值約為75μM，25μM濃度時ATP無明顯降低。ROX5-C14H24O4-Cl毒性的IC50值和ROX5-C14H24O4-Cl的“最大無毒濃度”以時間依賴方式降低，分別達到12.5μM和6.25μM。
D.檢測與含TAMRA-或DiAc-FAM-底物和固定劑接觸的CHO細胞中的DhaA.D106C將CHO細胞(ATCC，第4代)以低密度接種到8孔室形載玻片(German coverglass system)的DMEMF12培養基(Gibco)中，該培養基含10％FBS和1mM谷氨酰胺(生長培養基)，沒有抗生素。2天后，使用倒置相差顯徽鏡觀察細胞。在應用轉染試劑前確認兩種視覺基準1)每個室的細胞融合水平約為60-80％；2)＞90％的細胞粘附，并顯示出扁平形態。用150μl新鮮預溫生長培養基置換培養基，溫育細胞約1小時。
使用TransIt TKO系統(Miris)轉染細胞。通過每100μl無血清DMEMF12培養基加入7μl脂質稀釋TKO脂質，然后每100μl含脂質培養基加入1.2μg轉染級DhaA.D106C DNA。將混合物于室溫溫育15分鐘，然后將25μl等份轉移入單個培養室中(0.3μg DNA)。將細胞放回培養箱中5-6小時，用生長培養基清洗兩次，加入300μl新鮮生長培養基，然后再溫育細胞24小時。
將轉染或未轉染的對照細胞與12.5μM TAMRA-C14H24O4-Cl或12.5μM DiAc-FAM-C14H24O4-Cl的10％FBS/DMEM溶液在37℃和5％CO2中溫育30分鐘。用溫生長培養基清洗細胞3次，加入300μl新鮮培養基，然后溫育細胞1小時。
用溫PBS置換生長培養基，用配有羅丹明濾光片單元(激發濾光片＝540，發射濾光片＝560LP)和熒光濾光片單元(激發濾光片＝490，發射濾光片＝520)以及Spot CCD照相機的Zeiss Axiovert 100倒置顯微鏡顯示活細胞。以曝光時間0.15-0.60秒、增益調整4或16捕獲圖像。
分散的和特異性標記的轉染細胞在TAMRA-C14H24O4-Cl和DiAc-FAM-C14H24O4-Cl標記細胞中都很明顯。大部分細胞是非轉染細胞，它們沒有保留標記。
去除PBS，用3.7％多聚甲醛/0.1％Triton的PBS溶液固定細胞15分鐘。去除固定劑，加入PBS，捕獲TAMRA-C14H24O4-Cl和DiAc-FAM-C14H24O4-Cl標記細胞的第二組圖像。
用50％甲醇的PBS溶液置換PBS，溫育細胞15分鐘，接著在95％甲醇中溫育15分鐘。捕獲第三組圖像，然后將等體積的甲醇和丙酮混合物涂抹在細胞上，溫育15分鐘。用PBS置換培養基，獲得第四組圖像。
結果表明底物與DhaA.D106C突變體的結合在用多聚甲醛固定以及隨后以甲醇和丙酮處理固定細胞樣品后穩定。而且，TAMRA或FAM熒光的亮度在這些條件下沒有改變。
實施例VI基于突變β-內酰胺酶(blaZ)的束縛絲氨酸-β-內酰胺酶賦予細菌對β-內酰胺抗生素的抗性，其可能使用絲氨酸殘基(Ambler等(1991)A類公認編號體系中的Ser70)上的羥基降解多種β-內酰胺化合物。反應由形成前共價遭遇絡合物(圖20A)開始，經高能酰化四面體中間體(圖20B)形成瞬時穩定酰化酶中間體，通過催化殘基Ser70形成酯(圖20C)。隨后，酰化酶受到水解水攻擊(圖20D)，形成高能脫酰化中間體(圖20E)(Minasov等，2002)，其崩解形成水解產物(圖20F)。然后排出產物，再生游離酶。如同在絲氨酸蛋白酶中一樣，該機制需要催化堿基以活化絲氨酸親核體，攻擊底物的酰胺鍵，在形成酰化酶中間體后活化水解水攻擊加合物的酯中心。
A.突變β-內酰胺酶及其融合體材料和方法攜帶質粒pTS32的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)PClblaZ基因(Zawadzke等，1995)由O.Herzberg博士(University ofMaryland Biotechnology Institute)惠贈。blaZ基因序列如下AGCTTACTAT GCCATTATTA ATAACTTAGC CATTTCAACACCTTCTTTCA AATATTTATAATAAACTATT GACACCGATATTACAATTGT AATATTATTG ATTTATAAAAATTACAACTGTAATATCGGA GGGTTTATTT TGAAAAAGTTAATATTTTTA ATTGTAATTG CTTTAGTTTTAAGTGCATGTAATTCAAACA GTTCACATGC CAAAGAGTTA AATGATTTAGAAAAAAAATATAATGCTCAT ATTGGTGTTT ATGCTTTAGATACTAAAAGT GGTAAGGAAG TAAAATTTAATTCAGATAAGAGATTTGCCT ATGCTTCAAC TTCAAAAGCG ATAAATAGTGCTATTTTGTTAGAACAAGTA CCTTATAATA AGTTAAATAA
AAAAGTACAT ATTAACAAAG ATGATATAGTTGCTTATTCTCCTATTTTAG AAAAATATGT AGGAAAAGAT ATCACTTTAAAAGCACTTATTGAGGCTTCA ATGACATATA GTGATAATACAGCAAACAAT AAAATTATAA AAGAAATCGGTGGAATCAAAAAAGTTAAAC AACGTCTAAA AGAACTAGGA GATAAAGTAACAAATCCAGTTAGATATGAG ATAGAATTAA ATTACTATTCACCAAAGAGC AAAAAAGATA CTTCAACACCTGCTGCCTTCGGTAAGACCC TTAATAAACT TATCGCCAAT GGAAAATTAAGCAAAGAAAACAAAAAATTC TTACTTGATT TAATGTTAAATAATAAAAGC GGAGATACTT TAATTAAAGACGGTGTTCCAAAAGACTATA AGGTTGCTGA TAAAAGTGGT CAAGCAATAACATATGCTTCTAGAAATGAT GTTGCTTTTG TTTATCCTAAGGGCCAATCT GAACCTATTG TTTTAGTCATTTTTACGAATAAAGACAATA AAAGTGATAA GCCAAATGAT AAGTTGATAAGTGAAACCGCCAAGAGTGTA ATGAAGGAAT TTTAATATTCTAAATGCATA ATAAATACTG ATAACATCTTATATTTTGTATTATATTTTG TATTATCGTT GAC(SEQ ID NO36).
通過將點突變導入balZ基因，并將balZ編碼區克隆入pGEX5x3載體的SalI/AgeI位點，構建GST-blaZ(野生型和E166D、N170Q或E166DN170Q突變體)融合表達盒。內部誘變引物如下E166D(5′-CCAGTTAGATATGACATAGAATTAAATTACTATTCACC-3′，SEQID NO56；5′-GGTGAATAGTAATTTAATTCTATGTCATATCTAACTGG-3′，SEQ ID NO57)；N170Q(5′-CCAGTTAGATATGAGATAGAATTACAGTACTATTCACC-3′，SEQ ID NO58；和5′-GGTGAATAGTACTGTAATTCTATCTCATATCTAACTGG-3′，SEQ ID NO59)；E166DN170Q(5′CCAGTTAGATATGACATAGAATTACAGTACTATTCACC-3′；SEQ ID NO60和5′-GGTGAATAGTACTGTAATTCTATGTCATATCTAACTGG-3；SEQ ID NO61)。設計兩種外部引物(5′-CAACAGGTCGACGCCGCCATGAAAGAGTTAAATGATTTAG-3′，SEQ ID NO62；和5′-GTAGTCACCGGTAAATTCCTTCATTACACTCTTGGC-3′，SEQ ID NO63)，以將N-末端SalI位點和Kozak序列加入到blaZ的5′編碼區，將AgeI位點加入到blaZ的3′編碼區，并由blaZ.WT模板擴增806bp的片段。將獲得的片段插入到載體pGEX-5X-3的SalI/AgeI位點中，載體pGEX-5X-3含谷胱甘肽S-轉移酶(GST)基因、Xa因子切割位點編碼序列和多克隆位點(MCS)，后接Flag編碼序列和終止密碼子。這些基因融合構建物通過DNA測序確認。
在感受態大腸桿菌BL21(λDE3)細胞中過表達GST-blaZ(野生型或突變體)融合蛋白，基本如對DhaA和GST-DhaA融合蛋白的描述進行純化(除了使用磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH 6.8)代替緩沖液A)。蛋白均一性通過SDS-PAGE驗證。
發色底物6-β-[(呋喃基丙烯酰氨基]青霉烷酸三乙胺鹽(FAP)購自Calbiochem(La Jolla，CA)。用Beckman Du640分光光度計(BeckmanCoulter，Fullerton，CA)根據344nm吸光度的損失(ΔE＝1330M-1cm-1)監測FAP水解。全部檢測都在25℃于pH6.8的0.1M磷酸鉀緩沖液中進行。
在CCF2中，頭孢菌素內核將7-羥基香豆素連接至熒光素。對于完整分子，激發香豆素(Eex-409nm)導致FRET至熒光素，發射綠光(Eem-520nm)。用β-內酰胺酶裂解CCF2導致兩種染料空間分離，破壞了FRET，使得現在激發香豆素產生藍色熒光(Eex-477nm)。CCF2購自Aurora Biosciences Corporation(San Diego，CA)。使用熒光多孔板讀數器CytoFluorII(PerSeptive Biosystems，Framingham，MA，USA)檢測FRET信號的減少和藍色熒光的增加。
結果所有的β-內酰胺酶，包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)PCl的β-內酰胺酶，都水解不同化學結構的β-內酰胺。水解效力取決于酶的類型和底物化學結構。青霉素被認為是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)PCl β-內酰胺酶的優選底物。
如Zawadzke等(1995)所述研究了點突變對β-內酰胺酶水解青霉素能力的影響。如圖20所示，GST-β-內酰胺酶PCl融合蛋白有效水解FAP。即使在共溫育60分鐘后也沒有檢測到blaZ.E166D、blaZ.N170Q或blaZ.E166DN170Q blaZ突變體水解FAP。因此，這些突變導致blaZ顯著失活。
為顯示blaZ.E166D、blaZ.N170Q或blaZ.E166DN170Q突變體結合β-內酰胺，由此可將不同的官能團經β-內酰胺束縛至這些蛋白，將這些突變體的GST融合體與熒光青霉素BOCELLINTMFL(Molecular Probes Inc.，Eugene，OR)溫育。用SDS-PAGE分離蛋白，用熒光成像儀(Hitachi，Japan)以適于具體熒光團的Eex/Eem分析。圖22的數據顯示所有的blaZ突變體都結合BOCELLIN。而且，blaZ突變體和熒光底物之間的鍵非常強，可能是共價的，因為與SDS煮沸接著SDS-PAGE沒有破壞該鍵。此外，雙突變體blaZ.E166DN170Q的結合效力(根據蛋白-結合熒光團的熒光信號強度判斷)遠高于任一種單突變體的結合效力，而blaZ.N170Q的結合效力高于blaZ.E166D的結合效力。這些數據結合目前理解的單個氨基酸在β-內酰胺水解中的作用表明，額外的突變(例如輔助氨基酸的突變)可提高官能團與突變蛋白束縛的效力。
還使用Zlokarnik等(1998)描述的基于FRET的底物CCF2研究了點突變對β-內酰胺酶水解頭孢菌素能力的影響。如圖23所示，GST-β-內酰胺酶PCl融合蛋白有效水解CCF2(泳道2)。單點突變(即E166D或N170Q)降低了融合蛋白水解CCF2的能力(泳道3和4)。替換兩個氨基酸(blaZ.E166DN170Q突變體，泳道5)甚至更顯著地影響CCF2水解。但是，所有的blaZ突變體都能夠水解CCF2。
因此，在166或170位的氨基酸置換，例如Glu166Asp或Asn170Gly，能使突變β-內酰胺酶捕獲底物，因此將底物官能團經穩定(例如共價)鍵束縛至突變β-內酰胺酶。而且，對H2O活化具有輔助作用的氨基酸的突變增加了束縛效力。
實施例VII將DhaA.H272F靶向活細胞的胞核和胞質材料和方法通過將NLS3編碼序列(猿猴病毒大T抗原核定位信號(NLS)的三個串聯重復)插入到pCIneo.GFP-連接基團-DhaA.H272F-Flag載體的AgeI/BamHI位點，構建GFP-連接基團-DhaA.H272F-NLS3融合表達盒。退火兩種編碼NLS3肽的互補寡核苷酸(5′-CCGGTGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTATGAG-3′，有義，SEQ ID NO37，和5′-GATCCTCATACCTTTCTCTTCTTT-TTTGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCA-3′，反義，SEQ ID NO38)。退火DNA在5′末端具有AgeI位點，在3′末端具有BamHI位點。將退火DNA亞克隆入GFP-連接基團-DhaA.H272F-Flag構建物的AgeI/BamHI位點。基因融合構建物的序列通過DNA測序確認。
通過用DhaA.H272F-Flag編碼區替換編碼GFP2-β-抑制蛋白2的Packard載體(Packard#6310176-1F1)中的pGFP2編碼區，構建DhaA.H272F-β-抑制蛋白2融合表達盒。設計兩種引物(5′-ATTATGCTGAGTGATATCCC-3′；SEQ ID NO39和5′-CTCGGTACCAAGCTCCTTGTAGTCA-3′；SEQ ID NO40)，以將KpnI位點插入到DhaA的3′編碼區，并由pGEX5X-3.DhaA.H272F-Flag模板擴增930bp的片段。用NheI和KpnI限制酶切除pGFP2編碼區，然后將含編碼DhaA.H272F的片段插入到GFP2-β-抑制蛋白2編碼載體的NheI和KpnI位點。融合構建物的序列通過DNA測序確認。
將瞬時表達GFP-連接基團-DhaA.H272F-NLS3、GFP2-β-抑制蛋白2或DhaA.H272F-β-抑制蛋白2融合蛋白的CHO-K1細胞或3T3細胞以30,000細胞/cm2的密度置于LT-II室(Nunc)中。第二天，用含25μM TAMRA-C14H24O4-Cl的新鮮培養基置換培養基，將細胞放置回CO2培養箱中60分鐘。在溫育結束時，去除底物培養基，用PBS(pH7.4；4次連續清洗1.0ml/cm2；每次5秒)快速清洗細胞，然后向細胞中加入新培養基。將細胞放回CO2培養箱中，60分鐘后用PBS(pH7.4；1.0ml/cm2)快速清洗細胞。用配有適于檢測GFP和TAMRA的濾光片單元的聚焦顯微鏡Pascal-5(Carl Zeiss)獲得細胞的熒光圖像。
結果如圖24的圖像所示，GFP和TAMRA共定位于GFP-連接基團-DhaA.H272F-NLS3表達細胞的細胞核中，并與TAMRA-C14H24O4-Cl相連。
如圖25的圖像所示，GFP-β-抑制蛋白2表達細胞具有典型的β-抑制蛋白2胞質定位。DhaA.H272F-β-抑制蛋白2的SDS-PAGE凝膠的熒光掃描顯示，含DhaA底物的TAMRA與表達DhaA.H272F-β-抑制蛋白2的細胞強結合。
實施例VIII定點誘變DhaA催化殘基130鹵代烷脫鹵素酶使用三步機制裂解碳-鹵素鍵。該反應由親核殘基、堿性殘基和酸性殘基組成的氨基酸殘基三聯體催化，對于自養黃色桿菌(Xanthobacter autotrophicus)鹵代烷脫鹵素酶(DhlA)而言，所述殘基分別是殘基Asp124、His289和Asp260(Franken等，1991)，對于紅球菌(Rhodococcus)脫鹵素酶(DhaA)而言，所述殘基分別是殘基Asp106、His272和Glu130(Newman等，1999)。
與鹵代烷脫鹵素酶親核殘基和堿性殘基不同，催化三聯體第三個成員的作用迄今還不完全了解。催化酸性殘基與催化His殘基氫鍵鍵合，可能通過增加咪唑環中氮的堿性有助于His殘基的功能。Krooshof等(1997)使用定點誘變研究DhlA催化酸性Asp260的作用，證明D260N突變體催化失活。而且，該殘基顯然具有重要的結構作用，因為突變蛋白主要累積在包含體中。少動鞘氨醇單胞菌(Sphinogomonas pauciynobilis)鹵代烷脫鹵素酶(LinB)參與γ-六氯環己烷降解(Nagata等，1997)。Hynkova等(1999)用谷氨酰胺(Q)殘基替換了LinB的推定催化殘基(Glu-132)。但是，即使以非常高的底物濃度也沒有觀測到E132Q突變體的活性。
為檢測DhaA催化三聯體酸性殘基Glu130在蛋白生產中的作用和突變體蛋白與熒光標記的鹵代烷底物形成共價烷基-酶中間體的能力，使用定點誘變以谷氨酰胺、亮氨酸和丙氨酸替換130位的DhaA谷氨酸(E)殘基。
材料和方法菌株和質粒。在定點誘變反應的轉化中使用超感受態大腸桿菌XL10 Gold(Stratagene；TetrΔ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173endAl supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte[F′proAB lacIqZΔM15Tn10(Tetr)Amy Camr])作為宿主。使用大腸桿菌菌株JM109(e14-(McrA-)recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rK-mK+)supE44 relA1Δ(lac-proAB)[F′traD36 proAB lacIqZΔM15])作為宿主進行基因表達和全細胞酶標記研究。將GST-DhaA-FLAG基因融合體克隆入質粒pGEX5X3中，稱為pGEX5X3DhaAWT.FLAG，使用其作為E130誘變的起始模板。在DhaA中含H272F突變的突變質粒稱為pGEX5X3DhaAH272F-FLAG，將其作為標記研究中的陽性對照，使用克隆載體pGEX5X3作為陰性對照。
定點誘變DhaA E130殘基。用于誘變的寡核苷酸序列示于下文。標下劃線的核苷酸表示改變密碼子的位置。用Integrated DNATechnologies(Coralville，IA)以100nmol規模合成寡核苷酸，并通過在5′末端磷酸化進行修飾。DhaA E130Q 5′CAAAGGTATTGCATGTATGCAGTTCATCCGGCCTATCCCG3′(SEQ IDNO41)DhaA E130L 5′GTCAAAGGTATTGCATGTATGCTGTTCATCCGGCCTATCCCGAC3′(SEQ ID NO42)DhaA E130A 5′AGGTATTGCATGTATGGCGTTCATCCGGCCTATCCC3′(SEQ ID NO43)使用QuikChange Multi試劑盒按照生產商的說明(Stratagene，LaJolla，CA)進行定點誘變。將誘變反應物導入到感受態大腸桿菌XL10Gold細胞中，在含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂培養基平板上選擇轉化體。由于替換了谷氨酸密碼子(GAAttc)，最初篩選由單個轉化體分離的質粒DNA以獲得缺失EcoRI位點的質粒。選擇推測含各反應所需密碼子改變的克隆，對其進行DNA序列分析(SeqWright，Houston，TX)。用于驗證pGEX5X3載體中突變體序列的引物如下5′GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG 3′(SEQ ID NO44)。
DhaA突變體分析。將三種DhaA E130置換突變體與以下構建物對比野生型DhaA、DhaA.H272F和DhaA陰性對照(僅有pGEX5X3載體)。在2ml含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB中于30℃振蕩過夜培養每個克隆。將過夜培養物以1∶50稀釋入含50ml新鮮LB培養基和氨芐青霉素(100μg/ml)的無菌燒瓶中。將培養物于25℃振蕩溫育，以使產生的不溶性蛋白種類最少。當培養至對數中期(OD600＝0.6)時，加入IPTG(0.1mM)，再將培養物于25℃振蕩溫育22小時。為了用四甲基羅丹明(TAMRA)鹵代烷綴合的底物標記全細胞，將每種培養物的細胞密度調節至OD600＝1，然后加入底物至濃度為15μM。在溫和攪拌的情況下于4℃溫育細胞大約18小時。溫育后，將20μl每種標記反應的細胞加入到6μl加載染料的4×SDS中，將樣品煮沸約3分鐘，然后上樣到4-20％丙烯酰胺凝膠(Tris甘氨酸)。為進行體外標記研究，通過收集3mL細胞(OD600＝1)，并將所獲得的沉淀再懸浮在75μL RBS中，制備IPTG誘導培養物的粗裂解物。凍/融步驟后，加入含1.25mg/mL溶菌酶的225μL1×細胞培養物裂解試劑(PromegaCorp.，Madison，WI)以促進細胞裂解。將每種裂解物的20μL樣品與25μL 1×PBS混合。加入TAMRA標記的鹵代烷底物至終濃度為25μM。于室溫溫育標記反應物2小時。將25μl各種標記反應物樣品加入至6μl加載染料的4×SDS中，將樣品煮沸約3分鐘，然后上4-20％丙烯酰胺凝膠(Tris甘氨酸)。使用Fluorhnager SI設備(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)，設定在570nm檢測發射，將凝膠成像。
以14,000RPM離心粗裂解物15分鐘，產生無細胞裂解物。通過SDS-PAGE和蛋白質印跡分析監測蛋白產生。將轉移至PVDF膜的蛋白與綴合堿性磷酸酶(AP)(Sigma，St.Louis，MO)的抗-FLAGR抗體溫育。用Western Blue穩定的堿性磷酸酶底物(Promega Corp.，Madison，WI)顯色印跡。
結果通過定點誘變考察DhaA催化酸性殘基在烷基-酶中間體水解中的作用。用谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)或丙氨酸(A)密碼子替換DhaA密碼子E130，因為這些置換可能對酶結構的破壞最小。誘變后，使用限制性內切核酸酶篩選和DNA序列分析確認需要的密碼子改變。確認為DhaA.E130Q、DhaA.E130L和DhaA.E130A克隆的序列分別稱為Cl、A5和A12，選擇它們進行下一步分析。分析E130突變體的蛋白表達及其與TAMRA標記的鹵代烷底物形成共價烷基-酶中間體的能力。在用IPTG誘導后大腸桿菌JM109細胞過表達三種E130基因變異體。粗細胞裂解物的SDS-PAGE分析結果顯示，表達野生型和突變dhaA基因的培養物以大約相同的水平累積蛋白(圖26；泳道2、4、6、8、10和12)。而且，野生型和H272F構建物生產的DhaA蛋白大部分可溶，因為蛋白量在離心后沒有明顯變化(圖26；泳道3和5)。出現在僅有載體的泳道的大量22kDa蛋白條帶代表GST蛋白(圖26；泳道6和7)。但是，這些結果與DhaA.E130Q、DhaA.E130L和DhaA.E130A突變體完全相反，所述突變體似乎主要累積不溶性DhaA蛋白。此結論是基于以下觀察結果，即離心后存在于無細胞裂解物中的DhaA蛋白量有顯著損失(圖26；泳道9、11和13)。盡管如此，在離心(+s)后的每個DhaA.E130突變體泳道中都能清楚觀測到與DhaA共遷移的蛋白條帶，這提示存在可溶性酶。因此使用蛋白質印跡分析測定離心后在DhaA.E130突變體中觀測到的蛋白條帶是否代表可溶性DhaA物質。圖27顯示的免疫印跡證實，在每種DhaA.E130突變體無細胞裂解物中都存在可溶性DhaA蛋白(泳道9、11和13)。
還檢測了DhaA.E130突變體產生烷基-酶共價中間體的能力。在TAMRA標記底物存在時，溫育由各種構建物的IPTG誘導培養物制備的粗裂解物。圖28顯示DhaA.H272F突變體(泳道3)生產該中間體非常有效。用野生型DhaA或陰性對照裂解物未檢測到該產物。在開始檢測時，DhaA.E130突變體似乎沒有產生可檢測水平的共價產物。但是，在更嚴格檢查熒光圖像時，觀測到極微弱的條帶，可能表示微量的共價中間體(圖28；泳道5-7)。基于這些結果，研究了全細胞生產熒光烷基-酶共價中間體的能力。
圖29顯示了對比每種DhaA.E130突變體和陽性(DhaA.H272F突變體)以及陰性(DhaA-)對照的體內標記實驗的結果。正如所料，由接近GST-DhaA-Flag融合體預測分子量的單熒光條帶(圖29，泳道3)證實，DhaA.H272F突變體能夠產生共價烷基-酶中間體。正如先前體外標記結果所觀測到的一樣，野生型或陰性對照培養物(圖29，泳道2和3)都不能檢測到該產物，但全部三種DhaA.E130置換突變體都再一次檢測到遷移到正確位置的非常微弱的熒光條帶(圖29，泳道5-7)。這些結果指出，DhaA.E130Q、L和A突變體可能具有捕獲共價烷基-酶中間體的能力。但是，與DhaA.H272F突變體酶相比，該反應效率似乎急劇降低。
此誘變研究的結果提示，DhaA催化酸性殘基DhaA.E130對酶正確折疊起重要的結構作用。DhaA蛋白明顯對該氨基酸位置的置換敏感，證據是在DhaA.E130Q、DhaA.E130L和DhaA.E130A粗裂解物中存在大量不溶性蛋白復合物。盡管如此，基于SDS-PAGE和免疫印跡分析，在全部三種DhaA.E130突變體的無細胞裂接物中都檢測到顯著量的可溶性DhaA蛋白。
實施例IX捕獲活哺乳動物細胞中表達的DhaA.H272F-Flag和DhaA.H272F-Flag海腎熒光素酶融合蛋白材料和方法以30,000細胞/cm2的密度將CHO-K1細胞放置在24孔板(Labsystems)中，用pCIneo.DhaA.WT-Flag或pCIneo.hRLuc-連接基團-DhaA.H272F-Flag載體轉染。24小時后，用含25μM生物素-C18H32O4-Cl和0.1％DMSO的新鮮培養基或僅含0.1％DMSO的新鮮培養基置換培養基，將細胞放置于CO2培養箱中60分鐘。溫育結束時，去除培養基，用PBS(pH7.4；4次連續清洗1.0ml/cm2；每次5秒)快速清洗細胞，將新培養基加入到細胞中。在某些實驗中，沒有改變培養基。將細胞放置回CO2培養箱中。
60分鐘后，去除培養基，將細胞收集在含蛋白酶抑制劑(Sigma#P8340)的PBS(pH＝7.4，200μl/孔，室溫)中。通過用針(IM1 23GTW)研磨裂解細胞。然后，將細胞裂解物與MagnaBind鏈霉抗生物素蛋白包被的珠(Pierce #21344)按照生產商的方法溫育。簡而言之，使用轉盤將細胞裂解物與珠于室溫溫育60分鐘。收集未結合的物質；用PBS(3×500μl，pH＝7.4，室溫)清洗珠，并重懸浮在SDS-樣品緩沖液(用于SDS-PAGE分析)或PBS(pH＝7.4，用于測定R.Luc活性)中。用SDS-PAGE分離蛋白，轉移至硝酸纖維素膜，用抗-Flag-Ab或抗-R.Luc-Ab分析，通過增強型化學發光(ECL)系統(Pharmacia-Amersham)檢測結合抗體。使用Promega的“海腎熒光素酶測定系統”按照生產商的方法測定結合珠的hR.Luc活性。
結果捕獲活細胞中表達的蛋白使得可以用各種分析方法/技術分析這些蛋白。可利用的捕獲工具有很多，但這些工具大部分需要生產高度特異性的抗體或需要將目標蛋白和特異性標記肽/蛋白遺傳融合(Jarvik和Telmer，1998；Ragaut等，1999)。然而，用于活細胞成像的這些標記物很有限。為捕獲DhaA.H272F和融合至DhaA.H272F的功能蛋白，使用SA-包被的珠(Savage等，1992)。
野生型DhaA有效水解生物素-C18H32O4-Cl，生物素-C18H32O4-Cl與DhaA.H272F和DhaA.H272F融合蛋白在體內和體外共價結合。而且，在大腸桿菌和哺乳動物細胞中都觀測到結合。對照實驗表明，處理60分鐘后CHO-K1細胞中表達的DhaA.H272F-Flag蛋白的約80％被標記。
用生物素-C18H32O4-Cl處理瞬時表達DhaA.H272F-Flag的CHO-K1細胞。裂解生物素-C18H32O4-Cl處理的細胞，細胞裂解物與SA-包被珠溫育。使用抗-FlagR抗體通過蛋白質印跡分析DhaA.H272F與珠的結合。如圖30D所示，未用生物素-C18H32O4-Cl處理時沒有檢測到DhaA.H272F-Flag捕獲。同時，如果細胞用生物素-C18H32O4-Cl處理，則細胞中表達的DhaA.H272F-Flag有50％以上捕獲在SA包被珠上。
為顯示融合至DhaA.H272F-Flag的功能活性蛋白的捕獲，用編碼hR.Luc-連接基團-DhaA.H272F-Flag的載體轉染細胞，檢測捕獲在珠上的熒光素酶活性。如圖30C所示，在與生物素-C18H32O4-Cl處理細胞裂解物溫育的珠上檢測到顯著的熒光素酶活性。同時，在與生物素-C18H32O4-Cl未處理細胞裂解物溫育的珠上沒有檢測到熒光素酶活性。而且，在未洗出游離生物素-C18H32O4-Cl時，在與生物素-C18H32O4-Cl處理細胞裂解物溫育的珠上沒有檢測到hR.Luc活性。
總之，這些數據顯示，使用生物素-C18H32O4-Cl和SA-包被珠可有效捕獲融合至DhaA.H272F的功能活性蛋白(hR.Luc)。該捕獲是生物素依賴性的，并且可由過量生物素-C18H32O4-Cl競爭消除(competed-off)。由于觀測到所述珠對hR.Luc活性的顯著抑制作用(未列出數據)，所以使用SDS-PAGE和使用抗-R.Luc抗體的蛋白質印跡分析評價捕獲hR.Luc-連接基團-DhaA.H272F-Flag融合蛋白的效力。如圖30D所示，以生物素依賴性方式可捕獲50％以上的hR.Luc-連接基團-DhaA.H272F-Flag融合蛋白。這與DhaA.H272F-Flag的捕獲效力良好吻合(參見圖30A)。
實施例X優化DhaA基因DhaA通用序列設計制備合成DhaA.H272F基因，其具有人類密碼子偏倚、低CG含量、選擇的限制酶識別位點和數量減少的轉錄調節位點。相比于沒有信號序列(SEQ ID NO51)的野生型DhaA基因編碼的氨基酸序列和/或DhaA.H272F，密碼子優化的DhaA基因的氨基酸序列和側翼序列包括1)由于導入改良型Kozak序列(GCCACCATGG；SEQ IDNO45)和BamHI位點而在2位插入Gly(因此在具有Gly插入的DhaA突變體中H272F活性位點突變是在273位置)；2)由于導入SmaI/XmaI/AvaI位點獲得的A292G置換，該置換在具有Gly插入的DhaA突變體中處于293位；3)由于導入NaeI(NgoMIV)位點而在C-末端加入Ala-Gly；4)在5′側翼序列加入NheI、PvuII、EcoRV和NcoI位點；5)在5′側翼序列加入NNNN，以消除末端檢索算法誤差并保持ORF1(即NNN-NGC-TAG-CCA-GCT-GGC-GAT-ATC-GCC-ACC-ATG-GGA；SEQ ID NO46)；6)在NotI位點3′末端加入消除末端檢索算法誤差的NNNN、具有ORF Leu-Ile-Lys的PacI位點和兩個終止密碼子，其中至少一個是TAA(即TAATAGTTAATTAAGTAA-GCGGCCGCNNNN；SEQ ID NO47)。
SEQ ID NO51具有以下序列atgtcagaaatcggtacaggcttccccttcgacccccattatgtggaagtcctgggcgagcgtatgcactacgtcgatgttggaccgcgggatggcacgcctgtgctgttcctgcacggtaacccgacctcgtcctacctgtggcgcaacatcatcccgcatgtagcaccgagtcatcggtgcattgctccagacctgatcgggatgggaaaatcggacaaaccagacctcgattatttcttcgacgaccacgtccgctacctcgatgccttcatcgaagccttgggtttggaagaggtcgtcctggtcatccacgactggggctcagctctcggattccactgggccaagcgcaatccggaacgggtcaaaggtattgcatgtatggaattcatccggcctatcccgacgtgggacgaatggccggaattcgcccgtgagaccttccaggccttccggaccgccgacgtcggccgagagttgatcatcgatcagaacgctttcatcgagggtgcgctcccgaaatgcgtcgtccgtccgcttacggaggtcgagatggaccactatcgcgagcccttcctcaagcctgttgaccgagagccactgtggcgattccccaacgagctgcccatcgccggtgagcccgcgaacatcgtcgcgctcgtcgaggcatacatgaactggctgcaccagtcacctgtcccgaagttgttgttctggggcacacccggcgtactgatccccccggccgaagccgcgagacttgccgaaagcctccccaactgcaagacagtggacatcggcccgggattgcactacctccaggaagacaacccggaccttatcggcagtgagatcgcgcgctggctccccgcactctag密碼子選擇由基于2002年8月15日的GenBank Release 131.0(參見Nakamura等，2000)密碼子選擇數據庫(http//www.kazusa.or.jp/codon/)獲得密碼子選擇數據。下載用于以下的密碼子選擇表HS人(Homosapiens)[gbpri]50,031 CDS(21,930,294個密碼子)；MM小鼠(Musmusculus)[gbrod]23,113 CDS(10,345,401個密碼子)；EC大腸桿菌(Escherichia coli)[gbbct]11,985 CDS(3,688,954個密碼子)和EC K12大腸桿菌(Escherichia coli)K12[gbbct]4,291 CDS(1,363,716個密碼子)。對比HS和MM，發現非常相似，因此使用HS表。對比EC和EC K12，發現非常相似，因此使用EC K12表。
選擇密碼子的整體策略是采用的密碼子選擇對在哺乳動物細胞中表達最佳，同時避免低選擇大腸桿菌密碼子。針對每個氨基酸選擇一個“最佳”密碼子，使用其反翻譯需要的蛋白序列，產生起始基因序列。另一個選擇標準是避免高頻率使用含CG二核苷酸的HS密碼子，因為CG甲基化涉及轉錄基因調節，可引起穩定細胞系中基因表達下調。因此，排除所有含CG(8個人密碼子)和TA(4個人密碼子，除Tyr密碼子以外)的密碼子。還要避免密碼子終止在C，因為它們可與下游密碼子形成CG。在保留的密碼子中，選擇在HS中具有最高選擇的密碼子，除非是具有稍微低選擇但在大腸桿菌中具有很高選擇的密碼子。
DhaA基因序列為產生起始DhaA序列，使用Vector NTI 8.0(Informax)中的密碼子選擇表。反翻譯DhaA.v2.1蛋白序列(SEQ ID NO48)，產生起始基因序列hDhaA.v2.1-0，然后如上所述加入側翼序列，產生hDhaA.v2.1-0F(SEQ ID NO49)。DhaA.v2.1MGSEIGTGFPFDPHYVEVLGERMHYVDVGPRDGTPVLFLHGNPTSSYLWRNIIPHVAPSHRCIAPDLIGMGKSDKPDLDYFFDDHVRYLDAFIEALGLEEVVLVIHDWGSALGFHWAKRNPERVKGLACMEFIRPIPTWDEWPEFARETFQAFRTADVGRELIIDQNAFIEGALPKCVVRPLTEVEMDHYREPFLKPVDREPLWREPNELPIAGEPANIVALVEAYMNWLHQSPVPKLLFWGTPGVLIPPAEAARLAESLPNCKTVDIGPGLFYLQEDNPDLIGSEIARWLPGLAG(SEQ ID NO48)hDhaA.v2.1-0FNNNNGCTAGCCAGCTGGCGATATCGCCACCATGGGATCCGAGATTGGGACAGGGTTTCCTTTTGATCCTCATTATGTGGAGGTGCTGGGGGAGAGAATGCATTATGTGGATGTGGGGCCTAGAGATGGGACACCTGTGCTGTTTCTGCATGGGAATCCTACATCTTCTTATCTGTGGAGAAATATTATTCCTCATGTGGCTCCTTCTCATAGATGTATTGCTCCTGATCTGATTGGGATGGGGAAGTCTGATAAGCCTGATCTGGATTATTTTTTTGATGATCATGTGAGATATCTGGATGCTTTTATTGAGGCTCTGGGGCTGGAGGAGGTGGTGCTGGTGATTCATGATTGGGGGTCTGCTCTGGGGTTTCATTGGGCTAAGAGAAATCCTGAGAGAGTGAAGGGGATTGCTTGTATGGAGTTTATTAGACCTATTCCTACATGGGATGAGTGGCCTGAGTTTGCTAGAGAGACATTTCAGGCTTTTAGAACAGCTGATGTGGGGAGAGAGCTGATTATTGATCAGAATGCTTTTATTGAGGGGGCTCTGCCTAAGTGTGTGGTGAGACCTCTGACAGAGGTGGAGATGGATCATTATAGAGAGCCTTTTCTGAAGCCTGTGGATAGAGAGCCTCTGTGGAGATTTCCTAATGAGCTGCCTATTGCTGGGGAGCCTGCTAATATTGTGGCTCTGGTGGAGGCTTATATGAATTGGCTGCATCAGTCTCCTGTGCCTAAGCTGCTGTTTTGGGGGACACCTGGGGTGCTGATTCCTCCTGCTGAGGCTGCTAGACTGGCTGAGTCTCTGCCTAATTGTAAGACAGTGGATATTGGGCCTGGGCTGTTTTATCTGCAGGAGGATAATCCTGATCTGATTGGGTCTGAGATTGCTAGATGGCTGCCCGGGCTGGCCGGCTAATAGTTAATTAAGTAAGCGGCCGCNNNN(SEQ ID NO49)
進一步優化用于鑒別和去除序列模式(motif)的程序和數據庫得自GenomatixSoftware GmbH(Munich，Germany，http//www.genomatix.de)GEMSLauncher Release 3.5.1(2003年4月)、MatInspector professional Release6.1(2003年1月)、Matrix Family Library Ver 3.1.1(2003年4月，包括128個家族中318種脊椎動物矩陣)、ModelInspector professionalRelease 4.8(2002年10月)、Model Library Ver 3.1(2003年3月，226個模塊)、SequenceShaper工具和User Defined Matrices。以優先順序在起始基因序列中去除的序列模式是列于以下的限制酶識別序列；轉錄因子結合序列，包括具有默認記分或更高記分啟動子模塊(即具有確定方向的2個轉錄因子結合位點)，以及最小記分＝0.75/基質＝優化的脊椎動物轉錄因子結合序列；真核轉錄調節位點，包括Kozak序列、剪接供體/受體序列和聚腺苷酸化添加序列；以及原核轉錄調節序列，包括含大腸桿菌啟動子和大腸桿菌RBS(如果在Met密碼子上游少于20bp)。
用戶定義的矩陣DhaA子集形式矩陣名稱(核心相似閾/矩陣相似閾)optimized，優化U$AatII(0.75/1.00)，U$BamHI(0.75/1.00)，U$BglI(0.75/1.00)，U$BglII(0.75/1.00)，U$BsaI(0.75/1.00)，U$BsmAI(0.75/1.00)，U$BsmBI(0.75/1.00)，U$BstEII(0.75/1.00)，U$BstXI(0.75/1.00)，U$Csp45I(0.75/1.00)，U$CspI(0.75/1.00)，U$DraI(0.75/1.00)，U$EC-P-10(1.00/Optimized)，U$EC-P-35(1.00/Optimized)，U$EC-Prom(1.00/Optimized)，U$EC-RBS(0.75/1.00)，U$EcoRI(0.75/1.00)，U$EcoRV(0.75/1.00)，U$HindIII(0.75/1.00)，U$Kozak(0.75/Optimized)，U$KpnI(0.75/1.00)，U$MluI(0.75/1.00)，U$NaeI(0.75/1.00)，U$NcoI(0.75/1.00)，U$NdeI(0.75/1.00)，U$NheI(0.75/1.00)，U$NotI(0.75/1.00)，U$NsiI(0.75/1.00)，U$PacI(0.75/1.00)，U$PflMI(0.75/1.00)，U$PmeI(0.75/1.00)，U$PolyAsig(0.75/1.00)，U$PstI(0.75/1.00)，U$PvuII(0.75/1.00)，U$SacI(0.75/1.00)，U$SacII(0.75/1.00)，U$SaII(0.75/1.00)，U$SfiI(0.75/1.00)，U$SgfI(0.75/1.00)，U$SmaI(0.75/1.00)，U$SnaBI(0.75/1.00)，U$SpeI(0.75/1.00)，U$Splice-A(0.75/Optimized)，U$Splice-D(0.75/Optimized)，U$XbaI(0.75/1.00)，U$XcmI(0.75/1.00)，U$XhoI(0.75/1.00)，以及所有vertebrates.lib。
DhaA-EC子集沒有大腸桿菌特異性序列optimized，優化U$AatII(0.75/1.00)，U$BamHI(0.75/1.00)，U$BglI(0.75/1.00)，U$BglII(0.75/1.00)，U$BsaI(0.75/1.00)，U$BsmAI(0.75/1.00)，U$BsmBI(0.75/1.00)，U$BstEII(0.75/1.00)，U$BstXI(0.75/1.00)，U$Csp45I(0.75/1.00)，U$CspI(0.75/1.00)，U$DraI(0.75/1.00)，U$EcoRI(0.75/1.00)，U$EcoRV(0.75/1.00)，U$HindIII(0.75/1.00)，U$Kozak(0.75/Optimized)，U$KpnI(0.75/1.00)，U$MluI(0.75/1.00)，U$NaeI(0.75/1.00)，U$NcoI(0.75/1.00)，U$NdeI(0.75/1.00)，U$NheI(0.75/1.00)，U$NotI(0.75/1.00)，U$NsiI(0.75/1.00)，U$PacI(0.75/1.00)，U$PflMI(0.75/1.00)，U$PmeI(0.75/1.00)，U$PolyAsig(0.75/1.00)，U$PstI(0.75/1.00)，U$PvuII(0.75/1.00)，U$SacI(0.75/1.00)，U$SacII(0.75/1.00)，U$SalI(0.75/1.00)，U$SfiI(0.75/1.00)，U$SgfI(0.75/1.00)，U$SmaI(0.75/1.00)，U$SnaBI(0.75/1.00)，U$SpeI(0.75/1.00)，U$Splice-A(0.75/Optimized)，U$Splice-D(0.75/Optimized)，U$XbaI(0.75/1.00)，U$XcmI(0.75/1.00)，U$XhoI(0.75/1.00)，以及所有ALL vertebrates.lib。
去除序列模式的策略通過選擇可保留具體蛋白和側翼序列的可替代密碼子，由起始基因序列去除以上列舉的不需要序列模式。以盡可能和整體密碼子選擇策略一致的方式選擇可替代密碼子。
A.一般步驟-通過使用矩陣家族子集“DhaA”或“DhaA-EC”的MatInspector和使用默認設置的ModelInspector鑒別不需要的序列配對。
-用SequenceShaper(保持ORF)鑒別可能替換的密碼子，以去除不需要的序列配對。
-將所有改變加入新版合成基因序列中，用MatInspector和ModelInspector再分析。
B.具體步驟-使用子集“DhaA-EC”和SequenceShaper默認保留閾(0.70/Opt-0.20)去除不需要的序列配對。
-對于使用該方法不能去除的序列配對，使用較低的SequenceShaper保留閾(例如0.70/Opt-0.05)。
-對于仍不能去除的序列配對，嘗試人工選擇替換密碼子的不同組合(尤其是如果需要改變3個以上的堿基時)。如果引入新序列配對，則嘗試使用以上步驟去除(不同的起始序列有時可以有不同的去除方案)。
-使用子集“DhaA”檢查是否引入了有問題的大腸桿菌序列模式，如果是這種情況，則嘗試使用類似于以上用于非大腸桿菌序列的方法去除它們。
對側翼(非讀框)序列使用類似的策略。
C.鑒別和去除推定的CpG島使用的軟件EMBOSS CpGPlot/CpGReporthttp//www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/index.html)(參見Gardiner-Garden等，1987)。
參數默認(修飾)Window100；Step1；Obs/Exp0.6；MinPC50；Length100；Reverse無；Complement無。去除不需要的序列模式后，使用上述軟件檢查基因序列中至少100個堿基的推定CpG島。如果鑒別出CpG島，則通過在某些CG二核苷酸位選擇可保留具體蛋白和側翼序列但不導入新的不需要序列模式的可替代密碼子而去除它們。
D.限制位點導入獨特的MunI/MfeI(C′AATTG)位點，使得可以去除C-末端34個氨基酸，包括C末端附近的推定肉豆蔻化位點(GSEIAR)。導入另一個獨特的NruI位點，使得可以去除C-末端80-100個氨基酸。
hDhaA.v2.1-6F(最終序列，具有側翼序列)NNNNGCTAGCCAGCTGGCgcgGATATCGCCACCATGGGATCCGAGATTGGGACAGGGTTcCCTTTTGATCCTCAcTATGTtGAaGTGCTGGGgGAaAGAATGCAcTAcGTGGATGTGGGGCCTAGAGATGGGACcCCaGTGCTGTTcCTcCAcGGGAAcCCTACATCTagcTAcCTGTGGAGaAAtATTATaCCTCATGTtGCTCCTagtCATAGgTGcATTGCTCCTGATCTGATcGGGATGGGGAAGTCTGATAAGCCTGActtaGAcTAcTTTTTTGATGAtCATGTtcGATActTGGATGCTTTcATTGAGGCTCTGGGGCTGGAGGAGGTGGTGCTGGTGATaCAcGAcTGGGGGTCTGCTCTGGGGTTTCAcTGGGCTAAaAGgAATCCgGAGAGAGTGAAGGGGATTGCTTGcATGGAgTTTATTcGACCTATTCCTACtTGGGAtGAaTGGCCaGAGTTTGCcAGAGAGACATTTCAaGCcTTTAGAACtGCcGATGTGGGcAGgGAGCTGATTATaGAcCAGAATGCTTTcATcGAGGGGGCTCTGCCTAAaTGTGTaGTcAGACCTCTcACtGAaGTaGAGATGGAcCATTATAGAGAGCCcTTTCTGAAGCCTGTGGATcGcGAGCCTCTGTGGAGgTTtCCaAATGAGCTGCCTATTGCTGGGGAGCCTGCTAATATTGTGGCTCTGGTGGAaGCcTATATGAAcTGGCTGCATCAGagTCCaGTGCCcAAGCTaCTcTTTTGGGGGACtCCgGGaGTtCTGATTCCTCCTGCcGAGGCTGCTAGACTGGCTGAaTCcCTGCCcAAtTGTAAGACcGTGGAcATcGGcCCtGGgCTGTTTTAcCTcCAaGAGGAcAAcCCTGATCTcATcGGGTCTGAGATcGCacGgTGGCTGCCCGGGCTGGCCGGCTAATAGTTAATTAAGTAgGCGGCCGCNNNN(SEQ ID NO50)表III顯示了不同DhaA基因(沒有側翼序列)的核酸序列一致性的對比。
表III
a2位加入Gly，H272F、A292G、Ala-Gly加入到C-末端
b密碼子優化表IV提供了不同DhaA基因(沒有側翼序列)的GC含量。
表IV
表V顯示了發現于不同DhaA基因中的脊椎動物轉錄因子結合序列家族(核心相似性0.75/矩陣相似性opt)和啟動子模塊(默認參數優化閾或80％最大分值)。
表V
備注在DhaA.v2.1-0F和DhaA.v2.1-6F中EcoRV之前插入3bp片段以去除3′側翼區的5′結合序列配對。
DhaA.v2.1-6F中保留的轉錄因子結合序列配對包括在5′側翼區家族V$NEUR(NeuroD，β2，HLH域)，最佳匹配NEUROD1的DNA結合位點(β-2/E47二聚體)(MEDLINE9108015)；在可讀框中家族V$GATA(GATA結合因子)，最佳匹配GATA-結合因子1(MEDLINE94085373)，家族V$PCAT(啟動子CCAAT結合因子)，最佳匹配細胞和病毒CCAAT盒，(MEDLINE90230299)，家族V$RXRF(RXR異二聚體結合位點)，最佳匹配Farnesoid X-活化受體(RXR/FXR二聚體)(MEDLINE11792716)；在3′側翼區家族V$HNF1(肝核因子1)，最佳匹配肝核因子1(MEDLINE95194383)，家族V$BRNF(Brn POU域因子)，最佳匹配POU轉錄因子Brn-3(MEDLINE9111308)，家族V$RBIT(B細胞IgH轉錄調節物)，最佳匹配Bright，B細胞IgH轉錄調節物(MEDLINE96127903)，家族V$CREB(Camp-響應元件結合蛋白)，最佳匹配E4BP4，bZIP域，轉錄抑制劑(MEDLINE92318924)，家族V$HOMS(同源域亞家族S8)，最佳匹配S8型同源域結合位點(MEDLINE94051593)，家族V$NKXH(NKX/DLX-同源域位點)，最佳匹配DLX-1、-2和-5結合位點(MEDLINE11798166)，家族V$TBPF(Tata-結合蛋白因子)，最佳匹配鳥C型LTR TATA盒(MEDLINE6322120)和家族V$NKXH(NKX/DLX-同源域位點)，最佳匹配前列腺特異性同源域蛋白NKX3.1(MEDLINE10871372)。
其它保留在hDhaA.v2.1-6F可讀框中的序列模式是Met密碼子上游11b的大腸桿菌RBS(AAGG)和BsmAI限制位點(GTCTC)，大腸桿菌RBS由于保留蛋白序列(Lys-GlyAA(A/G)-GGN)而沒有去除，BsmAI限制位點由于導入轉錄因子結合位點序列而沒有去除。
如采用默認參數的EMBOSS CpGPlot/CpGReport中，分析每種DhaA基因編碼序列中的推定CpG島，結果示于表VI。
表VI
參考文獻Ambler et al.，Biochem.J.，2764710(1991).
Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.III，A.1(3-4)，Supplement 38(1997).
Chalfie，M.and Kain，S.R.，eds.，GFPGreen Fluorescent ProteinStrategies and Applications(Wiley，New York，1998).
Cubitt et al.，Trends Biochem.Sci.，20448(1995).
Eu and Andrade，Luminescence，1657-63(2001).
Farinas et al.，J.Biol.Chem.，2747603(1999).
Franken et al.，EMBO J.，101297(1991).
Gardiner-Garden et al.，J.Mol.Biol.，196261(1987).
Griffin et al.，Science，281269(1998).
Hermanson，Bioconiugate Techniques，Academic Press，San Diego，CA(1996).
Ho et al.，Gene，7751(1989).
Holloway et al.，J.Microbiol.Methods，3231(1998).
Hynkova et al.，FEBS Lett.，446177(1999).
Janssen et al.，Eur.J.Biochem.，17167(1988).
Janssen et al.，J.Bacteriol.，1716791(1989).
Jarvik and Telmer，Ann.Rev.Genet.，32601-618(1998).
Keppler et al.，Nature Biotechnology，2186(2003).
Keuning et al.，J.Bacteriol.，163635(1985).
Kneen et al.，Biophys.J.，741591(1998).
Krooshof et al.，Biochemistry，369571(1997).
Kulakova et al.，Microbiology，143109(1997).
Lakowicz，J.R.Principles of Fluorescence Spectroscopy，New YorkPlenum Press(1983).
Llopis et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，956803(1998).
Miesenb_ck et al.，Nature，394192(1998).
Minasov et al.，J.Am.Chem.Soc.，1245333(2002).
Miyawaki et al.，Nature，388882(1967).
Nagata et al.，Appl.Environ.Microbiol.，633707(1997).
Nakamura et al.，Nucl.Acids.Res.，28292(2000).
Newman et al.，Biochemistry，38，16105(1999).
Orm_ et al.，Science，2731392(1996).
Pries et al.，J.Biol.Chem.，27010405(1995).
Ragaut et al.，Nat.Biotechnol.，171030-1032(1999).
Rosomer et al.，J.Biol.Chem.，27213270(1997).
Sallis et al.，J.Gen.Microbiol.，136115(1990).
Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.1989.
Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，745463(1977).
Savage et al.，Avidin-Biotin ChemistryA Handbook(Pierce ChemicalCompany，Rockford，IL)(1992).
Schindler，Biochemistry，385772(1999).
Scholtz et al.，J.Bacteriol.，1695016(1987).
Silverman，Mechanism-based enzyme in activation，inMethodsEnzymology，249240(1995).
Stroffekova et al.，Eur.J.Physiol.，442859(2001).
Tsien，Ann.Rev.Biochem.，67509(1998).
Yokota et al.，J.Bacteriol.，1694049(1987).
Zawadzke et al.，Protein Engineering，81275(1995).
Zlokamik et al.，Science，27984(1998).
所有的出版物、專利和專利申請都通過引用結合到本文中。盡管在本發明前述說明書中已關于其某些優選實施方案描述了本發明，并為了說明目的闡述了很多細節，但對本領域技術人員顯而易見的是，本發明允許其它的實施方案，本文描述的某些細節可在不背離本發明基本原則的情況下進行相當程度的改變。
序列表<110>Wood，Keith V.
Los，Georgyi V.
Bulleit，Robert F.
Klaubert，DieterMcDougall，MarkZimprich，ChadPromega Corporation<120>官能團與蛋白質的共價束縛<130>341.020WO1<150>US 60/444,094<151>2003-01-31<150>US 60/474,659<151>2003-05-30<160>64<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>31<212>DNA<213>紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)<400>1gcttcacttg tcgtcatcgt ccttgtagtc a 31<210>2<211>31<212>DNA<213>紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)<400>2gcttcacttg tcgtcatcgt ccttgtagtc a 31
<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>3ccgggattgt tctacctcca ggaagac27<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>4ccgggattgg cctacctcca ggaagac27<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>5ccgggattgc agtacctcca ggaagac27<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物
<400>6ccgggattgg gctacctcca ggaagac27<210>7<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>7acgcgtcgac gccgccatgt cagaaatcgg tacaggc37<210>8<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>8ataagaatgc ggccgctcaa gcgcttcaac cggtgagtgc ggggagccag cgcgc 55<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>9ccggtgacta caaggacgat gacgacaagt gaagc 35<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸<400>10gcttcacttg tcgtcatcgt ccttgtagtc a 31<210>11<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>11gcttcacttg tcgtcatcgt ccttgtagtc a 31<210>12<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>12gcttcacttg tcgtcatcgt ccttgtagtc a 31<210>13<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>13cttgggtttg gaagaggtcg tcctggtcat ccactgctgg ggc 43
<210>14<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>14tgagccccag cagtggatga ccaggacgac ctcttccaaa cc 42<210>15<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>15ggaatgggcc ctctagagcg acgatgtca29<210>16<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>16cagtcagtca cgatggatcc gctcaa26<210>17<400>17000<210>18<400>18000
<210>19<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成親和分子<400>19His His His His His1 5<210>20<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成親和分子<400>20His His His His His His1 5<210>21<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成親和分子<400>21Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu1 5 10<210>22<211>8<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>合成親和分子<400>22Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>23<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成親和分子<400>23Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys1 5<210>24<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成親和分子<400>24Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5<210>25<400>25000<210>26<211>45<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸<400>26atcgaaggtc gtgggatccc caggaattcc cgggtcgacg ccgcc 45<210>27<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>27Ile Glu Gly Arg Gly Ile Pro Arg Asn Ser Arg Val Asp Ala Ala1 5 10 15<210>28<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>28tccggatcaa gcttgggcga cgaggtggac ggcgggccct ctagagccac c51<210>29<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>29Ser Gly Ser Ser Leu Gly Asp Glu Val Asp Gly Gly Pro Ser Arg Ala1 5 10 15Thr
<210>30<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>30accggttccg gatcaagctt gcggtaccgc gggccctcta gagcc45<210>31<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>31Thr Gly Ser Gly Ser Ser Leu Arg Tyr Arg Gly Pro Ser Arg Ala1 5 10 15<210>32<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>32tccggatcaa gcttgcggta ccgcgggccc tctagagccg tcgacgccgc c51<210>33<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽
<400>33Ser Gly Ser Ser Leu Arg Tyr Arg Gly Pro Ser Arg Ala Val Asp Ala1 5 10 15Ala<210>34<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>34cttgggtttg gaagaggtcg tcctggtcat ccaccagtgg ggc 43<210>35<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>35tgagccccac tggtggatga ccaggacgac ctcttccaaa cc 42<210>36<211>1053<212>DNA<213>金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)<400>36agcttactat gccattatta ataacttagc catttcaaca ccttctttca aatatttata 60ataaactatt gacaccgata ttacaattgt aatattattg atttataaaa attacaactg 120taatatcgga gggtttattt tgaaaaagtt aatattttta attgtaattg ctttagtttt 180aagtgcatgt aattcaaaca gttcacatgc caaagagtta aatgatttag aaaaaaaata 240taatgctcat attggtgttt atgctttaga tactaaaagt ggtaaggaag taaaatttaa 300ttcagataag agatttgcct atgcttcaac ttcaaaagcg ataaatagtg ctattttgtt 360agaacaagta ccttataata agttaaataa aaaagtacat attaacaaag atgatatagt 420tgcttattct cctattttag aaaaatatgt aggaaaagat atcactttaa aagcacttat 480tgaggcttca atgacatata gtgataatac agcaaacaat aaaattataa aagaaatcgg 540
tggaatcaaa aaagttaaac aacgtctaaa agaactagga gataaagtaa caaatccagt 600tagatatgag atagaattaa attactattc accaaagagc aaaaaagata cttcaacacc 660tgctgccttc ggtaagaccc ttaataaact tatcgccaat ggaaaattaa gcaaagaaaa 720caaaaaattc ttacttgatt taatgttaaa taataaaagc ggagatactt taattaaaga 780cggtgttcca aaagactata aggttgctga taaaagtggt caagcaataa catatgcttc 840tagaaatgat gttgcttttg tttatcctaa gggccaatct gaacctattg ttttagtcat 900ttttacgaat aaagacaata aaagtgataa gccaaatgat aagttgataa gtgaaaccgc 960caagagtgta atgaaggaat tttaatattc taaatgcata ataaatactg ataacatctt 1020atattttgta ttatattttg tattatcgtt gac 1053<210>37<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>37ccggtgatcc aaaaaagaag agaaaggtag atccaaaaaa gaagagaaag gtagatccaa 60aaaagaagag aaaggtatga g 81<210>38<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>38gatcctcata cctttctctt cttttttgga tctacctttc tcttcttttt tggatctacc 60tttctcttct tttttggatc a 81<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>39attatgctga gtgatatccc 20<210>40<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>40ctcggtacca agctccttgt agtca 25<210>41<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>41caaaggtatt gcatgtatgc agttcatccg gcctatcccg 40<210>42<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>42gtcaaaggta ttgcatgtat gctgttcatc cggcctatcc cgac44<210>43<211>36<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸<400>43aggtattgca tgtatggcgt tcatccggcc tatccc 36<210>44<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>44gggctggcaa gccacgtttg gtg 23<210>45<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的改進Kozak序列<400>45gccaccatgg 10<210>46<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>1-36<223>n＝A，T，G，or C
<400>46nnnngctagc cagctggcga tatcgccacc atggga 36<210>47<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>1-34<223>n＝A，T，G，or C<400>47taatagttaa ttaagtaagc ggccgcnnnn30<210>48<211>296<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>48Met Gly Ser Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val1 5 10 15Glu Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp20 25 30Gly Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Leu35 40 45Trp Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Ser His Arg Cys Ile Ala50 55 60Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Asp Tyr65 70 75 80Phe Phe Asp Asp His Val Arg Tyr Leu Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu85 90 95Gly Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu100 105 110
Gly Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala115 120 125Cys Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu130 135 140Phe Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Ala Asp Val Gly Arg145 150 155 160Glu Leu Ile Ile Asp Gln Asn Ala Phe Ile Glu Gly Ala Leu Pro Lys165 170 175Cys Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu180 185 190Pro Phe Leu Lys Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn195 200 205Glu Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu210 215 220Ala Tyr Met Asn Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe225 230 235 240Trp Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu245 250 255Ala Glu Ser Leu Pro Asn Cys Lys Thr Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu260 265 270Phe Tyr Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala275 280 285Arg Trp Leu Pro Gly Leu Ala Gly290 295<210>49<211>948<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>1-948<223>n＝A，C，T，or G<400>49nnnngctagc cagctggcga tatcgccacc atgggatccg agattgggac agggtttcct 60tttgatcctc attatgtgga ggtgctgggg gagagaatgc attatgtgga tgtggggcct 120agagatggga cacctgtgct gtttctgcat gggaatccta catcttctta tctgtggaga 180
aatattattc ctcatgtggc tccttctcat agatgtattg ctcctgatct gattgggatg 240gggaagtctg ataagcctga tctggattat ttttttgatg atcatgtgag atatctggat 300gcttttattg aggctctggg gctggaggag gtggtgctgg tgattcatga ttgggggtct 360gctctggggt ttcattgggc taagagaaat cctgagagag tgaaggggat tgcttgtatg 420gagtttatta gacctattcc tacatgggat gagtggcctg agtttgctag agagacattt 480caggctttta gaacagctga tgtggggaga gagctgatta ttgatcagaa tgcttttatt 540gagggggctc tgcctaagtg tgtggtgaga cctctgacag aggtggagat ggatcattat 600agagagcctt ttctgaagcc tgtggataga gagcctctgt ggagatttcc taatgagctg 660cctattgctg gggagcctgc taatattgtg gctctggtgg aggcttatat gaattggctg 720catcagtctc ctgtgcctaa gctgctgttt tgggggacac ctggggtgct gattcctcct 780gctgaggctg ctagactggc tgagtctctg cctaattgta agacagtgga tattgggcct 840gggctgtttt atctgcagga ggataatcct gatctgattg ggtctgagat tgctagatgg 900ctgcccgggc tggccggcta atagttaatt aagtaagcgg ccgcnnnn 948<210>50<211>951<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>1-951<223>n＝A，T，G，or C<400>50nnnngctagc cagctggcgc ggatatcgcc accatgggat ccgagattgg gacagggttc 60ccttttgatc ctcactatgt tgaagtgctg ggggaaagaa tgcactacgt ggatgtgggg 120cctagagatg ggaccccagt gctgttcctc cacgggaacc ctacatctag ctacctgtgg 180agaaatatta tacctcatgt tgctcctagt cataggtgca ttgctcctga tctgatcggg 240atggggaagt ctgataagcc tgacttagac tacttttttg atgatcatgt tcgatacttg 300gatgctttca ttgaggctct ggggctggag gaggtggtgc tggtgataca cgactggggg 360tctgctctgg ggtttcactg ggctaaaagg aatccggaga gagtgaaggg gattgcttgc 420atggagttta ttcgacctat tcctacttgg gatgaatggc cagagtttgc cagagagaca 480tttcaagcct ttagaactgc cgatgtgggc agggagctga ttatagacca gaatgctttc 540atcgaggggg ctctgcctaa atgtgtagtc agacctctca ctgaagtaga gatggaccat 600tatagagagc cctttctgaa gcctgtggat cgcgagcctc tgtggaggtt tccaaatgag 660ctgcctattg ctggggagcc tgctaatatt gtggctctgg tggaagccta tatgaactgg 720ctgcatcaga gtccagtgcc caagctactc ttttggggga ctccgggagt tctgattcct 780cctgccgagg ctgctagact ggctgaatcc ctgcccaatt gtaagaccgt ggacatcggc 840
cctgggctgt tttacctcca agaggacaac cctgatctca tcgggtctga gatcgcacgg 900tggctgcccg ggctggccgg ctaatagtta attaagtagg cggccgcnnn n 951<210>51<211>882<212>DNA<213>紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)<400>51atgtcagaaa tcggtacagg cttccccttc gacccccatt atgtggaagt cctgggcgag 60cgtatgcact acgtcgatgt tggaccgcgg gatggcacgc ctgtgctgtt cctgcacggt 120aacccgacct cgtcctacct gtggcgcaac atcatcccgc atgtagcacc gagtcatcgg 180tgcattgctc cagacctgat cgggatggga aaatcggaca aaccagacct cgattatttc 240ttcgacgacc acgtccgcta cctcgatgcc ttcatcgaag ccttgggttt ggaagaggtc 300gtcctggtca tccacgactg gggctcagct ctcggattcc actgggccaa gcgcaatccg 360gaacgggtca aaggtattgc atgtatggaa ttcatccggc ctatcccgac gtgggacgaa 420tggccggaat tcgcccgtga gaccttccag gccttccgga ccgccgacgt cggccgagag 480ttgatcatcg atcagaacgc tttcatcgag ggtgcgctcc cgaaatgcgt cgtccgtccg 540cttacggagg tcgagatgga ccactatcgc gagcccttcc tcaagcctgt tgaccgagag 600ccactgtggc gattccccaa cgagctgccc atcgccggtg agcccgcgaa catcgtcgcg 660ctcgtcgagg catacatgaa ctggctgcac cagtcacctg tcccgaagtt gttgttctgg 720ggcacacccg gcgtactgat ccccccggcc gaagccgcga gacttgccga aagcctcccc 780aactgcaaga cagtggacat cggcccggga ttgcactacc tccaggaaga caacccggac 840cttatcggca gtgagatcgc gcgctggctc cccgcactct ag 882<210>52<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>52cttgggtttg gaagaggtcg tcctggtcat ccacgaatgg ggc 43<210>53<211>42<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸<400>53tgagccccat tcgtggatga ccaggacgac ctcttccaaa cc 42<210>54<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>54cttgggtttg gaagaggtcg tcctggtcat ccactactgg ggc 43<210>55<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>55tgagccccag tagtggatga ccaggacgac ctcttccaaa cc 42<210>56<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>56ccagttagat atgacataga attaaattac tattcacc 38
<210>57<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>57ggtgaatagt aatttaattc tatgtcatat ctaactgg 38<210>58<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>58ccagttagat atgagataga attacagtac tattcacc 38<210>59<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>59ggtgaatagt actgtaattc tatctcatat ctaactgg 38<210>60<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物
<400>60ccagttagat atgacataga attacagtac tattcacc 38<210>61<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>61ggtgaatagt actgtaattc tatgtcatat ctaactgg 38<210>62<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>62caacaggtcg acgccgccat gaaagagtta aatgatttag 40<210>63<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>63gtagtcaccg gtaaattcct tcattacact cttggc 36<210>64<211>4<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>合成肽<400>64Asp Glu Val Asp權利要求
1.一種式(I)的化合物R-連接基團-A-X，其中R是一個或多個官能團，其中所述連接基團是含C、N、S或O的多原子直鏈或支鏈，其中A-X為脫鹵素酶底物，其中X為鹵素。
2.權利要求1的化合物，所述化合物為紅球菌(Rhodococcus)脫鹵素酶底物。
3.權利要求1的化合物，其中X為Cl或Br。
4.權利要求1的化合物，其中A為(CH2)n，n＝4-10。
5.權利要求1的化合物，其中所述連接基團包含(CH2CH2O)y，y＝2-8。
6.權利要求1的化合物，其中所述連接基團分隔R和A至少12個原子。
7.權利要求1的化合物，其中所述連接基團含3-30個原子。
8.權利要求1的化合物，其中所述連接基團具有11-30個原子。
9.權利要求1的化合物，所述化合物為
10.權利要求1的化合物，其中至少一個官能團為氨基酸、蛋白、糖蛋白、核酸分子、藥物、脂質、生物素或固相支持體。
11.權利要求1的化合物，其中至少一個官能團為光學可檢測分子。
12.權利要求11的化合物，其中至少一個官能團為熒光團。
13.權利要求1的化合物，其中R是以下的一種 其中R1為C1-C8。
14.權利要求1的化合物，所述化合物包含兩個官能團。
15.權利要求1的化合物，其中至少一個官能團結合Ca2+、結合K+、結合Na+、pH敏感、為放射性核素、電子不透明、為發色團、為MRI造影劑、在NO存在時有熒光或對活性氧敏感。
16.一種突變脫鹵素酶，所述酶相比于對應的野生型脫鹵素酶包含至少一個氨基酸置換，其中所述突變脫鹵素酶與含有一個或多個官能團的脫鹵素酶底物形成鍵，所述鍵比對應的野生型脫鹵素酶和所述底物形成的鍵更穩定，其中所述在突變脫鹵素酶中的至少一個氨基酸置換為在對應野生型脫鹵素酶中與活化水分子相關的氨基酸殘基上的置換，所述水分子裂解對應野生型脫鹵素酶和所述底物形成的鍵，或者所述置換為在對應野生型脫鹵素酶中與所述底物形成酯中間體的氨基酸殘基上的置換，其中在與活化水分子相關殘基上置換后的氨基酸不是谷氨酰胺或天冬酰胺。
17.權利要求16的突變脫鹵素酶，其中所述置換在野生型脫鹵素酶中活化水分子的殘基上。
18.權利要求17的突變脫鹵素酶，其中所述在野生型脫鹵素酶中活化水分子的殘基為組氨酸。
19.權利要求16的突變脫鹵素酶，其中所述置換在野生型脫鹵素酶中與所述底物形成酯中間體的殘基上。
20.權利要求19的突變脫鹵素酶，其中所述在野生型脫鹵素酶中形成酯中間體的殘基為天冬氨酸。
21.權利要求16的突變脫鹵素酶，其中至少一個所述置換在對應于紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)脫鹵素酶氨基酸殘基272的位置上。
22.權利要求21的突變脫鹵素酶，其中所述在對應于氨基酸殘基272位置上的置換后氨基酸是苯丙氨酸、甘氨酸或丙氨酸。
23.權利要求16的突變脫鹵素酶，其中至少一個所述置換在對應于紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)脫鹵素酶氨基酸殘基106的位置上。
24.權利要求23突變脫鹵素酶，其中所述在對應于氨基酸殘基106位置上的置換后氨基酸是半胱氨酸或谷氨酸。
25.權利要求16的突變脫鹵素酶，所述酶還含有目標蛋白，由此形成融合蛋白。
26.權利要求25的突變脫鹵素酶，其中所述目標蛋白為選擇標記蛋白、膜蛋白、胞質蛋白、核內蛋白、結構蛋白、酶、酶底物、受體蛋白、轉運蛋白、轉錄因子、通道蛋白、磷蛋白、激酶、信號蛋白、代謝蛋白、線粒體蛋白、受體相關蛋白、核酸結合蛋白、胞外基質蛋白、分泌性蛋白、受體配體、血清蛋白、免疫原性蛋白、熒光蛋白或具有活性半胱氨酸的蛋白。
27.權利要求16的突變脫鹵素酶，所述酶與對應野生型脫鹵素酶的氨基酸序列一致性至少為85％。
28.一種突變絲氨酸β-內酰胺酶，所述酶相比于對應的野生型絲氨酸β-內酰胺酶包含至少兩個氨基酸置換，其中所述突變絲氨酸β-內酰胺酶與含有一個或多個官能團的絲氨酸β-內酰胺酶底物形成鍵，所述鍵比對應野生型絲氨酸β-內酰胺酶和所述底物形成的鍵以及具有一種置換的突變β-內酰胺酶和所述底物形成的鍵更穩定，其中所述突變絲氨酸β-內酰胺酶中的至少兩個氨基酸置換為在對應野生型絲氨酸β-內酰胺酶中與活化水分子相關的氨基酸殘基上的置換，所述水分子裂解對應野生型絲氨酸β-內酰胺酶和所述底物形成的鍵，并且其中所述突變絲氨酸β-內酰胺酶中的至少兩個氨基酸置換與突變絲氨酸β-內酰胺酶和所述底物形成的鍵的穩定性相關。
29.權利要求28的突變β-內酰胺酶，其中所述置換在對應于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)絲氨酸β-內酰胺酶的氨基酸殘基166和氨基酸殘基170的位置上。
30.權利要求29的突變β-內酰胺酶，其中所述在對應于突變β-內酰胺酶氨基酸殘基166位置上的置換后氨基酸為天冬氨酸。
31.權利要求28的突變β-內酰胺酶，其中所述在對應于突變β-內酰胺酶氨基酸殘基170位置上的置換后氨基酸為谷氨酰胺。
32.權利要求31的突變β-內酰胺酶，其中所述在對應于突變β-內酰胺酶氨基酸殘基166位置上的置換后氨基酸為天冬氨酸，并且所述在對應于突變β-內酰胺酶氨基酸殘基170位置上的置換后氨基酸為谷氨酰胺。
33.權利要求28的突變β-內酰胺酶，所述酶還含有目標蛋白，由此形成融合蛋白。
34.權利要求33的突變β-內酰胺酶，其中所述目標蛋白為選擇標記蛋白、膜蛋白、胞質蛋白、核內蛋白、結構蛋白、酶、酶底物、受體蛋白、轉運蛋白、轉錄因子、通道蛋白、磷蛋白、激酶、信號蛋白、代謝蛋白、線粒體蛋白、受體相關蛋白、核酸結合蛋白、胞外基質蛋白、分泌性蛋白、受體配體、血清蛋白、免疫原性蛋白、熒光蛋白或具有活性半胱氨酸的蛋白。
35.一種檢測或測定突變水解酶存在或量的方法，所述方法包括a)使突變水解酶和包含一個或多個官能團的水解酶底物接觸，其中所述突變水解酶相比于對應的野生型水解酶包含至少一個氨基酸置換，其中所述至少一個氨基酸置換導致所述突變水解酶與所述底物形成的鍵比對應野生型水解酶和所述底物形成的鍵更穩定，其中所述突變水解酶中的至少一個氨基酸置換為對應野生型水解酶中與活化水分子相關的氨基酸殘基上的置換，所述水分子裂解對應野生型水解酶和所述底物形成的鍵，或者所述置換為對應野生型水解酶中與所述底物形成酯中間體的氨基酸殘基上的置換；b)檢測或測定所述官能團的存在或量，由此檢測或測定所述突變水解酶的存在或量。
36.權利要求35的方法，其中所述置換在野生型水解酶中活化水分子的殘基上。
37.權利要求36的方法，其中所述野生型水解酶中活化水分子的殘基為組氨酸。
38.權利要求35的方法，其中所述置換在野生型水解酶中與所述底物形成酯中間體的殘基上。
39.權利要求38的方法，其中所述野生型水解酶中與所述底物形成酯中間體的殘基為天冬氨酸。
40.一種分離樣品中目標分子、細胞或亞細胞器的方法，所述方法包括a)使樣品與含突變水解酶的融合蛋白以及包含一個或多個官能團的水解酶底物接觸，其中所述突變水解酶相比于對應的野生型水解酶包含至少一個氨基酸置換，其中所述至少一個氨基酸置換導致所述突變水解酶與所述底物形成的鍵比對應野生型水解酶和所述底物形成的鍵更穩定，其中所述突變水解酶中的至少一個氨基酸置換為對應野生型水解酶中與活化水分子相關的氨基酸殘基上的置換，所述水分子裂解對應野生型水解酶和所述底物形成的鍵，或者所述置換為對應野生型水解酶中與所述底物形成酯中間體的氨基酸殘基上的置換，其中所述融合蛋白包含結合目標分子、細胞或亞細胞器的蛋白；b)分離所述目標分子、細胞或亞細胞器。
41.權利要求40的方法，其中所述置換在野生型水解酶中活化水分子的殘基上。
42.權利要求41的方法，其中所述野生型水解酶中活化水分子的殘基為組氨酸。
43.權利要求40的方法，其中所述置換在野生型水解酶中與所述底物形成酯中間體的殘基上。
44.權利要求43的方法，其中所述野生型水解酶中與所述底物形成酯中間體的殘基為天冬氨酸。
45.權利要求40的方法，其中至少一個官能團為固相支持體或結合固相支持體的分子。
46.權利要求40的方法，其中所述目標分子為蛋白。
47.一種標記細胞的方法，所述方法包括a)使含突變水解酶的細胞與包含一個或多個官能團的水解酶底物接觸，其中所述突變水解酶相比于對應的野生型水解酶包含至少一個氨基酸置換，其中所述至少一個氨基酸置換導致所述突變水解酶與所述底物形成的鍵比對應野生型水解酶和所述底物形成的鍵更穩定，其中所述突變水解酶中的至少一個氨基酸置換為對應野生型水解酶中與活化水分子相關的氨基酸殘基上的置換，所述水分子裂解對應野生型水解酶和所述底物形成的鍵，或者所述置換為對應野生型水解酶中與所述底物形成酯中間體的氨基酸殘基上的置換；b)檢測或測定所述官能團的存在或量。
48.權利要求47的方法，其中所述置換在野生型水解酶中活化水分子的殘基上。
49.權利要求48的方法，其中所述野生型水解酶中活化水分子的殘基為組氨酸。
50.權利要求47的方法，其中所述置換在野生型水解酶中與所述底物形成酯中間體的殘基上。
51.權利要求50的方法，其中所述野生型水解酶中與所述底物形成酯中間體的殘基為天冬氨酸。
52.權利要求35、40或47任一項的方法，其中所述野生型水解酶為脫鹵素酶。
53.權利要求52的方法，其中所述底物包含R-連接基團-A-X，其中R是一個或多個官能團，其中所述連接基團是含C、N、S或O的多原子直鏈或支鏈，其中A-X為脫鹵素酶底物，其中X為鹵素。
54.權利要求53的方法，其中所述A為(CH2)n，n＝4-10。
55.權利要求53的方法，其中所述連接基團包含(CH2CH2)y，y＝2-8。
56.權利要求53的方法，其中所述連接基團分隔R和A至少12個原子。
57.權利要求35、40或47任一項的方法，其中所述野生型水解酶為絲氨酸β-內酰胺酶。
58.權利要求35、40或47任一項的方法，其中所述突變水解酶存在于細胞中或細胞表面上。
59.權利要求35、40或47任一項的方法，其中至少一個官能團為氨基酸、蛋白、糖蛋白、核酸分子、藥物、脂質、生物素或固相支持體。
60.權利要求35、40或47任一項的方法，其中至少一個官能團為光學可檢測分子。
61.權利要求60的方法，其中至少一個官能團為熒光團。
62.權利要求35、40或47任一項的方法，其中所述底物包含兩個官能團。
63.權利要求35、40或47任一項的方法，其中至少一個官能團結合Ca2+、結合K+、結合Na+、pH敏感、電子不透明、為發色團、為MRI造影劑、為放射性核素、在NO存在時有熒光或對活性氧敏感。
64.權利要求35、40或47任一項的方法，其中細胞中至少一個官能團的存在與所述突變水解酶的亞細胞定位相關。
65.權利要求35、40或47任一項的方法，其中所述突變水解酶還含有目標蛋白，由此形成融合蛋白。
66.權利要求65的方法，其中所述目標蛋白為選擇標記蛋白、膜蛋白、胞質蛋白、核內蛋白、結構蛋白、酶、酶底物、受體蛋白、轉運蛋白、轉錄因子、通道蛋白、磷蛋白、激酶、信號蛋白、代謝蛋白、線粒體蛋白、受體相關蛋白、核酸結合蛋白、胞外基質蛋白、分泌性蛋白、受體配體、血清蛋白、免疫原性蛋白、熒光蛋白或具有活性半胱氨酸的蛋白。
67.權利要求47的方法，其中所述突變水解酶還含有選擇標記蛋白。
68.權利要求67的方法，其中所述底物中的至少一個官能團為熒光團。
69.權利要求68的方法，其中所述突變水解酶與所述底物形成酯鍵。
70.權利要求68的方法，其中所述突變水解酶與所述底物形成硫酯鍵。
71.權利要求47的方法，所述方法還包括在使所述細胞與所述底物接觸之前或之后使所述細胞與固定劑接觸。
72.權利要求47的方法，所述方法還包括在使所述細胞與所述底物接觸的同時使所述細胞與固定劑接觸。
73.權利要求71或72的方法，其中所述細胞用甲醇、丙酮和/或多聚甲醛固定。
74.權利要求67的方法，所述方法還包括在使所述細胞與所述底物接觸之前或之后使所述細胞與固定劑接觸。
75.權利要求67的方法，所述方法還包括在使所述細胞與所述底物接觸的同時使所述細胞與固定劑接觸。
76.權利要求74或75的方法，其中所述細胞用甲醇、丙酮和/或多聚甲醛固定。
77.權利要求52的方法，其中所述突變脫鹵素酶由優化用于在選擇宿主細胞中表達的核酸序列編碼。
78.一種化合物，所述化合物為式II-XXVIII的任一種。
79.一種分離多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼脫鹵素酶的核酸序列，其中所述脫鹵素酶的核酸序列被優化用于在選擇的宿主細胞中表達。
80.權利要求79的分離多核苷酸，其中所述脫鹵素酶為相比于對應的野生型脫鹵素酶包含至少一個氨基酸置換的突變脫鹵素酶，其中所述突變脫鹵素酶與脫鹵素酶底物形成鍵，所述鍵比對應野生型脫鹵素酶和所述底物形成的鍵更穩定，其中所述突變脫鹵素酶中的至少一個氨基酸置換為對應野生型脫鹵素酶中與活化水分子相關的氨基酸殘基上的置換，所述水分子裂解對應野生型脫鹵素酶和所述底物形成的鍵，或者所述置換為對應野生型脫鹵素酶中與所述底物形成酯中間體的氨基酸殘基上的置換。
81.權利要求79的分離多核苷酸，其中所述核酸序列在中等嚴格條件下與SEQ ID NO50或其互補序列雜交。
82.權利要求81的分離多核苷酸，其中所述核酸序列在高嚴格條件下與SEQ ID NO50或其互補序列雜交。
83.權利要求79的分離多核苷酸，其中所述核酸序列編碼的突變脫鹵素酶和對應野生型脫鹵素酶的氨基酸序列一致性至少為85％。
84.權利要求83的分離多核苷酸，其中所述對應的脫鹵素酶由SEQ ID NO51編碼。
85.權利要求79的分離多核苷酸，其中所述核酸序列與SEQ IDNO51的核酸序列一致性低于90％。
86.權利要求79的分離多核苷酸，其中所述核酸序列與SEQ IDNO50的核酸序列一致性至少為90％。
87.一種分離細胞，所述細胞含有融合蛋白編碼多核苷酸，其中所述融合蛋白包含選擇標記蛋白和能夠不可逆或穩定結合含官能團底物或其部分的蛋白。
88.權利要求87的細胞，其中所述官能團為熒光團。
89.權利要求87的分離細胞，其中所述能夠穩定結合含官能團底物的蛋白是突變水解酶，所述酶相比于對應的野生型水解酶包含至少一個氨基酸置換，其中所述突變水解酶與包含熒光團的水解酶底物形成鍵，所述鍵比對應野生型水解酶和所述底物形成的鍵更穩定，其中所述突變水解酶中的至少一個氨基酸置換為對應野生型水解酶中與活化水分子相關的氨基酸殘基上的置換，所述水分子裂解對應野生型水解酶和底物形成的鍵，或者所述置換為對應野生型水解酶中與所述底物形成酯中間體的氨基酸殘基上的置換。
90.權利要求87的分離細胞，其中所述蛋白不可逆地結合含官能團底物的至少一部分。
91.一種標記細胞的方法，所述方法包括使含融合蛋白的細胞和含官能團的底物接觸，所述融合蛋白包含選擇標記蛋白和第二種能夠不可逆或穩定結合所述底物或其一部分的蛋白。
92.權利要求91的方法，其中選擇表達選擇標記蛋白的細胞后使所述細胞與所述底物接觸。
93.權利要求91的方法，其中在使所述細胞與所述底物接觸之后選擇表達選擇標記蛋白的細胞。
94.權利要求91的方法，其中所述官能團為熒光團。
95.權利要求91的方法，所述方法還包括在使所述細胞與所述底物接觸之前或之后使所述細胞與固定劑接觸。
96.權利要求91的方法，所述方法還包括在使所述細胞與所述底物接觸的同時使所述細胞與固定劑接觸。
97.一種突變水解酶，所述酶相比于對應的野生型水解酶包含至少一個氨基酸置換，其中所述突變水解酶與含有一個或多個官能團的水解酶底物形成鍵，該鍵比對應的野生型水解酶和所述底物形成的鍵更穩定，其中所述在突變水解酶中的至少一個氨基酸置換為在對應野生型水解酶中與活化水分子相關的氨基酸殘基上的置換，所述水分子裂解對應野生型水解酶和所述底物形成的鍵，或者所述置換為在對應的野生型水解酶中與所述底物形成酯中間體的氨基酸殘基上的置換，其中在與活化水分子相關的殘基上的置換后氨基酸不是谷氨酰胺或天冬酰胺。
98.權利要求97的突變水解酶，其中所述置換在野生型水解酶中活化水分子的殘基上。
99.權利要求98的突變水解酶，其中所述野生型水解酶中活化水分子的殘基為組氨酸。
100.權利要求97的突變水解酶，其中所述置換在野生型水解酶中與所述底物形成酯中間體的殘基上。
101.權利要求100的突變水解酶，其中所述野生型水解酶中形成酯中間體的殘基為天冬氨酸。
102.權利要求97的突變水解酶，其中至少一個所述置換在對應于紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)脫鹵素酶氨基酸殘基272的位置上。
103.權利要求102的突變水解酶，其中所述在對應于氨基酸殘基272位置上的置換后氨基酸是苯丙氨酸或甘氨酸。
104.權利要求97的突變水解酶，其中至少一個所述置換在對應于紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)脫鹵素酶氨基酸殘基106的位置上。
105.權利要求104的突變水解酶，其中所述在對應于氨基酸殘基106位置上的置換后氨基酸是半胱氨酸或谷氨酸。
106.權利要求97的突變水解酶，其中所述在與活化水分子相關殘基上的置換后氨基酸不是甲硫氨酸、天冬氨酸或丙氨酸。
107.一種制備式R-連接基團-A-X化合物的方法，所述方法包括偶聯式R-Y的化合物和式Z-連接基團-A-X的化合物，其中Y和Z是可反應以將R-與-連接基團-A-X連接的基團。
108.權利要求107的方法，其中R-Y是式R化合物的活化酯，其中Z是適于和所述活化酯反應形成酰胺鍵的胺。
109.一種制備式R-連接基團-A-X化合物的方法，其中所述連接基團含酰胺鍵，所述方法包括偶聯對應的活化酯和對應的胺，以提供式R-連接基團-A-X的化合物。
全文摘要
提供一種任選融合目標蛋白的突變水解酶。所述突變水解酶與對應非突變(野生型)水解酶的底物形成鍵，該鍵比野生型水解酶和所述底物形成的鍵更穩定。還提供包含一個或多個官能團的水解酶底物以及本發明突變水解酶和底物的使用方法。還提供能夠與底物形成穩定鍵的融合蛋白以及表達所述融合蛋白的細胞。
文檔編號G01N33/58GK1764721SQ200480008194
公開日2006年4月26日 申請日期2004年1月30日 優先權日2003年1月31日
發明者凱思·V·伍德, 杰奧基·V·羅斯, 羅伯特·F·布利特, 迪特爾·克勞伯特, 馬克·麥克杜格爾, 查德·齊姆普里茨 申請人:普羅美加公司