專利名稱：豬病毒病診斷性基因芯片及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于診斷豬病毒病的診斷性基因芯片，以及利用所述診斷性基因芯片的制備方法以及用于檢測傳染病的用途。
背景技術：
近年來，我國畜牧業獲得了高速的發展。長期以來，妨礙畜牧業發展和影響養殖業生產的主要問題是所述家禽和/或家畜罹患疫病的威脅，特別是雞和豬罹患傳染病的威脅。由于采用了集約化的飼養方式，雞、豬的交易流通加快，使得豬和雞的傳染病變得更為復雜，常常表現為多種致病病原混合感染，造成疾病診斷上的困難，防治難度也大大相應增加。據報道，在調查的27種雞的傳染病中，混合感染兩種或兩種以上的傳染病，占病例總數的65.1％，其中以傳染性法氏囊病的合并感染最多，常常同時并發雞新城疫，有時也合并大腸桿菌、傳染性喉氣管炎等病。還有報道，1995年初北京部分規模化養豬場仔豬大量死亡，死亡率為63.21％，十日齡仔豬的死亡率為100％，就是由于豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉和輪狀病毒合并感染而致。
目前，對于上述家禽和/或家畜常見疫病的檢測存在諸多困難。對家禽和/或家畜，特別是豬和雞傳染病的診斷目前雖然有一些方法，如病毒分離法、血凝(HA)法、血凝抑制(HI)法、瓊脂擴散法和ELISA法等，但上述傳統檢測方法存在較多缺陷。一方面，由于待測家畜一般都已接種了所述疾病的疫苗，所以不能用檢測抗體的血清學進行診斷。而常用病毒分離的方法，一般需要一到兩周的時間才出結果。還有檢測病毒的ELISA法、熒光抗體法等都比較復雜，需要時間一般要三天，特異性和敏感性不如基因芯片。至于PCR法是比較敏感，但易于污染造成假陽性，特別是RT-PCR難以操作，不易推廣。上述所有方法每次只能檢測一種病原，費時費力，不利于同時大批量檢測復合致病病原的感染。
生物芯片技術是近年來在生命科學領域中迅速發展起來的一項高新技術，它主要是通過微加工技術和微電子技術在固相芯片表面構建的微型生物化學分析系統，以實現對細胞、蛋白質、DNA及其他多種生物成份的準確、快速、大量信息的檢測。常用的生物芯片分為三大類即基因芯片，蛋白質芯片和芯片實驗室。生物芯片的主要特點是高通量，微型化和自動化。
本發明人首次將上述生物芯片技術應用于家禽和/或家畜，特別是雞和豬的傳染病檢測領域，制備了能通過一次檢測診斷多種病原的診斷性基因芯片，從而有效地解決了現有疫病診斷技術不能一次試驗同時檢測多種病原的問題，實現了所需樣品量少、靈敏、特異、快速、費用低廉的家禽和/或家畜，特別是豬和/或雞的傳染病檢測。
發明概述本發明的一個方面涉及一種用于診斷家禽和/或家畜疾病的基因芯片，其選自1)豬常見傳染病診斷基因芯片，用于診斷豬瘟、口蹄疫、偽狂犬病、和/或豬繁殖和呼吸綜合征；2)豬病毒病診斷基因芯片，用于診斷豬瘟、口蹄疫、偽狂犬病、豬傳染性胃腸炎、豬繁殖和呼吸綜合征、豬流感、豬細小病毒病、豬呼吸道冠狀病毒病、豬輪狀病毒病、豬流行性乙型腦炎；3)豬傳染性腹瀉病診斷基因芯片，用于檢測豬大腸桿菌病、豬痢疾、豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、輪狀病毒病；4)豬繁殖障礙綜合癥基因診斷芯片，用于檢測狂犬病、細小病毒病、豬流行性乙型腦炎、豬繁殖和呼吸綜合征；5)雞常見傳染病診斷基因芯片，用于檢測雞新城疫、禽流感、雞馬立克氏病、雞傳染性法氏囊病、雞傳染性支氣管炎、雞傳染性喉氣管炎、禽霍亂、雞沙門氏菌病、大腸桿菌病；6)雞病毒病診斷基因芯片，用于診斷病毒病雞新城疫、禽流感、雞傳染性支氣管炎、雞傳染性法氏囊病、雞傳染性喉氣管炎、雞馬立克氏病、減蛋綜合癥、禽網狀內皮組織增生癥、雞腦脊髓炎、雞傳染性貧血癥；7)雞呼吸道傳染病診斷基因芯片，用于診斷雞呼吸道傳染病，雞新城疫疫、禽流感、雞傳染性支氣管炎、雞傳染性喉氣管炎、雞毒支原體、滑液支原體。
8)動物細菌檢測基因芯片，用于測定相應的致病病原。
本發明的另一個方面，涉及一種本發明所述基因芯片用于檢測家畜和/或家禽疫病的方法，包括如下步驟1)依照待測個體和疾病類型，選用至少一種本發明所述的基因芯片；2)標記待測樣品，3)在適于與所選基因芯片進行雜交的條件下，加入經標記的待測樣品并使之反應足夠的時間；和4)檢測雜交反應的結果。
發明詳述根據目前我國對畜牧業影響最大的豬、雞的傳染病發生情況，本發明設計了用于檢測多種致病病原的診斷用基因芯片，其中所述診斷用基因芯片上具有用于鑒定特定致病病原的DNA片段，其被固定在適于檢測反應的固相載體上。
本發明中所述固相載體可選用本領域周知的那些，只要所述載體與所述反應物相容，不會影響檢測結果。優選的，本發明所述固相載體為硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯、載玻片等。
本發明所述診斷用基因芯片可包含在一個診斷試劑盒中，其中還包括用于診斷反應的相應試劑、緩沖液以及說明書。
本發明的一個方面，公開了一種由豬瘟病毒、口蹄疫病毒、偽狂犬病病毒、和/或豬繁殖和呼吸綜合征病毒病原基因特征性片段構成的豬常見傳染病診斷基因芯片，用于診斷豬瘟(Classical Swine Fever(CSF)或Hog Cholera(HC))、口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease(FMD))、偽狂犬病(Pseudorabies(PR)或Aujeszky’s Disease)、豬繁殖和呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRS)，其中采用如下所述病原基因的特征性片段豬瘟病毒(CSFV)的cDNA片段(參見M.Harding等人，1994年J.Clin.Microbiol.，第31卷10期第2600-2602頁，SEQ ID NO1)。所述豬瘟病毒特征性片段能夠檢測出美國的Baker、BAI株，德國的Glentorf、Osterode、V622株，法國的Alfort、Bas-rhin株，英國的Classical株，加拿大的Windsor株，荷蘭的Henken株，比利時的1821株，馬來西亞的VRI株，巴西的EVI株。而其他病毒和致細胞病變和不致細胞病變的牛病毒腹瀉病毒(BVDV)及邊界病毒(BDV)呈陰性；口蹄疫病毒(FMDV)的cDNA片段(參見，M.C.Hfner等人，1993年J.Virol.Methods第42卷第53-62頁，SEQ ID NO2)，所述特征性片段能檢測出FMDV的O、A、C、SAT 1、SAT 2、SAT 3和Asia1型各毒株，而其他病毒和豬水泡病病毒(SVDV)及牛腸道病毒(BEV-1和BEV-2)呈陰性；偽狂犬病病毒(PRV)的特征性DNA片段(參見，H.Hasebe等人，1993年Vet.Microbiol.第34卷第221-231頁，SEQ ID NO3)，其用于檢測如Becker、Iowa、Shope、4892、5894、Bartha、Bukarest等株PRV，而其他的各種病毒呈陰性；豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)的特征性cDNA片段(參見，S.A.Gilbert等人，1997年J.Clin.Microbiol.第35卷第264-267頁，SEQID NO4)，用于檢測Minnesota MN-1b、Quebec LHVA3、AlbertanPRRS B-9、H-5、U-28、European LV等株PRRS，而其他的各種病毒呈陰性。
在本發明的一個實施方案中，所述固相載體為硝酸纖維素。
本發明的又一方面，公開了一種由豬瘟病毒、口蹄疫病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖和呼吸綜合征病毒、豬流感病毒、豬細小病毒、豬呼吸道冠狀病毒、豬輪狀病毒、豬流行性乙型腦炎病毒病原基因特征性片段構成的豬病毒病診斷基因芯片，其用于診斷豬瘟、口蹄疫、偽狂犬病、豬傳染性胃腸炎(Transmissible Gastroenteritis TGE)、豬繁殖和呼吸綜合征、豬流感(Swine Influenza SI)、豬細小病毒病(Porcine Parvovirus PP)、豬呼吸道冠狀病毒病(Porcine RespiratoryCoronavirus PRC)、豬輪狀病毒病(Porcine Rotavirus PRT)、豬流行性乙型腦炎(Japanese Encephalitis JE)，其中采用如下所述的病原基因的特征性片段豬瘟病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO1)；口蹄疫病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO2)；偽狂犬病病毒特征性片段(同前，SEQ IDNO3)；豬傳染性胃腸炎病毒特征性cDNA片段(參見，1994年J.Clin.Microbiol.，第32卷第1809-1812頁，E.M.Vaughn等人，SEQ IDNO6)，它能檢測出CHV等毒株，而其他與TGEV很接近的豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)的病毒呈陰性；豬繁殖和呼吸綜合征病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO4)；豬流感病毒(SIV)特征性cDNA片段(參見，1994年，Am.J.Vet.Res.，第55卷第952-956頁，E.Schorr等人，SEQ ID NO5)，它能檢測出A/Sw/IN/1726/88、A/Sw/WI/1915/88等毒株，而其他的各種病毒呈陰性；豬細小病毒(PPV)特征性DNA片段(參見，1994年，Am.J.Vet.Res.，第55卷第344-347頁，C.M.Gradil等人SEQ ID NO8)，它能檢測出NADL-8等毒株，而其他的各種病毒呈陰性；豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)特征性cDNA片段(參見，1994年，J.Clin.Microbiol.，第32卷第1678-1812頁，E.M.Vaughn等人，SEQ IDNO7)，它能檢測出ISU-1、1894、LEEP等毒株，而豬傳染性胃腸炎病毒和其他的各種病毒呈陰性；豬輪狀病毒(PRTV)特征性cDNA片段(參見，1994年，J.Clin.Microbiol.，第32卷第1333-1337頁，V.Gouvea等人，SEQ ID NO9)，它能檢測出OSU、Gottfried等毒株，而其他的各種病毒呈陰性；豬流行性乙型腦炎病毒(JEV)特征性cDNA片段(參見，2000年，中國獸醫學報，第20卷第10-14頁，孫明等人，SEQ ID NO10)，它能檢測出A2、JEV活疫苗等毒株，而其他的各種病毒呈陰性。
本發明所述芯片可用于檢測大多數感染豬的病毒，在檢測有無混合感染、繼發感染方面有獨特的用途，還可適用于疫病普查。
本發明的又一方面，公開了由豬大腸桿菌、豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒病原基因特征性片段構成的豬傳染性腹瀉病診斷基因芯片，其用于檢測豬大腸桿菌病(Colibacillosis)、豬痢疾(SwineDysentery SD)、豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉(Porcine EpidemicDiarrhoea PED)、輪狀病毒病，其中采用如下所述病原基因特征性片段豬大腸桿菌特征性片段(參見，1991年，J.Bacteril.，第173卷697-702頁，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO26)；豬痢疾蛇形螺旋體特征性片段(參見，1991年，J.Bacteril.第173卷697-702頁，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO27)；豬流行性腹瀉病毒(PEDV)特征性cDNA片段(參見，1999年，J.VetMed.Sci.，第61卷第827-830頁，S.Kubota等人，SEQ ID NO11)，其能檢測出PEDV CV777、Korean等毒株，而與之相近的TGEV和血凝性腦脊髓炎病毒(HEV)及其他的各種病毒呈陰性；豬輪狀病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO9)。
由于在豬發生的腹瀉中病因比較復雜，單靠臨床癥狀不能確診，要用已有的診斷方法做這幾個病診斷三周也完不成，而用本發明所述基因芯片一天即可完成診斷。
本發明又一方面，公開了由偽狂犬病病毒、豬細小病毒、豬流行性乙型腦炎病毒、豬繁殖和呼吸綜合征病毒病原基因特征性片段構成的豬繁殖障礙綜合癥基因診斷芯片，用于檢測狂犬病、細小病毒病、豬流行性乙型腦炎、豬繁殖和呼吸綜合征，其中采用如下所述病原基因特征性片段偽狂犬病病毒特征性片段(同前，參見SEQ ID NO3)；豬細小病毒特征性片段(同前，參見SEQ ID NO8)；豬流行性乙型腦炎病毒特征性片段(同前，參見SEQ ID NO10)；豬繁殖和呼吸綜合征病毒特征性片段(同前，參見SEQ ID NO4)。
由于上述病原是引起懷孕母豬流產、死胎的主要病原，應用本發明所述基因芯片可較快查明具體由一種或幾種病毒引起的相關疫病。
本發明又一方面，公開了由雞新城疫病毒、禽流感病毒、雞馬立克氏病病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉氣管炎(Infectious Laryngotracheitis ILT)病毒、禽霍亂桿菌、雞沙門氏菌、大腸桿菌病病原基因特征性片段構成的雞常見傳染病診斷基因芯片，用于檢測雞新城疫(Newcastle Disease ND)、禽流感(Avian Influenza AI)、雞馬立克氏病(Marek’s Disease MD)、雞傳染性法氏囊病(Infectious bursalDisease IBD)、雞傳染性支氣管炎(Infectious Bronchitis IB)、雞傳染性喉氣管炎、禽霍亂(Avian Pasteurellosis)、雞沙門氏菌病(Salmonelosis)、大腸桿菌病(Avian Colibacillosis)，其中采用了如下所述的病原基因特征性片段雞新城疫病毒(NDV)特征性cDNA片段(參見，1993年，Avian Dis.，第37卷第724-730頁，Jarecki-Black.J.C等人，SEQ ID NO12)，它能檢測出NDV的HE2、、HE3、、HE11、、B1、、I系、IV系等毒株，而對禽流感病毒(AIV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)及其他的各種病毒呈陰性；禽流感病毒特征性cDNA片段(參見，2000年，J.Vet.Med.B，第47卷第295-301頁，E.Starick等人，SEQ ID NO13)，它能檢測出H1-H13型禽流感病毒(AIV)，而雞新城疫病毒(NDV)、傳染性法氏囔病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)及其他的各種病毒呈陰性；雞馬立克氏病病毒(MDV)的特征性DNA片段(參見，1995年，中國畜牧獸醫學會家畜傳染病學分會第六次學術研討會論文集，第261-264頁，盧春等人，SEQ ID NO14)，它能檢測出MDV 1的京-1、MD11/75等毒株，而MDV2、MDV3、SB-1、FC126株及其他的各種病毒呈陰性；雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的特征性cDNA片段(參見，2000年，Acta virologica，第44卷第259-263頁，R.S.Kataria等人，SEQ IDNO15)，它能檢測出IBDV的WB1/93、JK1/96、CH1/97、UP1/97、KT1/98等毒株，其他的各種病毒呈陰性，同時疫苗株Georgia、Im+、Lukert等在嚴格的雜交條件下也呈現陰性；雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)的特征性cDNA片段(參見，2000年，中國預防獸醫學報，第22卷第64-66頁，王澤霖等人，SEQ ID NO16)，它能檢測出IBV的H120、M41、Conn、Gray、Holte、T、118、宜、上、HK、云、N等12株毒株，NDV、IBDV、EDS-76V等病毒和其他的各種病毒呈陰性；雞傳染性喉氣管炎(ILTV)的特征性DNA片段(參見，1996年，Avian Dis.，第40卷第56-62頁，F.Abbas等人，SEQ ID NO17)，它能檢測出ILTV的88-1453、86-1169、Laryngo-Vac ILTV、88-1059、LT-ivax ILTV等5株毒株，IBRV、FHV、EH1、EH2、PRV、BHV等病毒和其他的各種病毒呈陰性；禽霍亂桿菌特征性DNA(參見，1991年，J.Bacteril.，第173卷697-702頁，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO24)；雞沙門氏菌特征性DNA片段(參見，1992年，Mol.Ceu Probes，第6卷第271-275頁，Rahn K.等人，SEQ ID NO25)，它能檢測出99.4％的沙門氏菌，其他的各種非沙門氏菌屬15種33株細菌發生非特異反應，但均不與標記的invA基因探針雜交。
大腸桿菌病細菌的DNA(參見，1991年，J.Bacteril.，第173卷697-702頁，Weiburg W.G.等人，16s rRNA的通用引物，SEQ ID NO26)。
由于現在采用高密度、大規模、集中飼養的方法養雞，因此雞的傳染病特別易于發生，可以說任何一家養雞場不用疫苗預防傳染病就無法生存。而且由于發病種類十分復雜，主要病原引起疫病不斷變化，還可能混合感染和繼發感染，這就給疫病的及時診斷和防治帶來了困難。采用本發明所述基因芯片，能夠快速、高效、特異、靈敏地及時對復雜致病病原作出診斷。
本發明又一方面，公開了一種由雞新城疫病毒、禽流感病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、雞馬立克氏病病毒、減蛋綜合癥病毒、禽網狀內皮組織增生癥病毒、雞腦脊髓炎病毒、雞傳染性貧血癥病毒病原基因特征性片段構成的雞病毒病診斷基因芯片，用于診斷病毒病雞新城疫、禽流感、雞傳染性支氣管炎、雞傳染性法氏囊病、雞傳染性喉氣管炎、雞馬立克氏病、減蛋綜合癥(EggDrop Syndrom-1976 EDS-76)、禽網狀內皮組織增生癥(AvianReticuloendotheliosis)、雞腦脊髓炎(Avian Encephalomyelitis AE)、雞傳染性貧血癥(Chicken Infectious Anemia CIA)，其中采用如下所述的特征性片段；雞新城疫病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO12)；禽流感病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO13)；雞傳染性支氣管炎病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO16)；雞傳染性法氏囊病病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO15)；雞傳染性喉氣管炎病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO17)；雞馬立克氏病病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO14)；減蛋綜合癥病毒(EDS-76V)特征性DNA片段(參見，1995年，中國畜牧獸醫學會95年全國禽病分子生物學研討會論文集，第116-125頁，張茲均等人，SEQ ID NO18)，它能檢測出珠海、上海、南京、石家莊、長春等分離株，NDV、IBV、ILTV、IBDV、FPV等病毒和其他的各種病毒呈陰性；禽網狀內皮組織增生癥病毒(REV)的特征性cDNA片段(參見，1993年，Avian Pathology，第22卷543-554頁，Aly，M.M.等人，SEQID NO19)，它能檢測出RE病毒，其他的各種病毒呈陰性；雞腦脊髓炎病毒(AEV)的特征性cDNA片段(參見，1999年，AvianDis.，第43卷第219-226頁，D.Todd等人，SEQ ID NO20)，它能檢測出AEV的各種毒株，其他的各種病毒呈陰性；雞傳染性貧血癥病毒(CIAV)的特征性DNA片段(參見，1992年，J.Clin.Microbiol.，第30卷第1661-1666頁，D.Todd等人，SEQ ID NO21)，它能檢測出GIFU-1、TK5803、1/80、1/91、EF 88/78/276、87/10/44、87/11/52、89/3711、89/3713、IMP704、NI CAV-1、NI CAV-2、EF 90-1等13株毒株，其他的各種病毒呈陰性。
本發明所述芯片基本包括了引起雞病的大部分病毒，做普查用十分合適。
本發明又一方面，公開了一種由雞新城疫病毒、禽流感病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、雞毒支原體、滑液支原體病原基因特征性片段構成雞的呼吸道傳染病診斷基因芯片，用于診斷雞新城疫疫、禽流感、雞傳染性支氣管炎、雞傳染性喉氣管炎、雞毒支原體、滑液支原體，其中采用如下所述病原基因特征性片段雞新城疫病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO12)；禽流感病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO13)；雞傳染性支氣管炎病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO16)；雞傳染性喉氣管炎病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO17)；雞毒支原體(MG)的特征性DNA片段(參見，1991年，Avian Dis.，第35卷第62-69頁，Elmiro R.Nascimento等人，SEQ ID NO22)，它能檢測出F-K810、F-F2F10、AAA、Fg38、F(g99)、GM607、S6(208)、S6(C4P8)、PG31、A5969、GM747、K2101、K2101(36P)、R、V503、F.Conn等16株支原體，其他的各種支原體呈陰性；滑液支原體(MS)的特征性DNA片段(參見，1996年，Avian Dis.，第40卷第218-222頁，R.M.Silveira等人，SEQ ID NO23)，它能檢測出MS支原體，其他的各種支原體呈陰性；本發明又一方面，公開了一種由空腸彎桿菌、豬布魯氏菌、支氣管敗血博代氏菌、胸膜肺炎放線桿菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌、豬丹毒桿菌、豬棒狀桿菌病原基因特征性片段構成的動物細菌檢測基因芯片，用于測定相應的致病病原，其中采用如下所述的特征性片段空腸彎桿菌特征性DNA片段(參見，1991年J.Bacteril.，第173卷697-702頁，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO28)；豬布魯氏菌特征性DNA片段(參見，1991年J.Bacteril.，第173卷697-702頁，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO29)；支氣管敗血博代氏菌特征性DNA片段(參見，1991年J.Bacteril.，第173卷697-702頁，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO30)；胸膜肺炎放線桿菌特征性DNA片段(參見，1991年J.Bacteril.，第173卷697-702頁，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO31)；金黃色葡萄球菌特征性DNA片段(參見，1991年J.Bacteril.，第173卷697-702頁，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO32)；豬鏈球菌特征性DNA片段(參見，1991年J.Bacteril.，第173卷697-702頁，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO33)；豬丹毒桿菌特征性DNA片段(參見，1991年J.Bacteril.，第173卷697-702頁，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO34)；豬棒狀桿菌特征性DNA片段(參見，1991年J.Bacteril.，第173卷697-702頁，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO35)。
采用上述基因芯片用16s rRNA保守序列作引物的PCR檢測的特異性和敏感性均為100％，而生化分析和細菌培養的敏感性分別為86.4％和22.7％。
本發明又一方面涉及一種用于檢測家畜和/或家禽疫病的方法，包括如下步驟1)依照待測個體和疾病類型，選用至少一種本發明所述的基因芯片；2)標記待測樣品，3)在適于與所選基因芯片進行雜交的條件下，加入經標記的待測樣品并使之反應足夠的時間；和4)檢測雜交反應的結果。
本領域技術人員知曉，在上述檢測傳染病的方法中需要對待測樣品進行標記。根據所選固相載體的不同，選用不同的標記以及相應的檢測方法。
在本發明的一個實施方案中，采用硝酸纖維素膜作為固相載體，向其上固定具有本發明所選種類致病病原特征性片段，制備診斷用基因芯片，同時對待測樣品以生物素進行標記。本發明中，優選的生物素為光敏生物素和生物素-dUTP。
本領域技術人員知曉，可以采用6-C光敏生物素標記方法比較簡單，它經可見光激發對DNA、RNA進行標記(參見獸醫微生物學1998年中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所編著中國農業出版社出版691頁)。
對于應用熒光素和生物素-dUTP標記待測樣品通常有如下幾種方法1)用多聚寡核苷(dT)引物反轉錄時摻入熒光素(cy3-dUTP)或生物素-dUTP(參見，分子克隆實驗指南中文第三版2002年J.薩姆布魯克等箸黃培堂等譯753-757頁)，這種方法適用于從3’端序列組成的陣列；2)聚6(聚9)隨機引物反轉錄時摻入熒光素(cy3-dUTP)或生物素-dUTP(參見，分子克隆實驗指南中文第三版2002年J.薩姆布魯克等箸黃培堂等譯750-753頁)；3)用上述引物反轉錄時不摻入熒光素或生物素，生成cDNA后再用缺口平移法摻入熒光素或生物素(參見，獸醫微生物學1998年中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所編著中國農業出版社出版690頁)。
在本發明的又一實施方案中，采用經氨基硅烷修飾的載玻片作為固相載體，向其上固定具有本發明所選種類致病病原特征性片段，再經水化和用紫外線照射固定，得到診斷用基因芯片。同時以熒光素標記待測樣品的核酸，用熒光檢測雜交結果。
在本發明中，待測樣品核酸的抽提可采用異硫腈酸胍鹽穩定法，用分光光度計對RNA定量。為了完成cDNA的標記，至少需要100ug的總的RNA。
本發明所述診斷用基因芯片在診斷相應疫病時采用了嚴格的雜交反應條件。依據本發明所選擇的條件，可以實現使大量雜交反應中的大多數反應物處于最佳狀況中，從而使盡可能多的配對物都不遺漏，即假陰性盡可能少，有錯配的雜交降低至最低，即假陽性盡可能的少。
在本發明的一個具體實施方案中，用于所述豬常見傳染病診斷的基因芯片上固定的待測病原基因特征性片段的平均多核苷酸序列長度為294個堿基，所述基因芯片和待測樣品的雜交條件為對于經標記的待測樣品(100ng/ml DNA或RNA)，選擇在約41℃條件下雜交5小時，使用甲酰胺濃度為40％。
在本發明的一個具體實施方案中，用于所述豬病毒病的診斷之基因芯片上固定的待測病原基因特征性片段的平均多核苷酸序列長度為617個堿基，所述基因芯片和待測樣品的雜交條件為對于經標記的待測樣品(200ng/ml DNA或RNA)，選擇在約43℃條件下雜交10小時，使用甲酰胺濃度為50％。
在本發明的一個具體實施方案中，用于所述豬傳染性腹瀉病的診斷之基因芯片上固定的待測病原基因特征性片段的平均多核苷酸序列長度為484個堿基，所述基因芯片和待測樣品的雜交條件為對于經標記的待測樣品(150ng/ml DNA或RNA)，選擇在約42℃條件下雜交8小時，使用甲酰胺濃度為45％。
在本發明的一個具體實施方案中，用于所述豬繁殖障礙綜合征的診斷之基因芯片上固定的待測病原基因特征性片段的平均多核苷酸序列長度為251個堿基，所述基因芯片和待測樣品的雜交條件為對于經標記的待測樣品(100ng/ml DNA或RNA)，選擇在約41℃條件下雜交4小時，使用甲酰胺濃度為40％。
在本發明的一個具體實施方案中，用于所述雞常見傳染病的診斷之基因芯片上固定的待測病原基因特征性片段的平均多核苷酸序列長度為439個堿基，所述基因芯片和待測樣品的雜交條件為對于經標記的待測樣品(150ng/ml DNA或RNA)，選擇在約42℃條件下雜交7小時，使用甲酰胺濃度為45％。
在本發明的一個具體實施方案中，用于所述雞病毒病的診斷之基因芯片上固定的待測病原基因特征性片段的平均多核苷酸序列長度為459個堿基，所述基因芯片和待測樣品的雜交條件為對于經標記的待測樣品(150ng/ml DNA或RNA)，選擇在約42℃條件下雜交6小時，使用甲酰胺濃度為45％。
在本發明的一個具體實施方案中，用于所述雞呼吸道傳染病的診斷之基因芯片上固定的待測病原基因特征性片段的平均多核苷酸序列長度為310個堿基，所述基因芯片和待測樣品的雜交條件為對于經標記的待測樣品(150ng/ml DNA或RNA)，選擇在約43℃條件下雜交7小時，使用甲酰胺濃度為45％。
在本發明的一個具體實施方案中，用于所述動物細菌檢測之基因芯片上固定的待測病原基因特征性片段的平均多核苷酸序列長度為294個堿基，所述基因芯片和待測樣品的雜交條件為對于經標記的待測樣品(100ng/ml DNA)，選擇在約41℃條件下雜交5小時，使用甲酰胺濃度為40％。
在本發明中，采用本領域周知的檢測方法檢測雜交結果。
在本發明的一個實施方案中，對載玻片作固相支持物同時應用熒光素標記的雜交結果，采用激光聚焦掃描儀(型號Scan Array 3000 GSTLumonics Inc制造，)掃讀，得到CY3圖象文件，通過圈點確定雜交范圍，過濾背景噪聲，提取雜交的熒光信號強度值，用預先定的內參照基因對CY3的原始提取信號進行均衡和修正，用ImaGene3.0軟件分析CY3熒光信號的強度和比值。
具體的，用以下兩個條件作為判定雜交陽性的標準。CY3陽性點的熒光信號平均值超過陰性點信號的3倍，比值范圍在2.7-3.3；陰性熒光信號值＜800，CY3陽性熒光信號值減去陰性熒光信號值后＞400。
在本發明的又一具體實施方案中，對硝酸纖維素膜作固相支持物同時應用生物素標記的雜交結果，采用親和素-堿性磷酸酶方法檢測系統(參見，獸醫微生物學1998年中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所編著中國農業出版社出版694頁)檢測，顯色反應在可見光下進行觀測，紫色斑點即為陽性反應。任選的，可使用數碼像機記錄，用計算機軟件對所述雜交結果進行分析。
實施例實施例1基因芯片制備的通用策略關于本發明所述基因芯片的制備，可采用如下詳述的通用策略(一)基于載玻片作為固相支持物的基因芯片1.載玻片處理取載玻片數片，置于2mol/L NaOH的70％乙醇溶液中浸泡2小時，取出后用水蕩洗數次，110℃烘干并冷卻至室溫，將載玻片置于1％的3-氨丙基三乙氧基硅烷95％丙酮溶液中浸泡2分鐘，取出用丙酮洗10次，110℃烘30分并冷卻至室溫備用。
2.點樣依據需要制備的本發明的基因芯片的具體類型，將所述基因芯片中所選擇的病原基因特征性DNA片段各取17μl，加入20×SSC緩沖液3ul混勻，轉移至96孔板中，將板置于pixsys7500 DNAMicroarray system(cartesian Technologies Inc；制造)的點樣平臺上，以3×10排列在處理好的載玻片上制作基因芯片。每份基因芯片中均至少包括一個陽性對照，和一個陰性對照。
將點好的陣列置濕盒中水化5分鐘，取出置100℃平臺上30秒，然后面朝下置于紫外透射儀上，以功率0.5mW/cm2波長230nm紫外光照射18分鐘固定。備用。
(二)基于硝酸纖維素膜作為固相支持物的基因芯片1.硝酸纖維素膜的處理取硝酸纖維素膜，置于2×SSC溶液(20×SSC＝NaCl 175.5g 3Mol/L，檸檬酸鈉C6H5O7Na 2H2O 88.2g 0.3Mol/L，加水溶解，調H至7.0，加水稀釋成1L，濾清，此液稀釋10倍即得2×SSC)，濕潤均勻，放在濾紙上，夾在兩塊玻璃板中，37℃烘干，即可點樣。
2.點樣依據需要制備的本發明的基因芯片的具體類型，將所述基因芯片中所選擇的病原基因特征性DNA片段各取17μl，加入20×SSC緩沖液3ul混勻，以3×3的陣列格式點在硝酸纖維素膜上，將點好的陣列放在濾紙上，夾在兩塊玻璃板中，80℃烘烤2小時，制作基因芯片。每份基因芯片中均至少包括一個陽性對照，和一個陰性對照。
實施例2本發明所述基因芯片檢測待測樣品的通用策略(一)采用生物素標記樣品及其檢測1.待測樣品的標記依照所檢測對象的不同，選擇具體的待測樣本，依照如下方法提取核酸樣品，并對所得待測樣品核酸進行生物素標記i)按RNA提取方法(參見分子克隆實驗指南中文第三版2002年J.薩姆布魯克等箸黃培堂等譯518-522頁)；對待測樣品的核酸進行提取，以提取的核酸作模板，采用RT-PCR方法進行擴增標記，在混合液(80ul)中應用隨機引物(產品號D3801公司TaKaRa)，dNTP(dTTP少加0.5ul)，另加入0.5ul的1mmol/L的Biotin-dUTP進行標記，擴增產物用PCR純化試劑盒(產品號D301，公司TaKaRa)純化，產物最終溶解在適量的5×SSC，0.2％SDS溶液中，終濃度為50mg/L。
ii)光敏生物素標記按RNA提取方法(參見分子克隆實驗指南中文第三版2002年J.薩姆布魯克等箸黃培堂等譯518-522頁)；對待測樣品總RNA進行提取，以提取的核酸作模板，在混合液(100ul)中依照(獸醫微生物學1998年中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所編著中國農業出版社出版691頁)中所述的方法，將需標記的核酸溶液加入離心管中，加入等量的1μg/μl光敏生物素(產品號2133222，公司EZ-link)溶液，充分混勻；光照射25-30分鐘；完畢后，加滅菌水至總體積為100μl，加入100μl仲丁醇，旋渦混合，3000轉/分離心1分鐘，小心吸去上層丁醇相。再如上述加入與溶液等量的丁醇提取一次，吸去丁醇；在此混合液中加入5μl 3mol/L醋酸鈉(NaOOCCH32.46g/10ml)充分混合。加100μl冷無水乙醇，置-70℃分鐘或-20℃過夜，4℃離心15分鐘。棄上清。用80％冷乙醇洗一次，沉淀抽空干燥；沉淀溶于0.1mMol/LEDTA(C10H14N2O8Na44H2O，45.2mg/L)-20℃冷凍保存，或凍干后4℃保存，用紫外法測定標記核酸含量，備用。
2.基因芯片與待測樣品的雜交配制以下溶液1)3％BSA封閉液3gBSA溶于70ml水中，以濃鹽酸調PH至3.0。煮沸20分鐘后至室溫。用10mM NaOH調PH至7.5，加入10ml下述緩沖液(1M Tris-HCl PH7.5；加入MgCl2190mg，Triton X-100 0.05mlNaCl5.8g，溶解，加水到100ml)。
2)50×Denhardt’s溶液1g Ficoll 400聚蔗糖，1g PVP40，1g B溶于水，配成100ml。
3)小牛胸腺DNA的制備100mg/10ml水浸泡軟，攪拌，用無針頭注射器吸入，裝上針頭推出，反復幾次至DNA長鏈斷裂，溶液變稀。
4)1M PBS/LNaCl 18g KCl 0.2g Na2HPO41.44g KH2PO40.24g加蒸餾水800ml，用HCl調到PH7.4，加水補足到1000ml。
5)100mM/L EDTA37.2g EDTA溶于1000ml水中。
6)臨用前按每cm2用80ul的量配制預雜交和雜交液。如用5×10cm2需用4ml預雜交液和雜交液。配制如下預雜交液4ml雜交液4ml試劑 用量 用量甲酰胺2.0ml1.8ml20×SSC 1.0ml1.0ml50×Denhartd’s 0.4ml80ul小牛胸腺DNA*0.2ml80ul光標樣品核酸**80-400ng1M PBS，PH6.4 0.2ml80ul100mM EDTA0.2ml20％硫酸葡聚糖鈉 1.0ml*用前煮沸10分鐘變性，速置冰水中冷卻；**煮沸變性10分鐘冷卻再加入預雜交將點有DNA陣列的膜放入雜交盤圓孔中，加入預雜交液，蓋上蓋玻片，于42℃中預雜交1-2小時。
雜交棄去預雜交液，按量加入雜交液和標記好的樣品核酸，蓋上蓋玻片，根據所選的基因芯片，按照發明詳述部分披露的具體雜交條件，將膜轉移到另外盛有0.1×SSC溶液的孔中洗膜3-4次，準備顯色。
3.雜交結果的檢測1)對于生物素標記的樣品，顯色①用3％BSA封閉液42℃封閉2-4小時；②吸去封閉液，加入4mlAV-AP酶聯液(緩沖液100mM Tris-HClpH7.5，1.0M NaCl，2mM MgCl2，0.05％(v/v)TritonX-100；4ml緩沖液加入親和素-堿磷酸酶(AV-AP)8-16U(1U/ul)，在室溫下避光輕輕振蕩反應15分鐘。
③將膜片移到盛有洗滌液(Tris 1.21g NaCl 5.8g MgCl219mg TritonX-100 0.05ml加80ml水，用HCl調PH至7.5，加水至100ml)的孔中洗滌4次。
④將膜片移到盛有底物溶液(100mM Tris-HCl pH9.5，100mMNaCl，5mM MgCl2)、BCIP(10mgBCIP溶于200ul DMF中)、NBT(15mgNBT溶200ul 70％的DMF中)的孔中，避光放置幾分鐘至1小時，直至出顯蘭紫色斑點，再用水終止反應。
⑤觀察記錄或用數碼像機記錄，用計算機軟件進行分析。
(二)采用熒光素標記樣品及其檢測1.待測樣品的標記按RNA提取方法(參見分子克隆實驗指南中文第三版2002年J.薩姆布魯克等箸黃培堂等譯518-522頁)對待測樣品總RNA進行提取，以提取的核酸作模板，采用RT-PCR方法進行擴增標記，在(體積為80ul)混合液中應用隨機引物(產品號D3801公司TaKaRa)，dNTP(dTTP少加0.5ul)，另加入0.5ul的1mmol/L的Cy3-dUTP進行標記，擴增產物用PCR純化試劑盒(產品號D301公司TaKaRa)純化，產物最終溶解在適量的5×SSC，0.2％SDS溶液中，終濃度為50mg/L。
2.基因芯片與待測樣品的雜交取標記好的待測樣品溶液，加至預先經100℃煮沸30秒變性DNA陣列上，蓋上蓋玻片置于濕盒中，根據所選的基因芯片，按照說明書詳述部分具體披露的雜交條件進行雜交，然后置2×SSC、0.1％SDS溶液中洗5分鐘，0.1×SSC、0.1％SDS溶液中洗5分鐘，0.1×SSC溶液中蕩洗數遍晾干。
3.雜交結果檢測將雜交完畢晾干的DNA陣列用Scan Array 3000(GST LumonicsInc制造)激光共聚焦掃描儀在適當條件下掃描檢測其雜交信號。
實施例3本發明所述基因芯片檢測結果采用本發明所述基因芯片，分別對100例病豬的樣品進行檢測，結果如下在100個樣品中，檢測出病毒CSFV的有17例，FMDV有6例，SIV有4例，PRV有23例，PRRSV有13例，TGEV有7例，PPV4有7例，PRCV有6例，PRTV有14例，JEV有3例。其中3例TGEV和PRTV混合感染，2例PRCV和SIV混合感染，5例CSFV和PRV混合感染，14例PRV和PPV混合感染。
上述檢測結果，與現有技術之病毒分離法、ELISA法，檢測上述病毒符合率為96％。
實施例4采用本發明所述基因芯片，分別對每種病100例病雞的樣品進行檢測，并與現有技術中的血凝抑制法(HI)、病毒分離法(VI)、PCR法進行比較，結果如下表1所示。
表1
從上表可看出基因芯片檢測敏感性高于HI、AI，比PCR略低，但PCR一次只能一種病原，而基因芯片一次能檢出多種病原。
序列表<110>山東澳蘭生物工程研究院<120>豬病毒病診斷性基因芯片及其用途<130>IDC020045<160>35<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>508<212>DNA<213>Classical swine fever<400>1gctcctggtt ggtaacctcg ggaaatcttg ggacggaggt gggagatttg gaacaccttg 60gctgggtgct tagagggcct gctgtttgca agaaggttac cgaacatgag aaatgcacca120catctataat ggataaattg actgcttttt tcggtgttat gccaaggggc accacaccta180gagcccctgt gagattcccc acttccctct taaagataag aagggggtta gaaactggct240gggcgtacac acaccaaggt ggcattagtt cagtggacca tgtcacttgt gggaaagact300tgctggtatg tgacactatg ggccggacaa gggtcgtttg ccaatcaaat aataagatga360cagacgagtc cgagtacgga gttaaaactg actccggatg cccggaagga gctaggtgtt420atgtgttcaa cccagaggca gttaacatat cagggactaa aggagccatg gtccacttac480agaagacttc acctgtgtga cagcatca 508<210>2<211>197<212>DNA<213>foot-and-mouth disease<400>2gaagggccca gggttggact caacattttg gacctcatgc agattccatc acacactttg 60
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ggttggtgta gaactcaacc tgtacctacc acctacctcc aacg 644<210>18<211>238<212>DNA<213>Egg Drop Syndrom-1976<400>18ttggcgtctt caaggcactg tcacccccct tggtgattct atccgcagga tacaagagtc 60tgtgactaca tccggaggaa ggagacagaa acgctttata ggtgctatta tcggcagtgt120agctcttggg gttgcaacag ctgcacagat aacagcagcc tcggccctga tacaagccaa180tcagaatgct gccaacatcc tccggcttaa ggagagcaca gtcagatgca gttgtgtg 238<210>19<211>291<212>DNA<213>Reticuloendotheliosis<400>19catactggag ccaatggttg tcggaaacct aaataatatg cgtgccacct acctggagac 60cttgtctgta agcacaacca agggatttgc ctcagcactc gtcccaaaag tggtgacaca120ggtcggttct gtgatagaag aacttgacac ttcatactgt atagagaccg atttggattt180gtattgtaca agaatagtga cattccctat gtctcctggt atttattcct gtttgaacgg240caatacatcg gcttgcatgt attcaaagac tgagtacttc gatacaacat t 291<210>20<211>140<212>DNA<213>Avian Encephalomyelitis<400>20gtgagacagc taacttgatg atcccggttg gcgcattcaa ggcgcaagat gggccccaga 60tcttctacca ggatcccaat acctctgatg ttgaccatcc ggatcgcgct ggcactgagt120
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<210>30<211>626<212>DNA<213>Bordetella bronchiseptica<400>30agagtttgat ctggctcagc attccctatg tctcctggta tttattcctg tttgaacggc 60aatacatcgg cttgcatgta ttcaaagact gaaggcgcac ttactacgcc atacatgact120ctcaaaggct cagttattgc caattgcaag atgacaacat gcagatgtgc agaccccccg180ggtatcatat cgcaaaatta tggagaagct gtgtctctaa tagataggca ctcatgcaat240gtcttatcct tggacgggat aactttgagg ctcagtgggg aatttgatgc aacttatcaa300aagaatatct caatactaga ttctcaagta atagtgacag gcaatctcga tatctcaact360gagcttggga atgtcaacaa ctcgataagt aatgctttgg ataagttaga ggaaagcaac420agcaaactag acaaagtcaa tgtcaaactg accagcacat ctgctctcat tacctatatc480gctttaactg ccatatctct tgtttgcggt atacttagtc tggttctagc atgctaccta540atgtacaagc aaaaggcgca acaaaagacc ttgttatggc ttgggaataa taccctgggt600cagatgagag gctggatcac ctcctt 626<210>31<211>586<212>DNA<213>Actinobacillus pleuropneumoniae<400>31agagtttgat ctggctcagt cacccccctt ggtgattcta tccgcaggat acaagagtct 60gtgactacat ccggaggaag gagacagaaa cgctttatag gtgctattat cggcagtgta120gctcttgggg ttgcaacagc tgcacagata acagcagcct cggccctgat acaagccaat180cagaatgctg ccaacatcct ccggcttaag gagagcatta ctgcaaccaa tgaagctgta240catgaggtca ctgacggatt atcacaacta gcagtggcag ttgggaagat gcagcagttt300
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1.一種用于診斷豬病毒病的基因芯片，其中包括固定在固相載體上的與待檢致病病原種類相對應的待測致病病原特征性DNA和/或cDNA片段，其中采用的特征性片段由豬瘟病毒、口蹄疫病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖和呼吸綜合征病毒、豬流感病毒、豬細小病毒、豬呼吸道冠狀病毒、豬輪狀病毒、豬流行性乙型腦炎病毒病原基因特征性片段組成，其分別相應于相應于SEQ ID NO1、2、3、6、4、5、8、7、9和10的序列。
2.權利要求1所述的基因芯片，其中所述固相載體選自硝酸纖維素膜、尼龍膜。
3.一種用于檢測豬瘟病毒、口蹄疫病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖和呼吸綜合征病毒、豬流感病毒、豬細小病毒、豬呼吸道冠狀病毒、豬輪狀病毒、豬流行性乙型腦炎病毒的方法，包括如下步驟1)選用權利要求1所述的基因芯片；2)標記待測樣品；3)在適于與所選基因芯片進行雜交的條件下，加入經標記的待測樣品并使之反應足夠的時間；和4)檢測雜交反應的結果。
4.權利要求3所述的方法，其中待測樣品的標記采用生物素。
5.權利要求4所述的方法，其中所述生物素選自光敏生物素和生物素-dUTP。
6.權利要求3所述的方法，其中對于固定有待測病原特征性片段的基因芯片與經標記的待測樣品之雜交條件為對于200ng/mlDNA或RNA，其平均多核苷酸序列長度為617個堿基，在約43℃條件下雜交10小時，使用甲酰胺濃度為50％。
全文摘要
本發明涉及用于診斷豬病毒病的基因芯片，以及利用所述診斷性基因芯片的制備方法以及用于檢測傳染病的用途。
文檔編號C12Q1/68GK1616682SQ20041007890
公開日2005年5月18日 申請日期2002年12月12日 優先權日2002年12月12日
發明者吳時友, 尹燕博 申請人:山東澳蘭生物工程研究院