冬蟲夏草的全人工培養方法

專利名稱：冬蟲夏草的全人工培養方法
技術領域：
本發明提供了冬蟲夏草的全人工培養方法，屬生物領域。
背景技術：
冬蟲夏草是一種名貴的菌類中藥材，是中國被毛孢侵染只生長在3500-5000公尺高寒灌叢草甸的蝙蝠蛾幼蟲產生的有性型。夏初子座出土、孢子未發散時挖取，除去包裹在蟲體外的似纖維狀菌絲體，曬干或低溫干燥。
冬蟲夏草的寄主蝠蛾幼蟲居于土中，中國被毛孢菌侵入蟲體后隨體液的循環并不斷的在幼蟲體內生長繁殖、充滿整個幼蟲體形成菌核，最后從幼蟲頭部抽生出子座。
冬蟲夏草主要分布于我國西南、西北3500公尺以上的高原，主要產區是四川、青海、西藏及云貴高原。由于產區局限，產量稀少，國內外的需求量日益增大，刺激藏民亂采濫挖，生態破壞嚴重，致使冬蟲夏草產量急劇下降，價格直線上升，供求矛盾突出，因此全人工培植冬蟲夏草的研究是恢復草原生態和對人類健康事業的一大貢獻。
在自然界寄主昆蟲完成一個世代需4年以上的時間，這表明形成冬蟲夏草有性型的時間很長；而且在自然界菌、蟲接觸的機率很小，自然侵染率也很低，冬蟲夏草菌侵染寄主蝠蛾幼蟲并形成冬蟲夏草的有性型的百分率自然就很低。
一些生物學專家采用液體深層發酵的方式解決對冬蟲夏草的市場需求，由于應用液體深層發酵生產的只能是冬蟲夏草的菌絲體，只能加工成冬蟲夏草菌絲體的制劑，無法獲得和天然同樣外形的冬蟲夏草，且人們多認可如同天然外形的冬蟲夏草，而全人工培養冬蟲夏草目前尚無相關報道。

發明內容
本發明所要解決的技術方案是，提供冬蟲夏草的全人工培養方法，大量的培養中國被毛孢菌；低海拔環境下規模化室內飼養寄主昆蟲；人工條件下中國被毛孢侵染寄主昆蟲完成冬蟲夏草的有性型。
本發明提供了冬蟲夏草的人工培養方法，它包括下列步驟a、取樣采冬蟲夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.樣本；b、菌種分離分別取冬蟲夏草的菌核(蟲體)部份、子座部份及子囊孢子進行分離、培養得中國被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.)，保藏號為CCTCC No.M87101；c、寄主昆蟲采集、繁殖和飼養首次寄主蝠蛾幼蟲采自海拔3500～5000公尺的草原，在人工規模化條件下經過化蛹、羽化、成蟲、交尾、產卵、孵化、幼蟲飼養，循環進行。
d、侵染取b步驟所得中國被毛孢的菌絲體、分生孢子制成混懸液，侵染c步驟人工繁殖的幼蟲；e、繼續飼養將d步驟經浸染后的幼蟲繼續飼養至呆滯狀態，經低溫4～8℃、光照處理，長出子實體，即得人工培養的冬蟲夏草。
其中步驟a取樣采自四川省甘孜州3500～5000公尺的高寒灌叢草甸的冬蟲夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.樣本。
其中步驟b中菌種分離、培養是將菌核(蟲體)及子座部分經表面消毒、多次無菌水沖洗后，挑取子囊孢子置有培養基的培養裝置中，在8℃～20℃下培養。具體地，可用0.1％升汞液進行表面消毒，無菌水沖洗后切片或切段置培養基培養。
步驟b中所述的分離培養基的物料為含馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、蛋白胨的混合液或含馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、蠶蛹汁的混合液，其中含馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、蛋白胨的混合液的重量配比馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蛋白胨10g，水1000ml。
其中步驟c所述的寄主昆蟲采集、繁殖和飼養的具體步驟為①寄主昆蟲的采集寄主蝠蛾幼蟲首次采自海拔3500～5000公尺的草原；②化蛹化蛹期溫度為10℃～18℃，濕度45％～60％，蛹的歷期20～50天，濕度太低，成蟲羽化時，無法展翅；③羽化蛹的羽化溫度10～18℃，羽化的空氣相對濕度為80～100％；
④成蟲、交尾羽化后的成蟲即可交尾，并人為的提高交尾率；交尾時間最短時間為10多分鐘，最多可達2小時以上，一般在1小時左右；⑤產卵交尾后的雌成蟲即行產卵，當天產完大部份卵，第2天還可產少量的卵，收集卵粒置容器養護；產的卵初時為白色，以后變黑色，有時也可不變色；⑥孵化在10～18℃，相對濕度60～90％，經20～55天即孵化；⑦幼蟲飼養幼蟲飼養溫度8～18℃；濕度40％～50％，幼蟲的飼養溫度高于18℃幼蟲表現出多動、焦躁不安的狀態，不能正常生長發育；低于8℃取食活動減少，生長緩慢，蝠蛾幼蟲比較耐低溫；適當提高生長環境的溫度，能加快幼蟲生長速率，縮短歷期；環境濕度過大容易發病致死；過干則造成幼蟲大量吐絲，蟲體縮小，逐漸死亡，過干過濕均不宜脫皮。整個寄主昆蟲的培育時間共需1年。
冬蟲夏草的寄主有斜脈蝠蛾Hepialus oblifurcus Chu et Wang還有蟲草蝙蝠蛾Hepialus armoricanus oberthür，康定蝠蛾Hepialuskangdingensis Chu et Wang，康姬蝠蛾Hepialus kangdingroides Chuet Wang。中國被毛孢菌的寄主蝠蛾種類較多，已鑒定的有19種(朱弘復、王林瑤，冬蟲夏草與蝙蝠蛾，動物學集刊，1985(3)121-134)，這些種類均可被侵染形成冬蟲夏草有性型。
步驟d所述的侵染方法為將所得的菌絲體、分生孢子制成混懸液，直接置于飼養幼蟲的飼料中或將幼蟲體表皮沾有混懸液中的菌絲及分生孢子，則中國被毛孢菌絲體和分生孢子侵染幼蟲體，并隨幼蟲體液的循環蔓延至幼蟲整體，蟲體消耗貽盡成為幼蟲表皮包裹的菌核，最后從幼蟲頭殼抽生出子座，完成冬蟲夏草的有性型。浸染率在60％以上，而在自然界侵染率僅為15％以下。
幼蟲的致病菌主要有粉狀擬青霉Paecilomyces farinose(Holm exS.F.Gray)Brown & Amith及綠僵菌Metarrhizium sp.，還有一種細菌所致的軟腐病。為了提高幼蟲的成活率，對幼蟲生長空間和幼蟲體需進行定期消毒殺菌處理。
本發明還提供了一種藥物組合物，它是由有效量的冬蟲夏草的全人工培養方法培養的冬蟲夏草為原料與藥學上可接受的輔料或食品中的添加劑制成的藥劑或食品。
其中所述的原料冬蟲夏草中每單位原料中含有甘露醇0.3％～0.4％、腺苷含量為0.03-0.036％，通過對上述成分的控制，達到控制本發明人工培養方法的培養產品質量的目的。
其中所述的藥劑為散劑、膠囊劑、片劑、丸劑、口服液。
采用本發明冬蟲夏草的人工培養方法，低海拔環境下室內規模化飼養寄主昆蟲，從卵孵化到完成冬蟲夏草有性階段只需1年時間，而冬蟲夏草寄主昆蟲在自然界從1齡到8齡老熟幼蟲的歷期在4年以上；人工條件下飼養幼蟲個體大，侵染成功率高，對全人工培養的冬蟲夏草成分檢測表明，本發明方法培養的冬蟲夏草與天然冬蟲夏草成分類同一些成分略高于天然冬蟲夏草，另一些成分基本相同，達到成品質量穩定、可控；人工條件下飼養的寄主幼蟲個體大，質量好，通過藥效試驗充分說明，本發明方法生產冬蟲夏草與天然冬蟲夏草相比，藥效相當，且能克服天然冬蟲夏草生長時間長，自然侵染率低的缺點，滿足市場需求，實現了冬蟲夏草的工廠化生產。
顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。


圖1人工飼養寄主昆蟲的成蟲圖2人工飼養寄主昆蟲的成蟲交尾圖3人工飼養寄主昆蟲的卵圖4人工飼養寄主昆蟲的幼蟲圖5人工飼養寄主昆蟲的蛹圖6中國被毛孢菌落(菌絲及分生孢子)圖7試管內中國被毛孢產生的子實體圖8人工培養的冬蟲夏草
具體實施例方式
實施例1 本發明冬蟲夏草的全人工培養方法1.1樣本的采集冬蟲夏草樣本采自四川甘孜州3500～5000公尺的高寒灌叢草甸。
1.2菌種分離1.2.1分離用的基本培養基馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂，加蛋白胨(簡稱PDA+胨)及馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂，加蠶蛹汁。
其重量配比馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蛋白胨10g，水1000ml。
1.2.2分離方法菌核(蟲體)及子座分離菌核及子座用0.1％升汞液進行表面消毒、無菌水清洗后切成小段或薄片，置于有培養基的培養皿上，在8～18℃下培養。
子囊孢子分離取子座頭部，用0.1％升汞液經表面消毒、無菌水清洗后，置于有培養基的三角瓶或培養皿。子囊孢子成熟后彈射到三角瓶和培養皿內進行培養。也可取成熟的子座在顯微鏡下挑取子囊孢子進行培養。
1.3培養用于產生冬蟲夏草菌絲體和無性孢子的培養基葡萄糖30g、蛋白胨10g、酵母膏10g、蠶蛹粉5g、瓊脂20g、MgSO4 0.5g、KH2PO4 1.0g、水1000ml1.4寄主昆蟲的采集與飼養寄主幼蟲首次采自3500～5000公尺的草原，在人工條件下室內規模化飼養，化蛹，羽化，成蟲交尾，產卵，孵化，幼蟲飼養。
1.5侵染用無菌水洗下中國被毛孢菌菌絲和分生孢子制成懸液，經鏡檢含有一定的孢子量，用孢子懸液接種及孢子懸液添加于飼料等方式進行侵染。
其中寄主昆蟲的采集與飼養方法具體為1、寄主蝠蛾的生境寄主蝠蛾幼蟲采自四川甘孜州海拔3500～5000公尺的高寒灌叢草甸帶。
自然界幼蟲在土中棲息的平均深度為20CM，最深達30CM，最淺5.0CM，幼蟲活動期主要分布于5～25CM深度的土層內，以20CM處為最多，幼蟲在土中活動的深度根據氣溫變化而定。幼蟲在自然界呈聚集分布，這與成蟲不善飛翔，在飛翔中分次間息產卵及幼蟲活動性不大的特點有關。
2、寄主蝠蛾的生物學特性研究2.1成蟲羽化自然界蛹在6月初開始羽化，羽化期約30天，到7月初結束。羽化與溫度關系密切，海拔越高溫度越低，羽化時間愈向后推遲。在自然界羽化率此較低。
羽化時間一般在白天，以下午居多。(圖1)2.2成蟲交尾一般在羽化后就進行交尾，少數可以在第二天交尾。成蟲交尾的關鍵因素是光線。交尾時間最短為15～20分鐘，最長的達2小時，一般都在1小時左右。(圖2)2.3產卵交尾結束，雌蛾開始產卵，產卵時基本沿地面撲飛過程中間歇分次產出，大部卵在當天產出，到第二天尚產有少數卵粒，平均每只雌蛾產卵400粒左右。
2.4卵卵呈橢圓形，開始為乳白色，逐漸變成黑色，轉色時間可以在幾小時之內，也有的要在10小時左右逐漸轉色，也有不轉色的，受精卵并不一定轉色。(圖3)卵期在10～18℃條件下，卵期最短是20天，最長是55天。
孵化率卵的孵化率在40～80％之間。
2.5幼蟲初孵幼蟲白色，長2mm左右，在人工條件下，可把快要孵化的卵放在飼料上，孵化后就在飼料上爬動，取食。(圖4)蟲草蝠蛾在自然界的幼蟲期約需4年多，在人工條件下，無休眠期或滯育現象，大大的縮短了幼蟲期，可在一年左右完成其生活周期。
2.6蛹自然界化蛹始期在5月上中旬，盛期是5月下旬至6月初。蛹期在日平均10～18℃溫度下為20～50天。蛹還需要比較濕潤的環境，達不到一定濕度，成蟲羽化時，無法展翅。(圖5)3、寄主昆蟲飼養條件3.1飼料蝠蛾幼蟲在自然條件中是打隧道取食，溫度決定它在土中的深淺。幼蟲的天然食料是高山的蓼科植物，最主要的是珠芽蓼Polygonumviviparum L.團穗蓼P.sphacrostachyum Meosn.。和小大黃Rheumpumilum Maxim.等三種。
在室內規模化飼養中對多種飼料進行了研究，選擇出的人工飼料取材容易，能滿足幼蟲的營養條件，不改變其筑隧道生活習性，潛入在飼料中取食，食料的濕度容易控制，便于消毒，又能加快幼蟲生長。
用天然食料試驗也取得了滿意結果，幼蟲喜食，生長良好，便于規模化操作。
3.2幼蟲飼養條件溫度幼蟲的飼養溫度一般在8℃以上18℃以下均能正常生長，高于18℃幼蟲表現出多動、焦躁不安的狀態，不能正常生長；低于8℃取食活動減少，生長緩慢。適當提高生長環境的溫度，能加快幼蟲生長速率，縮短歷期。
濕度生長環境濕度太大容易發病致死；過干則造成幼蟲大量吐絲，蟲體縮小，逐漸致死。過干過濕均不宜脫皮，一般人工飼養環境相對濕度控制在40～50％左右為宜。
4.0、分離獲得冬蟲夏草的無性型經進行菌核、子座和子囊孢子分離，獲得了90％以上是同一種真菌，該菌菌落堅硬，隆起，棕黃色或黑褐色，菌絲短而稀疏，有黑色色素滲入培養基。在更換培養基后可以在菌落上形成稀疏的菌絲及分生孢子(圖6)。
4.2、產生子實體在培養基上的菌落經低溫和光照處理，產生的子實體初呈牛角狀，繼續生長可達5厘米多長，色澤同天然冬蟲夏草的子實體。一個菌落可形成一個子實體(圖7)。
4.3、用中國被毛孢菌絲體、分生孢子侵染完全在人工條件下低海拔飼養的寄主昆蟲，形成與天然冬蟲夏草一樣的子實體，證明中國被毛孢是冬蟲夏草的無性型(圖8)實施例2 本發明方法培養的冬蟲夏草的質量控制選用天然冬蟲夏草與本發明全人工培養冬蟲夏草比較，以氨基酸為例樣品經6NHCl水解，溫度110℃，時間24hr，用日立835-50氨基酸分析儀分析，結果如下

本發明方法培養的冬蟲夏草中氨基酸成分略高于天然冬蟲夏草。
以腺苷(C10H13N5O4)活性成分為例對全人工培養冬蟲夏草的測定(《中國藥典》規定測定腺苷(C10H13N5O4)的含量不得少于0.010％)康定產冬蟲夏草全人工冬蟲夏草腺苷(mg/g)0.25-0.3 0.3-0.36通過測定，說明全人工冬蟲夏草中腺苷活性成分和天然冬蟲夏草基本接近，達到質量的可控。
實施例3 本發明方法培養的冬蟲夏草制劑取本發明方法培養的冬蟲夏草300g，直接打粉，裝入膠囊，制成膠囊劑，每顆膠囊含冬蟲夏草藥材0.3g。
以下通過藥效學試驗證明本發明的有益效果。
全人工培養的冬蟲夏草對中樞神經系統有鎮靜作用；對呼吸系統有明顯擴張支氣管作用，并可明顯增強腎上腺素的作用，還有祛痰平喘和防治肺氣腫的作用。
對心血管系統有降低心肌耗氧量、改善心肌缺血、抗血小板聚集、抗心律失常作用。
對內分泌系統有雄性激素樣作用。
實驗例1 對免疫功能的作用1、材料與方法1.1樣品本發明全人工培養冬蟲夏草粉末，日服用量1.8g/60Kg.bw。
1.2實驗動物雌性Balb/c小鼠，體重18-22克。
1.3劑量選擇先用基礎飼料喂養3天后，按隨機分組原則分0.15g/Kg.bw組、0.3g/Kg.bw組，和0.6g/Kg.bw組。實驗組以相應劑量的樣品灌胃，對照組以蒸餾水灌胃，灌胃量為2ml/Kg.bw，每天1次，連續灌胃25天。
1.4實驗方法1.4.1臟器/體重比值測定 連續灌胃25天后，頸椎脫臼處死動物，取出脾臟、胸腺，分析天平分別稱出動物、脾臟、胸腺重量，按公式計算臟器/體重比值(以mg/10g表示)，并進行統計學處理。
1.4.2遲發型變態反應(足跖增厚法)連續灌胃20天后，每只小鼠腹腔注射2％SRBC 0.2ml免疫，繼續灌胃4天后，測量左后足跖厚度，測量3次取平均值；然后在測量部位皮下注射20％(V/V)SRBC，每只20μl。注射后24小時、48小時分別測定左后足跖厚度，測量3次取平均值。計算攻擊前后足跖厚度的差值，以差值表示小鼠DTH的程度，并進行統計學處理。
1.4.3血清溶血素測定(血凝法)連續灌胃20天后，每只小鼠腹腔注射2％SRBC 0.2ml免疫，繼續灌胃5天后，摘除眼球取血于離心管內，放置1小時，剝離，2000rpm離心10分鐘，收集血清，用生理鹽水將血清作倍比稀釋，每份稀釋12孔，將不同稀釋度的血清置于血凝板中，每孔100μl，再加入0.5％SRBC懸液100μl，混勻，置濕盒37℃ 3小時后觀察結果，記錄每孔的凝集程度。按公式計算抗體積數，并進行統計學處理。
1.4.4小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗(半體內法)連續灌胃25天后于每只小鼠腹腔注射20％雞紅細胞懸液1ml，30分鐘后，頸椎脫臼處死，將其固定在鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經腹腔注入生理鹽水2ml，轉動鼠板1分鐘，吸出腹腔洗液1ml，平均滴于2張載玻片上，置濕盒37℃ 30分鐘，取出在生理鹽水中漂洗、涼干、固定，4％Giemsa PBS染色3分鐘，蒸餾水漂洗晾干，鏡檢。按公式計算吞噬百分率和吞噬指數，并進行統計學處理。
1.4.5NK細胞活性測定(乳酸脫氫酶測定法)連續灌胃25天后，頸椎脫臼處死動物，取出脾臟，撕碎，過200目篩網后，用Hank’s液洗3次，用完全1640培養液配成5×106、/ml細胞懸液。將各只小鼠的的細胞懸液取300μl分置于96孔培養板中，每孔100μl，每孔加靶細胞(YAC-1細胞1×105、/ml)100μl，同時取做靶細胞自然釋放孔(靶細胞100μl+培養液100μl)及最大釋放孔(靶細胞100μl+1％NP-40 100μl)各8孔，37℃ 5％ CO2培養4小時，取出，1500rpm離心5分鐘。將各孔上清液100μl置于另一培養板中，每孔再加入100μl基質液，10分鐘后加1mol/L HCl 30μl終止反應，在490nm處測定O.D值，按公式計算NK細胞活性率，并進行統計學處理。
1.5實驗數據統計采用方差分析數據進行處理。
2.0結果2.1對小鼠體重的影響各劑量小鼠的初始體重、中期體重及結束體重分別與對照組小鼠相應時期體重相比，均無顯著性差異，(P＞0.05)表1對小鼠體重的影響(血清溶血素與遲發型變態反應測定組)初始體重中期體重結束體重增長值動物數組別 (g)(X (g)(X± (g)(X (g)(X P值*(只)±S) S)±S)±S)20.32±20.73± 21.99± 1.67±對照組 120.790.97 0.740.380.15g/Kg 20.41± 21.37± 22.20±1.79±11＞0.05.bw組 1.010.97 1.140.510.3g/Kg.
20.32±21.16±22.02±1.70±12＞0.05bw組 0.611.03 0.680.500.6g/Kg.
20.54± 21.47± 22.15±1.61±12＞0.05bw組1.041.34 0.910.33*表示各劑量組與對照組的增重值比較注表格中“X±S”為“X±S”的簡寫。
表2對小鼠體重的影響(吞噬雞紅細胞試驗組)初始體重 中期體重結束體重增長值動物數組別(g)(X±(g)(X (g)(X± (g)(X P值*(只)S) ±S) S) ±S)對照組 20.15± 20.68±21.60±1.46±120.81 1.05 0.770.660.15g/Kg.bw 20.31± 21.39± 22.00±1.69±11 ＞0.05組 0.76 1.01 1.220.800.3g/Kg.bw20.45±21.48± 22.06± 1.61±11 ＞0.05組1.00 1.08 1.080.600.6g/Kg.bw20.51± 21.09± 22.10±1.59±13 ＞0.05組1.10 1.37 1.350.68*表示各劑量組與對照組的增重值比較表3 對小鼠體重的影響(NK細胞活性測定組)初始體重 中期體重 結束體重增長值組別動物數(g)(X (g) (X(g)(X± (g)(X± P值*(只)±S) ±S) S) S)20.17± 21.28± 21.71± 1.54±對照組 11 --0.75 0.690.95 0.670.15g/Kg.bw 20.28± 21.32± 22.01± 1.73±12 ＞0.05組 0.69 0.810.95 0.580.3g/Kg.bw 20.29± 21.57± 22.06± 1.77±組11 ＞0.051.01 0.611.020.570.6g/Kg.bw 20.63± 21.59± 22.25± 1.62±13 ＞0.05組 0.83 1.000.810.63*表示各劑量組與對照組的增重值比較2.2對小鼠臟器/體重比值的影響各劑量分別與對照組小鼠相比，其臟器/體重比值均無顯著性差異(P＞0.05)表4. 對小鼠臟器/體重比值的影響脾臟/體重比值胸腺/體重動物數組別(mg/10g)(X± P1值* 比(mg/10g)P2值*(只)S) (X±S)對照組12 47.73±7.02 --10.34±2.25--0.15g/Kg.bw組 11 48.68±7.58＞0.05 10.91±2.25 ＞0.050.3g/Kg.bw組 11 46.90±8.66＞0.05 11.39±2.60 ＞0.050.6g/Kg.bw組13 46.04±6.86＞0.05 11.34±2.87 ＞0.05*P1各劑量組與對照組脾臟/體重比值比較，P2為各劑量組與對照組胸腺/體重比值比較表5對遲發型變態反應(DTH)的影響抗原攻擊后24小時，各劑量分別與對照組小鼠相比，其足跖腫脹度均有顯著性增高(P＜0.05)；抗原攻擊后48小時，各劑量分別與對照組小鼠相比，其足跖腫脹度均有顯著性增高(P＜0.01)。
表5對小鼠遲發型變態反應(DTH)的影響

*P1各劑量組與對照組24h足跖腫脹度比較，P2為各劑量組與對照組48h足跖腫脹度比較2.4對小鼠血清溶血素產生的影響0.15g/Kg.bw劑量與對照組小鼠相比，其抗體積數有顯著性增高(P＜0.05)；0.3g/Kg.bw劑量、0.6g/Kg.bw劑量與對照組小鼠相比，其抗體積數顯著增高(P＜0.01)。
表6 對小鼠血清溶血素抗體積數的影響組別 動物數(只) 抗體積數(X±S))P值*對照組 12176.83±13.13 --0.15g/Kg.bw組 11192.36±13.59＜0.050.3g/Kg.bw組12197.25±16.94＜0.010.6g/Kg.bw組13197.85±15.92＜0.01
*P表示各劑量組與對照組抗體積數比較2.5對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響各劑量組與對照組小鼠相比，其腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬百分率、吞噬指數均無顯著差異性(P＞0.05)表7. 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響動物數吞噬百分率吞噬指數(X±組別P1值* P2值*(只) (％)(X±S)S)對照組12 32.54±8.07-- 1.09±0.24 --0.15g/Kg.bw11 32.68±8.23 ＞0.051.10±0.26＞0.05組0.3g/Kg.bw11 32.27±9.58 ＞0.051.11±0.27＞0.05組0.6g/Kg.bw13 31.38±7.66 ＞0.051.08±0.29＞0.05組*P1各劑量組與對照組吞噬百分率的比較，P2為各劑量組與對照組吞噬指數比較2.6對小鼠NK細胞活性的影響各劑量組與對照組小鼠相比，其NK細胞活性率均無差異(P＞0.05)表8. 對小鼠NK細胞活性的影響NK細胞活性率(％)組別 動物數(只)P值*(X±S)對照組 11 8.40±2.61--0.15g/Kg.bw組 12 8.62±2.56 ＞0.050.3g/Kg.bw組11 8.36±2.52 ＞0.050.6g/Kg.bw組13 8.29±2.25 ＞0.05*P各劑量組與對照組NK細胞活性率比較3.0小結分別經口給予小鼠(Balb/c)0.15g/Kg.bw、0.3g/Kg.bw，和0.6g/Kg.bw劑量組的全人工冬蟲夏草粉劑25天，在小鼠臟器/體重比值測定中，各劑量組分別與對照組小鼠相比，其臟器/體重比值均無顯著性差異(P＞0.05)；在小鼠遲發型變態反應試驗中，抗原攻擊后24小時，各劑量組分別與對照組小鼠相比，其足跖腫脹度均有顯著性增高(P＜0.05)，抗原攻擊后48小時，各劑量組分別與對照組小鼠相比，其足跖腫脹度均有顯著性增高(P＜0.01)；在小鼠血清溶血素測定試驗中，0.15g/Kg.bw劑量組與對照組小鼠相比，其抗體積數有顯著性增高(P＜0.05)，0.3g/Kg.bw劑量組、0.6g/Kg.bw劑量組與對照組小鼠相比，其抗體積數有顯著增高(P＜0.01)；在小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗中，各劑量組與對照組小鼠相比，其腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬百分率、吞噬指數均無顯著性差異(P＞0.05)。在小鼠NK細胞活性測定試驗中，各劑量組與對照組小鼠相比，其NK細胞活性率均無顯著性差異(P＞0.05)。
結論用天然冬蟲夏草和全人工培養冬蟲夏草進行免疫功能調節作用的試驗表明兩者均有作用無顯著差異。
兩者經口給予小鼠(Balb/c)0.15g/Kg.bw、0.3g/Kg.bw，和0.6g/Kg.bw劑量25天，經測試，兩者各劑量組均可增高小鼠足跖腫脹度(細胞免疫功能)；兩者各劑量組均可增高小鼠抗體積數(體液免疫功能)，說明全人工冬蟲夏草和天然冬蟲夏草一樣具有免疫調節功能。
實驗例2 全人工冬蟲夏草對改善睡眠作用1材料與方法1.1樣品全人工冬蟲夏草粉末，用量1.8g/人/日1.2試驗動物清潔級昆明種雌性鼠，體重18-20g，1.3劑量 300mg/Kg.bw、600mg/Kg.bw，和900mg/Kg.bw(相當于推薦量1.8g/人/日的10、20、30倍)1.4實驗方法1.4.1延長戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠時間試驗成年小鼠隨機分為4組(人工蟲草三個劑量組和陰性對照組)按全人工蟲草水溶液2％體積每天灌胃一次，連續4周。陰性對照組灌蒸餾水。末次灌胃30分鐘后給各組動物腹腔注射戊巴比妥鈉55mg/Kg.bw，觀察并記錄動物的深睡眠(即失去翻正反射)持續時間。分別計算各組動物的平均睡眠時間。
1.4.2戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗分組、灌胃方法和時間均同1.4.1。末次灌胃30分鐘后，按33mg/Kg.bw劑量給各組動物腹腔注射戊巴比妥鈉生理鹽水溶液，觀察注射后30分鐘內的入睡動物數(以翻正反射消失超過2分鐘為判斷入睡的標準)。分別計算各組動物的睡眠發生率。
1.4.3戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠潛伏時間試驗分組、灌胃方法和時間均同1.4.1。末次灌胃30分鐘后給各組動物腹腔注射戊巴比妥鈉240mg/Kg.bw，觀察并記錄注射后動物的入睡時間。分別計算各組動物的平均睡眠潛伏時間(即入睡時間—注射戊巴比妥鈉時間)。
1.5實驗數據統計睡眠發生率用卡方檢驗，睡眠時間、睡眠潛伏時間和體重用方差分析作組間差異的比較。
2.結果2.1對小鼠體重的影響方差分析表明試驗中期和試驗結束時各劑量組動物平均體重與對照組比較無顯著差異(P＞0.05)，表明本試驗品對小鼠生長發育無不良影響。
表9對小鼠體重的影響動物數組別 初始體重(g) 中期體重(g) 結束體重(g)(只)對照組 4118.88±0.81 30.71±1.91 34.37±2.59300mg/Kg..bw4118.88±0.78 29.73±2.29 33.44±2.86600mg/Kg..bw4118.90±0.80 29.83±1.91 34..07±2.61900mg/Kg..bw4118.88±0.78 29.61±1.93 32..95±2.162.2延長戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠時間試驗900mg/Kg.bw劑量組小鼠的平均睡眠時間顯著長于對照組(P＜0.05)，表明本試驗品對高劑量組戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠時間有延長作用。
表10 對戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠時間的影響戊巴比妥鈉劑 睡眠時間(分)劑量mg/Kg.bw動物數(只)P*值量mg/Kg.bw (X±S)對照組5513 74.62±21.3803005513 79..31±18.89＞0.056005513 89..23±18.46＞0.059005513 97..92±29.06＜0.05*與陰性對照組比較2.3戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗900mg/Kg.bw劑量組小鼠的睡眠發生率顯著高于對照組(P＜0.05)，且有較好的劑量—效應關系，即本試驗品可增加戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠發生率。
表11 對閾下劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠發生率的影響戊巴比妥鈉動物數入睡動物數 睡眠發生率劑量 劑量 P*值(％)mg/Kg.bw (只)(只)mg/Kg.bw對照組33 15 2 13.330300 33 15 2 13.33 ＞0.05600 33 15 4 26.67 ＞0.05900 33 15 8 53.33 ＜0.05*與陰性對照組比較2.4戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠潛伏時間試驗各劑量組小鼠的平均睡眠潛伏時間與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)即本試驗品對戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠潛伏時間無明顯影響。
表12對戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠潛伏時間的影響戊巴比妥鈉劑睡眠潛伏時間劑量mg/Kg.bw 動物數(只) P值*量mg/Kg.bw (分) (X±S)對照組240 13 26.54±3.150300240 13 27.08±6.38＞0.05600240 13 26.00±2.35＞0.05900240 13 25.08±6.03＞0.05
*與陰性對照組比較結論本試驗品改善睡眠作用動物試驗結果表明，對小鼠生長發育無不良影響；900mg/Kg.bw劑量組小鼠的平均睡眠時間顯著長于對照組，睡眠發生率顯著高于對照組，且有較好的劑量—效應關系。結論是本試驗品有改善睡眠作用。
此外，本發明方法培養的冬蟲夏草對藥物腎毒性損傷具保護作用；對慢性腎功能衰竭(CRF)的防治作用。
通過上述的質量控制試驗和藥效學試驗充分說明，本發明全人工培養冬蟲夏草的方法，可縮短冬蟲夏草的生長周期，實現規模化生產，且培養的冬蟲夏草中活性成分氨基酸、腺苷可控，質量穩定，通過藥效學試驗說明本發明方法培養的冬蟲夏草與天然冬蟲夏草在藥效學上無顯著性差異，能夠滿足臨床的需要。
權利要求
1.冬蟲夏草的全人工培養方法，它包括下列步驟a、取樣取冬蟲夏草樣本Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.；b、菌種分離分別取冬蟲夏草的菌核部份、子座部份及子囊孢子進行分離、培養得中國被毛孢Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.，保藏號為CCTCC No.M87101；c、寄主昆蟲采集、繁殖和飼養寄主蝠蛾幼蟲首次采自海拔3500～5000公尺的草原，在人工條件下經過化蛹、羽化、成蟲、交尾、產卵，孵化、幼蟲飼養循環進行；d、侵染將b步驟所得的菌絲體、分生孢子步驟制成混懸液，侵染c步驟繁殖的幼蟲；e、繼續飼養將d步驟經浸染后的幼蟲繼續飼養至呆滯狀態，經低溫4～8℃，光照處理，至長出子實體，即得人工培養的冬蟲夏草。
2.根據權利要求1所述的冬蟲夏草的全人工培養方法，其特征在于步驟a取樣采自四川省甘孜州3500～5000公尺的高寒灌叢草甸的冬蟲夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.樣本。
3.根據權利要求1所述的冬蟲夏草的全人工培養方法，其特征在于步驟b中菌種分離是將菌核、子座部份經表面消毒、無菌水沖洗后，挑取子囊孢子置有培養基的培養裝置中，在8℃～20℃進行培養。
4.根據權利要求3所述的冬蟲夏草的全人工培養方法，其特征在于所述的分離培養基的物料為含馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、蛋白胨的混合液或含馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、蠶蛹汁的混合液。
5.根據權利要求1所述的冬蟲夏草的全人工培養方法，其特征在于步驟c所述的寄主昆蟲繁殖和幼蟲飼養的具體步驟為①寄主昆蟲的采集寄主蝠蛾幼蟲首次采自海拔3500～5000公尺的草原；②化蛹化蛹期溫度為10℃～18℃，濕度45％～60％，蛹的歷期20～50天；③羽化蛹的羽化溫度10～18℃，羽化的空氣相對濕度為80～100％；④成蟲、交尾羽化后的成蟲即可交尾，并人為的提高交尾率；⑤產卵交尾后的雌成蟲即行產卵，收集卵粒置容器養護；⑥孵化在10～18℃，相對濕度60～90％的條件下，經20～55天即孵化；⑦幼蟲飼養幼蟲飼養溫度8～18℃，濕度40％～50％。
6.根據權利要求5所述的冬蟲夏草的全人工培養方法，其特征在于步驟①所述的寄主昆蟲為寄主蝠蛾幼蟲，包括蟲草蝙蝠蛾Hepialusarmoricanus oberthür，斜脈蝠蛾Hepialus oblifurcus Chu etWang，康定蝠蛾Hepialus kangdingensis Chu et Wang，康姬蝠蛾Hepialus kangdingroides Chu et Wang。
7.根據權利要求1所述的冬蟲夏草的全人工培養方法，其特征在于步驟d所述的侵染方法為將所得的菌絲體、分生孢子制成混懸液，直接置于飼養幼蟲的飼料中或將幼蟲體表皮沾有混懸液。
8.一種藥物組合物，它是由權利要求1所述的有效量的冬蟲夏草的全人工培養方法培養的冬蟲夏草為原料與藥學上可接受的輔料或食品中的添加劑制成的藥劑或食品。
9.根據權利要求8所述的藥物組合物，其特征在于，所述的每單位原料冬蟲夏草中，甘露醇含量為0.3％～0.4％、腺苷含量為0.03％～0.036％。
10.根據權利要求8所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥劑為散劑、膠囊劑、片劑、丸劑、口服液。
全文摘要
本發明提供了冬蟲夏草的全人工培養方法，它包括取樣、菌種分離、寄主昆蟲采集、繁殖和飼養、侵染、繼續飼養，在人工條件下，大量的培養中國被毛孢菌；低海拔環境下規模化室內飼養寄主昆蟲，完成中國被毛孢侵染寄主昆蟲完成冬蟲夏草的有性型。通過人工培養，寄主幼蟲個體大，質量好，侵染成功率高，時間短，質量穩定、可控，通過藥效試驗充分說明，本發明方法生產冬蟲夏草與天然冬蟲夏草相比，藥效相當，且能克服天然冬蟲夏草生長時間長，自然侵染率低的缺點，滿足市場需求，實現了冬蟲夏草的工廠化生產。
文檔編號C12N1/14GK1560228SQ20041002192
公開日2005年1月5日 申請日期2004年2月27日 優先權日2004年2月27日
發明者俞永信 申請人:俞永信