專利名稱：：新的抗igf－ir抗體及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及能夠與人胰島素樣生長因子I受體IGF-IR特異結合，和/或能夠特異地抑制所述IGF-IR受體的酪氨酸激酶活性的新的抗體，特別是鼠源、嵌合和人源化的單克隆抗體，以及編碼這些抗體的氨基酸和核酸序列。同樣本發明包括應用這些抗體作為過度表達IGF-IR的癌癥或任何與所述受體過度表達有關的病理狀況的預防和/或治療性藥物，以及在與IGF-IR受體過度表達有關的疾病的診斷過程或試劑盒中使用。最后，發明包括了這種抗體與抗EGFR抗體和/或化合物和/或抗癌劑或毒素共軛藥劑聯合的產物和/或組合物，及其預防和/或治療某些癌癥的應用。稱為IGF-IR的胰島素樣生長因子I受體是具有酪氨酸激酶活性的受體，與胰島素受體IR具有70％的同源性。IGF-IR是分子量大約為350,000的糖蛋白。它是雜-四聚受體，每一半均由二硫鍵橋接，由一個細胞外α-亞單位和跨膜β-亞單位構成(見圖1)。IGF-IR以很高的親合力(Kd#1nM)與IGFI和IGFII結合，但同樣能夠以100至不到1000倍的親合力與胰島素結合。相反地，盡管IGF僅能與胰島素受體以低于100倍的親合力結合，IR與胰島素以很高的親合力結合。盡管同源性較弱的區帶分別與位于α-亞單位和β-亞單位的C末端部分上的富含半胱氨酸的區域有關，IGF-IR和IR的酪氨酸激酶結構區具有很高的序列同源性。在α-亞單位上觀察到的序列差異位于配體的結合區帶中，因此對于IGF和胰島素，分別是IGF-IR和IR相對親合力的根源。B-亞單位C末端部分的差異引起了兩種受體信號傳導通路的分歧；IGF-IR介導有絲分裂、分化和抗凋亡效應，而IR的活化主要參與代謝通路水平上的效應(Baserga等人，Biochim.Biophys.Acta，1332F105-126，1997；BasergaR.，Exp.Cell.Res.，2531-6，1999)。細胞質酪氨酸激酶蛋白是通過配體與受體的細胞外結構區結合而被活化。激酶的活化又涉及不同細胞內底物的刺激，包括IRS-1、IRS-2、Shc和Grb10(PeruzziF.等人，J.CancerRes.Clin.Oncol.，125166-173，1999)。IGF-IR的兩個主要底物是IRS和She，它們通過激活大量下游效應器而介導與IGF與其受體附著有關的大多數生長和分化效應(圖2)。因此底物的可利用性決定了與IGF-IR活化有關的最終生物學效應。當IRS-1占優勢時，細胞趨向于增殖和轉化。當Shc占優勢時，細胞趨向于分化(ValentinisB.等人，J.Biol.Chem.27412423-12430，1999)。看起來涉及抗凋亡效應的通路主要是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶)通路(PriscoM.等，Horm.Metab.Res.，3180-89，1999；PeruzziF.等人，J.CancerRes.Clin.Oncol.，125166-173，1999)。IGF系統在癌癥發生中的作用成為最近十年中深入研究的主題。這種興趣是基于以下的發現，即除了促有絲分裂和抗凋亡特性外，IGF-IR似乎是建立和維持轉化表現型所需要的。實際上，已經很詳細地了解IGF-IR的過度表達或結構性活化在絕大多數細胞中可引起細胞的生長，而不依賴于無胎牛血清培養基的支持，并在裸鼠中形成腫瘤。這本身并不是一種獨特的特性，因為過度表達基因的大多數產物可轉化細胞，包括很多生長因子的受體。但是，清楚證明IGF-IR在轉化作用中扮演的主要地位的重要發現顯示，IGF-IR編碼基因被滅活的R細胞對通常能夠轉化細胞的不同藥劑的轉化作用完全沒有反應，這些藥劑如牛乳頭狀瘤病毒E5蛋白、過度表達的EGFR或PDGFR、SV40的T抗原、活化的ras或這后兩種因子的聯合(SellC.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，9011217-11221，1993；SellC.等人，Mol.Cell.Biol.，143604-3612，1994；MorrioneA.J.，Virol.，695300-5303，1995；CoppolaD.等人，Mol.Cell.Biol.，144588-4595，1994；DeAngelisT等人，J.Cell.Physiol.，164214-221，1995)。IGF-IR在大量的腫瘤和腫瘤細胞系中表達，IGF通過其與IGF-IR的附著而增強腫瘤的生長。其他贊成IGF-IR在癌癥發生中地位的說法來自采用針對受體的鼠單克隆抗體或采用IGF-IR的功能失活物的研究。事實上，針對IGF-IR的鼠單克隆抗體抑制大量的培養細胞系的增殖和體內腫瘤細胞的生長(ArteagaC.等人，CancerRes.，496237-6241，1989；Lietal.，Biochem.Biophys.Res.Com.，19692-98，1993；ZiaF等人，J.Cell.Biol.，24269-275，1996；ScotlandiK等人，CancerRes.，584127-4131，1998)。而且在Jiang等人的工作中已經顯示(Oncogene，186071-6077，1999)IGF-IR的功能失活物能夠抑制腫瘤的增殖。本發明的目的是能夠獲得鼠單克隆抗體，優選嵌合的或人源化的抗體，它能夠特異地識別IGF-IR，并具有很高的親合力。這種抗體與胰島素上的IR受體將很少作用或根本不起作用。在體外其附著將能夠抑制表達IGF-IR的腫瘤的生長，主要是與IGF1/IGF-IR和IGF2/IGF-IR相互作用的過程中活化的信號轉導通路發生作用。在體內這種抗體在所有類型表達IGF-IR的腫瘤上都將是有活性的，這些腫瘤包括雌激素依賴性乳腺腫瘤和前列腺腫瘤，它們不是目前可獲得的抗IGF-IR單克隆抗體(書寫為MAb或MAB)可以作用的。實際上，αIR3是指IGF-IR的結構區，可在體外完全抑制雌激素依賴性乳腺腫瘤的生長(MCF-7)，但對相應的體內模型卻沒有效果(ArteagaC.等人，J.Clin.Invest.841418-1423，1989)。相同的方式，來自鼠單克隆1H7的scFv-Fc片段在乳腺腫瘤MCF-7上僅有微弱的活性，在雄激素非依賴性前列腺腫瘤上完全是無活性的(LiS.L.等人，CancerImmunol.Immunother.，49243-252，2000)。發明者以一種令人驚訝的方式證明了一種嵌合抗體(記為C7C10)和兩種人源化抗體，分別稱為h7C10人源化型1和h7C10人源化型2，鼠單克隆抗體7c10的衍生物，可識別IGF-IR，并對應于上述的所有標準，也就是說，不識別胰島素上的受體，體外可阻斷誘導的IGF1和/或IGF2增殖，但同樣在體內可抑制不同的表達IGF-IR的腫瘤的生長，其中有骨肉瘤和非小細胞肺腫瘤，更特別的是雌激素依賴性乳腺腫瘤MCF-7和雄激素非依賴性前列腺腫瘤DU-145。同樣以令人驚訝的方式，體內抗體7c10抑制腫瘤MCF-7細胞生長的強度與他莫西芬所觀察到的結果是可以相對比的，甚至是明顯優于后者，他莫西芬是治療雌激素依賴性乳腺腫瘤中的一個參考化合物。而且，已經顯示這些抗體可抑制IGF-IR和IRS1的β鏈的酪氨酸的磷酸化，受體的第一個底物。而且，同樣也已經明確的是這些抗體可引起所述受體的內化及其降解，這與通常天然配體所觀察的是相反的，后者可使受體在細胞表面上迅速再循環。通過其肽和核酸序列，特別是決定其與IGF-IR互補性(CDR)的區域的序列已經可能來定性這些抗體。因此，根據第一個實施例，本發明的一個主題是分離的抗體，或其功能片段之一，所述的抗體或其片段之一能特異與人胰島素樣生長因子I受體結合，如果需要，更優選能抑制IGF-IR的配體IGF1和/或IGF2的自然附著和/或，能夠特異地抑制所述IGF-IR受體的酪氨酸激酶活性，該抗體或其片段的特征是它所包含的輕鏈含有選自氨基酸序列SEQIDNo2，4或6的CDR的至少一個互補決定區CDR，或至少一個在序列最優排列后與序列SEQIDNO2、4或6具有至少80％，優選85％，90％，95％和98％同一性的CDR，或者特征是含有的重鏈含有選自氨基酸序列SEQIDNO8、10、12的CDR的至少一個CDR，或至少一個在序列最優排列后與序列SEQIDNO8、10和12具有至少80％，優選85％，90％，95％和98％同一性的CDR。在本發明描述中，術語“結合”和“附著”具有相同的含義，可互換。在本發明描述中，術語多肽、多肽序列、附著于抗體化合物或其序列的肽和蛋白是可以互換的。在此必須理解的是發明不涉及天然形式的抗體，也就是說，它們并不處在其自然環境下，但它們已經能被分離或通過從天然來源中純化獲得，或通過基因重組獲得，或通過化學合成，然后它們將如進一步要描述的那樣可含有非天然的氨基酸。通過CDR區或CDR，要指出的是如Rabat等人所定義的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的超變區(Rabat等人，Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thEd.，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，NIH，1991，和后續的版本)。存在3個重鏈CDR和3個輕鏈CDR。根據情況，在此術語CDR或CDR用來表示這些區域之一或幾個，或甚至全部這些區域，它們含有結合作用所需要的大多數氨基酸殘基，所述結合作用是通過抗體與抗原或它識別的抗原決定簇的親合力實現的。就本發明而言，通過兩條核酸或氨基酸序列之間的“同一性百分比”，要指出的是在最佳排列(最優排列)后獲得的，要比較的兩條序列之間的核苷酸或相同氨基酸殘基的百分比，這個比例是純統計學數字，要隨機分布的兩條序列之間的差異和在其整個長度上。兩條核酸或氨基酸序列之間序列的比較一般是通過在以最優方式排列后比較這些序列來進行的，所述的比較能夠通過片段或通過“比較窗”來執行。除了人工操作以外，比較所需要的序列最優排列可通過Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法[Ad.App.Math.2482]，Neddleman和Wunsch(1970)的局部同源性算法[J.Mol.Biol.48443]，Pearson和Lipman(1988)的相似性搜索法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444)，采用這些算法的計算機軟件(WisconsinGenetics軟件包中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup，575ScienceDr.，Madison，WI，或通過BLASTN或BLASTP比較軟件)來執行。兩條核酸或氨基酸序列之間同一性的百分比可通過比較以最優方式排列的兩條序列來確定，其中要比較的核酸或氨基酸序列可根據兩條序列之間的這些最優排列的參考序列可含有一些添加和缺失。同一性百分比的計算可通過確定相同位點的數目，對于此位點兩條序列之間核酸或氨基酸殘基是相同的，通過在比較窗中將此相同位點的數目除位點的總數，將獲得的結果乘100，獲得兩條序列之間的同一性百分比。例如，可使用BLAST程序，“BLAST2序列”(Tatusova等人，“Blast2序列-一種新的比較蛋白和核酸序列的新工具”，FEMSMicrobiolLett.174247-250)，它在站點http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html上可獲得，參數使用缺省參數(特別是參數“開放間隙補償”5，和“擴展間隙補償”2；選擇的矩陣，是例如，程序所建議的″BLOSUM62″)，要比較的兩條序列之間的同一性百分比通過程序直接計算。對與參考氨基酸序列具有至少80％，優選85％，90％，95％和98％同一性的氨基酸序列，就參考序列而言，優選那些具有某些修飾作用，特別是缺失，添加或取代至少一個氨基酸，截斷或延伸的序列。在一個或多個連續或非連續氨基酸取代的情況下，取代作用優選被取代的氨基酸由“等效”的氨基酸替換。在此“等效氨基酸”的表述是指能被基本結構的氨基酸之一取代，但實質上不影響相應抗體生物學活性的任何氨基酸，這將在后面詳述，特別是在實例中。這些等效氨基酸可根據其與它們替換的氨基酸的結構同源性，或根據能被實施的不同抗體之間生物學活性對比試驗的結果來確定。通過實例，要注意能進行而不引起相應修飾的抗體的生物學活性發生復雜的修飾作用的取代作用的可能性。因此可能用纈氨酸替換亮氨酸，谷氨酸替換天冬氨酸，天冬酰胺替換谷氨酰胺，賴氨酸替換精氨酸等，在相同條件下相反的取代作用自然也是可行的。根據本發明的抗體優選特異的單克隆抗體，特別是鼠，嵌合或人源化來源的，可根據本領域專業技術人員所熟知的標準方法獲得。通常，對于單克隆抗體或其功能片段的制備，特別是鼠源性的，可能要提到特別是在手冊“抗體”(Harlow和Lane，抗體實驗室手冊，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborNY，726頁，1988)中所描述的技術或Kohler和Milstein所描述的來自雜交瘤的制備技術(Nature，256495-497，1975)。根據本發明單克隆抗體的獲得，例如可來自IGF-IR受體或含有根據本發明由所述單克隆抗體特異識別的抗原決定簇的其片段之一免疫的動物細胞。所述的IGF-IR受體，或其所述片段之一，根據通常的工作方法，可特別地通過基因重組產生，由包含在編碼IGF-IR受體的cDNA序列中的核酸序列起始，或通過肽合成產生，由IGF-IR受體的肽序列中包含的氨基酸序列起始。例如，根據本發明，單克隆抗體可在親合柱上被純化，柱上以前已經固定了IGF-IR受體或其片段之一，根據本發明該片段含有由所述單克隆抗體特異識別的抗原決定簇。更特殊的是，所述單克隆抗體可通過蛋白A和/或G層析純化，然后進行或不進行離子交換層析，主要是為了消除殘留的蛋白污染物以及DNA和LPS，由于二聚體或其他多聚體的存在，其本身在Sepharose凝膠上進行或不進行排除層析以消除潛在的聚集物。以更為優選的方式，整體這些技術可同時使用或連續使用。根據本發明，嵌合或人源化抗體也包括在抗體中。對于嵌合抗體，要指出的是抗體含有來自指定物種抗體的天然可變區(輕鏈和重鏈)，以及與所述指定物種不同的物種抗體的輕鏈和重鏈恒定區。根據本發明抗體或其嵌合型片段可采用基因重組技術來制備。例如，嵌合抗體可通過克隆重組DNA而產生，該DNA含有一個啟動子，和編碼根據本發明的非人、特別是鼠源單克隆抗體可變區的序列，和編碼人抗體恒定區的序列。由這樣一種重組基因編碼的發明的嵌合抗體，例如，將是一個鼠-人的嵌合體，這種抗體的特異性由來自鼠DNA的可變區確定，其同種型則由來自人DNA的恒定區確定。對于制備嵌合抗體的方法，例如可能是指Verhoeyn等人的文章(BioEssays，874，1988)。對于人源化抗體，要指出的是抗體含有來自非人來源抗體的CDR區，抗體分子的其他部分來自一個(或幾個)人抗體。而且，骨架片段的一些殘基(稱為FR)可被修飾以保留結合的親合力(Jones等人，Nature，321522-525，1986；Verhoeyen等人，Science，2391534-1536，1988；Riechmann等人，Nature，332323-327，1988)。根據本發明人源化抗體或其片段可通過本領域專業技術人員已知的技術來制備(例如，在Singer等人，J.Immun.1502844-2857，1992；Mountain等人，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.，101-142，1992；或Bebbington等人，Bio/Technology，10169-175，1992等文章中所描述的)。根據本發明這些人源化抗體優選用于體外診斷方法中，或體內預防和/或治療性的處理。對于根據本發明的功能性片段，要特別指出的是抗體片段，如Fv，scFv(單鏈為sc)，Fab，F(ab’)2＞Fab’，scFv-Fc片段或雙抗體，或任何可通過化學修飾作用增加半衰期的片段，如添加聚(烯基)乙二醇如聚(乙烯)乙二醇(“PEGylation”)(pegylated片段稱為Fv-PEG，scFv-PEG，Fab-PEG，F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG)(對聚(乙烯)乙二醇為“PEG”)，或摻入進一個脂質體，根據本發明所述的片段具有至少一個序列SEQIDNO2，4，6，8，10或12的特征性CDR，特別是因為這樣能夠以普通的方式發揮它所來源的抗體的部分活性，如特別是識別和結合IGF-IR受體的能力，如果需要，可抑制IGF-IR受體的活性。優選地，所述的功能片段將組成或含有它所來源抗體的重或輕可變鏈的部分序列，就IGF-IR受體而言，所述的部分序列足以保持與它所來源抗體相同的結合特異性，足夠的親合力，優選至少等于它所來源抗體的1/100，更優選的是至少1/10。這樣一種功能性片段將含有它所來源抗體的最小5個氨基酸，優選10，15，25，50和100個連續氨基酸序列。優選地，這些功能片段是Fv，scFv，Fab，F(ab’)2，F(ab’)，scFv-Fc型片段或一個完整體，后者通常與它所來源的抗體具有相同的結合特異性。根據本發明，發明的抗體片段可從如上所述的抗體通過如酶消化的方法，如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶和/或通過化學還原切斷二硫鍵而獲得。另一種方式是，本發明中包含的抗體片段可通過本領域專業技術人員所熟知的基因重組技術獲得，或通過肽合成，使用例如自動肽合成儀，如由AppliedBiosystems等公司供應的儀器。以更優選的方式，發明包含抗體，或其功能片段，根據本發明，特別是通過基因重組或化學合成獲得的嵌合或人源化抗體。在一個優選的實施例中，發明的主題是一種抗體或其功能片段之一，根據本發明，其特征是它含有一條重鏈，含有序列SEQIDNO12的一個CDR，或在最優排列后與序列SEQIDNO12具有至少80％同一性的序列。在六個短的CDR序列中，重鏈(CDRH3)的第三個CDR具有更大的大小可變性(根本上是由于賦予其的基因排列機制獲得更大的多樣性)。盡管最長的大小已知為26，但可短至2個氨基酸。從功能上說，CDRH3在決定抗體的特異性中具有很重要的地位(Segal等人，PNAS，714298-4302，1974；Amit等人，Science，233747-753，1986；Chothia等人，J.Mol.Biol.，196901-917，1987；Chothia等人，Nature，342877-883，1989；Caton等人，J.Immunol.，1441965，1968，1990；Sharon等人，PNAS，874814-4817，1990；Sharon等人，J.Immunol.，1444863-4869，1990；Rabat等人，J.Immunol.，1471709-1719，1991)。已知CDR的氨基酸中僅有很少比例能參與構建抗體的結合位點，但這些殘基必須保持非常特殊的三維構型。以更優選的方式，本發明涉及一種抗體或其功能片段之一，根據本發明其特征是它含有一條重鏈，含有序列SEQIDNO8，10和12中的三個CDR或三個CDR中的至少兩個，或在最優排列后分別與序列SEQIDNO8，10和12具有至少80％同一性的序列中的三個CDR或三個CDR中的至少兩個。同樣在一個優選的實施例中，本發明的主題是一種抗體或其功能片段之一，根據本發明，其特征是它含有一條輕鏈，含有選自序列SEQIDNO2，4或6中CDR的至少一個CDR，或一個CDR，其序列經最優排列后與序列SEQIDNO2，4或6具有至少80％同一性。在一個更優選的實施例中，發明的主題是一種抗體或其功能片段之一，其特征是它含有一條輕鏈，含有序列SEQIDNO2，4和6中的三個CDR或三個CDR中的至少兩個，或在最優排列后分別與序列SEQIDNO2，4和6具有至少80％同一性的序列中的三個CDR或三個CDR中的至少兩個。以更優選的方式，根據本發明的抗體或其功能片段之一的特征是它含有一條重鏈，含有序列SEQIDNO8，10和12中的三個CDR，或在最優排列后分別與序列SEQIDNO8，10和12具有至少80％同一性的序列中的三個CDR，而且它含有一條輕鏈，含有序列SEQIDNO2，4和6中的三個CDR，或在最優排列后分別與序列SEQIDNO2，4和6具有至少80％同一性的序列中的三個CDR。根據另一個方面，本發明的一個主題是一種抗體或其功能片段之一，根據本發明其特征是它不能附著或它不能以顯著的方式附著于人胰島素受體IR。以一種優選的方式，根據本發明所述的功能片段將選自片段Fv，scFv，Fab，(Fab’)2，Fab’，scFv-Fc或雙抗體，或任何通過化學修飾可增加半衰期的功能片段，特別是通過PEGylation，或摻入進脂質體中。根據本發明的另一個方面，本發明涉及能夠分泌一種單克隆抗體的鼠雜交瘤，特別是鼠源性雜交瘤如CentreNationaldeCultureDeMicroorganisms(CNCM，NationalCenterofMicroorganismCulture)(InstitutPasteur，Paris，France)在2001年9月19日存放的，序號1-2717。在此稱為7C10的單克隆抗體，或其功能片段之一，其特征是所述抗體由2001年9月19日在CNCM存放，序號為1-2717的雜交瘤分泌，當然它也是本發明的一部分。在一個特殊的實施例中，本發明涉及一種鼠抗體，或其功能片段之一，根據本發明，其特征是所述抗體含有一條輕鏈的序列，后者包含氨基酸序列SEQIDNO54，或在最優排列后與序列SEQIDNO54具有至少80％同一性的序列，或/和它含有一條重鏈序列，后者包含氨基酸序列SEQIDNO69，或在最優排列后與SEQIDNO69具有至少80％同一性的序列。同樣根據一個特殊的方面，本發明涉及一種嵌合抗體，或其功能片段之一，根據本發明，其特征是所述抗體進一步含有來自與鼠不同物種，特別是人抗體的輕鏈和重鏈恒定區，優選地來自人抗體的輕鏈和重鏈恒定區分別是κ和γ-1，γ-2或γ-4區。同樣根據一個特殊的方面，本發明涉及人源化抗體或其功能片段之一，根據本發明，其特征是所述抗體包含一條輕鏈和/或一條重鏈，其中所述輕鏈和/或重鏈的骨架節段FR1至FR4(suchasdefinedbelowinexamples12and13，intables5and6)分別來自人抗體輕鏈和/或重鏈骨架節段FR1至FR4。根據一個優選的實施例，人源化抗體或其功能片段之一，根據本發明，其特征是所述人源化抗體含有一條輕鏈，它含有氨基酸序列SEQIDNO61或65，或在最優排列后與序列SEQIDNO61或65具有至少80％同一性的序列，或/和，它含有一條重鏈，它含有氨基酸序列SEQIDNO75，79或83，或在最優排列后與序列SEQIDNO75，79或83具有至少80％同一性的序列。優選地，人源化抗體，或其功能片段之一，根據本發明，其特征是所述人源化抗體含有一條輕鏈，它包含氨基酸序列SEQIDNO65，并因此含有一條重鏈序列，它包含氨基酸序列SEQIDNO79或83，優選SEQIDNO83。根據一個新的方面，本發明涉及一種分離的核酸，其特征是它選自下面的核酸a)根據本發明，編碼一種抗體或其功能片段之一的核酸，DNA或RNA；b)如在a)中定義的核酸的互補核酸；和c)在極度嚴格性條件下能夠與核酸序列SEQIDNO1，3，5，7，9或11中的至少一個CDR雜交的至少18個核苷酸的核酸，或在最優排列后與序列SEQIDNO1，3，5，7，9或11具有至少80％，優選85％，90％，95％和98％同一性的序列。對于核酸，核酸或核酸序列，多聚核苷酸，寡核苷酸，多聚核苷酸序列，核苷酸序列，這些將在本發明中普遍使用的術語，要指出的是核苷酸的準確連接，可使要確定核酸的片段或區域含有或不含有非天然的核酸，正好能夠對應于一個雙鏈的DNA，單鏈DNA作為所述DNA的轉錄產物，其中核苷酸可被修飾或未被修飾。在此也必須理解的是本發明與自然染色體環境中的核苷酸序列無關，也就是說自然狀態下序列。它與已經被分離和/或純化的序列有關，也就是說它們已經直接或間接被選擇，例如通過拷貝，它們的環境已經至少部分被改變。因此同樣在此要指出的是通過，例如宿主細胞的基因重組獲得，或通過化學合成獲得的分離核酸。對于在最優排列后與參考序列具有至少80％，優選85％，90％，95％和98％的同一性百分比的序列，要指出的是就參考核苷酸序列而言，核苷酸序列具有某些修飾，如缺失，截斷，延伸，嵌合融合和/或取代，特別是點取代。優選與下列序列有關，其中的序列編碼與參考序列相同的氨基酸序列，這與基因代碼的簡并性有關，或能夠特異與參考序列雜交的互補序列，優選在高度嚴格性條件下，特別是如下所述的情況下。在高度嚴格性條件下的雜交的含義是以這種方式選擇的溫度條件和離子強度可維持互補DNA的兩個片段之間進行雜交。通過圖解說明，為了確定上述多聚核苷酸片段所進行的雜交步驟中的高嚴格性條件可很方便地采用下列的條件。DNA-DNA或DNA-RNA雜交以兩個步驟進行(1)在含有5×SSC(1×SSC相當于0.15MNaCl+0.015M檸檬酸鈉溶液)，50％甲酰胺，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，10×Denhardt’s，5％硫酸葡聚糖和1％鮭魚精DNA的磷酸鹽緩沖液(20mM，pH7.5)中42℃預雜交3小時；(2)根據探針的大小在一個溫度下(也就是，對于探針大小＞100個核苷酸的，42℃)實際雜交20小時，然后在20℃2×SSC+2％SDS中沖洗20分鐘2次，在20℃0.1×SSC+0.1％SDS中沖洗20分鐘1次。對于探針大小＞100個核苷酸，最后一次沖洗在60℃，0.1×SSC+0.1％SDS中進行30分鐘。對于上述已確定大小的多聚核苷酸的高嚴格性雜交條件可由本領域專業技術人員根據Sambrook等人(1989，分子克隆實驗室手冊，第二版，ColdSpringHarbor)的教授，對更大或更小的寡核苷酸進行修改。發明同樣涉及含有依照本發明的核酸的載體。發明的目標特別是克隆和/或表達載體，它們含有依照本發明的核苷酸序列。根據本發明載體優選含有在已確定的宿主細胞中允許核苷酸序列表達和/或分泌的元件。因此載體必須含有一個啟動子，啟動和終止翻譯的信號，以及適當的轉錄調節區。必須能以穩定的方式在宿主細胞中保留，可選擇性地含有特殊的信號，它引導已翻譯蛋白的分泌。本領域專業技術人員可選擇這些不同的元件并進行優化作為宿主細胞所使用的一種功能。為了達到這種效應，根據本發明的核苷酸序列在選擇的宿主中插入進自主復制載體中，或是選擇宿主的整合載體。通過本領域專業技術人員所使用的常規方法可制備這些載體，得到的克隆可通過標準的方法導入進合適的宿主中，如通過lipofection，電穿孔，熱休克，或化學方法。根據本發明的載體，例如是質粒或病毒來源的載體。它們可用于轉化宿主細胞以便克隆或表達依照本發明的核苷酸序列。本發明同樣包括由依照本發明的載體轉化的宿主細胞，或含有載體的宿主細胞。可以從原核或真核系統中選擇宿主細胞，例如細菌細胞，以及酵母細胞或動物細胞，特別是哺乳動物細胞。同樣可能使用昆蟲細胞或植物細胞。發明同樣與動物有關系，除人類以外，該動物含有至少一種根據本發明被轉化的細胞。根據另一個方面，本發明的一個主題是產生抗體或其功能片段之一的過程，根據本發明其特征是它含有下面的階段a)根據本發明在一種培養基和適當的培養條件下培養宿主細胞；和b)回收由培養基或所述培養細胞開始產生的所述抗體，或其功能片段之一。根據本發明轉化的細胞可用于制備依照本發明的重組多肽的過程中。制備根據本發明的重組形式的多肽的過程包含在本發明中，其特征是應用了一種載體和/或由根據本發明的一種載體轉化的細胞。優選由根據本發明的載體轉化的細胞在一定條件下進行培養，該條件可表達所述多肽和回收所述的重組肽。如已經描述的那樣，宿主細胞可從原核或真核系統中選擇。特別是，又可能鑒定依照本發明的核苷酸序列，促進其在這樣一種原核或真核系統中的分泌。根據本發明攜帶這樣一種序列的載體因此可很方便地用于要分泌的重組蛋白的生產中。實際上，這些目的重組蛋白的純化可被促進，因為存在這樣的現實，即它們存在于細胞培養上清液中，而不是存在于宿主細胞內部。也可能通過化學合成制備依照本發明的多肽。這樣一種制備過程同樣是發明的主題。本領域專業技術人員了解化學合成的過程，例如應用固相的技術(特別見Steward等人，1984，固相肽合成，PierceChem.Company，Rockford，111，第二版，(1984))或采用部分固相的技術，通過濃縮片段或在溶液中進行經典的合成。由化學合成獲得并能包含相應的非天然氨基酸的多肽同樣也包括在本發明中。能由依照本發明的過程獲得的抗體或其功能片段之一同樣包括在本發明中。根據第二個實施例，本發明與依照本發明的一種抗體有關，如上進一步所述，而且其特征是能特異地與人表皮生長因子受體EGFR結合和/或能特異地抑制所述EGFR受體的酪氨酸激酶活性。通常，生長因子是小的蛋白參與正常細胞增殖和分化的調節中。這些生長因子中的一些在啟動和維持細胞轉化過程中具有重要地位，能作為自分泌或旁分泌因子。除了上面進一步所述的IGF1，對于表皮生長因子也特別是這種情況，似乎可特殊地參與至腫瘤表現型的出現，腫瘤的進展和產生轉移。EGF和IGF1通過其各自受體的介導而發揮其作用，這些受體在此稱為EGFR和IGF-IR。它與具有酪氨酸激酶活性的兩種膜受體有關，據稱其過度表達發生在大量癌癥中。但必須注意的是這兩種受體的相互作用并不清楚，對于這種關系許多研究隊伍進行的研究就這兩種受體的協同關系得出了相反的結果。對于前列腺腫瘤細胞進行的研究顯示，抗EGFR單克隆抗體(在此稱為″MAB″或″MAb″)對自分泌環EGF/EGFR的阻斷作用是通過DU145細胞完全喪失對IGF1的反應表現出來的(ConnollyJ.M.和RoseD.P.，Prostate，Apr.24(4)167-75，1994；PutzT.等人，CancerRes.，Jan.1，59(1)227-33，1999)。這些結果表明阻斷EGF受體足以完全抑制由兩種受體(EGFR和IGF-IR)活化所產生的轉化信號。另一方面，其他研究(Pietrzkowski等人，CellGrowthDiffer，Apr.，3(4)199-205，1992；Coppola等人，MolCellBiol.，Jul.，14(7)4588-95，1994)顯示EGFR的過度表達需要功能性IGF-IR的存在以發揮其有絲分裂和轉化體的潛力，盡管IGF-IR就其一部分而言，并不需要功能性EGFR的存在以介導這種作用。這兩個系列的研究與傾向于阻斷IGF-IR，同時影響兩種受體的策略更為一致。以一種令人驚訝的方式，發明者首先證明了同時抑制IGF1和/或IGF2與IGF-1R受體的附著以及EGF與EGFR受體的附著可使這兩種作用產生明顯的協同效應，獲得的這兩種作用在攜帶表達這兩種受體的腫瘤的裸鼠體內可抑制腫瘤生長。能夠解釋協同效應的更可能的假設之一是兩個生長因子EGF和IGF1(和/或IGF2)本身在正常細胞轉化為具有腫瘤特征的細胞和/或在某些腫瘤的腫瘤細胞的生長和/或增殖過程中是協同作用的，特別是對于那些過度表達兩種受體EGFR和IGF-IR和/或由這兩種受體介導的轉導信號過度活化，特別是在這些受體的酪氨酸激酶活性水平上的腫瘤。根據此實施例的一個優選的方面，發明與如上進一步所述的抗體有關，其特征是它含有一種雙特異性的抗體，含有一個第二基序，可特異地抑制EGF與EGFR的附著和/或特異地抑制所述EGFR受體的酪氨酸激酶活性。術語“第二基序”在上面要指出的特別是一條氨基酸序列，含有能夠與EGFR特異結合的片段，特別是抗EGFR抗體可變鏈的CDR區，或具有足夠長度以發揮這種特異結合作用的這種CDR區的片段之一，或抗EGFR抗體的幾個CDR區。雙特異性或雙功能性抗體形成了第二代單克隆抗體，其中兩個不同的可變區組合在同一個分子中(Hollinger和Bohlen，1999，Cancerandmetastasisrev.18411-419)。它們的應用已經證明了在診斷領域和治療領域，它們都能恢復新的效應器功能，或能靶向腫瘤細胞表面上的幾個分子。這些抗體可通過化學方法(GlennieMJ等人，1987J.Immunol.139，2367-2375；ReppR.等人，1995J.Hemat.377-382)或體細胞方法(StaerzU.D.和BevanM.J.1986PNAS83，1453-1457；SureshM.R.等人，1986MethodEnzymol.121210-228)獲得，但同樣可優選通過基因工程技術，該技術可強制進行異二聚化，因此可加速所尋找的抗體的純化過程(Merchand等人，1998NatureBiotech.16677-681)。這些雙特異性抗體可構建為整個IgG、雙特異性Fab’2、Fab’PEG或完整體或其他的雙特異性scFv，但同樣可構建為四價的雙特異性抗體或對于每個靶向抗原存在兩個附著位點(Park等人，2000Mol.Immunol.37(18)1123-30)或如上進一步所述的其片段。除了產生和應用雙特異性抗體較產生兩個特異性抗體要簡便得多所獲得經濟方面的優勢以外，使用這種雙特異性抗體的優勢是減少了治療的毒性。這是因為使用雙特異性抗體可使循環抗體的總量和因此產生的可能毒性減少。在本發明的一個優選實施例中，雙特異性抗體是一個二價或四價的抗體。實際上，使用四價雙特異性抗體的興趣在于它較二價抗體有更強的親合力，因為對于每個靶標存在兩個附著位點，在本發明中分別是IGF-IR和EGFR。與選擇上述抗IGF-IR抗體的功能片段相似的方式，所述的第二基序選自片段Fv，Fab，F(ab’)2，Fab’，scFv，scFv-Fc和完整體，或任何其半衰期已經被增加的形式，如pegylated片段如Fv-PEG，scFv-PEG，Fab-PEG，F(ab’)2-PEG或Fab’PEG。根據本發明的一個更優選的方面，所述的第二個抗EGFR基序可來自鼠單克隆抗體225，其鼠-人嵌合衍生物C225，或這種抗體225衍生的人源化抗體。仍根據另一個方面，本發明的一個主題是抗體或其功能片段之一，根據本發明作為一種藥物，優選如上所確定的人源化抗體。抗體，對于本發明余下的描述，必須被理解為抗IGF-IR抗體以及雙特異性抗IGF-IR/EGFR抗體。同樣發明與一種藥學組合物有關，作為有效成分它含有的一種化合物，根據本發明包括一種抗體，或其功能片段之一，優選與一種賦形劑和/或藥學可接受的載體混合。仍然根據另一個實施例，本發明同樣與一種藥學組合物有關，如上面進一步所描述的，它含有一個第二化合物，選自能特異抑制EGF與人表皮生長因子受體EGFR附著和/或能特異抑制所述EGFR受體的酪氨酸激酶活性的化合物。在本發明的一個優選的方面，所屬第二化合物選自分離的抗EGFR抗體，或其功能片段，能通過競爭作用抑制EGF與EGFR的附著。更特別的是，所述的抗EGFR抗體選自單克隆，嵌合或人源化抗EGFR抗體，或其功能片段。更為特別的是，所述的抗EGFR抗體的功能片段選自片段Fv，Fab，F(ab’)2，Fab’，scFv-Fc或完整體，或任何其半衰期已被增加的片段，如pegylated片段。所述的抗體以一種更為優選的方式可含有鼠單克隆抗體225，其鼠-人嵌合衍生物C225(也稱為IMC-C225)或由這個抗體225衍生的人源化抗體。本發明的另一個補充實施例含有如上所述的一種組合物，為了作為一種組合產物同時，單獨或相繼使用，它可含有一種細胞毒/細胞生長抑制劑和/或IGF-I和/或EGF受體各自的酪氨酸激酶活性抑制劑。“同時使用”可理解為依照本發明的組合物的兩種化合物以單一和相同的藥物形式給藥。“單獨使用”可理解為依照本發明的組合物的兩個化合物同時以不同的藥物形式給藥。“相繼使用”可理解為依照本發明的組合物的兩個化合物每個都以不同的藥物形式相繼給藥。依照本發明的組合物以普通的形式可很大程度上的增加治療癌癥的效率。換言之，依照本發明抗IGF-IR抗體的治療效應可以一種意想不到的方式通過給予一種細胞毒性劑而實現。依照本發明的一種組合物隨后所產生的另一個主要優勢是有可能使用有效成分的有效劑量更低，可使出現第二效應的危險性得到避免或減少，特別是細胞毒性劑的作用。另外，依照本發明這種組合物可使所期望的治療效應更快速的達到。在一個特別優選的實施例中，依照本發明作為一種組合產物的所述組合物的特征是所述的細胞毒/細胞生長抑制劑選自與DNA相互作用的藥劑，抗代謝物，拓撲異構酶I或II抑制劑，或紡錘體抑制劑或穩定劑或其他任何能用于化療中的藥劑。對于前面所述每種類型的細胞毒性劑，這樣的細胞毒/細胞生長抑制劑，例如可在VIDAL2001版中引用，所在的頁面專門針對附加在癌學和血液學一欄″細胞毒素類″中的化合物，就本文而言，這些引用的細胞毒化合物在此引用作為優選的細胞毒性劑。在一個特別優選的實施例中，依照本法且作為一種組合產物的所述組合物的特征是所述的細胞毒性劑可與所述抗體化學性偶聯以便同時使用。在一個特別優選的實施例中，依照本發明所述的組合物的特征是所述的細胞毒/細胞生長抑制劑選自紡錘體抑制劑或穩定劑，優選長春瑞賓和/或長春氟寧和/或長春新堿。為了加速所述細胞毒性劑和所述的依照本發明的抗體之間的偶聯，特別有可能在要被偶聯的兩個化合物之間導入間隔分子，如聚(烯基)乙二醇，象聚乙二醇或氨基酸，在另一個實施例中，使用所述細胞毒性劑的活性衍生物，它已經被引入了一些功能，能與依照本發明的所述抗體反應。這些偶聯技術對于本領域專業技術人員是熟知的，在這里的描述中并沒有被擴展。在另一個優選的實施例中，所述IGF-I和/或EGF受體酪氨酸激酶活性抑制劑選自衍生的天然藥劑，二苯胺酞酰亞胺，吡唑-或吡咯吡啶嘧啶或喹唑啉。這樣的抑制劑對于本領域的專業技術人員是熟知的，并在文獻中有所描述(CiardielloF.，Drugs2000，Suppl.1，25-32)。EGFR的其他抑制劑，沒有任何限制，可含有抗EGFR單克隆抗體C225和22Mab(ImCloneSystemsIncorporated)，ABX-EGF(Abgenix/CellGenesys)，EMD-7200(MerckKgaA)或化合物ZD-1834，ZD-1838和ZD-1839(AstraZeneca)，PKI-166(Novartis)，PKI-166/CGP-75166(Novartis)，PTK787(Novartis)，CP701(Cephalon)，來氟米物(Pharmacia/Sugen)，CI-1033(Warner-LambertParke-Dayis)，CI-1033/PD183，805(Warner-LambertParke-Davis)，CL-387，785(Wyeth-Ayerst)，BBR-1611(BoehringerMannheimGmbH/Roche)，NaamidineA(Bristol-MyersSquibb)，RC-3940-II(Pharmacia)，BIBX-1382(BoehringerIngelheim)，OLX-103(Merck&Co)，VRCTC-310(VentechResearch)，EGF融合毒素(SeragenInc.)，DAB-389(Seragen/Lilgand)，ZM-252808(ImperialCancerResearchFund)，RG-50864(INSERM)，LFM-A12(ParkerHughesCancerCenter)，WHI-P97(ParkerHughesCancerCenter)，GW-282974(Glaxo)，KT-8391(KyowaHakko)或“EGFR疫苗”(YorkMedical/CentrodeImmunologiaMolecular)。仍然根據發明的另一個實施例，如上所述的組合物同樣含有另一個抗體化合物，針對HER2/neu受體的細胞外結構區，作為同時，單獨或連續使用的一種組合產物，打算用于預防和治療癌癥，特別是過度表達所述HER2/neu受體和受體IGF-IR和/或EGFR的癌癥，如特別是乳腺癌。參考文獻可特別的參照Albanell等人(J.oftheNationalCancerInstitute，93(24)1830-1831，2001)和Lu等人(J.oftheNationalCancerInstitute，93(24)1852-1857，2001)的出版物，證實了在將一種抗HER2/neu抗體與依照本發明的一種抗IGF-IR抗體進行組合方面的出入意料的關注。以一種特殊的方式，依照本發明的組合物的所述抗HER2/neu抗體是一種稱為Trastuzumab(也稱為Herceptin)的抗體。發明在另一個方面涉及一種組合物，其特征是至少一個所述抗體，或其功能片段之一，與一種細胞毒素和/或一種放射性元素交聯在一起。優選地，所述毒素或所述放射性元素能夠抑制表達IGF-IR和/或EGFR受體的細胞的至少一種細胞活性，更優選的方式是能防止所述細胞的生長或增殖，特別是完全使所述細胞失活。也優選的是，所述的毒素是腸細菌毒素，特別是綠膿假單胞菌外毒素A。用于治療的優選與抗體交聯的放射性元素(或放射性同位素)是能釋放γ射線的放射線同位素，優選碘131，釔90，金199，鈀100，銅67，鉍217和銻211。可釋放β和α射線的放射性同位素同樣可用于治療。對于與依照本發明的至少一種抗體，或其功能片段之一交聯的毒素或放射性元素，要指出的是任何可使所述毒素或所述放射性元素與所述至少一種抗體，特別是通過兩種化合物之間的共價偶聯進行結合的方式，可以引入或不引入連接分子。在可使交聯物的所有或部分成分以化學(共價)，靜電或非共價方式結合的試劑中，特別要提到苯醌，碳化二亞胺，更特殊的是EDC(1-乙基-3-[3-二甲基-氨丙基]-碳化二亞胺氫氯化物)，二馬來酰胺，二硫代雙硝基苯甲酸(DTNB)，N-琥珀酰亞胺酰S-乙酰硫代乙酸鹽(SATA)，具有一個或多個可與紫外線(U.V.)反應的苯疊氮基的交聯劑，優選N-[-4-(疊氮水楊酰氨基)丁基-3’-(2’-吡啶二硫代)-丙酰胺(APDP)，N-琥珀酰亞胺酰3-(2-吡啶二硫代)丙酸鹽(SPDP)，6-肼基-煙酰胺(HYNIC)。偶聯的另一種形式，特別是對于放射性元素，可以使用雙功能離子螯合劑。在這些螯合物中，可能要提到來自EDTA(乙二胺四乙酸)或DTPA(二乙撐三胺五乙酸)的螯合物，已經被開發用來結合金屬，特別是放射活性金屬，合免疫球蛋白。因此DTPA及其衍生物可由碳鏈上不同的基團取代以便增加配體-金屬復合體的穩定性合剛性(Krejcarek等人，(1977)；Brechbiel等人，(1991)；Gansow(1991)；US專利4831175)。例如二乙撐三胺五乙酸(DTPA)及其衍生物，已經被廣泛用于醫藥合生物學中很長時間了，以游離形式或與金屬離子復合體的形式，其非常明顯的特征是可與金屬離子形成穩定的螯合物，并可與治療或診斷目的的蛋白偶聯，如在癌癥治療中開發放射免疫交聯劑所使用的抗體(Meases等人，(1984)；Gansow等人，(1990))。同樣優選地，依照本發明形成所述交聯物的所述至少乙種抗體選自其功能片段，特別是其Fc部分的截斷片段，如scFv片段。而且本發明包括使用依照本發明的組合物制備一種藥物。更特殊地，根據另一個實施例，發明與使用一種抗體或其功能片段，和/或一種組合物來制備一種準備用來防止或治療疾病的藥物有關，該疾病是由IGF-IR和/或EGFR受體的過度表達和/或異常活化誘導的，和/或與由IGF-1或IGF-2與IGF-IR和/或EGF與EGFR和/或HER2/neu相互作用介導的信號轉導通路的過度活化有關。優選地，依照本發明所述的應用，其特征是使用所述的藥物并不誘導或僅輕微誘導第二效應，與胰島素受體IR的抑制有關，也就是說，IR受體與其天然配體的相互作用的抑制是由于所述藥物的存在，特別是通過所述藥物與IR附著所形成的競爭性抑制。而且本發明包括使用一種抗體，或其功能片段之一，優選人源化，和/或依照本發明制備一種藥物的組合物，該藥物是準備用來抑制正常細胞轉化為具有腫瘤特征的細胞，優選IGF依賴性的，特別是IGF1-和/或IGF2-依賴性和/或EGF-依賴性和/或HER2/neu-依賴性的細胞。同樣本發明涉及使用一種抗體，或其功能片段之一，優選人源化，和/或依照本發明制備一種藥物的組合物，該藥物是用來抑制腫瘤細胞的生長和/或增殖，優選IGF-依賴性，特別是IGF1-和/或IGF2-依賴性和/或EGF-依賴性和/或雌激素依賴性，和/或HER2/neu-依賴性的細胞。總體上，本發明的主題是使用一種抗體或其功能片段之一，優選人源化，和/或依照本發明的一種組合物，來制備準備用來防止或治療癌癥的一種藥物，優選表達IGF-IR和/或EGFR的癌癥，和/或優選由IGF-1或IGF-2與IGF-IR和/或EGF與EGFR相互作用介導的信號轉導通路的過度活化有關的癌癥，例如IRS1的過度表達。同樣本發明的主題是使用一種抗體，或其功能片段之一，優選人源化，和/或依照本發明的一種組合物，來制備準備用來防止或治療干癬的一種藥物，干癬的表皮過度增殖與IGF-IR和/或EGFR的表達或過度表達，和/或與由IGF-IR與其天然配體和/或EGFR與其天然配體相互作用介導的信號轉導通路的過度活化有關(WraightC.J.等人，Nat.Biotechnol.，2000，18(5)521-526.胰島素樣生長因子I受體反義寡核苷酸對干癬表皮過度增殖的逆轉)。在要防止或治療的癌癥中，優選前列腺癌，骨肉瘤，肺癌，乳腺癌，子宮內膜腫瘤或結腸癌或任何其他過度表達IGF-IR的癌癥。仍然根據另一個方面，本發明的一個主題是一種診斷方法，優選在體外診斷與IGF-IR和/或EGFR受體過度表達或表達下調，優選過度表達有關的疾病，從懷疑有IGF-IR和/或EGFR受體的異常存在的生物學標本開始，其特征是所屬的生物學標本與依照本發明的一種抗體，或其功能片段之一有關，如果需要，所述的抗體可能是被標記的。優選在所述診斷方法中與IGF-IR和/或EGFR受體的過度表達有關的所述疾病是癌癥。所述的抗體或其功能片段可以一種免疫交聯物的形式存在，或以標記抗體的形式存在以便獲得可檢測到和/或可定量的信號。標記的抗體或依照本發明的其功能片段包括，例如稱為免疫交聯物的抗體，例如可與酶如過氧化物酶、堿性磷酸酶、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰膽堿酯酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶或葡萄糖-6-磷酸脫氫酶交聯或被一種分子如生物素，digoxygenin或5-溴脫氧尿苷酸交聯。同樣熒光標記可與抗體或依照本發明的其功能片段交聯，特別包括熒光素和其衍生物，熒光色素，羅丹明和其衍生物，GFP(GFP為“綠熒光蛋白”)，dansyl，傘形酮等。在這種交聯物中，發明的抗體或其功能片段可通過本領域專業技術人員已知的方法制備。它們可與酶偶聯或與熒光標記直接偶聯或通過一個間隔基團或連接基團如聚醛，象戊二醛，乙二胺四乙酸(EDTA)，二乙撐三胺五乙酸(DPTA)的中間體偶聯，或存在偶聯劑如上面所述的那些治療性交聯劑。含有熒光素型標記的交聯物可通過與異硫氰酸鹽反應而制備。同樣其他的交聯物包括化學發光標記如魯米諾和dioxetanes，生物發光標記如蟲熒光素酶和蟲熒光素，或其他的放射活性標記如碘123、碘125、碘126、碘133、溴77、锝99m、銦111、銦113m、鎵67、鎵68、釕95、釕97、釕103、釕105、汞107、汞203、錸99m、錸101、錸105、鈧47、碲121m、碲122m、碲125m、銩165、銩167、銩168、氟18、釔199、碘131。本領域專業技術人員已知的將治療性放射性同位素與抗體直接或通過上面提到的一種螯合劑如EDTA，DTPA偶聯的方法可用于在診斷中使用的放射性元素。同樣可能要提到用Na[I125]通過氯胺T法[HunterW.M.和GreenwoodF.C.(1962)Nature194495]或用锝99m通過Crockford等人的技術(US專利4424200)或如Hnatowich(US專利4479930)所述經DTPA被附著等進行標記。因此，抗體或依照本發明的其功能片段，可用于檢測和/或定量IGF-IR和/或EGFR受體在生物學標本中的過度表達或表達下調的過程中，其特征是它包括下列的步驟a)將生物標本與抗體或依照本發明的其功能片段之一接觸，和b)證明可能形成的IGF-IR和/或EGFR/抗體復合體。在一個特殊的實施例中，抗體或依照本發明的其功能片段，可用于在一個生物標本中檢測和/或定量IGF-IR和/或EGFR受體的過程，以監測預防和/或治療IGF-和/或EGF依賴性癌癥或干癬的功效。更普遍的，抗體或依照本發明的其功能片段，可很方便地用于下面的任何情況中，其中IGF-IR和/或EGFR受體的表達必須可以可定性和/或可定量的方式觀察。優選地，生物標本可通過生物體液，如血清，全血，細胞，組織標本或人的活組織檢查獲得。可使用任何步驟或常規試驗，以便進行這樣一種檢測和/或用藥。所述的試驗可以是一種競爭或夾心試驗，或任何本領域專業技術人員已知的試驗，依靠形成一種抗體-抗原型免疫復合體。根據本發明應用后，抗體或其功能片段之一可被固定或標記。這種固定可在本領域專業技術人員已知的多種支持物上進行。這些支持物可特別地包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，尼龍或天然的或修飾的細胞。這些支持物可以是可溶性的或不溶性的。通過實例，根據ELISA技術，一種優選的方法可通過免疫熒光，或放射免疫測定(RIA)技術或相同的技術開始進行免疫酶過程。因此，本發明同樣包括實施診斷疾病的方法，或實施在一種生物標本中檢測和/或定量EGF-IR和/或EGFR受體過度表達或表達下調的過程所需的試劑盒或裝置，所述疾病由IGF-IR和/或EGFR受體的過度表達或表達下調誘導，優選過度表達所述受體，其特征是所述的試劑盒或裝置包含下列的元件a)根據本發明的一種抗體或其功能片段；b)可選擇的是，可形成有利于免疫學反應的介質的試劑；c)可選擇的是，能證明由免疫學反應產生的IGF-IR和/或EGFR/抗體復合體的試劑。而且發明涉及使用一種組合物作為依照本發明的一種組合產物，以制備準備用來防止或治療癌癥的藥物，特別是所述細胞毒性劑或所述的抗HER2/neu抗體通常用于處方中的癌癥，特別是腫瘤細胞表達或過度表達IGF-IR和/或EGFR受體的癌癥。發明的一個主題同樣是使用依照本發明的一種抗體來制備準備用來將一種生物活性化合物特異靶向表達或過度表達IGF-IR和/或EGFR受體的細胞的藥物。在此要說明的生物活性化合物是指任何能夠調節，特別是抑制細胞活性，特別是其生長，其增殖，轉錄或基因翻譯的化合物。本發明的一個主題也是一種體內診斷試劑，含有根據本發明的一種抗體，或其功能片段之一，優選標記的，特別是放射標記的，及其在醫學影像中的應用，特別是檢測與細胞表達或過度表達IGF-IR和/或EGFR受體有關的癌癥。發明同樣涉及作為一種組合產物的組合物或依照本發明作為一種藥物的抗IGF-IR和/或EGFR/毒素交聯物或放射性元素。優選地，作為組合產物的所述組合物或依照本發明的所述交聯物將與一種賦形劑和/或一種藥學可接受的載體混合在一起。在本發明中，藥學可接受的載體是指可進入藥學組合物中的一種化合物或化合物的組合，沒有令人反感的第二反應，例如可促進活性化合物的給藥，增加其壽命和/或在體內的功效。這些藥學可接受的載體是本領域專業技術人員所熟知的，并可根據所選擇的活性化合物的給藥方式和功能特性而改變的。優選，這些化合物以全身的途徑給藥，特別是通過靜脈內途徑，肌肉內，真皮內，腹膜內或皮下途徑，或通過口服途徑。以一個更優選的方式，含有依照本發明的抗體的組合物以順序的方式給藥數次。其給藥的方式，劑量和最佳藥物學形式可根據標準來確定，一般要考慮所制定的治療措施適合患者，例如，患者的年齡或體重，其一般狀況的嚴重性，對治療和明顯的第二效應的耐受性。本發明的其他特征和優勢將在實例和圖表的繼續描述中出現，其圖例在下面表述。附圖描述圖1IGF-IR的圖示。圖2在IGF附著的過程中IGF-IR介導的信號轉導圖。圖3A，3B和3C單克隆抗體7C10識別MCF-7細胞表面上的天然IGF-IR。對于這個實驗，MCF-7細胞與7C10抗體或陰性對照抗體孵育，在熒光抗某種種屬的二抗的輔助下回收。標記在FACS上讀數。第一個直方圖(圖3A)單獨對應于MCF-7細胞。在第二個直方圖(圖3B)中，無陰影的曲線對應于對照同型鼠抗體的非特異性標記。在第三個直方圖(圖3C)中，無陰影的曲線顯示了MAS7C10對IGF-IR的識別。圖4A，4B和4C分別表達IGF-IR或IR的Sf9昆蟲細胞的標記。圖4A顯示了非轉染細胞單獨的標記(1)或用對照的分別識別IGF-IR(2)或IR(3)市售單克隆抗體標記的細胞。在圖4B，唯一表達IGF-IR的Sf9細胞用αIR3(2)或抗IR(3)標記，峰(1)代表單一細胞。在圖4C中，唯一表達IR的Sf9用抗IR(3)或αIR3(2)標記，峰(1)代表單一細胞。圖57C10抗體對IGR-I誘導的MCF-7細胞增殖的抑制效應。在存在或不存在要檢測的MAB情況下，在增加IGF1濃度的情況下孵育MCF-7細胞。細胞的增殖通過3H胸苷摻入來評價。市售抗體αIR3用作試驗的陽性對照。7G3是鼠抗IGF-IRIgG1，對增殖沒有活性，用作對照的同型。圖6A，6B和6C-圖6A單克隆抗體7C10對裸鼠中MCF--7腫瘤生長的體內效應；-圖6B和6C分別來自Arteaga等人(J.Clin.Invest.，84，1418-1423，1989)和Li等人(CancerImmunol.Immunother.，49，243-252)發表文章中的圖表，圖6B顯示了鼠αIR3的效應(同樣注明為αIR3)和圖6C顯示了來自1H7的重組scFv-Fc對腫瘤生長的效應。圖7MAb7C10效應和他莫西芬對體內腫瘤MCF-7生長的對比研究。圖8A，8B和8C鼠抗體7C10在體內腫瘤細胞的不同異種移植模型中的抗腫瘤活性研究。圖8A顯示了骨肉瘤模型SK-ES-1中獲得的結果，圖8B與一種前列腺雄激素非依賴性腫瘤DU-145有關，圖8C與肺非小細胞腫瘤模型A549有關。在這三種模型中，每周兩次腹腔內以250μg/次用藥/鼠的速率給藥治療。曲線7G3，EC2和9G4分別對應每個模型中用作試驗對照同型的三種鼠IgG1。圖9MAb7C10與新霉酰胺(長春瑞賓)抗腫瘤效應的對比以及兩種化合物在體內對細胞系A549生長的協同作用的研究。圖10MAbαIR3，7C10和1H7對IGF-2誘導的MCF-7細胞增殖活性的比較。圖11比較鼠7C10和嵌合C7C10MAb對體外IGF1誘導的MCF-7細胞增殖的抑制作用。抗體9G4是用作試驗對照同型的鼠IgG1。圖127C10和h7C10MAb(人源化1，在此記為7H2HM)對體外IGF1誘導的MCF-7細胞增殖模型的效應比較。圖137C10和h7C10MAb(人源化1，在此記為7H2KM)對IGF1誘導的信號轉導的效應。第一行點對應于由抗磷酸酪氨酸抗體所顯示的免疫沉淀的β鏈的磷酸化，是來自在IGF1單獨存在下或IGF1與要檢測的多種抗體混合的情況下孵育的細胞中。9G4和hlgG1分別是7C10和h7C10(同樣記為7H2HM)的對照同型。第二行點對應于β鏈的顯示，顯示所有孔中沉淀的量均完全相等。圖14cDNA(SEQIDNo.48)序列，其互補鏈(SEQIDNo.50)序列，及其翻譯的氨基酸(SEQIDNo.49)序列，用引物MKV-1和MKC從鼠雜交瘤7C10擴增的PCR片段的序列，該引物編碼引導肽的3’末端和7C10VL。圖15cDNA(SEQIDNo.51)序列，其互補鏈(SEQIDNo.53)序列和其翻譯的氨基酸(SEQIDNo.52)序列，用引物MHV-12和MHC-1和MHV-8和MHC-1從鼠雜交瘤7C10擴增的PCR片段的序列，所述引物編碼引導肽的3’末端和7C10VH。圖16通過嵌合抗體7C10識別IGF-1受體，同樣稱為C7C10(cos7轉染細胞培養物的上清液)。圖17鼠7C10VL(SEQIDNo.54)的氨基酸序列與具有最大序列同源性的其他鼠抗體單位的比較。氨基酸的編號方式采用Kabat等人(1991)的方法。框架區(CDR外側)的殘基，在7C10VL和Kabat鼠亞組II(SEQIDNo.57)之間有差異，被加上下劃線。圓點表示在這個位置上與7C10VL的序列比較殘基是相同的。DRB1-4.3(SEQIDNo.55)代表了抗人鼠抗體MHCII類B鏈(在Kabat數據庫中的記錄號為N011794)的輕鏈序列。C94-5B11’CL(SEQIDNo.56)代表了鼠抗體的輕鏈序列(Kabat數據庫中的記錄號為P019314)。圖18比較鼠7C10VL(SEQIDNo.54)的氨基酸序列與屬于Kabat人亞組II(SEQIDNo.60)并具有最大序列同源性的人輕鏈單位。氨基酸序列被排列，并與鼠7C10VL的序列相比較。圓點表示在這個位置上與7C10VL的序列比較殘基是相同的。GM607(SEQIDNo.58)代表由人淋巴母細胞瘤細胞系GM607分泌的κ輕鏈的序列(Klobeck等人，NucleicAcidsRes.，126995-7006，1984a和Klobeck等人，Nature，30973-76，1984b，Kabat數據庫中的記錄編號為N011606)。DPK15/A19(SEQIDNo.59)代表人V胚細胞系κII的序列。圖19比較鼠7C10(SEQIDNo.54)輕鏈(VL)，人抗體CM607(SEQIDNo.58)和人源化7C101和2(SEQIDNos.61and65)的兩種形式的可變區氨基酸序列。氨基酸序列被排列，并與鼠7C10VL相比較。圓點表示在這個位置上與7C10VL的序列相比較殘基是相同的。GM607代表由人淋巴母細胞瘤細胞系GM607分泌的κ輕鏈的序列(Klobeck等人，1984a和1984b，Kabat數據庫中的記錄編號為N011606)。圖20cDNA序列(SEQIDNo.62)，其互補鏈序列(SEQIDNo.64)和其翻譯的氨基酸序列(SEQIDNo.63)，由引導肽和7C10VL人源化形式1重新組裝編碼所構建的基因序列。圖21cDNA序列(SEQIDNo.66)，其互補鏈序列(SEQIDNo.68)和其翻譯的氨基酸序列(SEQIDNo.67)，由引導肽和7C10VL的人源化形式2重新組裝編碼所構建的基因序列。圖22比較鼠7C10VH(SEQIDNo.69)的氨基酸序列與屬于Kabat鼠亞組I(A)，并具有最大序列同源性的人鼠重鏈的序列。氨基酸的編號方式采用Kabat等人(1991)的方法。框架區(CDR外側)的殘基，在7C10VH和Kabat鼠亞組I(A)之間有差異，被加上下劃線。圓點表示在這個位置上與鼠7C10VH的序列比較殘基是相同的。ANO3’CL(SEQIDNo.70)代表了鼠抗體(在Kabat數據庫中的記錄號為P001289)的重鏈序列。圖23比較鼠7C10VH(SEQIDNo.69)的氨基酸序列與屬于Kabat鼠亞組II(SEQIDNo.72)，并具有最大序列同源性的人重鏈的序列。加了下劃線的殘基是Chothia等人(1989)所確定的典型結構的一部分。圓點表示在這個位置上與鼠7C10VH序列比較殘基是相同的。人VHFUR1’CL(SEQIDNo.73)代表了自體免疫來源的人抗核纖層蛋白B抗體IgM/K的重鏈序列(Marietta等人，ArthritisandRheumatism，361315-1324，1993，Kabat中的記錄編號為N020619)。人germline(SEQIDNo.74)代表人germinal系4.22VHIV的序列(Sanz等人，EMBO.J.83741-3748，1989)。圖24比較鼠7C10(SEQIDNo.69)重鏈(VH)的可變區氨基酸序列和由CDR嫁接人源化VH1，2和3(分別為SEQIDNos.75，79和83)三種人源化形式的氨基酸序列。殘基的編號方式與Kabat方法對應。序列被排列，并與鼠7C10VH進行比較。圓點表示在這個位置上與鼠7C10VH的序列相比較殘基是相同的。圖25cDNA序列(SEQIDNo.76)，其互補鏈序列(SEQIDNo.78)和其翻譯的氨基酸序列(SEQIDNo.77)，由引導肽和7C10VH的人源化形式1重新組裝編碼所構建的基因序列。圖26cDNA序列(SEQIDNo.80)，其互補鏈序列(SEQIDNo.82)和其翻譯的氨基酸序列(SEQIDNo.81)，由引導肽和7C10VH的人源化形式2重新組裝編碼所構建的基因序列。圖27cDNA序列(SEQIDNo.84)，其互補鏈序列(SEQIDNo.86)和其翻譯的氨基酸序列(SEQIDNo.85)，由引導肽和7C10VH的人源化形式3重新組裝編碼所構建的基因序列。圖28在ELISA中比較嵌合抗體7C10(稱為“C7C10”)和其人源化形式1(7C10hum1)對IGF-1受體的識別活性。圖29在ELISA中對7C10抗體輕鏈的人源化形式1和2識別IGF-1受體活性的影響。圖30在ELISA中比較嵌合抗體7C10和與人源化的7C10VL2組合的重鏈的三種人源化形式(7C10hum1，2和3)的IGF-1受體識別活性。圖317C10抗體在常位模型A549中的抗腫瘤活性。圖32A，32B，32C和32D在抗體7H2HM(分別為圖表32C和32D)存在下在4小時中培養的A549和MCF-7細胞水平上觀察到的ADCC的研究。抗體h4D5用作細胞A549和MCF-7(分別為圖表32A和32B)的平行試驗陽性對照。圖33A，33B和33C抗體7C10和7H2HM對MCF-7細胞的細胞循環的效應。圖33A代表了在缺少IGF1的情況下，G0/G1，S和G2/M期中MCF-7細胞的比例，表示為所觀察到的總MCF-7細胞的顯著百分比。圖33B代表了存在IGF-1的情況下G0/G1，S和G2/M期中MCF-7細胞的比例，表示為所觀察到的總MCF-7細胞的百分比。與缺少IGF1(″0″)的對照標本相比較的圖表中表明有化合物的存在下，圖33C代表了在S(■)和G2/M(□)期MCF-7細胞的比例，表示為所觀察到的總MCF-7細胞的百分比。圖34A和34B抗體7C10和7H2HM對體外A549細胞生長(圖34A)和體內MCF-7細胞生長(圖34B)的效應比較。圖35A和35B與對照標本比較，抗體7H2HM與新霉酰胺(NA)組合在模型A549中的體內協同作用的研究。圖35A代表了種植的腫瘤體積的進展，從治療開始和經過大約50天，作為治療的函數(圖35A)。圖35B代表了與大約48天相比，這種進展以一種特殊的方式所獲得的結果。在這個圖表中，抗體7C10所獲得的結果已經通過比較被引入(星號(*)對應于對照組/組(7C10+Na)或對照組/組(7H2HM+Na)以t-檢驗進行的比較)。圖36抗體7C10和7H2HM對凋亡效應的研究。數字表明抗體7C10和7H2HM可增強阿霉素的效應(阿霉素2μg/ml)。圖37A至37D通過在FACS上的標記證明A549細胞上EGFR和IGF-IR的存在。圖38共同給予MAB7C10和225對腫瘤A549體內生長的效應。圖39共同給予MAB7C10和225對用A549細胞同位種植小鼠生存的效應。圖40A和40B證明MAB7C10和7H2HM可抑制IGF-IR和IRS-1β鏈的酪氨酸磷酸化。圖41證明MAB7C10和7H2HM對IGF-IR內化的誘導。圖42A至42C證明MAB7C10和7H2HM對IGF-IR的降解。實例1鼠單克隆抗體(MAb)的產生和選擇目標是產生特異針對IGF-IR的MAb，不識別IR，設想的方案包括6個篩選階段。它包括用重組IGF-IR免疫小鼠，以便產生雜交瘤，-通過ELISA對培養上清液篩選可用來免疫的重組蛋白，通過ELISA檢測所有陽性的雜交瘤上清液，在MCF-7腫瘤細胞表面上過度表達天然受體，根據分別表達IGF-IR或IR的桿狀病毒感染的昆蟲細胞上IGF-IR和IR的差別識別，評價在兩個首次篩選中均陽性的雜交瘤上清液，-證實在此期選擇的抗體能夠在體外抑制IGF1所誘導的MCF-7細胞增殖，-根據對腫瘤MCF-7生長的影響，保證所保留的候選物在裸鼠中的體內活性。所有這些不同的階段和獲得的結果將簡要地在下面的實例1中進行描述。對于免疫階段，小鼠通過皮下途徑用8μg重組IGF-IR注射兩次。在雌性大鼠細胞與小鼠骨髓瘤Sp20Agl4融合前3天，小鼠通過靜脈注射3μg重組受體刺激小鼠。融合后14天，雜交瘤的上清液通過ELISA在用IGF-IR敏化的板上進行篩選。保留發現上清液陽性的雜交瘤，在被FACScan進行檢測前進行擴增以證實產生的抗體同樣能夠識別天然的IGF-IR。為了做到這一點，來自過度表達IGF-IR的雌激素依賴的乳腺腫瘤的MCF-7細胞用在ELISA選擇的雜交瘤產生的每種培養上清液孵育。在細胞表面上的天然/MAb受體復合體通過與一種熒光色素偶聯的第二抗種屬抗體所識別。圖3A至3C顯示了用雜交瘤7C10(圖3C)上清液獲得的類型與單獨標記的細胞+二抗(圖3A)或與用對照同型(圖3B)標記的細胞比較的直方圖。在選擇階段，僅有同時識別重組受體和天然受體，分泌MAb的雜交瘤可被選擇和克隆。產生由這些雜交瘤分泌的MAb，然后在被FACScan檢測之前，根據上述的方法，在表達IGF-IR或IR的Sf9昆蟲細胞上純化，以便去除同時識別兩種受體的雜交瘤。圖4A顯示了直方圖1，2，3的總體回收情況，這些直方圖分別對應未感染的細胞+二抗(1)，αIR3標記的未感染細胞+二抗(2)和抗IR抗體+二抗標記的未感染細胞(3)。第一個結果良好地顯示了在這些未感染昆蟲細胞表面上缺少可檢測到的IGF-IR和IR。圖4B顯示了通過表達IGF-IR的桿狀病毒對感染細胞的標記。在第二個圖中，αIR3用作陽性對照，可如所預期的那樣可良好地標記細胞(峰2)，而抗IR(峰3)則疊加在單一細胞的峰上。最后，在圖4C中，顯示如所預期的，抗IR可很好地標記表達IR的Sf9細胞(峰3)，但以一種意外的方式，在文獻中所述的對IGF-IR有特異性的αIR3似乎同樣可識別IR(峰2)。在第三個篩選系統中獲得的結果在表中進行總結，顯示了一種MAb7C10的產生，滿足了識別IGF-IR，不識別IR的標準。Mab7C10的同種分型顯示它涉及一種IgG1。表1MAb7C10對表達IGF-IR或IR的Sf9昆蟲細胞的比較反應性供選擇MAb的兩個最后的篩選物在于證實后者能夠抑制IGF-1在體外和體內誘導的MCF-7細胞系的細胞增殖。對于體外選擇，接種MCF-7細胞，無胎牛血清，然后在IGF-1濃度漸增(從1至50ng/ml)、存在或不存在加至終濃度10μg/ml的待測7C10抗體的條件下孵育。在此實驗中，引用市售αIR3Mab作為陽性對照，7G3MAb(與7C10并行分離，對天然受體弱識別(在FACS上MFI為50，相比MAb7C10為200))作為同型對照。通過以下用β計數器檢測摻入含氚胸腺嘧啶核苷的細胞來評估細胞增殖。結果表述為增殖指數。數據呈現在圖5中，顯示IGF1能夠以劑量依賴的方式刺激MCF-7細胞的增殖。用作陽性對照的MAbαIR3完全地抑制IGF-1誘導的MCF-7細胞的增殖。以同樣的方式，MAb7C10顯著地抑制IGF-1誘導的MCF-7細胞的生長。最后，如所預期的，用作同型對照的MAb7G3很好地證明是對MCF-7細胞的體外腫瘤細胞生長沒有影響。在已建立的腫瘤模型中進行體內選擇。為此，裸鼠接受皮下植入緩釋雌激素，這對鼠模型中得到腫瘤是不可缺少的。雌激素植入24小時后，5.106MCF-7細胞被皮下接種在小鼠右腹側。此細胞接種5天后，腫瘤可測量，并隨機形成6只小鼠的批次。每周對小鼠進行兩次處理，在5至6周的時間內，以250μg/次/小鼠的劑量。在對照組，小鼠以與同型對照鼠同樣的方式處理。結果呈現于圖6A，顯示抗體7C10對腫瘤生長產生非常顯著的抑制作用。如果對照可獲得關于αIR3的數據，此活性是特別意外的，αIR3通常在IGF1受體結構區中被用作參照，已知對雌激素依賴腫瘤的活體內生長沒有任何作用(見圖6B)。以同樣的方式，與用來自鼠MAb1H7的重組抗體scFv-Fc獲得的結果相比(見圖6C)，MAb7C10對MCF-7細胞的活體生長的抑制作用更有效。實例2.7C10和他莫西芬對MCF-7腫瘤活體生長效應的比較為了確定抗體7C10對雌激素依賴乳腺癌治療的有效性，將7C10和他莫西芬做了比較，而他莫西芬是當前用于治療有局部和/或轉移的進展乳腺癌以及預防復發的藥物(見VIDAL2000，1975-1976頁)。在激素依賴的乳腺癌中，雌激素受體(ER)表達和IGF-IR表達存在著顯著的相關關系(SurmaczE等人，BreastCancerResTreat，Feb，47(3)255-267，1998)。此外，雌激素(E2)為了刺激細胞增殖似乎可與IGF1(有時寫作IGF-I或者IGFI)一道起協同作用。已經顯示E2治療可以使IGF-IRmRNA及其蛋白質表達水平升高近10倍(LeeAV等人，MolEndocrinol，May，13(5)787-796，1999)，具體表現為IGF-IR的磷酸化顯著增加。另外，E2能明顯刺激IRS-1(胰島素受體底物-1的縮寫)的表達，而IRS-1是磷酸化IGF-IR的底物之一。許多年來，他莫西芬廣泛用于E2依賴乳腺癌患者的激素療法(ForbesJF，SeminOncol，Feb，24(1stSuppl1)S1-5-S1-19，1997)。他莫西芬和雌二醇競爭并抑制雌二醇對其受體的附著(JordanV.C.，BreastCancerRes.Treat.，31(1)41-52，1994)。另外，他莫西芬還可通過抑制IGF-IR的表達和磷酸化來抑制IGF-IR依賴的增殖(GuvakovaM.A.等人，CancerRes.，July1，57(13)2606-2610，1997)。這些資料作為一個整體似乎指明了IGF-IR是E2/ER相互作用誘導的增殖過程中的一個重要介質。長期使用他莫西芬還能顯著增加子宮內膜腫瘤發生的危險(Fisher等人，J.NationalCancerInstitute，86，7527-537，1994；VIDAL2000，1975-1976)及E2非依賴性乳腺癌的間接復發(LiC.I.等人，J.Natl.CancerInst.，July4，93(13)1008-1013，2001)。于是在這種情形下利用MCF-7模型做了7C10抗體和他莫西芬體內抗腫瘤效應的比較研究，以便明確其在與IGF-IR相關的ER增殖中的活性。為此，7×106MCF-7細胞皮下種植于裸鼠，24小時后植入長久釋放的雌二醇顆粒(0.72mg/片，釋放超過60天)，這是建立任何人類E2依賴性腫瘤動物模型必不可少的。細胞種植5天后測量腫瘤大小，并將小鼠分成6組，分別做如下處理1)腹膜內注射7C10抗體，劑量為250μg/只，每周兩次；2)腹膜內注射10μg他莫西芬PBS液，內含3％羥基丙烷基纖維素(HPC)；或者3)溶解他莫西芬的溶劑(羥基丙烷基纖維素)。他莫西芬每天注射，持續4周，周末除外。接受類似單抗7C10處理的小鼠每天注射含3％HPC的PBS。先前已經有一項研究證實單獨注射溶劑對腫瘤生長沒有影響。圖7結果顯示單抗7C10能顯著抑制腫瘤MCF-7的生長(星號*對應于對照組/7C10組以t檢驗的比較)，而且7C10抗體似乎比他莫西芬抑制腫瘤生長更有效(圓圈°對應于他莫西芬組/7C10組以t檢驗的比較)，提示這種單抗治療可能替代他莫西芬治療。實例3.單抗7C10體內抗不同來源人體腫瘤活性的實證a)抗體7C10在三種腫瘤模型上的體內活性為了歸納對其他表達IGF1受體腫瘤的活性，7C10抗體分別在雄激素非依賴性的前列腺腫瘤模型DU145(也寫作DU-145)、SKES-1骨肉瘤模型以及肺非小細胞腫瘤模型A549上做了測試。實驗方案與前述MCF-7的設計可比，結果(圖8A～8C)顯示此單抗在這三種腫瘤模型上有明顯的活性。前列腺腫瘤模型上觀察到的活性特別引人關注，因為單抗1H7的單鏈scFv對雄激素非依賴性的前列腺腫瘤模型并無作用(Li等人，2000)。b)抗體7C10在同位移植腫瘤模型A549上的體內活性前述的傳統的異種移植模型不能進行腫瘤轉移的藥物研究，因為皮下種植的腫瘤仍然局限于注射部位，因而不能如實人體的實際情況。為了在一個更接近實際情形的模型上評價我們的抗體，我們將A549細胞植入胸膜內。此模型(Clin.CancerRes.2000Jan；6(1)297-304有詳細描述)就可用于腫瘤轉移研究，接近人體上觀察到的腫瘤轉移，如縱隔、肺、心以及脊柱的轉移。實驗中，106A549細胞注入雌性裸鼠胸膜內，7天后，22只裸鼠分成兩批一批接受500μg/只的攻擊劑量，然后每周兩次250μg的7C10治療；另一批依照同樣的設計用同種型9G4抗體治療。圖31顯示單抗7C10治療的小鼠存活率顯著提高，表明此抗體對腫瘤轉移有作用。實例4.體內單抗7C10和新霉酰胺的比較以及兩種療法共用的效果新霉酰胺是一種在肺非小細胞腫瘤和乳腺轉移腫瘤治療中需要的化療化合物。我們在A549腫瘤模型上做了有關7C10抗體和新霉酰胺的比較及這兩種產品可能有的相互協同作用的研究。在實驗中，5.106A549細胞被皮下移植到小鼠的右側腹部，5天后測量腫瘤大小并開始單抗和/或新霉酰胺的治療。抗體劑量始終為250μg/次/鼠，一周兩次，腹膜內注射。至于新霉酰胺，腹膜內注射小鼠所能承受的最大劑量或者10mg/kg。這種治療每隔7天進行一次，共3次，共同治療時兩種產品注射前再混合。圖9的結果顯示抗體7C10令人驚異地與傳統的新霉酰胺治療在這種模型中一樣起作用，同樣于第72天在7只小鼠中的5只身上(無可測出的腫瘤)也觀察到兩種產品顯著的協同作用。實例5.體外抑制IGF2誘發MCF-7腫瘤生長的研究正如上面指出的，許多腫瘤都過表達IGF-IR，尤其在大部分乳腺和結腸腫瘤中，增殖信號是通過IGF2(有時寫作IGF-II或IGFII)轉給此受體的。所以，確保單抗7C10同樣可以體外抑制IGF2誘導的MCF-7腫瘤增長是非常必要的。為此，細胞接種于96孔板中，去除胎牛血清并加入在培養基中為終濃度的200ngIGF2/ml進行刺激(加或不加濃度為10μg/ml的待測單抗)。圖10的結果顯示如同IGF1一樣，IGF2顯著刺激MCF-7細胞的生長，而加入用作對照的同種型9G4抗體則沒有刺激作用。正如DeLeon等人描述的(GrowthFactors，6327-334，1992)一樣，在加入單抗αIR3的過程中沒有觀察到任何效應。另一方面，單抗7C10完全抑制了IGF2誘發的生長，其活性顯著高于1H7。實例6.嵌合7C10(C7C10)和人源化7C10(h7C10)的生物學活性a)7C10/C7C10和7C10/h7C10的體外作用在MCF-7模型上的比較如上所述，在MCF-7模型上測試了嵌合形式的7C10抗體及純化的人源化形式1的抗體(此處寫作7H2HM)。圖11和12的結果分別顯示出這兩種形式的抗體很完美地保留了其抑制IGF1誘導的MCf-7腫瘤生長的特性。b)單抗7C10和h7C10在IGF1附著其受體后所誘發的信號轉導過程的比較效應體外實驗中對IGF1誘導的MCF-7細胞系生長的抑制活性應該是單抗7C10結合IGF1受體過程中抑制IGF1介導的信號轉導的轉化。為證實這個假說，MCF-7細胞在有或沒有待測抗體存在的條件下和IGF1或不和IGF1共同孵育。經過短暫的孵育后，溶解細胞，免疫沉淀β鏈，并借助抗磷酸酪氨酸激酶抗體評估此亞單位的磷酸化。圖13的實驗結果顯示7C10或h7C10附著后顯著抑制了IGF-IRβ亞單位的磷酸化，與無關鼠抗體(9G4)或人抗體(實驗方案中寫作IgG1)相反。c)7H2HM抗體介入的ADCC機制b)段所述信號轉導的抑制是7C10和7H2HM抗體發揮生物學活性的主要機制，然而，在應用于人體時，IgG1的同種型7H2HM抗體可能通過ADCC(抗體依賴的細胞毒性)類型的機制引發細胞的溶解。為了證實此觀點，來自人類供體的外周血NK(自然殺傷)細胞置于A549或預先和10μg7H2HM抗體共同孵育4小時(每5×105個細胞)并標記了51Cr(50μg)的MCF-7細胞中。在本實驗中，賀賽汀(herceptin)(圖32A和32B中寫作h4D5)作為實驗的陽性對照。正如預期的那樣，圖32A至圖32D的結果顯示賀賽汀在A549和MCF-7兩種細胞上都引發了明顯的ADCC(分別見圖32A和32B)。同樣地，7H2HM亦可在A549細胞引發ADCC(見圖32C)，但此現象發生的幅度小于MCF-7細胞(見圖32D)。d)抗體7C10和7H2HM對細胞周期的效應體外實驗觀察到的MCF-7細胞生長抑制應能透過對細胞周期的效應而表現出來。為了回答這個問題，我們將4×105MCF-7細胞接種于6孔板，24小時后去除小牛血清，在有或無被測試抗體的條件下加入IGF1。經過24小時的孵育，收獲細胞用于細胞周期的研究。圖33B顯示了有IGF1對進入細胞周期以及MCF-7細胞生長的效應和無IGF1對進入細胞周期以及MCF-7細胞生長的效應(見圖33A)。加入生長因子后，可觀察到G0/G1期的顯著下降(從88.2％降至56.3％)而S期(從7.8％升至31％)和G2/M期(從4％升至12.7％)因此升高。加入抗體7C10和7H2HM(見圖33C)過程中，可見進入細胞周期的進程明顯受到抑制，其中要注意的是鼠源性抗體及其人源化類似物對細胞周期具有可相比的活性。作為陽性對照，αIR3在實驗中的活性較7C10和7H2HM稍差，而對照同種型9G4抗體對細胞周期無影響。e)A549體內模型上抗體7C10和7H2HM的比較活性為了證實人源性抗體7H2HM的體內活性，我們將7H2HM和單抗7C10在肺非小細胞腫瘤模型A549上做了比較，除了將每周兩次、每次劑量250μg改為125μg外，其余實驗嚴格按上面的方案進行，因為大量的7H2HM抗體未利用。抗體9G4作為單抗7C10的同型對照，一無關的人免疫球蛋白同種型IgG1(以下稱為HIgG1)用作人源化抗體7H2HM的對照。圖34A顯示9G4與HIgG1的對照曲線沒有明顯差異，而鼠單抗7C10則如愿抑制了腫瘤的生長，至于人源化抗體7H2HM的活性強度與其鼠源性抗體完全一致。此結果連同前面體外實驗觀察到的現象提示人源化并未改變抗體的特性。另一方面，在小鼠異種移植模型中，人源化抗體的活性似乎固有地與信號轉導的抑制機制聯系在一起，于是，如果ADCC效應在裸鼠腫瘤生長抑制的過程中起作用，那么，應該可以觀察到鼠源性和人源化抗體活性上的差異。如所預期的，在MCF-7乳腺癌模型所做的同樣的體內實驗就顯示抗體7H2HM在抑制體內腫瘤生長方面完全可與鼠源性抗體7C10媲美(圖34B)。f)7H2HM和新霉酰胺之間協同作用的實證重復實例4所提供的實驗方案以期重獲7C10及其人源化抗體7H2HM的結果。圖35A和35B的結果顯示，在有7C10的情況下，人源化抗體和7H2HM和新霉酰胺之間有明顯的協同效應。g)抗體7C10和7H2HM對MCF-7細胞體外凋亡的效應如前所述，在細胞表面過表達時IGF-IR可提供針對凋亡的保護。此外，前述的實例也表明抗體7C10和7H2HM具有作為化療活性化合物的潛力。為了測試抗體7C10和7H2HM誘導凋亡的能力并部分解釋其與化療藥物的潛在協同作用，我們對MCF-7細胞在有無阿霉素(可致體外細胞系凋亡的藥劑)的條件下進行了實驗。在實驗中，MCF-7細胞以2.104/cm2接種于平皿內并在無酚紅的10％胎牛血清(FCS)RPMI培養基中培養24小時，然后PBS洗兩次，再放回無FCS的培養基中培養。在加入10μg/ml抗體之前允許有37℃、10分鐘的適應時間，再37℃培養10分鐘，將重組的IGF-1(Sigma)加入培養基(終濃度50ng/ml)。細胞再次置于37℃，1小時，使抗體和IGF-I吸附。最后，培養基中加入阿霉素(Sigma)，濃度2μg/ml，細胞繼續37℃孵育24小時。10μg/ml新霉酰胺亦做同樣的處理。在用annexinV-FITC(20分鐘，4℃)和DAPI(2μg/ml)標記后，借助流式細胞術分析細胞的活力。死細胞百分率通過標記的Annexin+/DAPI+集落計算。抗體5C2用作同型對照。圖36的結果顯示阿霉素誘發了8％的MCF-7細胞凋亡。當細胞經抗體7C10和阿霉素共同處理后可見細胞死亡明顯增加。相同的效應亦見于抗體7H2HM。抗體和新霉酰胺共用時也能觀察到相同形式的結果。實例7.編碼單克隆抗體(MAb)7C10重和輕鏈可變區的基因的克隆策略使用TRIREAGENTTM(按照供應商提供的使用說明書，SIGMA，T9424)從107的分泌抗體7C10的雜交瘤細胞中抽提總RNA。借助Amersham-Pharmacia的’第一鏈cDNA合成’試劑盒(#27-9621-01，按照供應商提供的使用說明書)，合成第一個cDNA鏈。對于二個鏈，用試劑盒中含有的寡核苷酸NotI-d(T)18進行激發反應。由此獲得的cDNA:mRNA雜交體被用來通過PCR擴增編碼Mab7C10重和輕鏈的基因。通過使用對小鼠免疫球蛋白重和輕(κ)鏈特異的寡核苷酸聯合進行PCR。對應于5’端的引物在對應于信號肽的區域內雜交(表2為重鏈，表3為輕鏈)。這些引物是從數據庫中的大量小鼠抗體序列中搜集的(JonesS.T.等人，Bio/Technology988-89，1991)。對應于3’端的引物在重鏈恒定區內雜交(亞類IgG1的CH1區，距V-C連接不遠，表4的MHC-1引物)和輕鏈(κ區，距V-C連接不遠，表4的MKC引物)。表2小鼠免疫球蛋白重鏈可變區(MHV)5’區的寡核苷酸引物(″小鼠可變重鏈″″MHV″)MHV-15′ATGAAATGCAGCTGGGTCATSTTCTT3′(SEQIDNo.13)MHV-25′ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT3′(SEQIDNo.14)MHV-35′ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTT3′(SEQIDNo.15)MHV-45′ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRT3′(SEQIDNo.16)MHV-55′ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTT3′(SEQIDNo.17)MHV-65′ATGGCTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTG3′(SEQIDNo.18)MHV-75′ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT3′(SEQIDNo.19)MHV-85′ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG3′(SEQIDNo.20)MHV-95′ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATT3′(SEQIDNo.21)MHV-105′ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCT3′(SEQIDNo.22)MHV-115′ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG3′(SEQIDNo.23)MHV-125′ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT3′(SEQIDNo.24)NBKEYR＝A/G，Y＝T/C，W＝A/T，K＝T/G，M＝A/C，S＝C/G.表3小鼠免疫球蛋白κ(輕)鏈可變區(MKV)5’區的寡核苷酸引物(″小鼠可變κ″″MKV″)MKV-15′ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT3′(SEQIDNo.25)MKV-25′ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGT3′(SEQIDNo.26)MKV-35′ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT3′(SEQIDNo.27)MKV-45′ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGG3′(SEQIDNo.28)MKV-55′ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTT3′(SEQIDNo.29)MKV-5A5′ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT3′(SEQIDNo.30)MKV-65′ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRG3′(SEQIDNo.31)MKV-75′ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACA3′(SEQIDNo.32)MKV-85′ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAAT3′(SEQIDNo.33)MKV-95′ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTT3′(SEQIDNo.34)MKV-105′ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTC3′(SEQIDNo.35)MKV-115′ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTT3′(SEQIDNo.36)MKV-12A5′ATGRAGTYWCAGACCCAGGTCTTYRT3′(SEQIDNo.37)MKV-12B5′ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT3′(SEQIDNo.38)MKV-135′ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTAT3′(SEQIDNo.39)NBKEYR＝A/G，Y＝T/C，W＝A/T，K＝T/G，M＝A/C，S＝C/G.表4小鼠VH和VL基因3’端的寡核苷酸引物輕鏈(MKC)5′ACTGGATGGTGGGAAGATGG3′(SEQIDNo.40)小鼠κ區的恒定區ADAAPTVSIFPPSS(SEQIDNo.41)GCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGT(SEQIDNo.42)||||||||||||||||||||(MKC)CCATCTTCCCACCATCCAGT(SEQIDNo.43)重鏈(MHC-1)5′CCAGTGGATAGACAGATG3′(SEQIDNo.44)小鼠γ-1(IgG1亞類)的CH1區AKTTPPSVYPL(SEQIDNo.46)GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTG(SEQIDNo.45)|||||||||||||||||||||(MHC-1)CCCCCATCTGTCTATCCACTG(SEQIDNo.47)實例8.克隆自鼠雜交瘤7C10的免疫球蛋白序列遵循前述的擴增策略，對應于重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的PCR產物用pGEM_-TEasyVectorSystems(Promega)進行克隆。對7C10VL而言，PCR產物經MKC連同MKV1與MKV2引物擴增得到，而7C10VH則需用MHC-1連同MHV8和MHV12引物擴增PCR產物。PCR產物的全序列測定顯示輕鏈有兩處不同而重鏈只有一處。a)從寡核苷酸MKV1分離出的可變區所得DNA序列具有功能性免疫球蛋白可變區的特征，因此推測是7C10VL的編碼基因，其DNA(SEQIDNos.48和50)和氨基酸(SEQIDNo.49)的cDNA序列見圖14。b)從寡核苷酸MKV2分離出的可變區此輕鏈編碼基因來自于一異常mRNA轉錄物，該轉錄物存在于所有用于生產7C10雜交瘤的鼠骨髓瘤細胞Sp2/Oag14中的原始MOPC-21腫瘤的標準融合伴侶中。該序列包含了一種V、J基因異常重組的方式(四個堿基缺失致使讀框中有一處改變)以及23位胱氨酸-酪氨酸的突變。這些改變提示此輕鏈可能沒有功能，盡管可以轉錄為mRNA。假輕鏈的DNA序列沒有給出。c)從寡核苷酸MHV8和MHV12分離出的可變區除了寡核苷酸自身編碼的序列之外，用MHV8和MHV12擴增得到的DNA序列完全一樣。這種序列是一種功能性重鏈的新的編碼序列，被推定為單抗7C10的VH。編碼7C10VH的cDNA的DNA(SEQIDNos.51和53)及氨基酸(SEQIDNo.52)序列見圖15。實例9.鼠-人嵌合基因的構建構建嵌合抗體7C10，使鼠7C10的VL和VH分別聯接到人恒定區κ(kappa)和γ(gamma)-1區。寡核苷酸用于修飾7C10的VL和VH編碼DNA的側翼序列5’與3’端，使其能夠克隆入載體進行哺乳動物細胞的表達。表達載體使用強啟動子HCMV，以使嵌合抗體7C10重鏈和輕鏈有效轉錄。另一方面，這些載體同樣含有SV40的復制啟始點，使DNA高效復制并在cos細胞中瞬時表達。實例10嵌合抗體7C10IGF-1受體識別活性的表達和評估兩個包含嵌合抗體7C10編碼DNA的質粒共轉染cos-7細胞(ATCC編號CRL-1651)用于研究重組抗體的瞬時表達。孵育72小時后移去培養基，離心去除細胞碎片，用ELISA技術分析人IgG1抗體的產生(見實例16)及其識別IGF-1受體的活性(見實例17)。人IgG1/Kappa濃度用ELISA方法檢測，結果顯示嵌合抗體7C10在cos-7細胞中的表達濃度介于300～500ng/mm，與大多數抗體測得的數據具有可比性。IGF-1受體的識別采用ELISA試驗，結果顯示嵌合抗體特異地識別受體，且相對親合力很好(見圖3A，3B和3C)。這為7C10抗體正確的VH和VL基因鑒定提供了功能上的證據。另外，這種7C10的嵌合形式看來對人源化抗體親合力的評估是一個不可缺少的工具。實例11.鼠抗體7C10可變區的分子建模為協助并改良經所謂“CDR嫁接”實現人源化的過程，基于1AY1重鏈和2PCP輕鏈的X射線結晶衍射獲得的結構，我們構建了一個鼠抗體7C10VL和VH區的分子模型。實例12.抗體7C10輕鏈可變區(7C10VL)經CDR嫁接的人源化過程a)7C10VL氨基酸序列與所有已知鼠序列的比較作為經CDR嫁接而人源化過程的一項預備步驟，7C10VL的氨基酸序列和Kabat數據庫中所有的鼠VL序列進行了比較(數據庫的互聯網地址是ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/database/kabat/fasta_format/，最后更新于1999年)。7C10VL經Kabat等人鑒定為κ輕鏈II亞組(見Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest第五版，NIHpublicationNo.91-3242，USDepartmentofHealthandHumanServices，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，1991)。序列同一性高達95％的鼠單克隆抗體輕鏈可變區(VL)已經鑒定(DRB1-4.3(SEQIDNo.55)95％，C94-5B11’CL(SEQIDNo.56)95％，見圖17)。為確定7C10VL序列中的非尋常氨基酸殘基，7C10VL氨基酸序列(SEQIDNo.54)和Kabat定義的鼠κ輕鏈II亞組的共有序列(SEQIDNo.57)進行了排列(見圖17)。在Kabat定義的3號位置，通常出現在κ輕鏈II亞組(71％)的纈氨酸(V)被亮氨酸(L)取代。此處的亮氨酸并非罕見，比如DR31-4.3和C94-5B11’CL就是如此。根據構建的分子模型，此氨基酸似乎并無特殊功能。因此，其保守性在人源化過程中可不必考慮。在Kabat定義的7號位置，通常出現在κ輕鏈II亞組(66％)的蘇氨酸(T)被異亮氨酸(I)取代。此處的異亮氨酸相對地較為罕見，因為在所有已知的鼠VL序列中僅僅發現了15次而在人VL序列中一次都沒有發現過。分子模型顯示此處的殘基(17)指向分子的表面，但并不與CDR接觸(最近處的CDR殘基應是Kabat42位精氨酸)。另外，17位殘基似乎也不太可能直接接觸抗原。因此，其保守性在人源化過程中可不必考慮，至少不是首先要考慮的。在Kabat定義的77號位置，通常出現在κ輕鏈II亞組(95.5％)的精氨酸(R)被絲氨酸(S)取代。此處的絲氨酸并非罕見。b)7C10VL的氨基酸序列與所有已知人VL序列的比較為了確定“CDR嫁接”的最佳候選序列，我們搜索了可能與7C10VL具有最大同源性的源自人的κ(Kappa)型VL區，最后還比較了鼠7C10κ(Kappa)型VL的氨基酸序列和所有Kabat數據庫中的人κ(Kappa)VL序列。鼠7C10VL和Kabat(1991)等定義的人II亞組κ(Kappa)型VL區有最大的序列同源性。源自人單克隆抗體的VH區在構成可變區的112個氨基酸中具有高達75.9％的序列同一性(GM607(SEQIDNo.58)，見圖18)。一個源自人胚細胞系的序列DPK15/A19(SEQIDNo.59)也得以鑒定，序列和GM607(Klobeck等人，1984)相比有76％的同一性(見圖18)。由此，GM607序列被選定為鼠7C10VL對人CDR的受位序列(根據Kabat的定義)。通過比較GM607序列和人II亞組的共有序列(SEQIDNo.60)(圖18)，沒有發現框架區(Rch)有什么特別的氨基酸殘基，同樣的事實再次指明GM607是進行CDR嫁接的很好的候選位置。c)人源化的7C10VL人源化的下一步是把鼠7C10VLCDR與篩選出來的人輕鏈框架區(Rch)即GM607(Klobeck等人，1984)連接起來。在這一步驟里，鼠7C10Fv區的分子模型對于選擇保守的氨基酸殘基特別有用，保守的序列既能在維持抗體分子三維結構方面(CDR的規范結構，VH/VL界面，等等)起到一定作用又能結合抗原分子。在框架區內，鼠(7C10VL)和人(GM607)氨基酸的每一處差異都進行了小心翼翼的檢查(見表5)。另外，鼠7C10VL序列里經鑒定的某些特別的氨基酸殘基(見實施例12.a)在必要時也都預以考慮。第一種7C10VL經“CDR嫁接”人源化的形式(human1)只是將GM607框架區(Rch)的一個殘基改變，即Rch1中的第2位殘基纈氨酸(按Kabat命名)，它實際上參與了7C10VLCDR1規范結構的構成，因而可能在維持CDR1環的正確構型方面起關鍵作用，所以此纈氨酸在人源化時依然保留在同樣的位置上(見表5和圖19的氨基酸序列(SEQIDNo.61)和圖20的DNA序列(SEQIDNos.62和64)，以及構成此肽信號的氨基酸序列(SEQIDNo.63)。第二種7C10VL經“CDR嫁接”人源化的形式(human2)沒有在人輕鏈GM607Rch內做任何改變，框架區里所有的殘基均來自人，包括第2位替換鼠7C10VL纈氨酸至人異亮氨酸的突變(見于人輕鏈GM607的相同位置(見表5和圖19的氨基酸序列(SEQIDNo.65)和圖21的DNA序列(SEQIDNos.66和68)，以及構成此肽信號的氨基酸序列(SEQIDNo.67))。這種形式是完全徹底的人源化(當然CDR本身要除外)，因為框架區內所有的氨基酸殘基都來自人輕鏈GM607。表5氨基酸序列排列，引導改型的人7C10VL區設計圖例第1欄(Kabat)表明根據Kabat等人(1991)的氨基酸殘基位置；第2欄(#)表明氨基酸殘基在正常序列中的位置；第3欄(FR或CDR)為容易地確定骨架節段(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR節段(CDR1、CDR2和CDR3)(″互補性決定區″的″CDR″)而制，具有3個CDRs分隔4個FRs；第4欄(小鼠輕鏈7C10)表示小鼠抗體7C10VL區的氨基酸序列(SEQIDNo.54)；第5欄(人胚細胞系DPK15/A19)表示胚細胞系κII人V輕鏈的氨基酸序列(SEQIDNo.59)；第6欄(GM607)表示人抗體GM607VL區的氨基酸序列(SEQIDNo.58)；第7和第8欄(改型的人7C101和2)表示人源化的1和2抗體7C10VL的氨基酸序列(分別為SEQIDNos.61和65)。”*”表示為如Chothia等人所定義的CDR環的正規結構部分(Nature，342，877-883，1989)。實例13.通過抗體7C10重鏈(7C10VH)可變區的CDR嫁接進行人源化的步驟a)7C10VH氨基酸序列與所有已知小鼠VH序列的比較作為通過CDR嫁接進行人源化的預備階段，首先將7C10VH的氨基酸序列與Kabat數據庫(Internetaddressftp//ftp.ebi.ac.uk/pub/database/kabat/fasta_format/，最后數據更新日期從1999)中存在的所有小鼠VH序列比較。因此7C10VH被確定為屬于Kabat等人(1991)所定義的重鏈亞群I(A)。確定了具有高達90.5％序列同一性的小鼠單克隆抗體VH區(ANO3’CL(SEQIDNo.70)，見圖22)。為了要確定7C10VH序列中非普通殘基，我們將7C10VH的氨基酸序列(SEQIDNo.69)與Kabat所定義的小鼠重鏈亞群I(A)的共有序列(SEQIDNo.71)進行了排列對比(見圖22)。殘基17(Kabat’s編號方式)，亞群I(A)共有序列是Thr，7C10VH中是Ser，定位在有關恒定區界面的分子表面上。此殘基看起來是不重要的。殘基27(Kabat’s編號方式)，亞群I(A)共有序列是Asp，7C10VH中是Tyr，是CDR1正則殘基。在此位置的Tyr并不罕見，對維持CDR1的良好構型可能是關鍵的。殘基84(Kabat’s編號方式)，亞群I(A)共有序列是Thr，7C10VH中是Asn。Asn在小鼠VH被發現93次，在人VH中發現3次。按照分子模型，它是遠離抗體結合部位的表面殘基。氨基酸的編號方式是Kabat等人的方式(1991)。在7C10VH和Rabat小鼠亞群I(A)間不同的框架區中(除了CDRs)的殘基被加下劃線。ANO3’CL表示小鼠抗體重鏈的序列(在Kabat數據庫中的記錄號是P001289)。b)7C10VH氨基酸序列與所有已知人VH序列的比較為了確定″CDR嫁接″的最佳人源候選者，考慮與7C10VH具有最大可能同一性的人源VH區。為此，小鼠7C10VH的氨基酸序列與Kabat數據庫中存在的所有人VH序列比較。如Kabat等人(1991)所定義的，小鼠7C10VH與亞群II的人VH區具有最大的序列同一性。人源單克隆抗體的VH區被確定在可變基因(也就是說除了CDRS和J區)編碼的全部98個氨基酸范圍內，具有高達67.3％的序列同一性(人VHFUR1’CL(SEQIDNo.73，見圖23)。按照與VHFUR1’CL同樣的標準還確定，人源胚細胞系4.22VHIV(Sanz等人，1989)具有68.4％的序列同一性(人胚細胞系(SEQIDNo.74)，見圖23)。由胚細胞系4.22VHIV編碼的序列被選擇作為能夠接受鼠7C10VH而非VHFUR1’CL的CDRs(按照Kabat的定義)的人序列，因為在比較4.22VHIV和VHFUR1’CL序列與人亞群II(人KabatsgII(SEQIDNo.72)，見圖23和表6)的共有序列時，盡管在VHFUR1’CL編碼的序列中確定存在兩個非典型的殘基(按照Kabat的命名法，分別是81和82A位置上的Gln和Arg)，但在4.22VHIV框架區(Rch)內沒有鑒定到非典型的殘基存在。c)7C10VH的人源化形式以下人源化過程的階段包括連接小鼠7C10VH的CDRs到人胚細胞系4.22VHIV的框架區(Rch)上(Sanz等人，1989)。在此階段，小鼠7C10Fv區的分子模型在選擇要保留的小鼠殘基中特別地有用，保留的殘基能夠在保持分子的立體結構(CDRs正規結構，VH/VL界面，等)或與抗原結合(屬于抗體結合部位)中起作用。在Rchs中，小鼠(7C10VH)和人(4.2.2VHIV)氨基酸之間的每一個差異被認真地檢查(見表6)。此外，如果需要考慮已被確定的小鼠7C10VH序列中的特殊殘基(見實例8.a)。在通過″CDR嫁接″人源化的第一種形式7C10VH，人源化1中，在4.22VHIV框架區(Rch)內進行了4個改變(見表6，圖24是氨基酸序列(SEQIDNo.75)，圖25是DNA序列(SEQIDNos.76和78)，以及組成肽信號的氨基酸序列(SEQIDNo.77))。這4個改變涉及·位于Rch1的殘基30(Kabat’s命名法)。此殘基實際上進入7C10VHCDR1的結構組合物中(如Chothia等人所定義的，1989)，并因此對維持此環的正確構造可能是關鍵的。在小鼠序列7C10VH中存在于此位置的Thr因此保留在人源化形式的相同位置上。·位于Rch2的殘基48(Kabat’s命名法)。此殘基接近CDRs，盡管按照分子模型不直接與后者接觸，但能夠影響其最終構造。在小鼠序列7C10VH中存在于此位置的蛋氨酸因此保留在人源化形式1的相同位置上。·位于Rch3的殘基67(Kabat’s命名法)。此殘基接近CDRs，按照分子模型能夠接觸CDR2中的賴氨酸60(Kabat’s命名法)。在小鼠序列7C10VH中存在于此位置的異亮氨酸因此保留在人源化形式1的此位置上。·位于Rch3的殘基71(Kabat’s命名法)。此殘基是CDR2正規結構的一部分，因此對維持此環的正確構造應當是關鍵的。在小鼠序列7C10VH中存在于此位置的精氨酸因此保留在人源化形式1的此位置上。在通過″CDR嫁接″人源化的第二種形式7C10VH，人源化2中，在4.22VHIV框架區(Rch)內進行了2個改變。這2個改變涉及已經在人源化形式1中描述的殘基30和71(Kabat’s命名法)(見表6，圖24是氨基酸序列(SEQIDNo.79)，圖26是DNA序列(SEQIDNos.80和82)，以及組成肽信號的氨基酸序列(SEQIDNo.81))。在通過″CDR嫁接″人源化的第三種形式7C10VH，人源化3中，沒有對4.22VHIV的框架區(Rch)進行改變。Rchs的所有殘基因此即是人源殘基，包括已經保留的殘基30、48、67和71(Kabat’s命名法)(見表6，圖24是氨基酸序列(SEQIDNo.83)，圖27是DNA序列(SEQIDNos.84和86)，以及組成肽信號的氨基酸序列(SEQIDNo.85))。因此，此人源化的形式3是完全人源化的(當然，除了如Kabat所定義的CDRs本身以外)，因為所有的Rchs殘基是由胚細胞系4.22VHIV的VH基因編碼的。表6氨基酸序列排列，引導改型的人7C10VH區設計圖例第1欄(Kabat)表明根據Kabat等人(1991)的氨基酸殘基位置第2欄(FR或CDR)為容易地確定骨架節段(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR節段(CDR1、CDR2和CDR3)而制，具有3個CDRs分隔的4個FRs第3欄(小鼠重鏈7C10)表示小鼠抗體7C10VH區的氨基酸序列(SEQIDNo.69)第4欄(胚細胞系4.22VHIV)表示基因4.22VHIV的氨基酸序列(Sanz等人，1989)(SEQIDNo.74)第5欄(人FUR1’CLVH，kabat記錄號N020619)表示人源IgMK抗核纖層蛋白B的氨基酸序列(SEQIDNo.73)[lacuna](Mariette等人，1993)第6、7和8欄(改型的人7C101、2和3)表示改型的人7C10VH區的氨基酸序列，分別是形式1(SEQIDNo.75)、2(SEQIDNo.79)和3(SEQIDNo.83)。″*″表示如Chothia等人所定義的CDR環正規結構部分(1989)。實例14.通過裝配寡核苷酸構建編碼7(210VL和VH人源化形式1的基因a)原理編碼人源化可變區的基因(引導肽+VH可變區VDJ或VK可變區VJ)通過在用抗生物素蛋白鏈菌素包被的磁珠上進行固相裝配而合成。由于在兩個序列中存在KpnI限制性位點，并且幾乎位于基因長度的一半(對于VL和VH基因5’端分別位于200和245號核苷酸)，因此編碼人源化7C10VH(445個堿基對)和人源化7C10VL(433個堿基對)的基因是通過融合兩個DNA片段來構建的。融合在一起的兩個片段本身通過裝配技術組合，包括使用磷酸化寡核苷酸(大約30-35mer)以在延長期間重疊的方式兩兩雜交(一個寡聚正義和其它反義，同一性大約為50％)。第一個在5’位置生物素化的寡核苷酸附著在磁珠上，然后逐個加入磷酸化寡核苷酸對。通過T4DNA連接酶在并列的磷酸化寡核苷酸之間產生磷酸二酯鍵。由此重新合成的基因可以直接地克隆(通過用與選擇的表達載體相適應的限制性酶消化)或通過PCR擴增以獲得更多的物質作為通過酶消化定向克隆的準備。然后，由此通過重新裝配構建的基因序列通過DNA自動測序證實。b)重新裝配技術的實驗方案濃度被調節到100μM的在5’位置磷酸化或在5’位置生物素化的寡核苷酸從MWGBiotech定購(見表7用于構建人源化7C10VL的寡核苷酸序列，和表8用于構建人源化7C10VH)。寡核苷酸按照表9描述的計劃成對雜交(克分子數相等的正義寡聚和反義寡聚混合物，500pmol，在T4DNA連接酶緩沖液中被加熱至95℃5分鐘，然后在工作臺上使其冷卻至室溫)。第一個生物素化的寡核苷酸附著在用抗生物素蛋白鏈菌素包被的磁珠上(Dyna微珠M-280抗生物素蛋白鏈菌素，Dynal產品編號112-05)。為此，500pmol的生物素化寡核苷酸的15mMNaCl溶液加入50ul輕輕倒出的微珠中(使用磁容器)，微珠預先用100μlTE1X緩沖液(Tris-EDTA100X緩沖液1MTris-HCl，pH8，0.1MEDTA，SigmaT-9285)沖洗兩次。37℃孵育15min后，用沖洗緩沖液(10mMTris-HClpH7.6，10mMEDTA和50mMNaCl)沖洗微珠兩次，然后逐個添加雜交的寡聚核苷酸對。在每次新添加寡核苷酸對時，加熱混合物至95℃5min，然后在工作臺上使其冷卻至室溫。一旦達到室溫，加入2μl的10U/lT4DNA連接酶(Biolabs)，混合物在37℃孵育20min。然后沖洗微珠(沖洗緩沖液)，接著加入后續寡核苷酸對。最后未配對的寡聚體(反義)以下面的方式裝配。5μl寡聚體(500pmol)和43μlT4DNA連接酶緩沖液加入輕輕倒出的微珠上，然后加熱混合物至95℃5min，并在工作臺上使其冷卻至室溫。一旦達到室溫，加入2μl的T4DNA連接酶(Biolabs)，并在37℃孵育混合物20min。然后用沖洗緩沖液沖洗微珠兩次，再用TE1X緩沖液沖洗兩次。然后，在進行基因重新裝配的克隆和測序之前，微珠可被4℃保存。表7用于通過重新裝配構建人源化7C10VL1的寡核苷酸DNA序列引導MluI.生物素5’-GTCAGAACGCGTGCCGCC(SEQIDNo.87)7C10Lresh.1正義S’-ACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT(SEQIDNo.88)7C10Lresh.2正義5’-GATGTTCTGGTTTCCTGCTTCCAGCAGTGATG(SEQIDNo.89)7C10Lresh.3正義5’-TTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCC(SHQIDNo.90)7C10Lresh.4正義5’GTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTG(SEQIDNo.91)7C10Lresh.5正義5’-CAGGTCTAGTCAGACCATTATACATAGTAATG(SEQIDNo.92)7C10Lresh.6正義5’-GAAACACCTATTTGGAATGGTACCTGCAGA(SEQIDNo.93)7C10Lresh.7反義5’-GGCAACTTCATGGTGGCGGCACGCGTTCTGAC(SEQIDNo.94)7C10Lresh.8反義5’-GAAACCAGAACATCAGCACCAACAGCCTAACA(SEQIDNo.95)7C10Lresh.9反義5’-CTGAGTCATCACAACATCACTGCTGGAAGCAG(SEQIDNo.96)7C10Lresh.10反義5’-TCTCCAGGGGTGACGGGCAGGGAGAGTGGAGA(SEQIDNo.97)7C10Lresh.11反義5’-TCTGACTAGACCTGCAGGAGATGGAGGCCGGC(SEQIDNo.98)7C10Lresh.12反義5’-AAATAGGTGTTTCCATTACTATGTACAATGC(SEQIDNo.99)7C10Lresh.13正義5’CAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATAAA(SEQIDNo.100)7C10Lresh.14正義5’-GTTTCTAATCGGCTTTATGGGGTCCCTGACAG(SEQLDNo.101)7C10Lresh.15正義5’GTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTA(SEQIDNo.102)7C10Lresh.16正義5’-CACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGAT(SEQIDNo.103)7C10Lresh.17正義5’-GTTGGGGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACA(SEQIDNo.104)7C10Lresh.18正義5’-TGTTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCATIGG(SEQIDNn.105)7C10Lresh.19正義5’TGGAAATCAAACGTGAGTGGATCCTCTGCG(SEQIDNo.106)7C10Lresh.KpnIREV5’-TCTGCAGGTACCATTGC(SEQIDNo.107)7C10Lresh.KpnI生物素5’-TGCAATGGTACCTGCAGAAGC(SEQIDNo.108)7C10Lresh.20反義5’-AGACTGCCCTCSGCTTCTGCAGGTACCATTGCA(SEQIDNo.109)7C10Lresh.21反義5’-CGATTAGAAACTTTATAGATCAGGAGCTGTGG(SEQIDNo.110)7C10Lresh.22反義5’-TGCCACTGAACCTGTCAGGGACCCCATAAAGC(SEQIDNo.111)7C10Lresh.23反義5’-GATTTTCAGTGTAAAATCTGTGCCTGATCCAC(SEQIDNo.112)7C10Lresh.24反義5’-TAA/kCCCCAACATCCTCAGCCTCCACTCTGCT(SEQIDNo.113)7C10Lresh.25反義5’-TCCACGGAACATGTGAACCTTGAiVAGCAGTAA(SEQIDNo.114)7C10Lresh.26反義5’-TTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCCGAAC(SEQIDNo.115)7C10Lresh.BamHI反義5’-CGCAGAGGATCCACTCACG(SEQIDNo.116)表8用于通過重新裝配構建人源化7C10VH1的寡核苷酸DNA序列引導MluI.生物素5’-GTCAGAACGCGTGCCGCC(SEQIDNo.117)7C10Hresh.1正義5’-ACCA’I’GAAAGTG’fTGAGTCTG’rrGTACCTCTTGfl.(SEQIDNo.118)7C10Hresh.2正義5’-CAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTCAGGTGCAGCT(SEQIDNo.119)7C10Hresh.3正義5’-TCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTG/JiGCCTTCG(SEQIDNo.120)7C10Hresh.4正義5’-GAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTC’1’CTGGT(SEQIDNo.121)7C10Hresh.5正義5’-TACTCCATCACCGGTGGTTATTTATGGKACTGG(SEQIDNo.122)7C10Hresh.6正義5’-ATACGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGCAGTGG(SEQIDNo.123)7C10Hresh.7正義5’-ATGGGGTATATCAGCTACGACGGTACCAATAAC(SEQIDNo.124)7C10Hresh.8反義5’-TCAACACTTTCATGGTGGCGGCACCCGTTCTGAC(SEQIDNo.125)7C10Hresh.9反義5’-ATACCAGGAATGGCTGTCAAGAGGTACAACAGAC(SEQIDNo.126)7C10Hresh.10反義5’-TGGGCCCGACTCCTGAAGCTGCACCTGAGACAGG(SEQIDNo.127)7C10Hresh.11反義5’-TGAGGGACAGGGTCTCCGAAGGCTTCACCAGTCC(SEQIDNo.128)7C10Hresh.12反義5’-CCACCGGTGATGGAGTAACCAGAGACAGTGCAGG(SEQIDNo.129)7C10Hresh.13反義5’-CCCTGGGGGCTGCCGTATCCAGTTCCATJiAATAA(SEQIDNo.130)7C10Hresh.14反義5’-TAGCTGATATACCCCATCCACTCCAGTCCCTT(SEQIDNo.131)7C10Hresh.KpnIREV5’-GTTATTGGTACCGTCG(SEQIDNo.132)7C10Hresh.KpnI生物素5’-TACGACGGTACCAATAACTAC(SEQIDNo.133)7C10Hresh.15正義5’-AAACCCTCCCTCAAGGATCGAATCACCATATC(SEQIDNo.134)7C10Hresh.16正義5’-ACGTGACACGTCC.IAGAACCAGTTCTCCCTGA(SEQIDNo.135)7C10Hresh.17正義5’-AGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACTGCA(SEQIDNo.136)7C10Hresh.18正義5’-GTCTATTACTCTGCGAGATACGGTAGGGTCTT(SEQIDNo.137)7C10Hresh.19正義5’-CTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCA(SEQIDNo.138)7C10Hresh.20正義5’-CCGTCTCCTCAGGTGAGTGGATCCTCTGCG(SEQIDNo.139)7C10Hresh.21反義5’-AGGGAGGGTTTGTAGTTATTGGTACCGTCGTA(SEQIDNo.140)7C10Hresh.22反義5’-JiCGTGTCACGTGATATGGTGATTCGATCCTTG(SEQIDNo.141)7C10Hresh.23反義5’-AGAGCTCAGCTTCAGGGAG.AACTGGTTCTTGG(SEQIDNo.142)7C10Hresh.24反義5’-CAGTAATACACTGCAGTGTCCGCAGCGGTCAC(SEQIDNo.143)7C10Hresh.25反義5’-ACTAGTCAWVGAAGACCCTACCGTATCTCGCA(SEQIDNo.144)7C10Hresh.26反義5’-CTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCC(SEQIDNo.145)7C10Hresh.BamHI反義5’-CGCAGA.GGATCCACTCAC(SBQIDNo.146)表9重新裝配人源形式7C10VH和VL編碼基因的寡核苷酸配對方案重新裝配7C10VL人源化1的重新裝配7C10VL人源化1的MlUI-Kpn1片段KpnI-BamHI片段生物素化的寡聚引導子MlUI7C10VL生物素化的寡聚7C10LKpnI寡聚對1和7寡聚對13和20寡聚對2和8寡聚對14和21寡聚對3和9寡聚對15和22寡聚對4和10寡聚對16和23寡聚對5和11寡聚對17和24寡聚對6和12寡聚對18和25反義寡聚7C10VLKpnI寡聚對19和26反義寡聚7C10LBamHI重新裝配7C10VL人源化1的M1UI-Kpnl片段重新裝配7C10VL人源化1的KpnI生物素化的寡聚引導子M1UI7C10VH生物素化的寡聚7C10HKpnI寡聚對1和8寡聚對15和21寡聚對2和9寡聚對16和22寡聚對3和10寡聚對17和23寡聚對4和11寡聚對18和24寡聚對5和12寡聚對19和25寡聚對6和13寡聚對20和26寡聚對7和14反義寡聚7C10VHBamHI反義寡聚7C10VHKpnl實例15通過定向誘變構建編碼7C10VL和7C10VH人源化形式2以及7C10VH人源化形式3的基因7C10VH的人源化形式2是通過對人源化形式1的48和67殘基(按照Kabat’s命名法)進行定向誘變獲得的。此定向誘變是在QuikChangeTM系統Stratagene位點-定向誘變(試劑盒#200518)的幫助下，按照廠商描述的方法實施的。構建分兩個階段進行，首先，形式1上的殘基48在7C10H人源化1QCM48正義和反義引物對(見表10)的幫助下突變，隨后，這個在48位殘基上突變的形式在7C10H人源化1QCI67正義和反義(見表10)引物對的幫助下自身在67位殘基上突變。同樣采用QuikChangeTM系統，通過對人源化形式2的30和71殘基(按照Kabat’s命名法)進行位點定向的突變獲得7C10VH的人源化形式3。此構建分兩個階段進行。首先，形式2上的殘基30在7C10H人源化QCT30正義和反義引物(見表10)的幫助下進行突變。隨后，這個在殘基30上突變的形式通過使用7C10H人源化1V67QCR71正義和反義引物對(見表10)在殘基71自身突變。7C10VL人源化形式2通過采用QuikChangeTM系統對形式1的殘基2(按照Kabat’s命名法)進行位點定向突變而獲得。形式1上的殘基2是通過使用7C10L人源化1QCV2正義和反義(見表10)引物對而突變的。表10通過stratageneQuikChangeTM系統進行定向誘變所使用的寡核苷酸列表實例16.電穿孔轉染cos7細胞含有嵌合或抗體7C10人源形式的輕、重鏈的哺乳動物表達載體在cos7細胞里做了重組7C10抗體瞬時表達的測試。DNA借助BioRad儀器(GenePulsar)經電穿孔導入cos細胞。載體DNA(每個載體10μg)加入0.8ml濃度為1×107/ml懸浮于PBS緩沖液的cos細胞(無Ca++和Mg++)，加載1900伏特和25微法的脈沖。轉染的cos細胞隨后加到8ml含5％小牛血清的DMEM培養液中37℃孵育72小時。收集上清，離心去除細胞碎片，最后用ELISA檢測重組IgG1/人K型抗體7C10的濃度。實例17.檢測cos轉染子培養上清中重組IgG1/人κ型抗體濃度的ELISA方法cos7細胞瞬時表達的培養上清需經7C10IgG1/人K型抗體的檢測。為檢測IgG1/人K型免疫球蛋白，用山羊抗人IgG的多克隆抗體(特異性針對γ球蛋白的Fc段，JacksonImmuno-ResearchLaboratoriesInc.，#109-005-098)包被96孔ELISA板(Maxisorb，Nunc)。cos細胞培養上清做系列稀釋后加入包被的孔板。37℃孵育1小時后洗滌，加入過氧化物酶標記的山羊抗人κ型輕鏈的多克隆抗體(HRP，Sigma，A-7164)。37℃孵育45分鐘，洗滌，加TMB底物(KPL#50-76-04)。孵育10分鐘，加1M硫酸終止反應，在450nm處讀取光密度值。用已知濃度的純化的人IgG1/人K型免疫球蛋白(Sigma，1-3889)作為標準參照抗體。實例18.測定7C10的人IgG1/κ型重組抗體識別IGF-1受體(IGF-IR)活性的ELISA方法用一種ELISA方法測定cos7培養上清識別IGF-1R的能力。96孔ELISA板(DynexImmulon2HB)用濃度為0.31ng/ul的IGF-1R(人胰島素樣生長因子I的可溶性受體，R&DSystems，#391-GR)PBS溶液包被，100ul/孔，4℃孵育過夜。用含0.05％Tween20的PBS洗板，加含0.5％明膠的PBS溶液封閉，37℃孵育1小時。PBS洗滌三次，然后將預先用含0.1％明膠和0.05％Tween20的PBS預先系列稀釋的待測cos細胞培養上清樣品加入板中。37℃孵育1小時，隨后洗三次(PBS中含0.05％Tween20)，再加過氧化物酶(HRP，JacksonImmune-ResearchLaboratoriesInc.，#109-035-098)標記的抗-人IgG抗體(特異性針對Fc段，用含0.1％明膠和0.05％Tween20的PBS按1∶5000稀釋)。37℃孵育45分鐘，PBS洗滌三次(含0.05％Tween20)，加TMB底物(KPL#50-76-04)。孵育10分鐘，加1M硫酸終止反應，在450nm處讀取光密度值。實例19測定經“CDR嫁接”不同形式人源化7C10抗體的對IGF1-R的識別活性起先，我們比較了嵌合的7C10輕、重鏈人源化樣式1抗體對IGF-1受體的識別活性。圖28顯示了ELISA法測定cos7細胞培養上清識別IGF-1R(見實例18)活性的結果，其中的IgG1/人K型抗體濃度(見實例17)已經ELISA定量。經測試的四種重組抗體其滴定曲線重疊得非常完美，表明它們對IGF-IR的相對親和力很相似、接近。由此可以得出結論由組成人源化輕鏈1(框架區內有一個鼠源的氨基酸殘基)和人源化重鏈1(框架區內有四個鼠源的氨基酸殘基)的7C10人源化形式1特異地識別IGF-1受體，且其親和力非常類似于由鼠可變區構成的嵌合抗體。隨后，我們考察了7C10的人源化輕鏈(人源化形式1對人源化形式2，見圖19)第2位氨基酸殘基(按照Kabat的命名)對IGF-IR識別功能的影響。圖29顯示了ELISA法測定cos7細胞培養上清識別IGF-1R(見實例18)活性的結果，其中的IgG1/人K型抗體濃度(見實例17)已經ELISA定量。兩種輕鏈的人源化形式1和2都成功地與人源化7C10VH1相結合。兩條滴定曲線相互重疊，表明輕鏈第2位氨基酸殘基的人源化突變(形式1突變為纈氨酸，形式2突變為異亮氨酸)顯然沒有對識別IGF1受體的相對親和力產生任何影響。7C10輕鏈人源化形式2除CDR以外沒有任何鼠的成分(即完全的人源化)，是我們傾向的7C10VL改造結果。我們對完全人源化的7C10輕鏈(人源化形式2，見上)以及三種人源化的7C10重鏈都做了測試。圖30顯示了ELISA法測定cos7細胞培養上清識別IGF-1R活性的結果，其中的IgG1/人K型抗體濃度(見實例17)已經ELISA定量。滴定曲線非常相似，事實上與相應嵌合抗體的標準參照曲線重疊，表明當和人源化的7C10VL2連接后，7C10VH人源化的三種形式1、2和3對IGF-1R有完全一樣的相對親和力。盡管如此，其他ELISA平行測試的結果(未給出)卻顯示71位(Kabat的命名)從精氨酸(鼠)到纈氨酸(人)的點突變與相應抗體對IGF-1R親和力的輕微損失有關系，因此，有理由認為人源化的7C10VH2和7C10VH1對IGF-1R的相對親和力是一樣的。相比于人源化形式1，形式2更可取，因為它僅有2個鼠氨基酸(30和71位，見圖24)。形式3同樣可取，因為它除了CDR以外沒有任何鼠的成分，而且親和力的損失似乎也及其微小。總之，根據本發明看起來有兩種改造的人源化7C10抗體特別可取一種由人源化7C10VH2(2個保守的鼠氨基酸殘基)和人源化7C10VL2(無保守的鼠氨基酸殘基)連接后組成，另一種由人源化7C10VH3(無保守的鼠氨基酸殘基)和人源化7C10VL2(無保守的鼠氨基酸殘基)連接后組成。最后這種形式是同時在輕鏈、重鏈中都沒有鼠氨基酸殘基出現的最后的人源化形式。實例20.EGFR和IGF-IR在A549細胞表面的表達我們在荷非小細胞肺腫瘤裸鼠(經皮下注射肺癌細胞系A549建立)身上同時使用分別針對IGF-IR和EGFR的兩種單抗研究了它們的協同作用。首先，為確保A549細胞在注射小鼠之前在細胞表面同時表達了IGF-IR和EGFR兩種受體，我們分別用鼠7C10抗-IGF-IR單抗(圖37B)和鼠225抗-EGFR單抗(圖37D)標記A549細胞，然后行流式細胞術計數。為此，A549細胞用含10％胎牛血清的PBS溶液4℃封閉30分鐘，洗滌后和目標抗體4℃孵育30分鐘，然后再洗三遍，加入FITC(異硫氰酸熒光素)標記抗鼠二抗，孵育30分鐘，最后在FACS(熒光活化的細胞分選儀)上讀取520nm(激發波長488nm)計數。結果如圖37A～37D所示A549細胞表面EGF受體和IGF1受體數目相當，分布均一。抗體標記的特異性經同種型抗體對照所證實(圖37C)。這些結果證實A549可作為細胞模型用于IGF-IR和EGFR兩種受體相互協同、協作的研究。實例21.共用抗-IGF-IR和抗-EGFR單克隆抗體在裸鼠體內抗腫瘤治療的協同作用裸鼠皮下移植5.106A549細胞。5天后測量腫瘤大小，腫瘤體積均一的裸鼠組成一批。從這一批裸鼠開始，每6只裸鼠隨機產生一組。每只裸鼠將接受每周兩次腹腔內單獨注射7C10或225單抗的治療，或者同時注射兩種單抗，總劑量均為250μg/鼠。單抗9G4作為實驗的同型對照。圖38結果顯示，單獨注射抗體7C10或225能顯著減緩腫瘤的生長。需要注意的是，這兩種單抗對抗腫瘤的能力基本相當。同時使用兩種單抗時可見明顯的協同作用(每次做動力學t檢驗時p≤0.01)，這與以往文獻報道不同，提示這兩種受體在體內存在著協作，最適于腫瘤的生長；而且，阻斷一種受體的作用并不能完全抑制另一個受體介導的腫瘤生長，這也與以往文獻報道不同。實例22.共用鼠單抗7C10和225在同位種植A549細胞的裸鼠中的抗腫瘤活性研究用同位模型評價抗腫瘤活性對于研究腫瘤擴散的過程有特殊的重要性。為了評估分別針對IGF-IR和EGFR的抗體混合物的抗腫瘤活性，106A549細胞(非小細胞肺癌)種植于裸鼠胸腔內。注意，這種腫瘤細胞種植的后果和在人體上觀察到的擴散過程是非常相似的，并能導致動物的死亡。圖39顯示單用抗體225和7C10可見存活率明顯提高，兩者效能彼此相當；令人驚訝的是，同時使用這兩種抗體裸鼠存活率有相當程度的提高，提示這樣的處理對腫瘤細胞的擴散有影響。實例23.7C10和7H2HM抑制IGF-IR和IRS-Iβ鏈中酪氨酸的磷酸化MCF7細胞在20mlRPMI培養基中培養24小時，細胞密度5×104細胞/cm2(75cm2平板，COSTAR)，培養基中無酚紅，但含5mM谷氨酰胺，青霉素/鏈霉素(濃度分別是100U/100μg/ml)，以及10％胎牛血清。PBS洗滌三次，細胞在RPMI培養基中培養12小時，此時培養基不含酚紅、胎牛血清，但仍含有5mM谷氨酰胺，青/鏈霉素，0.5μg/ml牛血清白蛋白(SigmaA-8022)和5μg/ml轉鐵蛋白(SigmaT8158)。為了激活，細胞先用封閉抗體(10μg/ml)37℃孵育2分鐘，然后加入IGF-I(SigmaI3769，50ng/ml)額外孵育2分鐘。隨著吸出孵育培養基終止活化反應，并將平板置于冰上，然后給細胞加入0.5ml裂解緩沖液((50mMtris-HClpH7.5，150mMNaCl，1％NonidetP40，0.5％脫氧膽酸鈉，)再混合蛋白酶抑制劑(每50ml1片，BoehringerRef.1697498)和磷酸酶抑制劑(CalbiochemRef.524625(1/100))進行裂解。刮下細胞，重獲懸液，置于振蕩器上4℃振蕩1.5小時。溶液經4℃12000rpm離心10分鐘，上清中的蛋白濃度由BCA試劑進行定量。500μg細胞裂解物蛋白與抗-IGF-IR(SantaCruzRef.sc-713)混合進行免疫沉淀，振蕩器上4℃孵育1.5小時。加入蛋白A-瓊脂糖(BoehringerRef.1134515)收獲免疫沉淀物，4℃振蕩器上孵育過夜。IRS-1的免疫沉淀則用的是抗-IRS-1抗體偶聯的瓊脂糖微珠(SantaCruzRef.559Ac)。瓊脂糖微珠用1ml裂解緩沖液洗兩次，用洗滌緩沖液1(50mMtris-HClpH7.5；500mMNaCl；0.1％NonidetP40；0.05％脫氧膽酸鈉(Boehringer1332597)，加有蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑)洗兩次，用洗滌緩沖液2(50mMtris-HCl；0.1％NonidetP40；0.05％脫氧膽酸鈉(BoehringerRef.1332597)，加有1∶100蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)洗一次。免疫沉淀物重懸于Laemmli緩沖液，加熱至100℃5分鐘。上清進行聚丙烯酰胺SDS凝膠(8％NovexEC6015)電泳分析。蛋白轉移至硝酸纖維素膜上進行免疫印跡用HRP標記的抗-磷酸化酪氨酸抗體(UpstateBiotechnology4G10)，或者抗-IGF-IR或抗-IRS-1β鏈(SantaCruzRef.sc8038)，然后是HRP標記的抗-兔抗體。印跡采用化學發光(AmershamRPN2209)，KodakX-matAR膠片上放射自顯影。圖40A描述的是MCF7細胞未經刺激(0)，單獨經IGF-1(50ng/ml)(0+IGF-1)刺激，或者結合了單抗或人源化抗-IGF-IR抗體(10μg/ml)7C10，1H7，7H2HM。抗體9G4或hIgG1被用作陰性對照的鼠或人同種型免疫球蛋白IgG1。IGF-IR的β鏈經免疫沉淀后用磷酸化的抗-酪氨酸抗體進行印跡。結果顯示單抗或人源化的抗-IGF-IR抗體7C10，1H7和7H2HM抗體抑制了IGF-IRβ鏈中酪氨酸的磷酸化。圖40B描述的是MCF7細胞未經刺激(0)，單獨經IGF-1(50ng/ml)(0+IGF-1)刺激，或者結合了單抗或人源化抗-IGF-IR抗體(10μg/ml)7C10，1H7，7H2HM。抗體9G4或hIgG1被用作陰性對照的鼠或人同種型免疫球蛋白IgG1。IRS-1經免疫沉淀后用磷酸化的抗酪氨酸抗體進行印跡。結果顯示單抗7C10，7H2HM和1H7抑制了IRS-1中酪氨酸的磷酸化。實例24.7C10和7H2HM引發IGF-IR的內化MCF7和A549細胞用10％胎牛血清PBS(FACS緩沖液)懸浮至1.107細胞/ml。1.106細胞和10μg/ml單抗(7C10，7G3，9G4)或20μg/ml7H2HM37℃孵育30分鐘。洗滌后，細胞被生物素化的抗-IGF-IR抗體(單抗12B1)標記(4℃30分鐘)，然后是和鏈親合素-488alexaFluor結合物4℃孵育30分鐘。最后，去除了細胞碎片的細胞經FACScan(Becton-Dickinson，Enembogegem，Belgium)用Cellquest軟件進行分析。圖41顯示A549細胞無染色(第一個峰)，和7C10或7H2HM孵育后(第二個峰)，以及和無關小鼠或大鼠IgG1孵育后(第三個峰)。當細胞經7C10或7H2HM孵育處理后，可見細胞表面IGF-IR表達的減少。實例25.7C10和7H2HM誘發IGF-IR的降解MCF-7細胞在15ml完全培養基培養24小時至10.104細胞/cm2(75cm2，Costar)，細胞用PBS洗三次，接著用無血清培養基孵育12小時。然后，細胞單獨用25μg/ml放線菌酮孵育，或者和10μg/ml單抗7C10、9G4、7G3，或者IGF-I(50ng/ml)孵育。在某些實驗中，細胞在和單抗孵育前需經MG-132(10uM，Calbiochem474791)37℃處理1小時以抑制蛋白酶體的活性。孵育后洗滌，然后加裂解緩沖液裂解細胞。20μg蛋白經8％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，再轉移至硝酸纖維素膜上進行上述的IGF-IR的抗β鏈免疫印跡實驗。經由Western印跡所作的IGF-IR完整性分析(圖42A)顯示7C10和7H2HM誘發了受體的降解，而受體的天然配體并沒有引起后者的降解。作為同種型抗體的對照，無關抗體9G4也沒有引起受體的降解。圖42B顯示受體降解被一個蛋白酶體抑制劑MG132(孵育2小時)所抑制。用人源化抗體7H2HM也獲得了大體相當的實驗結果(圖42C)。序列表<110>皮埃爾法布雷醫藥公司<120>新的抗IGF-IR抗體及其應用<130>346315-CN<150>PCT/FR03/00178<151>2003-01-20<150>FR02/00653<151>2002-01-18<150>FR02/00654<151>2002-01-18<150>FR02/05753<151>2002-05-07<160>156<170>PatentInVer.2.1<210>1<211>48<212>DNA<213>Musmusculus<220><221>CDS<222>(1)..(48)<400>1agatctagtcagagcattgtacatagtaatggaaacacctatttacaa48ArgSerSerGlnSerIleValHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuGln151015<210>2<211>16<212>PRT<213>Musmusculus<400>2ArgSerSerGlnSerIleValHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuGln151015<210>3<211>21<212>DNA<213>Musmusculus<220><221>CDS<222>(1)..(21)<400>3aaagtttccaaccgactttat21LysValSerAsnArgLeuTyr15<210>4<211>7<212>PRT<213>Musmusculus<400>4LysValSerAsnArgLeuTyr15<210>5<211>27<212>DNA<213>Musmusculus<220><221>CDS<222>(1)..(27)<400>5tttcaaggttcacatgttccgtggacg27PheGlnGlySerHisValProTrpThr15<210>6<211>9<212>PRT<213>Musmusculus<400>6PheGlnGlySerHisValProTrpThr15<210>7<211>18<212>DNA<213>Musmusculus<220><221>CDS<222>(1)..(18)<400>7ggtggttatttatggaac18GlyGlyTyrLeuTrpAsn15<210>8<211>6<212>PRT<213>Musmusculus<400>8GlyGlyTyrLeuTrpAsn15<210>9<211>48<212>DNA<213>Musmusculus<220><221>CDS<222>(1)..(48)<400>9tacataagctacgacggtaccaataactacaaaccatctctcaaagat48TyrIleSerTyrAspGlyThrAsnAsnTyrLysProSerLeuLysAsp151015<210>10<211>16<212>PRT<213>Musmusculus<400>10TyrIleSerTyrAspGlyThrAsnAsnTyrLysProSerLeuLysAsp151015<210>11<211>24<212>DNA<213>Musmusculus<220><221>CDS<222>(1)..(24)<400>11tacggtagggtcttctttgactac24TyrGlyArgValPhePheAspTyr15<210>12<211>8<212>PRT<213>Musmusculus<400>12TyrGlyArgValPhePheAspTyr15<210>13<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>13atgaaatgcagctgggtcatsttctt26<210>14<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>14atgggatggagctrtatcatsytctt26<210>15<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>15atgaagwtgtggttaaactgggtttt26<210>16<211>23<212>DNA<213>Musmusculus<400>16atgractttgggytcagcttgrt23<210>17<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>17atggactccaggctcaatttagtttt26<210>18<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>18atggctgtcytrgsgctrctcttctg26<210>19<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>19atggratggagckggrtctttmtctt26<210>20<211>23<212>DNA<213>Musmusculus<400>20atgagagtgctgattcttttgtg23<210>21<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>21atggmttgggtgtggamcttgctatt26<210>22<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>22atgggcagacttacattctcattcct26<210>23<211>28<212>DNA<213>Musmusculus<400>23atggattttgggctgattttttttattg28<210>24<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>24atgatggtgttaagtcttctgtacct26<210>25<211>29<212>DNA<213>Musmusculus<400>25atgaagttgcctgttaggctgttggtgct29<210>26<211>29<212>DNA<213>Musmusculus<400>26atggagwcagacacactcctgytatgggt29<210>27<211>23<212>DNA<213>Musmusculus<400>27atgagtgtgctcactcaggtcct23<210>28<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>28atgaggrcccctgctcagwttyttgg26<210>29<211>29<212>DNA<213>Musmusculus<400>29atggatttwcaggtgcagattwtcagctt29<210>30<211>29<212>DNA<213>Musmusculus<400>30atggatttwcargtgcagattwtcagctt29<210>31<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>31atgaggtkcyytgytsagytyctgrg26<210>32<211>23<212>DNA<213>Musmusculus<400>32atgggcwtcaagatggagtcaca23<210>33<211>29<212>DNA<213>Musmusculus<400>33atgtggggayctktttycmmtttttcaat29<210>34<211>24<212>DNA<213>Musmusculus<400>34atggtrtccwcasctcagttcctt24<210>35<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>35atgtatatatgtttgttgtctatttc26<210>36<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>36atggaagccccagctcagcttctctt26<210>37<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>37atgragtywcagacccaggtcttyrt26<210>38<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>38atggagacacattctcaggtctttgt26<210>39<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>39atggattcacaggcccaggttcttat26<210>40<211>20<212>DNA<213>Musmusculus<400>40actggatggtgggaagatgg20<210>41<211>42<212>DNA<213>Musmusculus<220><221>CDS<222>(1)..(42)<400>41gctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagt42AlaAspAlaAlaProThrValSerIlePheProProSerSer1510<210>42<211>14<212>PRT<213>Musmusculus<400>42AlaAspAlaAlaProThrValSerIlePheProProSerSer1510<210>43<211>20<212>DNA<213>Musmusculus<400>43ccatcttcccaccatccagt20<210>44<211>18<212>DNA<213>Musmusculus<400>44ccagtggatagacagatg18<210>45<211>33<212>DNA<213>Musmusculus<220><221>CDS<222>(1)..(33)<400>45gccaaaacgacacccccatctgtctatccactg33AlaLysThrThrProProSerValTyrProLeu1510<210>46<211>11<212>PRT<213>Musmusculus<400>46AlaLysThrThrProProSerValTyrProLeu1510<210>47<211>21<212>DNA<213>Musmusculus<400>47cccccatctgtctatccactg21<210>48<211>438<212>DNA<213>Musmusculus<220><221>CDS<222>(28)..(393)<400>48atgaagttgcctgttaggctgttggtgctgatgttctggattcctgcttccaga54LeuMetPheTrpIleProAlaSerArg15agtgatgttttgatgacccaaattccactctccctgcctgtcagtctt102SerAspValLeuMetThrGlnIleProLeuSerLeuProValSerLeu10152025ggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagcattgtacat150GlyAspGlnAlaSerIleSerCysArgSerSerGlnSerIleValHis303540agtaatggaaacacctatttacaatggtacctgcagaaaccaggtcag198SerAsnGlyAsnThrTyrLeuGlnTrpTyrLeuGlnLysProGlyGln455055tctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgactttatggggtc246SerProLysLeuLeuIleTyrLysValSerAsnArgLeuTyrGlyVal606570ccagacagg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>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>129ccaccggtgatggagtaaccagagacagtgcagg34<210>130<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>130ccctgggggctgccgtatccagttccataaataa34<210>131<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>131tagctgatataccccatccactccagtccctt32<210>132<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>132gttattggtaccgtcg16<210>133<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>133tacgacggtaccaataactac21<210>134<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>134aaaccctccctcaaggatcgaatcaccatatc32<210>135<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>135acgtgacacgtccaagaaccagttctccctga32<210>136<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>136agctgagctctgtgaccgctgcggacactgca32<210>137<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>137gtgtattactgtgcgagatacggtagggtctt32<210>138<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>138ctttgactactggggccagggaaccctggtca32<210>139<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>139ccgtctcctcaggtgagtggatcctctgcg30<210>140<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>140agggagggtttgtagttattggtaccgtcgta32<210>141<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>141acgtgtcacgtgatatggtgattcgatccttg32<210>142<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>142agagctcagcttcagggagaactggttcttgg32<210>143<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>143cagtaatacactgcagtgtccgcagcggtcac32<210>144<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>144agtagtcaaagaagaccctaccgtatctcgca32<210>145<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>145ctgaggagacggtgaccagggttccctggcccc33<210>146<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>146cgcagaggatccactcac18<210>147<211>31<212>DNA<213>類人<400>147ctggttactccatcagcggtggttatttatg31<210>148<211>31<212>DNA<213>類人<400>148cataaataaccaccgctgatggagtaaccag31<210>149<211>31<212>DNA<213>類人<400>149gggactggagtggatcgggtatatcagctac31<210>150<211>31<212>DNA<213>類人<400>150gtagctgatatacccgatccactccagtccc31<210>151<211>31<212>DNA<213>類人<400>151tccctcaaggatcgagtcaccatatcacgtg31<210>152<211>31<212>DNA<213>類人<400>152cacgtgatatggtgactcgatccttgaggga31<210>153<211>39<212>DNA<213>類人<400>153gatcgagtcaccatatcagtggacacgtccaagaaccag39<210>154<211>39<212>DNA<213>類人<400>154ctggttcttggacgtgtccactgatatggtgactcgatc39<210>155<211>31<212>DNA<213>類人<400>155gcttccagcagtgatattgtgatgactcagt31<210>156<211>31<212>DNA<213>類人<400>156actgagtcatcacaatatcactgctggaagc3權利要求1.一種分離的抗體，或其功能片段之一，所述的抗體或其所述片段之一能夠與人胰島素樣生長因子I受體IGF-IR結合，如果需要，能夠抑制其配基IGF1和/或IGF2的自然附著，和/或能特異地抑制所述IGF-IR受體的酪氨酸激酶活性，其特征是它含有包括至少一個互補決定區CDR的輕鏈，CDR選自序列SEQIDNo.2、4或6，或其序列在最優排列后與序列SEQIDNo.2、4或6具有至少80％同一性的至少一個CDR，或其特征是含有包括至少一個CDR的重鏈，CDR選自SEQIDNo.8、10和12序列，或其序列在最優排列后與序列SEQIDNo.8、10和12具有至少80％同一性的至少一個CDR。2.如權利要求1所要求的抗體或其功能片段之一，其特征是它含有一個重鏈，它包括至少一個序列SEQIDNo.12的CDR或在最優排列后與序列SEQIDNo.12具有至少80％同一性的序列。3.如權利要求1或2所要求的抗體或其功能片段之一，其特征是它含有一個重鏈，包括序列SEQIDNo.8、10和12的三個CDR中的至少兩個或三個CDR，或在最優排列后分別與序列SEQIDNo.8、10和12具有至少80％同一性的序列的三個CDR中的至少兩個或三個CDR。4.如權利要求1至3之一所要求的抗體或其功能片段之一，其特征是它含有一個輕鏈，包括選自SEQIDNo.2、4或6序列的至少一個CDR，或其序列在最優排列后與序列SEQIDNo.2、4或6具有至少80％同一性的CDR。5.如權利要求1至4之一所要求的抗體或其功能片段之一，其特征是它含有一個輕鏈，包括序列SEQIDNo.2、4和6的三個CDR中的至少兩個或三個CDR，或在最優排列后與序列SEQIDNo.2、4和6分別具有至少80％同一性的三個CDR中的至少兩個或三個CDR。6.如權利要求1至5之一所要求的抗體或其功能片段之一，其特征是它不以顯著的方式與人胰島素受體IR附著。7.如權利要求1至6之一所要求的抗體，其特征是所述的功能片段選自Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、scFv-Fc和完整體，或任何其半衰期已經被增加的片段，如pegylated片段。8.能夠分泌如權利要求1至6之一所要求的抗體的鼠雜交瘤。9.如權利要求8所要求的鼠雜交瘤存放在CNCM，法國巴斯德學院，巴黎，2001年9月19日，編號1-2717。10.一種抗體或其功能片段之一，其特征是所述的抗體由權利要求9所要求的雜交瘤分泌。11.如權利要求1至7之一所要求的抗體或其功能片段之一，其特征是所述的抗體含有一個包括氨基酸序列SEQIDNo.54的輕鏈序列，或包括在最優排列后與序列SEQIDNo.54具有至少80％同一性的序列，或/和它含有一個包括氨基酸序列SEQIDNo.69的重鏈序列，或包括在最優排列后與序列SEQIDNo.69具有至少80％同一性的序列。12.如權利要求11所要求的抗體或其功能片段之一，其特征是所述的抗體是嵌合抗體，而且含有來自與鼠不同種屬的抗體輕鏈和重鏈恒定區。13.如權利要求12所要求的嵌合抗體或其功能片段之一，其特征是所述的不同種屬是人。14.如權利要求13所要求的嵌合抗體或其功能片段之一，其特征是來自人抗體的輕鏈和重鏈恒定區分別是κ和γ-1、γ-2或γ-4區。15.如權利要求1至7之一所要求的抗體或其功能片段之一，其特征是所述的抗體是人源化抗體，包含一個輕鏈和/或一個重鏈，其中所述輕鏈和/或重鏈的骨架節段FR1至FR4分別來自人抗體輕鏈和/或重鏈的骨架節段FR1至FR4。16.如權利要求15所要求的人源化抗體或其功能片段之一，其特征是所述的抗體含有一個輕鏈，它包括氨基酸序列SEQIDNo.61或65，或在最優排列后與序列SEQIDNo.61或65具有至少80％同一性的序列，或/和其特征是含有一個重鏈，它包括氨基酸序列SEQIDNo.75、79或83，或在最優排列后與序列SEQIDNo.75、79或83具有至少80％同一性的序列。17.如權利要求15或16所要求的人源化抗體或其功能片段之一，其特征是所述的抗體包含包括氨基酸序列SEQIDNo.65的輕鏈，并含有包括氨基酸序列SEQIDNo.79或83，優選SEQIDNo.83的重鏈。18.一種分離的核酸，其特征是它選自下列核酸a)編碼如權利要求1至7和10至17之一所要求的抗體或其功能片段之一的核酸，DNA或RNA；b)如a)所定義的核酸的互補核酸；和c)在最嚴格條件下能夠與序列SEQIDNo.1、3、5、7、9或11的至少一個CDR雜交，或與在最優排列后與序列SEQIDNo.1、3、5、7、9或11具有至少80％同一性的序列雜交的至少18個核苷酸的核酸。19.含有如權利要求18所要求的核酸的載體。20.含如權利要求19所要求的載體的宿主細胞。21.除人以外的轉基因動物，含有至少一種細胞被如權利要求19所要求的載體轉化。22.產生如權利要求1至7和10至17所要求的抗體或其功能片段之一的過程，其特征是包括以下階段a)在培養基和合適的條件下培養如權利要求20所要求的細胞；和b)回收所述的抗體或其功能片段之一，它的產生是從培養基或所述培養的細胞開始。23.能夠通過如權利要求22所要求的過程獲得的抗體或其功能片段之一。24.如權利要求1至7、10至17和23之任一所要求的抗體或其功能片段之一，其特征是還能特異地附著于人表皮生長因子受體，和/或能特異地抑制所述EGFR受體的酪氨酸激酶活性。25.如權利要求24所要求的抗體，其特征是它含有一個雙特異性抗體，以及含有特異地抑制EGF和人表皮生長因子受體EGFR附著和/或特異地抑制所述EGFR受體酪氨酸激酶活性的第二個基序，。26.如權利要求25所要求的抗體，其特征是它是二價的或四價的。27.如權利要求25或26之一所要求的抗體，其特征是所述的第二個基序選自片段Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、Fab’PEG、scFv、scFv-Fc和完整體，或任何其半衰期已被增加的形式。28.如權利要求25至27之任一所要求的抗體，其特征是所述的第二個抗EGFR基序來自鼠單克隆抗體225，其鼠-人嵌合衍生物C225，或來自此抗體225的人源化抗體。29.如權利要求1至7、10至17和23至27之一所要求的抗體或其功能片段之一作為一種藥物。30.含有一種化合物作為有效成分的組合物，該化合物由如權利要求1至7、10至17和23至29之一所要求的抗體或其功能片段之一組成。31.如權利要求30所要求的組合物，其特征是含有第二個化合物，后者選自能夠特異地抑制EGF與人表皮生長因子受體EGFR的附著、和/或能夠特異地抑制所述EGFR受體酪氨酸激酶活性的化合物。32.如權利要求31所要求的組合物，其特征是所述的第二個化合物選自分離的抗EGFR抗體，或其功能片段，能夠通過競爭EGF與EGFR的附著而產生抑制作用。33.如權利要求32所要求的組合物，其特征是所述的抗EGFR抗體選自單克隆、嵌合或人源化的抗EGFR抗體，或其功能片段。34.如權利要求32或33任一條所要求的組合物，其特征是所述的抗EGFR抗體的功能片段選自片段Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc和完整體，或任何其半衰期已被增加的片段，如pegylated片段。35.如權利要求32至34之一所要求的組合物，其特征是所述的抗EGFR抗體是鼠單克隆抗體225、其鼠-人嵌合衍生物C225、或來自此抗體225的人源化抗體。36.如權利要求30至35之任一所要求的組合物，其特征是它還含有細胞毒性/細胞生長抑制劑和/或IGF-1受體和/或EGF受體各自的酪氨酸激酶活性抑制劑，作為同時、單獨或連續使用的聯合產物。37.如權利要求36所要求的組合物，其特征是所述的細胞毒性/細胞生長抑制劑選自與DNA相互作用的藥劑、抗代謝物、拓撲異構酶I或II抑制劑、或紡錘體抑制劑或穩定劑或任何能用于化療的藥劑。38.如權利要求36或37所要求的組合物，其特征是所述的細胞毒性/細胞生長抑制劑與所述組合物的至少一個成分化學性偶聯以同時使用。39.如權利要求37或38所要求的組合物，其特征是所述的細胞毒性/細胞生長抑制劑選自紡錘體抑制劑或穩定劑，優選長春瑞賓、長春氟寧或長春新堿。40.如權利要求36至39之一所要求的組合物，其特征是所述的IGF-1和/或EGF受體各自的酪氨酸激酶活性抑制劑選自衍生的天然藥劑、二苯胺酞酰亞胺、吡唑基或吡咯吡啶嘧啶或喹唑啉。41.如權利要求30至40之任一所要求的組合物，其特征是它還含有另一個針對HER2/neu受體細胞外結構區的抗體化合物，作為同時、單獨或連續使用的聯合產物，準備用于預防和治療癌癥。42.如權利要求41所要求的組合物，其特征是所述的針對HER2/neu受體細胞膜外結構區的抗體是賀賽汀(Trastuzumab)或其功能片段之一。43.如權利要求30至42之任一所要求的組合物，其特征是所述抗體的至少之一或其功能片段之一與細胞毒素和/或放射性元素共扼。44.如權利要求30至43之一所要求的組合物作為一種藥物。45.使用如權利要求1至7、10至17和23至29之一所要求的抗體或其功能片段之一，和/或權利要求30至44之任一所要求的組合物，來制備準備用于預防或治療疾病的藥物，所述疾病與IGF-IR和/或EGFR受體的過度表達和/或異常活化有關，和/或與由IGF1或IGF2與IGF-IR的相互作用和/或EGF與EGFR的相互作用介導的信號轉導通路的過度活化有關。46.如權利要求45所要求的使用，其特征是所述藥物的使用不誘導或僅輕微誘導與胰島素受體IR抑制有關的繼發效應。47.如權利要求45或46所要求的使用藥物制劑，所述藥物準備用于抑制正常細胞向具有腫瘤特征細胞的轉化，優選IGF依賴性的，特別是IGF1-和/或IGF2依賴性的和/或EGF依賴性的和/或HER2/neu依賴性的細胞。48.如權利要求45至47之任一所要求的使用藥物制劑，所述藥物準備用于抑制腫瘤細胞的生長和/或增殖，優選IGF依賴性的，特別是IGF1-和/或IGF2-依賴性和/或EGF依賴性和/或HER2/neu依賴性的細胞。49.使用如權利要求45至48之一所要求的藥物制劑，所述的藥物準備用于預防或治療癌癥。50.如權利要求49所要求的使用，其特征是所述的癌癥選自前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳腺癌、子宮內膜癌或結腸癌。51.使用如權利要求45至48之一所要求的藥物制劑，所述藥物準備用于預防或治療牛皮癬。52.體外診斷由IGF-IR和/或EGFR受體的過度表達或表達下調誘導的疾病的方法，始于懷疑有IGF-IR和/或EGFR受體異常存在的生物標本，其特征是所述的生物標本與權利要求1至7、10至17和23至29中之一所要求的抗體接觸，如果需要，所述抗體可能被標記。53.實施疾病診斷方法的試劑盒或裝置，所述疾病由IGF-IR和/或EGFR受體過度表達或表達下調而誘導，或進行一個過程以檢測和/或定量生物標本中IGF-IR和/或EGFR受體的過度表達或表達下調，優選所述受體的過度表達，其特征是所述試劑盒或裝置含有下列元件a)如權利要求1至7、10至17和23至29之一所要求的抗體或其功能片段之一；b)可選擇地，可形成有助于免疫反應的介質的試劑；c)可選擇地，可顯示由免疫反應產生的IGF-IR/抗體和/或EGFR/抗體復合物的試劑。54.使用如權利要求1至7、10至17和23至29之一所要求的抗體或其功能片段之一，制備藥物，所述藥物準備用來特異地將生物學活性化合物靶向至表達或過度表達IGF-IR和/或EGFR受體的細胞上。全文摘要本發明涉及能夠與人胰島素樣生長因子I受體IGF－IR特異結合，特別是鼠源、嵌合和人源化的單克隆抗體，以及編碼這些抗體的氨基酸和核酸序列。本發明還涉及應用這些抗體作為過度表達IGF－IR的癌癥或任何與所述受體過度表達有關的病理狀況的預防和/或治療癌癥的藥物，以及用于診斷與IGF－IR受體過度表達有關的試劑盒。發明進一步包括這種抗體與抗EGFR抗體和/或化合物和/或抗癌劑或毒素共軛藥劑聯合的產物和/或組合物，及其預防和/或治療某些癌癥的應用。文檔編號C12P21/08GK1620468SQ03802448公開日2005年5月25日申請日期2003年1月20日優先權日2002年1月18日發明者L·格奇,N·科爾瓦亞,O·萊熱申請人:皮埃爾法布雷醫藥公司