專利名稱：一種紅球菌sp.D12、培養方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物催化劑，具體的說是紅球菌sp．D12(Rhodococcus sp．D12)、它的培養條件及用于氰基水解的用途。
腈化物是用于有機合成的重要物質，但同時也是一些最嚴重的污染源。因此，腈化物的生物降解顯得尤為重要。工業上用微生物催化方法以丙烯腈為原料合成用途廣泛的化合物丙烯酰胺是其中最典型，也是最成功的例子。在氰基水解酶催化不對稱合成的研究中，α-芳基丙腈的手性拆分倍受關注，因為它們的水解產物α-芳基丙酸是一類非常重要的非甾體抗菌消炎藥，某些品種在市場上取得了巨大成功[Faber，K．2000．Biotransformations inorganic chemistrya textbook，4th ed．Spring-Verlag]。這些藥絕大多數以消旋體形式上市，但大量研究表明其S異構體效力遠遠優于R異構體，因而使光學純產品的需求大增。所以在這方面開發利用氰基水解酶催化的方法具有十分誘人的前景。1964年，氰基水解酶的首次分離來源于大麥葉子[Thimann，K．VMahadevan，SArch．Biochem．Biophys1964，105，133]。之后，幾乎所有用于學術研究和工業應用的均來源于微生物，其中絕大多數屬于細菌[Ohta，HChimia，1996，50，434]。在生物催化反應的研究中，合適的催化劑的獲得是一切工作的前提，這一點對于研究氰基水解酶來說也不例外。遺憾的是，目前市場上沒有商業化的氰基水解酶出售。為了滿足社會的需要，就需要研制出高活力、高選擇性的產氰基水解酶菌株并確定優化的培養條件。
本發明的目的是提供一種新的氰基水解酶菌株，即紅球菌sp．D12。
本發明的另一目的是提供上述紅球菌sp．D12的培養條件。
本發明的目的還提供紅球菌sp．D12的用途，具體來說用于催化降解腈化物轉化為光學活性的羧酸、酰胺或其混合物。
本發明所提供的菌株是采用逐級篩選的方法，直接從土壤中篩選含有所需酶的菌種并分離純化而得，而且提供了該菌種的優化培養條件和用于氰基水解的用途。
本發明提供的紅球菌sp．D12已于2000年10月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No．0497，分類命名為紅球菌sp．D12(Rhodococcus sp．D12)。
本發明的紅球菌sp．D12的培養方法，具體來說是用接種針挑取從土壤中分離篩選純化得到的紅球菌sp．D12菌體或其孢子接到斜面上，在斜面培養基中生長1-3天，PH=3-8，培養溫度15-40℃，培養基的成分是碳源0-20g／L、氮源1-15g／L、緩沖溶液0-10g／L、NaCl 0-1g／L、微量元素溶液0-5g／L，瓊脂10-40g／L。然后將少量無菌水倒入菌體生長良好的斜面中，用接種環挑散后直接倒入培養液中培養1-3天，PH=3-8，培養溫度15-40℃，培養液成分是碳源0-20g／L、氮源1-15g／L、誘導劑0．2-10g／L、緩沖溶液0-10g／L、NaCl 0-1g／L、微量元素溶液0-5g／L，所述的誘導劑是苯甲酰胺、尿素、乙腈、甲基丙烯腈、甲基丙烯酰胺、異丁酸、正丁腈、丙酰胺、甲酰胺或丙酸等。上述培養基和培養液均可先在107-127℃滅菌10-40分鐘。上述緩沖溶液是磷酸氫的一價金屬鹽或其水合物0．5-5g／L、磷酸二氫的一價金屬鹽或其水合物0．5-5g／L。本發明的培養方法中，推薦在無誘導劑的培養液中菌體培養16-32小時后再加入誘導劑，有利于提高產氰基水解酶的活力。
本發明的培養方法中，經培養液培養后離心分離得到的菌株可用生理鹽水洗滌，再離心分離，所得的濕菌能直接用于催化氰基水解反應。
上述碳源是葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、木糖、可溶性淀粉、乙醇、丁二酸鈉、甘露糖醇或可溶性糊精。其中葡萄糖、果糖、蔗糖和丁二酸鈉的比活力沒有很大差別，底物在所有情況下都能順利轉化，即使不加碳源也是如此。丁二酸鈉作碳源時酶比活力最好，但立體選擇性稍遜。葡萄糖和蔗糖作碳源時，細胞生長、酶活力和選擇性最好，而且葡萄糖作為碳源的立體選擇性稍優于蔗糖。
上述氮源是酵母膏、牛肉浸膏、黃豆粉浸液、蛋白胨、L-谷氨酸鈉、硫酸銨、氯化銨或硝酸銨。氨谷氨酸鈉的含氮量較高，成分穩定，有利于實驗的可重復性。蛋白胨是一種兩性電解質，具有良好的緩沖作用，易溶于水，便于細菌吸收利用。黃豆粉浸液作氮源時能得到最高的比活力，但立體選擇性稍遜。用蛋白胨作氮源時，酶活力低，選擇性也不佳。在牛肉浸膏配制的培養液中，無論細胞生長、酶活力和立體選擇性三個方面都較理想。上述誘導劑是苯甲酰胺、尿素、乙腈、甲基丙烯腈、甲基丙烯酰胺、異丁酸、正丁腈、丙酰胺、甲酰胺或丙酸。用乙腈、苯甲酰胺或甲基丙烯酰胺作誘導劑時，D12表現出好的氰基水解酶活力。其中用苯甲酰胺作誘導劑時得到的產物酸的構型為R，與用乙腈和甲基丙烯酰胺作誘導劑時相反。使用甲基丙烯酰胺，無論在細胞生長、酶活力還是立體選擇性方面，都明顯占優。優化的誘導時間是在培養液中培養16-32小時以后再加入誘導劑。當在培養20-28小時后再加入誘導劑時，酶活力大大提高，菌體生長量和立體選擇性也小有提高。誘導劑的量的增加對提高酶的比活力很有幫助，但對細胞生長及立體選擇性來說則不盡然，推薦每升培養液中加入1-5g誘導劑較優。
上述微量元素是鋅、錳、鈷、鎳、鎂、鐵、鈣、銅或硼。微量元素的溶液如MgCl2、FeSO4·7H2O、CaCl2、ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、CoSO4·7H2O、H3BO3等。
本發明中優選的培養液成分葡萄糖8-15g／L、牛肉浸膏2-8g／L、甲基丙烯酰胺1-5g／L、K2HPO4或K2HPO4·3H2O 0．5-2g／L、KH2PO40．5-3g／L、NaCl 0．1-0．5g／L、微量元素溶液0-2g／L。其中，誘導劑甲基丙烯酰胺在培養20-28小時后加入更佳。
本發明的紅球菌sp．D12具有高氰基水解活力，例如苯甲腈，苯乙腈，苯丙腈，鹵代、硝基或甲氧基取代的苯甲腈或苯丙腈，甲基丙烯腈，萘甲腈，萘乙腈，鹵代、硝基或甲氧基取代的萘丙腈或萘乙腈等都是可以被降解的底物，其中紅球菌sp．D12分別將上述外消旋的化合物轉化為光學活性的酸或酰胺。具體的方法是取新培養的紅球菌sp．D12菌體，懸浮于K2HPO4-KH2PO4緩沖液中，在15-40℃攪拌活化。將底物腈化物溶于或丙酮等溶劑中，慢慢加入(若底物減少，則菌體和緩沖液均按比例減少)。15-40℃下攪拌，TLC跟蹤反應進程。反應結束后，反應液離心處理(13000rpm，30min，20℃)，取上層清液，調節PH值至堿性，用乙醚等溶劑萃取，分別得到水相和有機相。有機相經洗滌，干燥，過濾，蒸除溶劑，純化，得到酰胺及回收的原料。調節水相PH值至酸性，用乙醚等溶劑萃取，合并有機相，同上步驟洗滌、干燥、蒸除溶劑、純化，得到酸。得到的氰基水解產物產率較高，光學選擇性好，如(S)-(+)-α-甲基-2-萘乙酸、(S)-(+)-6-甲氧基-α-甲基-2-萘乙酸等的ee值可高達90％以上。
圖1是不同培養時間的紅球菌sp．D12菌體生長量及酶活力其中培養條件培養液配方是微量元素溶液1g／L，K2HPO41．03g／L，KH2PO40．75g／L，NaCl 0．1g／L，牛肉浸膏5g／L，葡萄糖10g／L。PH=7．0，30℃，48小時。
反應條件PH=7．0，30℃，向每1g分別培養了不同時間的濕菌／4ml K2HPO4-KH2PO4緩沖液中加入誘導劑甲基丙烯酰胺2．5g／L，底物是10mg苯甲腈，反應時間1小時。產物由HPLC測定后計算酶活力。
符號說明。，以在波長546nm測定的光密度(OD546)表示的菌體生長情況；·，氰基水合酶和酰胺酶的總活力。
本發明提供了一種具有高活性的氰基水解的新酶源紅球菌sp．D12，并提供了上述新酶源的最優化培養條件，提供了最佳誘導劑、氮源、碳源、誘導時間、誘導劑的量，從而為氰基水解提供最合適的細胞生長、酶活力和立體選擇性。使用上述生物催化劑催化氰基水解，條件溫和，產率較高，選擇性尤佳，并適于工業化生產。
通過下述實施例將有助于進一步理解本發明，但并不能限制本發明的內容。
實施例1紅球菌sp．D12的培養用接種針挑取篩選到的菌體或其孢子接到斜面上，在斜面培養基中生長1-3天，PH=3-8，培養基的成分是葡萄糖8-15g／L、牛肉浸膏2-8g／L、K2HPO4或K2HPO4·3H2O 0-2g／L、KH2PO40-3g／L、NaCl 0-0．5g／L、微量元素溶液0-2g／L、瓊脂12-35g／L。將少量無菌水倒入菌體生長良好的斜面中，用接種環挑散后直接倒入無誘導劑的培養液中，PH=3-8，培養液成分是葡萄糖8-15g／L、牛肉浸膏2-8g／L、甲基丙烯酰胺1-5g／L、K2HPO4或K2HPO4·3H2O 0-2g／L、KH2PO40-3g／L、NaCl 0-0．5g／L、微量元素溶液0-2g／L，上述培養基和培養液均經在107-127℃滅菌10-40分鐘。30℃往復搖床培養24小時(或32小時)后再加入誘導劑甲基丙烯酰胺1-5g／L，經24小時培養后離心，生理鹽水洗滌，離心分離，得到的濕菌用于反應。
實施例2各種誘導劑對酶活力及立體選擇性的影響固定培養條件、反應條件、培養液配方中除誘導劑外的其他成分，分別考察了各種腈、酰胺和酸對酶活力的影響。
從斜面上挑取生長良好的紅球菌sp．D12接到培養液中，室溫下往復搖床培養48小時，培養液配方是微量元素溶液1．0g／L、K2HPO41．03g／L、KH2PO40．75g／L、NaCl 0．1g／L、牛肉浸膏5g／L、葡萄糖10g／L、誘導劑10g／L，PH=7．0，30℃。
取新培養的紅球菌sp．D12菌體，懸浮于K2HPO4-KH2PO4緩沖液中，濃度是10g濕菌／40mlK2HPO4-KH2PO4緩沖溶液，加入底物100mg 2-苯基丙腈反應，PH=7．0，30℃。TLC跟蹤反應進程。反應結束后，反應液離心處理(13000rpm，30min，20℃)，取上層清液，調節PH值至堿性，用乙醚萃取(50ml×3)，分別得到水相和有機相。有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓蒸除溶劑，殘余物柱層析純化，得到酰胺及回收的原料。調節水相PH值至酸性，用乙醚萃取(50ml×3)，合并有機相，同上步驟洗滌、干燥、蒸除溶劑、純化，得到酸。
結果如表1所示。表1誘導劑生長情況(干反應時 2-苯基丙酰胺2-苯基丙酸％總活力比活(unit／g重，g／l) 間(h) ％(產量／ee．) (產量／ee．) (unita／l) 干重)4．42 20 0／NDb0／ND00苯甲酰胺c 10．5 110／ND 26／6d13．11．25尿素12．63202／ND 1／ND0．630．05甲基丙烯酰胺 4．84 1064／6930／90 30．86．36正丁腈 3．59 203／ND 1／ND0．360．1苯乙腈 3．37 200／ND 0／ND00乙腈3．78 2262／3935／87 12．43．27甲基丙烯腈 3．16 202／ND 1／ND0．160．05丙酸2．1 201／ND 2／ND0．130．06苯甲酸 3．15 200／ND 0／ND00甲基丙烯酸 3．79 200／ND 0／ND00丙酰胺 3．16 204／ND 6／ND0．630．2a活力單位unit定義為每分鐘轉化1μmol苯甲腈的氰基水合酶及酰胺酶總活力。
bND，未測。
c底物回收66％產量，4％ee．構型未定。
d產物構型為R．實施例3各種氮源對酶活力及立體選擇性的影響固定培養條件、反應條件、培養液配方中除氮源外的其他成分，其他實驗條件同實施例2，分別考察了各種氮源對酶活力的影響。結果如表2所示。
表2氮源生長情況 反應時間2-苯基丙酰胺 2-苯基丙酸 ％ 總活力比活(unit／g(干重，g／l)(h) ％(產量／ee．) (產量／ee．) (unit／l)干重)無 0．84 ND酵母膏 5．47 2033／8560／6629．3 5．36牛肉浸膏 5．89 1812／9980／6039．5 6．71硝酸銨 5．65 1944／6350／5928．1 4．98黃豆粉浸液 5．47 1917／5276／11b 34．1 6．23蛋白胨a5．26 1923／40b27／4315．0 2．84L-谷氨酸鈉 4．21 1970／6418／8016．5 3．91a底物回收40％產量，2％ee．
b由旋光測定。
實施例4各種碳源對酶活力及立體選擇性的影響固定培養條件、反應條件、培養液配方中除碳源外的其他成分，其他實驗條件同實施例2，分別考察了各種碳源對酶活力的影響。結果如表3所示。表3碳源生長情況(干 反應時間 2-苯基丙酰胺 2-苯基丙酸％ 總活力比活(unit／g重，g／l) (h) ％(產量／ee．) (產量／ee．) (unit／l)干重)無2．5211 66／19 24／72 13．25．23葡萄糖5．8911 44／94 50／90 39．56．71蔗糖 5．0511 36／98 55／72 34．36．80果糖 3．5811 53／24 36／66 20．95．84丁二酸鈉 3．5811 40／66 55／45 25．06．90實施例5不同誘導時間對酶活力及立體選擇性的影響固定培養條件、反應條件、培養液配方中除誘導時間外的條件，其他實驗條件同實施例2，分別考察了不同誘導時間對酶活力的影響。結果如表4所示。表4誘導 碳源生長情況反應時間 2-苯基丙酰胺 2-苯基丙酸 ％ 總活力比活(unit／g時間a(干重，g／l) (h) ％(產量／ee．)(產量／ee．) (unit／l)干重)A蔗糖 5．471136／9855／72 34．3 6．80A葡萄糖 5．891144／9450／90 39．5 6．71B蔗糖 5．68 636／9854／77 47．9 8．43B葡萄糖 6．31 639／9952／93 52．8 8．37aA，培養開始時加入誘導劑；B，培養一天后加入誘導劑。
實施例6不同數量的甲基丙烯酰胺對酶活力及立體選擇性的影響固定培養條件、反應條件、培養液配方中除誘導劑的量外的條件，其他實驗條件同實施例2，分別考察了各種氮源對酶活力的影向。結果如表5所示。表5誘導劑的量 生長情況反應時 2-苯基丙酰胺 2-苯基丙酸％ 總活力比活(unit／g(g)a(干重，g／l) 間(h)％ (產量／ee．) (產量／ee．)(unit／l)干重)None 4．42 20 0／ND 0／ND 0 00．855．26 6 40／9750／78 43．1 8．202．5 6．31 6 39／9952／93 52．8 8．373 42／9748／96 52．8 8．375．0 6．11 6 20／9571／33 57．9 9．47a誘導劑加入時間均為培養23小時以后。
實施例7紅球菌sp．D12對α-甲基-4-硝基苯乙腈的氰基水解的催化作用取新培養的紅球菌sp．D12菌體5-10g，懸浮于20-40ml PH 7的K2HPO4-KH2PO4緩沖液中，在30℃攪拌活化0．5hr。將底物α-甲基-4-硝基苯乙腈80mg溶于0．2mlTHF或丙酮中，慢慢加入(若底物減少，則菌體和緩沖液均按比例減少)。30℃下攪拌，TLC跟蹤反應進程。反應結束后，反應液離心處理(13000rpm，30min，20℃)，取上層清液，調節PH值至堿性，用乙醚萃取(50ml×3)，分別得到水相和有機相。有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓蒸除溶劑，殘余物柱層析純化，得到酰胺及回收的原料。
反應式如下所示 反應55小時結束。柱層析純化石油醚-乙酸乙酯10∶1-乙酸乙酯，得到酰胺43mg(49％)。產物(R)-(-)-α-甲基-4-硝基苯乙酰胺淺黃色固體73％ ee，[α]D25-28．0(c1，CHCl3)．1H NMR(90 MHz，CDCl3)δ7．52，8．32(AB，4H，J=8Hz，Ar-H)，5．83(br s，2H，NH2)，3．72(q，1H，J=8Hz，CH)，1．56(d，3H，J=8Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13455，3283，3202，1675(C=O)，1594，1515(NO2)，1350(NO2)，860．MS m／z (rel．Intensity ％)195(M++1，45．7)，151(85．5)，104(51．7)，103(37．4)，92(32)，91(100)，57(29．4)，44(30．3)．實施例8紅球菌sp．D12對α-甲基-4-硝基苯乙腈的氰基水解的催化反應反應式如下所示 其他實驗條件如實施例7，調節水相PH值至酸性，用乙醚萃取(50ml×3)，合并有機相，同上步驟洗滌、干燥、蒸除溶劑、純化，得到酸。柱層析純化石油醚-乙酸乙酯3∶1，得到酸40mg(45．4％)。產物(S)-(+)-α-甲基-4-硝基苯乙酸淺黃色固體79％ ee， [α]D25+46．3(c1，CHCl3)．1H NMR(90 MHz，CCl4)δ10．59(s，1H，COOH)，7．47，8．27(AB，4H，J=9Hz，Ar-H)，3．83(q，1H，J=8Hz，CH)，1．59(d，3H，J=8Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13455，3283，3202，1675(C=O)，1594，1515(NO2)，1350(NO2)，860．MS m／z (rel．Intensity ％)196(M++1，9．0)，195(M+，23．9)，150(100)，105(25．1)，104(30．6)，103(324)，92(28)，91(31)，77(30．5)．實施例9紅球菌sp．D12對α-甲基-4-甲氧基苯乙腈的氰基水解的催化作用反應式如下所示 其他實驗條件如實施例7，反應30小時結束。柱層析純化石油醚-乙酸乙酯3∶1，得到產物58mg(65％)。產物(R)-(-)-α-甲基-4-甲氧基苯乙酰胺白色固體10％ee．1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ7．20，6．85(AB，4H，J=8．5Hz，Ar-H)，6．15(s，1H，NH2)，5．44(s，1H，NH2)，3．79(s，3H，OC3)，3．52(q，1H，J=7．1Hz，CH)，1．48(d，3H，J=7．1Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13347，3170(NH2)，2984，2838，1662(C=O)，1517，1464，1403，1253，1180，1031，832，788．MS m/z (rel．Intensity ％)180(M++1，3．5)，179(M+，9)，135(M+-CONH2，100)，105(20．7)，103(11．4)，91(16)，79(10．6)，77(11．1)，44(9)．實施例10紅球菌sp．D12對α-甲基-4-甲氧基苯乙腈的氰基水解的催化作用反應式如下所示 其他實驗條件如實施例8，30小時結束。柱層析純化石油醚-乙酸乙酯3∶1，得到酸21mg(23％)。產物(S)-(+)-α-甲基-4-甲氧基苯乙腈酸白色固體，m．p．70-72℃。93％ ee，[α]D25+65．2(c 0．95，EtOH)．{Lit[10]．87．3％ee，[α]D22-61．5(c1．15，EtOH)，R}1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ7．23，6．84(AB，4H，J=8．7Hz，Ar-H)，3．78(s，3H，OCH3)，3．68(q，1H，J=7．2Hz，CH)，1．48(d，3H，J=7．1Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13500-2800(br，OH)，1723(C=O)，1668，1611，1515，1457，1250，1180，1031，858，790．MS m／z (rel．Intensity ％)180(M++1，3．5)，179(M+，9)，135(M+-CONH2，100)，105(20．7)，103(11．4)，91(16)，79(10．6)，77(11．1)，44(9)．
紅球菌sp．D12對α-甲基-2-萘乙腈的氰基水解的催化作用反應式如下所示 其他實驗條件如實施例7，反應22小時結束。柱層析純化石油醚-乙酸乙酯1∶1，得到產物55mg(63％)。產物(R)-(-)-α-甲基-2-萘乙酰胺白色固體3％ee，[α]D25-2．1(c1，CHCl3)．1H NMR(90 MHz，CDCl3)δ7．60-7．98(m，4H，Ar-H)，7．30-7．60(m，3H，Ar-H)，5．60(br s，2H，NH2)，3．80(q，1H，J=8Hz，CH)，1．60(d，3H，J=8Hz，CH3)．IR(KBr)vmax/cm-13349，3192(NH2)，3051，2986，1652(C=O)，1506，1458，1408，1114，891，817，740，672，475．MSm／z (rel．Intensity ％)199(M+，28．2)，156(25．4)，155(M+-CONH2，100)，153(22)，152(11)，141(11．6)，128(10)，127(7．9)．Anal．Calcd．for C13H13NOC，78．36；H，6．58；N，7．03．FoundC，78．18；H，6．61；N，6．55．實施例12紅球菌sp．D12對α-甲基-2-萘乙腈的氰基水解的催化作用反應式如下所示 其他實驗條件如實施例8，反應22小時結束。柱層析純化石油醚-乙酸乙酯3∶1，得到產物25mg(28％)。產物(S)-(+)-α-甲基-2-萘乙酸白色固體，m．p．150-152℃98％ee，[α]D26+119．6(c 0．8，Me2CO){Lit[11]．[α]D25-129．38(c2．250，Me2CO)，R}1H NMR(90 MHz，CCl4)δ11．09(s，1H，COOH)，7．54-7．91(m，4H，Ar-H)，7．07-7．54(m，3H，Ar-H)，3．85(q，1H，J=8Hz，CH)，1．59(d，3H，J=8Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-12800-3080(br，COOH)，1698(C=O)，1599，1508，1458，1419，1225，900，865，831，803，745，690，481．MS m／z (rel．Intensity ％)200(M+，44．2)，155(M+-COOH，100)，153(21．8)，152(11．3)，129(7．3)，128(10．5)，127(8．1)，115(5．7)．實施例13紅球菌sp．D12對6-甲氧基-α-甲基-2-萘乙腈的氰基水解的催化作用反應式如下所示 其他實驗條件如實施例8，反應30小時結束。柱層析純化石油醚-乙酸乙酯3∶1，得到產物24mg(27％)。產物(S)-(+)-6-甲氧基-α-甲基-2-萘乙酸白色固體，m．p．150-152℃98％ee，[α]D26+62．2(c 0．8，CHCl3){Lit[14]．[α]D25+65．5(c1，CHCl3，S}1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ7．72(d，3H，J=8．7Hz，Ar-H)，7．41(d，1H，J=8．8Hz，Ar-H)，7．14-7．10(m，2H，Ar-H)，4．02(s，3H，OMe)，3．87(q，1H，J=7．1Hz，CH)，1．6(d，3H，J=7．1Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13196(br，COOH)，1729(C=O)，1605，1454，1265，1159，856，819，674，483．MS m／z (rel．Intensity ％)230(M+，48．1)，185(M+-COOH，100)，170(20．5)，154(11．7)，153(13．7)，142(9．4)，115(14．6)．實施例14紅球菌sp．D12對-α-甲基-2-甲氧基苯乙腈的氰基水解的催化作用反應式如下所示 其他實驗條件如實施例7，34小時結束。柱層析純化石油醚-乙酸乙酯1∶1，得到產物58mg(65％)。產物(R)-(-)α-甲基-2-甲氧基苯乙酰胺白色固體34．2％ee，[α]D22-41．5(c1．23，CHCl3)．1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ7．32-7．23(m，2H，Ar-H)，6．98(t，1H，J=7．5Hz，ArH)，6．90(d，1H，J=8．2Hz，ArH)，5．66(s，2H，NH2)，3．88(s，3H，OCH3)，4．04(q，1H，J=7．1Hz，CH)，1．48(d，3H，J=7．1Hz， CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13393，3196(NH2)，2968，1648(C=O)，1619，1494，1459，1245，756．MS m／z(rel．Intensity ％)180(M++1，7．7)，179(M+，22．1)，136(25．7)，135(M+-CONH2，100)，121(19．3)，105(29．9)，103(15．1)，91(23．5)，77(19．7)．Anal．Calcd．for C10H13NO2C，67．02；H，7．31；N，7．81．FoundC，67．15；H，7．28；N，7．81．實施例15紅球菌sp．D12對-α-甲基-2-甲氧基苯乙腈的氰基水解的催化作用反應式如下所示 其他實驗條件如實施例8，反應34小時結束。柱層析純化石油醚-乙酸乙酯3∶1，得到酸21mg(28％)。產物(S)-(+)-α-甲基-2-甲氧基苯乙酸白色固體91．4％ee，[α]D22+60．3(c0．9，CHCl3)．{Lit．67％ee，[α]D-46(c，CHCl3)，R}1H NMR(90MHz，CCl4)δ10．73(s，1H，COOH)，7．35-7．0(m，2H，Ar-H)，7．0-6．65(m，2H，ArH)，3．8(s，3H，OCH3)，4．01(q，1H，J=7Hz，CH)，2．43(d，3H，J=7Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13050-2750(br，OH)，1702(C=O)，1602，1588，1495，1459，1282，1243，1025，760．MS m／z(rel．Intensity％)181(M++1，2．6)，180(M+，29)，136(37．3)，135(M+-COOH，100)，121(42．3)，105(36．8)，103(20．8)，91(30．8)，77(23．6)．實施例16紅球菌sp．D12對α-甲基-4-溴苯乙腈的氰基水解的催化作用反應式如下所示 其他實驗條件如實施例7，反應4小時結束。柱層析純化石油醚-乙酸乙酯1∶1，得到酰胺46mg(53％)。產物(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺白色固體89．3％ee，[α]D22-48．7(c2．0，CHCl3)．1H NMR(90MHz，CDCl3)δ7．16，7．48(AB，4H，J=9Hz，Ar-H)，5．63(br s，2H，NH2)，3．55(q，1H，J=7Hz，CH)，1．47(d，3H，J=7Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13395，3200(NH2)，1657(C=O)，1618，488，1451，1396，1075，1010，827，795．MS m／z(rel．Intensity％)229(M++2，20)，228(M++1，12)，227(M+，20)，185(M++2-CONH2，96)，184(51)，183(M+-CONH2，96)，148(11．4)，105(54．2)，104(100)，103(48)，77(29．7)．實施例17紅球菌sp．D12對α-甲基-4-溴苯腈的氰基水解的催化作用反應式如下所示
其他實驗條件如實施例8，反應4小時結束。柱層析純化石油醚-乙酸乙酯3∶1，得到酸37mg(42％)。產物(S)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸白色固體99．6％ee，[α]D22+48．5(c1．8，MeOH)．{Lit．93．9％ee．+46(MeOH)，S}￡1H NMR(90MHz，CCl4)δ9．7(br，s，1H，COOH)，7．46，7．15(AB，4H，J=9Hz，Ar-H)，3．65(q，1H，J=7Hz，CH)，1．52(d，3H，J=7Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13050-2870(br，OH)，2984，2938，2879，1702(C=O)，1489，1461，1421，1403，1294，1280，827，749．MS m／z(rel．Intensity％)230(M++2，35)，228(M+，34)，185(M++2-COOH，98)，183(M+-COOH，100)，149(M+-Br，4)，104(66)，103(27)，81(24)，77(18)．
權利要求
1．一種紅球菌，其特征是由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏的編號為CGMCC No．0497的紅球菌sp．D12(Rhodococcus sp．D12)。
2．一種如權利要求1所述的紅球菌sp．D12的培養條件，其特征是(1)紅球菌sp．D12菌體或其孢子接到斜面上，在斜面培養基中生長1-3天，所述的培養基成分是碳源0-20g／L、氮源1-15g／L、緩沖溶液0-10g／L、NaCl 0-1g／L、微量元素溶液0-5g／L，瓊脂10-40g／L，PH=3-8，培養溫度是15-40℃，其中所述的緩沖溶液是0．5-5g／L磷酸氫的一價金屬鹽或其水合物、0．5-5g／L磷酸二氫的一價金屬鹽或其水合物。(2)從斜面上取菌體在培養液中培養1-3天，所述的培養液成分是碳源0-20g／L、氮源1-15g／L、緩沖溶液0-10g／L、NaCl 0-1g／L、微量元素溶液0-5g／L、誘導劑0．2-10g／L，PH值是3-8，培養溫度是15-40℃，緩沖溶液如前所述，所述的誘導劑是苯甲酰胺、尿素、乙腈、甲基丙烯腈、甲基丙烯酰胺、異丁酸、正丁腈、丙酰胺、甲酰胺或丙酸。
3．一種如權利要求2所述的紅球菌sp．D12的培養條件，其特征是所述的碳源是葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、木糖、可溶性淀粉、乙醇、丁二酸鈉、甘露糖醇或可溶性糊精。
4．一種如權利要求2所述的紅球菌sp．D12的培養條件，其特征是所述的氮源是酵母膏、牛肉浸膏、黃豆粉浸液、蛋白胨、L-谷氨酸鈉、硫酸銨、氯化銨或硝酸銨。
5．一種如權利要求2所述的紅球菌sp．D12的培養條件，其特征是一種如權利要求2所述的紅球菌sp．D12的培養條件，其特征是所述的微量元素是鋅、錳、鈷、鎳、鎂、鐵、鈣、銅或硼。
6．一種如權利要求2所述的紅球菌sp．D12的培養條件，其特征是誘導劑是菌株在培養液中培養16-32小時以后加入。
7．一種如權利要求2所述的紅球菌sp．D12的培養條件，其特征是所述的培養基或培養液在107-127℃滅菌10-40分鐘，
8．一種如權利要求2所述的紅球菌sp．D12的培養條件，其特征是培養后得到的菌株用生理鹽水洗滌，再離心或過濾分離得到菌株。
9．一種如權利要求2或6所述的紅球菌sp．D12的培養條件，其特征是培養液成分是葡萄糖1-15g／L、牛肉浸膏2-8g／L、甲基丙烯酰胺1-5g／L、K2HPO4或K2HPO4、3H2O 0．5-2g／L、KH2PO40．5-3g／L、NaCl 0．1-0．5g／L、微量元素溶液0-2g／L。
10．一種如權利要求1所述的紅球菌sp．D12的用途，其特征是用作氰基水解的催化劑。
全文摘要
本發明涉及一種紅球菌sp.D12(Rhodococcus sp.D12),該菌株系從土壤中逐級篩選出并經分離純化獲得,并且提供了紅球菌sp.D12的優化培養條件包括誘導劑的種類、氮源、碳源、誘導時間、誘導劑的量。該菌株在不同條件下將腈化物催化水解為羧酸、酰胺或它們的混合物。
文檔編號C12P7/40GK1291648SQ0012745
公開日2001年4月18日 申請日期2000年11月17日 優先權日2000年11月17日
發明者李祖義, 吳中柳 申請人:中國科學院上海有機化學研究所