專利名稱：用于目標物質的俘獲磁性揀選系統的制作方法
用于目標物質的俘獲磁性揀選系統交叉引用的相關申請本申請要求2007年8月23日申請的標題為“Trapping Magnetic CellSorting System”的US臨時專利申請No. 60/966092，和2008年3月19日申請的標題為"Trapping Magnetic Cell Sorting System”的US臨時專利申請No. 61/037994的優選權，這兩個申請 的公開內容在此以它們全部引入作為用于全部目的之參考。
背景技術：
基于它們的表面標志來揀選化學或者生物物質是生物學和醫學中的一種重要的 能力。磁性活化細胞揀選(MACS)有時候被用作細胞揀選技術，這是因為它能夠快速的選擇 大量的目標細胞。MACS的使用橫跨了寬的幅度，范圍從蛋白質凈化到細胞基治療。典型的， 目標細胞是用一種或多種超順磁性粒子來標示的，該粒子共軛到分子識別因素上(例如單 克隆抗體)，其識別具體的細胞表面標志。MACS的使用經常受限于熒光基血細胞計數之前的預富集。然而，由于它比其他方 法例如熒光活化細胞揀選(FACS)更高的通過量，因此MACS仍然是一種有競爭性的技術。為了實現稀少細胞(或者其他目標成分)的高通過量和高回收，需要對現有的 MACS系統進行改進。
發明內容
在不同的實施方案中，流體揀選模塊被設計來接收磁性粒子，然后將該粒子臨時 保持在模塊的適當位置上。隨后，將該粒子和/或它們的俘獲物質進行釋放、收集和/或進 一步加工。在這樣的實施方案中，流入揀選站中的磁性粒子在這里被俘獲，同時其他樣品成 分(非磁性成分)連續的流過和流出該站，由此分離和濃縮俘獲在磁性粒子上的物質。僅 僅在非磁性樣品成分已經流出揀選室之后，才可以釋放磁性粒子和/或它們的有效載荷， 并且在該揀選站的出口處分別收集。本發明的一方面涉及一種微流體揀選裝置，其用于將樣品揀選成為基本是目標物 質和基本是非目標物質。該裝置包括俘獲模塊，預加工和/或后加工站。該俘獲模塊包括 具有兩個相對的壁的通道，該壁的一個包括磁場梯度發生結構來施加磁力到樣品上，來至 少臨時的俘獲樣品中的磁性粒子。該預加工和/或后加工站與俘獲模塊一起整合到微流體 揀選裝置上。俘獲模塊中的流動通道可以包括相對的壁，其是不透明的壁和透明的壁或者兩個 不透明的壁。磁場梯度發生結構可以位于不透明壁上。該磁場梯度發生結構可以是以圖案 或者無規的配置到它的相對的壁上的鐵磁性結構。圖案可以是平行線，正交柵格，規則或者 不規則幾何形狀的長方陣列，及其組合。該鐵磁性結構可以是鎳，釩波明德合金，坡莫合金 或者其他鐵磁性材料。流動通道包括入口區域，俘獲區域和出口區域。在俘獲區域中的通道的深度可以 大于入口和出口區域的深度，優選是入口或者出口區域的大約2倍。可以使用多個獨立的 流動通道。這些流動通道可以共用緩沖劑歧管，并且可以配置來加工相同的樣品或者不同的樣品。在某些實施方案中，多個俘獲區域可以用于相同的流動通道中。該微流體揀選裝置可以包括外部磁性源，其位于俘獲模塊的一側上，優選位于磁 場梯度發生結構一側上，來產生磁場。在某些實施方案中，將磁場逐漸施加到俘獲站上來與 所述的俘獲站中的流體流動相抗衡，由此來在該俘獲區域逐漸被所述的磁場占據時，停止 所述移動。換句話說，移動磁場，來在俘獲區域中產生隨時間變化的磁場，由此引起期望的 磁性粒子運動。這可以用來以一種均勻的方式將磁性珠結合的目標粒子鋪展到俘獲區域中。這能 夠促進后分離操作等，例如通過使得釋放反應劑有效的接近磁性珠結合的目標物質的珠釋 放。磁性的逐漸施加能夠通過將外部磁性源相對于俘獲模塊移動來完成。外部源可以是一 個或多個永磁體，一個或多個電磁體，或者它們的組合。預加工站可以包括標示站，其用來用磁性粒子標示樣品中的物質，該磁性粒子具 有與所標示物質的親合性。要注意的是該標示物質可以是目標物質或者非目標物質。如果 標示了非目標物質，則通過俘獲非目標物質而提高了通過俘獲模塊的樣品中的目標物質的 濃度。如果標示了目標物質，則在俘獲模塊中俘獲了目標物質，隨后進行收集。在某些實施方案中，至少一個的預加工站或者后加工站包括富集模塊(用于提高 通過揀選裝置的樣品中的目標物質的濃度)，反應模塊，探測模塊，和溶解模塊(用于溶解 細胞，破壞病毒蛋白質表層，或者釋放小型生命系統的成分)。該俘獲模塊可以設計或者配 置來進行非俘獲操作，包括基因分析，用于DNA或者RNA低聚物的探測和/或擴增方案，基 因表達，酶活性化驗，受體結合化驗和ELISA化驗。本發明另一方面涉及一種微流體揀選裝置，其用于將樣品揀選成基本是目標物質 和基本是非目標物質。該裝置包括俘獲模塊，上述的預加工和/或后加工站，在俘獲模塊一 側上用于產生磁場的外部源，和隨時間來變化磁場的機構。該俘獲模塊包括具有兩個相對 的壁的通道，并且不具有磁場梯度發生結構。在一種實施方案中，具有外部磁性源的俘獲模 塊一側是不透明的。本發明仍然的另一方面涉及一種在微流體揀選裝置中揀選樣品的方法，該揀選裝 置包括俘獲模塊和在該俘獲模塊的兩個相對的壁中的僅僅一個上的磁場梯度發生結構。該 方法包括將樣品流入俘獲模塊中，在該俘獲模塊中產生磁場梯度，和在俘獲模塊中俘獲磁 性粒子。所述的樣品包含其上帶有分子識別因素的磁性粒子，目標物質和非目標物質。將 來自該模塊僅僅一側的外部磁場施加到磁場梯度發生結構上。在緊鄰磁場梯度發生結構處 俘獲磁性粒子。該揀選方法還可以包括將磁場外部源相對于俘獲模塊移動，同時將流體介質中的 磁性粒子流過模塊，由此以一種基本均勻的方式來俘獲磁性粒子。將磁場逐漸施加到俘獲 站上來與所述的俘獲站中的流體流動相抗衡，由此來在該俘獲區域逐漸被所述的磁場占據 時，停止所述移動。換句話說，移動磁場，來在俘獲區域中產生隨時間變化的磁場，由此引起 期望的磁性粒子運動，來將磁性珠結合的目標粒子以一種均勻的方式鋪展到俘獲區域中。在某些實施方案中，該揀選方法可以包括從磁場梯度發生結構的一個區域中釋放 磁性粒子，來釋放任何所俘獲的非磁性粒子和在磁場梯度發生結構或者另一個磁場梯度發 生結構的另一個區域中所俘獲的磁性粒子。該揀選方法還可以包括用磁性粒子標示樣品中 的目標物質，該磁性粒子具有與目標物質的親合性，或者用磁性粒子標示樣品中的非目標物質，該磁性粒子具有與非目標物質的親合性。該揀選方法還可以包括在微陣列中探測目 標物質，溶解目標物質，反應目標物質，或者成像所俘獲的目標物質。反應操作可以包括擴 增，排列，雜交，標示，交聯或者培養該目標物質。要注意的是這些預加工和后加工操作可以 發生在俘獲模塊中或者發生在相同的微流體裝置上的另外一個模塊中。本發明的這些和其他特征和實施方案將在下面參考相關的附圖進行更詳細的描 述。
圖1A表示了一種系統，其使用一次性流體控制芯片或者儲料筒。圖1B是一種工藝流程圖，表示了使用圖1A系統的方法。圖1C和1D表示了根據某些實施方案的磁性俘獲模塊的頂視圖和側視圖。圖2是一種根據本發明不同的實施方案的揀選樣品的方法的工藝流程圖。圖3表示了一種實施方案，在其中在磁性粒子通過俘獲區域的過程中，磁場發生 器在俘獲區域的一個表面上的移動。圖4A-4C表示了分級俘獲和釋放俘獲系統的一個例子。圖5表示了用于樣品孔和珠釋放試劑孔的流體輸入。圖6A-6H表示了布置在流體裝置中的不同結構的磁性俘獲，其用于目標物質的后 俘獲處理。圖7表示了在軟磁性(例如鎳)圖案中制作的非磁性俘獲特征的一個例子。圖8A-8C表示了無規陣列的鐵磁性結構的例子。圖9A和9B表示了流體通道實施方案的側視圖，其在俘獲區域具有大的深度。圖9C表示了一種實施方案，其具有平行的流體通道，該通道共享著共用緩沖劑歧管。圖9D表示了具有兩個俘獲區域的流體通道。
具體實施例方式導言和上下文磁性活化的細胞揀選(MACS)系統能夠高純度的選擇所標示的細胞或者其他樣品 成分。在某在實施方案中，這些系統以“俘獲模式”運行，這里在施加外部磁場之后，將非目 標物質和目標物質依次洗提。換句話說，將結合到磁性粒子上的物質保持在適當位置上，同 時洗提未結合的物質。然后，在該第一洗提步驟完成之后，將所述的結合到磁場上的并且防 止被洗提掉的物質以某些方式釋放，以使得它們能夠洗提和回收。根據某些實施方案，MACS系統的俘獲模塊包括樣品流過其中的通道，該樣品包括 結合和未結合到磁性粒子上的物質。通道的一側上包括磁場梯度發生結構，其在外部源的 磁場施加下產生磁場梯度。該磁場梯度吸引和俘獲磁性粒子以及所結合的物質。在樣品流 過俘獲模塊之后，所俘獲的粒子可以如下來釋放通過改變所施加的磁場或者通過分開在 磁性粒子與所結合的物質之間的結合。在上下文中，現在將描述俘獲型磁性分離系統的一個例子。圖1A和1C表示了根據 某些實施方案的磁性揀選模塊和系統。圖1A表示了系統101，其使用一次性流體控制芯片
6或者儲料筒103。每個芯片或者儲料筒包含著流體元件，該元件包括磁性俘獲模塊。在一種 運行模式中(正向選擇)，將樣品105例如少量血液提供到儲料筒的接受口 107，然后將帶 有樣品一起的儲料筒插入到加工和分析儀器121中。在該芯片中，在磁性俘獲模塊中揀選 和濃縮來自樣品的磁性粒子和目標物質(如果有任何的)。在樣品以此方式加工之后，可以 將所俘獲的物質在輸出管109中進行釋放和收集。這可以通過不同的手段來完成，包括減 少或者消除施加到俘獲模塊上的外部磁場或者施加試劑，該試劑從磁性粒子上釋放所俘獲 的物質。可選擇的，或者相結合的，可以提高施加到磁性粒子上的液體動力。在所示的實施 方案中，底盤包括著系統部件，該部件包括壓力系統(包括注射泵111和壓力控制器113)， 其提供了用于使樣品流過俘獲模塊的主要驅動力。當然，可以使用其他的設計，該設計使用 可選擇的驅動力例如連續泵或者氣動系統。還將來自緩沖劑存儲器115的緩沖劑通過緩沖 劑泵119和流動控制模塊117，在受控下提供到儲料筒。 在圖IB中，表示了一個加工順序的例子。具體的，該加工通過將樣品加裝到芯片 或者儲料筒上來開始，然后插入儀器中，如操作131所示。然后，在操作133中，將該芯片插 入儀器中來與外部磁體，流體連接器，和相關的設備排列成行。其后，將一個或多個收歧管 同樣加裝到該儀器中(操作135)。要注意的是在某些實施方案中，加裝到儀器中的順序可 以變化。接下來，在操作37中，將流體界面可靠連接到芯片上，來保證將樣品和緩沖劑無泄 漏的連接到芯片上。最后，將該儀器開始分離過程(139)，并且分離的細胞樣品可以通過卸 載收歧管來重新得到(141)。圖IC和ID表示了根據一種實施方案的俘獲模塊的頂視圖和側視圖。在一種具體 的例子中，所示的俘獲模塊是在圖IA所示的一次性儲料筒中進行。在圖IC中，所示的磁性 俘獲模塊的頂視圖包括中心樣品入口 143，和兩個分跨該樣品入口 143的緩沖劑入口 141。 從緩沖劑入口遞送緩沖劑能夠防止樣品的內容物沿著俘獲模塊的邊緣變成拖曳的，并且幫 助穩定壓力以及流動流體。如所示的，俘獲區域147 (其在這種實施方案中包括鐵磁性圖案 151)是在流動通道的下壁上形成的。在其上形成圖案的通道壁可以是透明的，半透明的或 者不透明的。如所示的，目標物質145是在俘獲區域上俘獲的。樣品所提供的剩余的未俘獲的 細胞149 (或者其他物質)和碎片從俘獲區域中被清洗出去，因為它們沒有附著到磁性粒子 上。應當注意的是可以使用正向或者負向俘獲方案。在圖IC和ID所示的正向俘獲方 案中，目標物質例如145和163是經由連接劑171來連接到磁性粒子167表面上的，其后在 俘獲區域中與磁性粒子一起俘獲。這有效的凈化和濃縮了目標物質。在負向俘獲實施方案， 非目標物質(不同于目標物質)是用磁性粒子標示的。因此，未標示的目標物質連續的流 過俘獲模塊，同時標示的非目標物質在俘獲區域中俘獲，并且從懸浮液中除去。這種方案凈 化了目標物質，但是這樣作并沒有濃縮它們。圖ID中表示了工作中的俘獲區域的側視圖。如這里所示，鐵磁性結構175是在流 動通道173的下壁177的內表面上形成的。這些結構充當了磁場梯度產生(MFG)結構(下 面更詳細的描述)。外部磁場169典型的被用作驅動力，來俘獲流過流體介質的磁性粒子。 MFG結構175可以成形該外部磁場，來產生局部高的磁場梯度，來幫助俘獲流動的磁性粒子 167。在圖ID所示的實施方案中，外部磁場是通過交替極性的一個陣列的永磁體161來提供的。更通常的，該外部磁場可以通過一個或多個永磁體和/或電磁體來產生。在某些實施方案中，聚集的磁體例如圖ID所示的這些磁體是可移動的，單獨的或者作為一組，目的 是動態的改變施加到俘獲區域上的磁場。在某些實施方案中，該磁場是使用電磁體來控制的。在其他實施方案中，可以使用 永磁體，其能夠機械的移入和移出鄰近揀選站之處，以使得在該揀選區域中的磁場梯度能 夠局部升高和降低，來促進磁性粒子的依次俘獲和釋放。在某些使用電磁體的情況中，該磁 場是受控的，以使得在該加工的早期(在磁性粒子的俘獲過程中)產生強的磁場梯度，然后 在該方法的后期(在粒子釋放過程中)降低或者除去。如圖ID中的例子所示，磁性粒子涂覆有一種或多種分子識別因素171 (例如抗 體)，該元素是待俘獲的目標細胞163或者其他物質的特有標志。因此，一種或多種磁性粒 子167，連同結合的細胞或者其他目標物質163 —起，作為組合單元流入該俘獲模塊中。對 于具有許多曝露的結合部分的大的目標物質而言(例如哺乳動物細胞)，它通常具有多個 所附著的磁性粒子。在某些實施方案中，俘獲區域是相當薄的，但是可以相當寬來提供相對高的通過 量。換句話說，通道本身的橫截面面積是相對大的，同時該通道的高度或者深度是相對小 的。通道的厚度可以由有效到達的磁場來定義，該磁場被用來吸引流過俘獲區域的流體介 質中的磁性粒子。適用于本發明的流體系統不同的細節在US專利申請No. 11/583989 (2006年10月 18日申請)中的流動模塊的說明書的其他上下文中進行了討論，其在此引入作為用于全部 目的之參考。這樣的細節的例子包括緩沖劑組合物，磁性粒子特征，外部磁體特征，用于MFG 的鐵磁性材料，流動條件，樣品類型，與其他模塊的整合，用于流體和磁性元件的控制系統， 在目標物質和磁性粒子之間的結合機構，等等。通常，在磁性俘獲模塊中，所施加的外部磁 場將遠高于US專利申請No. 11/583989中所述類型的連續流動磁性流動揀選機中所使用的 磁場(考慮模塊的整體設計)。無論如何，施加到目標物質上的磁力應當足夠的大于流體動 力阻力，來確保俘獲目標物質(偶合到磁性粒子上)，并且抵抗著流動的流體來保持到適當 位置上。在圖2所示的一種典型的正向選擇例子中，磁性俘獲方法200如下來進行。首先， 在操作201中，用小的磁性粒子來標示樣品例如潛在的含有目標細胞的生物學樣本，該小 的磁性粒子涂覆有俘獲部分(例如抗體)，其對于目標細胞的表面標志來說是特有的。這 個標示過程可以微流體揀選裝置之上或者之外進行。在該標示之后，在操作203中，將樣品 流入揀選站(包含俘獲區域)中，具有或者不具有共同流動的緩沖劑溶液。緩沖劑可以通 過一個或多個入口傳遞，樣品通過一個或多個另外的入口傳遞。揀選站是在操作207中用 外部磁場提供能量，來在操作209中將磁性標示的目標細胞或者其他物質保持在適當位置 上，抵抗流動的流體所施加的流體動力阻力。與此同時，在操作211中連續的洗提未標示的 非目標物質。如上所述，磁場典型的是通過緊鄰揀選站布置的外部磁體來施加的。在大部 分或者全部的樣品溶液流出揀選站之后，可以在操作213中，通過許多不同機構中的任意 一個來釋放磁性成分，該機構包括涉及改變磁場梯度和/或提高液體動力的這些。例如，在 所述室中的磁場可以減少，除去，或者重新定向，并且同時將樣品入口流體用釋放劑(用于 釋放所俘獲的物質)和/或緩沖劑流體代替。最后在前面所固定的磁性成分，或者僅僅它們所俘獲的物質(現在被凈化)，流出了緩沖劑溶液室。該含有目標物質的凈化的樣品成分 然后可以在操作215中，在揀選室出口處進行收集，其在某些構造中可以直接位于俘獲室 的下游。
當使用大的目標物質例如哺乳動物細胞時(其對于液體動力有強的響應，對于磁 力的響應相對較弱，這可能僅僅因為只有一個或者少數的結合到細胞上的磁性粒子受磁場 梯度發生結構的影響)，俘獲和釋放方案是特別有利的。當使用相對小的目標物質例如病 毒(其具有這樣的傾向，即，變成攜帶到微流體裝置中的流動場的分界層中)，該俘獲和釋 放方案也會是有益的。使用俘獲類型的揀選模塊具有不同的特征和優勢。它們如下。1.目標物質能夠很大程度的進行濃縮，因為僅僅使用了小的洗提體積來釋放所俘 獲的目標物質。隨著時間的變化，萃取了來自低濃度樣品的目標物質，并且保持固定，直到 整個樣品處理完成。然后將所俘獲的物質在相對小體積的載體介質中釋放，由此產生高純 度、高濃度的溶液或者懸浮液。2.揀選機的物理尺寸可以相對大，因為它能夠使用相對大的磁場，影響在揀選模 塊中的相對遠距離上的磁性粒子。作為舉例，流動通道高度可以是20微米或者更高。這允 許相對高的通過量(例如，至少大約10ml/h，或者50ml/h或者100ml/h，或者lL/h)。3.能夠產生所俘獲物質的單層(或者亞單層)。可選擇的，能夠產生僅僅由幾個 亞層組成的層(例如，雙層或者三層)。在每種情況中，能夠避免大的“團塊”，該團塊會壓 縮流路或者干擾俘獲。這是可能的，因為能夠如下所述來動態的控制外部場。可選擇的，或 者另外，MRi可以用來限制將非常強的磁力在僅僅非常小的距離上施加到磁性粒子上。將俘 獲物質限制成單層具有不同的優點。這些優點之一在于在單層上提供了暢通無阻的流路。 因此在流過俘獲模塊的同時，非目標物質不太可能變成攜帶到目標物質的整個上。另一優 點在于這樣的能力，即，將單層的不同物質在所關注的充分定義的深度上進行成像的能力。4.能夠使用陣列的外部磁體(參見例如圖1D)。這允許在揀選模塊區域中對磁場 進行微調。在一些實施方案中，該陣列的磁體使用了交替的極性磁體，如圖ID所示，雖然這 并非必需的。在一些實施方案中，僅僅使用了兩個磁體(均位于MRi之下)。5.揀選模塊中的流動通道的尺寸和形狀可以沿著流路變化，來控制作用于磁性粒 子(和相關的目標物質)上的液體動力。以此方式，可以調節磁泳力和液體動力之間的平 衡，來產生高性能的分離。應當理解本發明的實施方案不限于生物或者甚至有機材料的分析，而是延伸到非 生物和無機材料。因此，上述的設備和方法能夠用于篩選，分析或者加工寬范圍的液體中的 生物和非生物物質。目標和/或非目標物質可以包含天然或者合成來源的小的或者大的化 學實體，例如化學化合物，超分子組合體，細胞器官，碎片，玻璃，陶瓷等等。在某些實施方案 中，它們是單體，低聚物和/或具有任何支化度的聚合物。它們可以表達為細胞或者病毒， 或者它們可以是獨立的實體。它們還可以是完整的細胞或者病毒本身。外部磁體(或者磁體系統)可以在俘獲磁性粒子過程中是位置不定的，并且如所 解釋的那樣，其可以是永磁體或者電磁體，或者是這些永磁體和電磁體或者它們的組合中 的多個或者任何一個。用于本發明分離中的磁性俘獲粒子可以采用許多不同的形式。在某些實施方案中，它們是超順磁性粒子或者納米粒子，雖然在某些情況中它們可以是鐵磁性或者順磁性。 作為一個總的觀點，磁性粒子應當選擇為具有這樣的尺寸，質量和磁化系數，即，當曝露于 微流體裝置中的磁場時(平衡的液體動力和磁性效應)，使得它們容易的從流體流動方向 上轉移。在某些實施方案中，當除去磁場時，該粒子不保持磁力。在一種典型的例子中，磁 性粒子包含氧化鐵(Fe2O3和/或Fe3O4)，并且其直徑范圍是大約IOnm-大約100微米。但 是，在其中甚至使用更大的磁性粒子的實施方案也是可以預期的。該磁性粒子可以涂覆有這樣的材料，該材料賦予它們與流體環境的相容性以及允 許偶合到具體的目標成分上。涂料的例子包括聚合物殼，玻璃，陶瓷，凝膠等等。在某些實 施方案中，該涂料本身涂覆有促進其與目標物偶合或者物理結合的材料。例如，在微磁性粒 子上的聚合物涂料可以涂覆有抗體，核酸序列，抗生物素蛋白或者維生素H。一類磁性粒子是納米粒子例如獲自德國Miltenyi Biotec Corporationof Bergisch Gladbach的這些。這些粒子是相對小的粒子，由涂覆的單域氧化鐵粒子制成，典 型的處于大約IO-IOOnm直徑的范圍。它們偶合到特定的抗體，核酸，蛋白質等等上。另一 類型的磁性粒子是由植入到聚合物基質例如聚苯乙烯中的磁性納米粒子制成。這些粒子典 型的是光滑的，和通常是直徑為大約1-5微米的球形的。合適的珠子獲自加拿大Carlsbad 的Invitrogen Corporation.這些珠子還偶合到特定的抗體，核酸，蛋白質等等上。產生粒子在俘獲區域中的均勻分布不同的技術和裝置設計可以用來促進所俘獲的磁性粒子在俘獲區域表面上的均 勻分布。在一些情況中，俘獲的粒子的層有效的是在俘獲區域上的磁性粒子單層，雖然亞單 層以及雙層等等也可以產生(這取決于俘獲區域的面積和待加工的樣品的量)。一種方案包括仔細的設計磁場梯度成形元件在俘獲區域中的排列。在某些實施方 案中，間隔形成磁場梯度發生結構的鐵磁性圖案是在下游的方向上減少的。換句話說，柵格 的設計可以作為位置的函數來變化。這種方案促進了磁性粒子軌道(在其中粒子進入俘獲 模塊)初始時朝著基底向下，然后在磁場梯度發生結構上俘獲到單層中。在僅僅短的距離 上的非常強的磁力是在該結構上產生來俘獲粒子的。可以將進入強磁力覆蓋其上的流動流 體的距離控制到磁性粒子和標示的目標粒子的單層的長度上。在某些情況中，雙層等可以 通過所俘獲的磁性粒子的自磁化來產生，其然后充當了用于隨后流過俘獲模塊的磁性粒子 的俘獲結構。另外一種方案涉及在磁性粒子流動的過程中，動態的改變施加到俘獲區域上的外 部磁場。這可以包括例如，在俘獲操作過程中，逐漸的將磁場插入到俘獲區域中。這些和其他方案具有這樣的優點，即，降低或者防止磁性粒子在俘獲區域的前緣 或者其他地方的積聚。通常，觀察到積聚發生在磁場最強之處，典型的是發生在用于施加外 部磁場的永磁體的邊緣。顯而易見的，這樣的積聚會導致俘獲區域利用率的降低(俘獲區 域磁場強度不大的一部分不能俘獲許多的或者任何的磁性粒子)。此外，磁性粒子的團塊或 者積聚實際上會堵塞另外的磁性粒子進入俘獲區域下游的通道。它還會從樣品中俘獲未結合的物質，由此降低了樣品中所俘獲的成分的純度。通過使用仔細設計的MFG結構和規劃和/或動態變化的磁場，能夠在俘獲區域中 產生相對均勻分散的俘獲磁性粒子層。用于完成同樣或者類似結果的其他技術包括沿著俘 獲區域(軸向)并排排列的交替極性的多個薄永磁體或者以棋盤圖案排列的交替極性(軸向和橫向二者)的多個薄永磁體。磁性粒子在俘獲區域中相對均勻的分布在后分離操作例如珠釋放過程中會是有 用的。釋放劑將填充整個通道，并且均勻分布的磁性結合的目標粒子將允許釋放劑更廣泛 的接近于該磁性珠結合的目標粒子。根據本發明的一些實施方案，最大磁場強度的位置在粒子流入通道的時間過程中 在俘獲區域中是逐步移動的。在俘獲過程中磁場移動方向在一種實施方案中可以是從俘獲 區域中的下游位置移動到上游位置。換句話說，磁場移動方向與流體在俘獲區域中的流動 方向相反。這樣的實施方案可以包括例如在流動通道底部下面，特別是在俘獲區域的含通 道的區域，將永磁體在從下游位置向上游位置的方向上移動。因此，在磁性粒子開始進入俘 獲區域時，永磁體的前緣剛剛位于超出俘獲區域下游邊緣的位置。其后，當磁性粒子開始流 入俘獲區域時，永磁體的前緣逐漸移向上游，并最終停止于或者接近于俘獲區域的上游邊 界。在某些實施方案中，它在與磁性粒子停止流入俘獲區域的大約同時到達它的位置。在一種可選擇的實施方案中，外部磁體在磁性粒子俘獲過程中從俘獲區域的上游 移向下游位置。換句話說，該外部磁體在與流體流動相同的方向上移動。在這種實施方案 中，如同前述的實施方案那樣，外部磁體的移動時間應當對應于，至少大致對應于，磁性粒 子流過俘獲區域的時間。如同下面參考圖3所解釋的那樣，一種具體的實施方案使用了下 游移動的磁體來依次俘獲和釋放，然后再俘獲和釋放……同樣的粒子，目的是從磁性粒子 中除去非特定結合的樣品物質。如所示的，在俘獲區域中對磁場重新布置的控制可以通過不同的機構來完成。在 第一種實施方案中，這是通過在磁性粒子通過俘獲區域的過程中，將磁場發生器(例如永 磁體)在俘獲區域的一個表面上(典型的在通道外面)移動來完成的。圖3表示了這種實 施方案的一個例子。如所示的，永磁體303在俘獲磁性粒子的過程中在俘獲區域301的下 面移動。在所示的實施方案中，磁體303在俘獲操作過程中從下游位置305朝著上游位置 307移動。它產生了磁場相互作用體積309，其有效的橫跨了俘獲區域流體體積的高度。因 此，在流過俘獲區域體積的流體中的全部磁性粒子經受了由移動的磁場發生器303所產生 的力。在另外一種實施方案中，該外部磁體是一種電磁體，其在磁性粒子流入俘獲區域 的過程中，沿著俘獲區域移動(與永磁體相同)。任選的，該電磁體所產生的磁場的位置可 以通過其他手段來控制，例如在俘獲期間機械移動的一些或者全部的電磁體繞線。在另外一種實施方案中，在俘獲過程中磁場的動態重新布置是通過依次插入一系 列外部磁體來完成的，每個磁體具有比俘獲區域的尺寸小的尺寸。在一種實施方案中，該磁 體是永磁體。在一種具體的實施方案中，這些永磁體是交替極性排列的(例如，第一磁體它 的南極朝著俘獲區域定向，第二磁體它的北極朝著俘獲區域定向，第三磁體它的南極朝著 俘獲區域定向，第四磁體它的北極朝著俘獲區域定向，等等)。圖ID表示了這樣排列的永磁 體的一個例子。用于依次施加外部磁場到俘獲區域中的設計和方法的其他細節描述在US臨時專 利申請No. 61/037994中，在前面已經引入作為參考。圖4A-4C表示了分級俘獲系統一個例子。如圖4A所示，磁 性標示的目標物質471 和非目標物質473首先在流體通道485的最左邊的俘獲區域475 (其包含“軟”磁性圖案(鐵磁性結構陣列)477)上流動，其俘獲了磁性標記的目標物質471以及非特定的俘獲了 幾個非目標物質473。該非特定俘獲可以是由例如目標物質的截獲這樣的因素引起的。外 部磁體479 (在一些實施方案中，其可以是組合的磁體)在這種初始俘獲操作中位于緊鄰俘 獲區域475之處。其后，外部磁體479向下游移動到圖4B中的第二俘獲階段481，使得從 最左邊的俘獲階段475所俘獲的物質得以釋放。該磁性標記的物質在第二階段481中重新 俘獲，并且在流體連續的流過該階段(其沿著單個通道排列)時，將更多的非目標物質從該 通道中沖出。在圖4C所示的第三俘獲階段483中，最后的非目標物質從該通道中沖出，僅 僅在圖案487上留下磁性標記的目標物質。現在可以除去外部磁體479，來洗提目標物質 (如果期望如此)。使用這種磁性俘獲、釋放和再俘獲的分級系統(與單個俘獲階段相反) 的一個優點是任何非特定結合的非目標物質例如細胞將在連續的俘獲階段之間被更有效 的從磁性俘獲物中除去，因此提高了洗提的目標細胞或者其他物質的純度。 除了分級俘獲系統之外，可以使用變化間距的鐵磁性圖案。在一種例子中，在俘獲 區域的上游側沒有提供磁場梯度發生結構。該結構僅僅朝著下游區域提供。結果，接近于 通道下表面之處的局部磁場梯度并沒有如它在結構存在之處的進一步下游之處那樣強。但 是，在不具有磁場梯度發生結構的上游區域中，磁場可以在垂直方向上進一步滲透到流動 通道中。這將進入的磁性粒子朝著俘獲區域的下部拖拉，在這里它們會受到(在它們進一 步向下游流動時)由磁場梯度發生結構所產生的非常強的磁場梯度的影響。在僅僅短的距 離上的非常強的磁力是在該結構上產生來俘獲粒子的。可以將進入強磁力覆蓋其上的流動 流體的距離控制到磁性粒子和標示的目標粒子的一個單層的長度上。在某些情況中，雙層 等可以通過所俘獲的磁性粒子的自磁化來產生，其然后充當了用于隨后流過俘獲模塊的磁 性粒子的俘獲結構。加工所俘獲的物質在一些實施方案中，所俘獲的物質將從它們相關的磁性粒子上釋放，同時被限制 到俘獲區域中。如所述的，不同的機構可以用于此目的。一種方案包括將珠釋放劑施加到 所俘獲的磁性粒子上。這樣的試劑可以通過分離所述珠與所俘獲的物質之間的連接或者通 過與連接物質的競爭性結合來起作用。當然，對本領域技術人員來說，使用其他分離或者釋 放劑也是可以理解的。在某些實施方案中，可以分別提供用于樣品和珠釋放試劑的流體輸入。在分離加 工過程中，將樣品從樣品孔泵送到俘獲區域中。一旦分離加工完成，則將珠釋放試劑從釋放 試劑孔泵送到俘獲區域。為了洗提該釋放細胞，緩沖劑可以從輸入孔，或者從分開的緩沖劑 入口來泵送入。在所有的情況中，泵送動作可以使用例如氣體(例如空氣)或者液體(例 如緩沖的水)來進行。所俘獲的目標物質可以如所述的那樣進行簡單的濃縮、凈化和/或釋放。可選擇 的，它們可以進一步分析和/或處理。這種進一步的分析和/或處理可以在俘獲模塊中進 行或者在從俘獲模塊釋放之后，在隨后的模塊中進行。圖5表示了布置在流體裝置505中， 用于所俘獲的物質的后俘獲處理的磁性俘獲器501結構的一個例子。如所示的，俘獲器501 包括用于接收原料樣品流的入口管線507，和出口管線509。俘獲器501還包括輔助管線 511和513，用于提供一種或多種其他的試劑。每個管線507，509，511和513分別包括它本 身的閥門517，519，521和523。在俘獲器501中是不同的俘獲元件525。這些元件可以是鐵磁性元件，其成形或者傳遞磁場等等。雖然圖5所示的管線和閥門從四面包圍著俘獲元件，但是本發明不限于此。例如，其他構造包括圖IC的構造，在這里在流過俘獲區域之前， 將輸入物進行匯聚。參考圖5，在將磁場或者其他俘獲性激勵施加到俘獲特征525的同時，俘獲了流入 俘獲器501的粒子。在俘獲了足夠數目的粒子之后(其可以通過簡單的將樣品流運行通過 裝置505 —個規定的時間來指示)，關閉閥門517和519。其后，在一種實施方案中，打開閥 門521和523，使得緩沖劑從管線511輸送通過俘獲器501，并從管線513送出。該緩沖劑 用于清洗所俘獲的粒子。在清洗了足夠長的時間之后，清洗過的粒子可以如下來回收通過 洗提(通過例如除去外部磁場或者電場，同時連續流動緩沖劑)，通過從俘獲器501中用吸 液器吸取，通過除去俘獲器或者整個裝置的蓋子或者封蓋，等等。關于最后的選項，要注意 的是在一些實施方案中，裝置是一次性的，并且可以設計成這樣，即，上部或者蓋子容易通 過例如剝離來除去。在另外一種實施方案中，將已經如上所述在俘獲器中進行俘獲和清洗的粒子曝露 于一種或多種標志(例如標示的抗體)，該標志用于目標細胞或者樣品中的其他目標物質。 探測某些瘤細胞，例如，表達為兩種或者多種特定表面抗原的瘤細胞。這種組合的抗原僅 僅出現在非常獨特的瘤中。為了探測這樣的結合到磁性粒子的細胞的存在，在俘獲器501 中的俘獲完成之后，可以關閉閥門517和523，打開閥門521。然后將第一標示物經由管線 511流入俘獲器501中，并且經由管線509流出。一些標示物可以結合到俘獲器501中的固 定細胞上。其后，關閉閥門521，打開閥門523，將第二標示物經由管線513進入俘獲器501 中。在標示物流過俘獲器足夠的時間長度之后，可以如上所述來清洗所俘獲的粒子/細胞。 其后，該粒子/細胞可以從俘獲器501中除去，用于進一步的分析或者它們可以原位進行分 析。例如，俘獲器501的內容物可以在用于第一和第二標示物(如果例如是這樣的標示物或 者熒光團)的激勵處用探針束進行掃描。發射的光然后在第一和第二標示物的特征頻率進 行探測。在某些實施方案中，對單個細胞或者粒子進行成像，來表征俘獲器501的內容物， 由此確定目標瘤細胞的存在(或者量)。當然，可以探測不同于瘤細胞的不同的目標成分。 例子包括病原體例如某些細菌或者病毒。在另外一種實施方案中，來自樣品的核酸經由管線507進入俘獲器501，并且通過 適當的機構(下面給出例子)來俘獲。隨后，關閉閥門517，PCR試劑(核苷，聚合酶，和在 適當的緩沖劑中的引物(primer))經由管線511和513進入俘獲器501。其后，關閉全部的 閥門(517，519，521和523)，并且在俘獲器501上進行適當的PCR熱循環程序。該熱循環持 續到達到適當程度的擴增為止。隨后可以在原位進行擴增的目標核酸的探測，例如基因分 型。可選擇的，探測可以在俘獲器501下游，在例如分離室中進行，該分離室可以包含核酸 微陣列或者電泳介質。在另外一種實施方案中，通過引入例如用于目標序列的適當的標示 的插入探針或者給體猝滅劑探針，可以在俘獲器501中進行實時的PCR。該探針可以與其他 PCR試劑(例如引物，聚合酶和核苷)經由管線511或者513—起引入。原位實時PCR對于 這樣的分析是合適的，在該分析中分析表達程度。在實時PCR或者終點PCR的每一個中，擴 增序列的探測在一些實施方案中可以在俘獲器501中，通過使用適當的探測設備例如聚焦 于俘獲區域的熒光顯微鏡來進行。對于擴增反應而言，俘獲元件525俘獲和將核酸樣品限制到反應室501中。其后，關閉通過管線507的流動，并且將溶解劑(例如鹽或者清潔劑)經由例如管線511或者513 傳遞到室501。該溶解劑可以在一個柱塞的溶液中傳遞，并且允許其擴散到整個室101中， 在這里它及時的溶解固定的細胞。這能夠萃取細胞基因材料，用于隨后的擴增。在某些實 施方案中，該溶解劑可以與PCR試劑一起傳遞，來在足夠的時間之后，使該溶解劑溶解細胞 和除去核酸，可以開始熱循環程序，并且探測目標核酸。在其他實施方案中，將樣品核酸提供到原料樣品中，并且偶合到含有適當的雜交 序列的磁性粒子上。該磁性粒子然后進行揀選，并且固定到俘獲器501中。在PCR試劑傳 遞到室501，并且關閉全部的閥門之后，PCR可以經由熱循環來進行。在初始的溫度行程中， 所俘獲的樣品核酸從磁性粒子上釋放。此處所述的核酸擴增技術是聚合酶鏈反應(PCR)。但是，在某些實施方案中，可以 使用非PCR擴增技術，例如不同的等溫核酸擴增技術；例如，實時鏈替代擴增(SDA)，滾環擴 增(RCA)和多替代擴增(MDA)。這些技術的每個可以在俘獲器例如圖5所示的室501中進 行。示例性磁性俘獲結構最基本的，俘獲站是通過流體裝置中的區域或者通道的邊界來界定的。流體流過 該俘獲站，并且遭遇到由緊鄰該俘獲站的一種或多種外部磁體所產生的磁場。另外，俘獲站 可以任選的使用磁場梯度發生結構(MFG)。MRi元件(例如條，釘栓，點，柵格，無規排列等 等)成形了外部磁場，來在俘獲站中產生局部高的磁場梯度。圖6表示了不同類型的鐵磁性MFG結構的例子，其能夠與本發明的磁性俘獲站一 起使用。8個不同的鐵磁性元件圖案表示在該圖中。這些圖案用于成形源自外部源磁場(未 示出)的磁場梯度。如所示的，該鐵磁性結構是以有組織的或者無規的圖案來提供的，例如 平行線，正交柵格，和規則或者不規則幾何形狀的長方陣列。該結構可以是所示的規則的或 者網狀的。通常，這些圖案中的特征或者元件可以由不同的材料制成，該材料具有明顯不同 于所述裝置中的流體介質(例如緩沖劑)的滲透性。如所示的，該元件可以由鐵磁性材料 制成。在具體的實施方案中，該圖案是由在玻璃或者聚合物基底上的鎳特征來定義的。在可選擇的實施方案中，MRi結構是與其他類型的俘獲結構例如電極，特定結合部 分(例如核苷探針區域或者抗體)，物理突出物或者缺口等等相結合的。圖7代表了非磁 性俘獲特征的一個例子，其是在軟磁性(例如鎳)圖案701中制作的。該圖案可以正性或 者負性表面特征，來促進在鎳結構上的流體的層狀混合，產生增強的磁性俘獲。圖7表示了 具有非磁性俘獲特征的磁場梯度發生結構701。正性特征包括圓形突起703和正方形突起 705。負性特征包括下凹707和正方形孔709。每個這些特征可以將它的幾何形狀效應用于 流動混合或者用有助于反應或者流動的物質進行涂覆。其他類型的MFG結構包含鐵磁性材料，該材料部形成孔結構形狀或者規則的特 征。代替的，該結構形成了無規的位置特征例如無規的分散粉末，填充物，細粒等等。這些 結構是結合到俘獲站粘接劑，壓力結合等的一個或多個壁上。圖8A-8C表示了無規陣列的 鐵磁性結構的例子，從左到右為5% (圖8A)，10% (圖8B)和30% (圖8C)的在環氧樹脂 中的鎳粉。已經發現這樣的結構是磁性俘獲站中有效的MFG元件。在一種可選擇的實施方案中，俘獲站不包 含MFG結構。代替的，磁性俘獲僅僅基于外部磁場的強度，而沒有場成形元件例如MFG結構的幫助。流體和揀選室設計
雖然本發明的一些實施方案是在微觀尺寸的微流體系統中進行的，但是應當理解 本發明的方法，設備和系統不限于微流體系統。典型的，更大的俘獲室尺寸范圍是長度為大 約1-100毫米(在流動方向上)，寬度是大約1-100毫米和深度是大約1微米-10毫米(雖 然典型的是大約1毫米或者更低)。深度和寬度一起界定了流體流過的橫截面。深度代表 了在磁場滲透入通道方向上的尺寸，典型的是在遠離外部磁體的位置點的方向上。在某些 實施方案中，所述的室的長寬比(長度比寬度)大于1，例如是大約2-8。通常，所施加的磁場應當足夠大，來捕集或者俘獲在流體介質中流動的磁性粒子。 本領域技術人員將認可所施加的磁力必須明顯大于由流動流體施加到粒子上的液體動力。 這會限制俘獲站的深度尺寸。在某些實施方案中，整合的流體系統是微流體系統。微流體系統可以用具有至少 一個“微”通道的裝置來表征。這樣的通道可以具有在毫米或者更低量級(例如小于或者 等于大約1毫米)的至少一個橫截面尺寸。對于某些應用而言顯而易見的是這種尺寸是可 以調整的；在一些實施方案中至少一個橫截面尺寸是大約500微米或者更低。在一些實施 方案中，作為應用所允許的，橫截面尺寸是大約100微米或者更低(或者甚至是大約10微 米或者更低，有時候甚至是大約1微米或者更低)。橫截面尺寸是通常垂直于中心線流動 方向的尺寸，雖然應當理解當遇到通過急轉彎或者其他傾向于改變流動方向的特征的流動 時，在使用中該橫截面尺寸不必嚴格的垂直于流動方向。通常微通道將具有兩個或者多個 橫截面尺寸，例如矩形橫截面的高度和寬度或者橢圓形橫截面的長軸和短軸。每一個這些 尺寸可以類比于此處所示的尺寸。要注意的是本發明所用的微通道可以具有兩個尺寸，其 是粗的不成比例的，例如，矩形橫截面具有大約100-200微米的高度和同樣量級或者厘米 或者更高的量級的寬度。當然，某些裝置可以使用這樣的通道，在其中兩個或者多個軸在尺 寸上是非常類似的或者甚至相同的(例如，具有正方形或者圓形橫截面的通道)。在一些實施方案中，流體通道可以具有比俘獲區域更大的深度，來減慢粒子的速 度，用于提高磁性沉降和俘獲。圖9A和9B表示了示例性流體通道901的側視圖，該通道包 括與該通道的入口和/或出口部分相比更大深度的俘獲區域(903和905)。在一種例子中 (圖9A)，該通道深度在俘獲區域903中增加(沿著從入口向俘獲區域的流動方向)，其后降 低。在另外一種例子中(圖9B)，該通道深度在俘獲區域905之后(下游)降低。典型的， 俘獲區域深度與入口或者出口通道深度的比例范圍是大約1_5(典型的大約2)。在俘獲區 域與入口或者出口通道之間的過渡區域的形狀具有光滑的曲線通道，來防止在角落處的回 流或者物理俘獲。在某些實施方案中，該流體通道可以具有相同的深度，但是在接近入口通 道處具有更大的寬度以及在接近于出口通道處具有更窄的寬度。在圖9C所示的某些實施方案中，揀選裝置可以包含兩個或者多個平行的通道 919，帶有共用緩沖劑歧管911，用于多個共同的樣品分離和/或提高通過量。在兩個通道 919中，來自樣品入口 913的流體與來自歧管911的緩沖劑相合并，并且流過俘獲區域中的 磁場梯度發生結構915，流向出口 917。在仍然的其他實施方案中，流體通道可以包括大于一個的俘獲區域，來進行俘獲 和釋放方案。圖9D表示了揀選室，其配置來進行圖4A-4C中所述的俘獲和釋放方案。如圖9D所示，兩個或者多個俘獲區域915可以包括在流體通道中。每個這些俘獲區域可以具有 相應的外部磁性源，其允許將磁場獨立的施加到每個區域。該俘獲區域可以共享一個外部 磁性源。在其中使用兩個外部磁性源的實施方案中，這些源可以獨立的或者一起配置來提 供隨時間變化的磁場。一種改變磁場的方式是將該外部源相對于流體通道進行移動。該外 部磁性源可以在平行于或者垂直于流體流動的方向上移動，來產生所期望的磁場變化。通常使用控制器來調整在整個微流體系統中所用的不同的系統或者亞系統的運 行。這樣的控制器將設計或者配置來引導樣品通過微流體流動通路。它還可以控制系統的 其他特征和動作，例如施加到流過微流體裝置的流體上的磁場強度和定向，通過啟動閥門 和其他流動控制機構來控制微流體裝置中的流體流動條件，在附加系統中混合磁性粒子和 樣品成分，產生樣品(例如，庫產生系統中的庫)，和將流體從一個系統或者裝置導入另外 一種中。該控制器可以包括一個或多個處理器，并且在軟件和/或硬件指令的控制下運行。整合 能夠與流體裝置中的磁性俘獲揀選機整合的運行模塊的例子包括(a)另外的富 集模塊例如熒光活化的細胞揀選機和清洗模塊，(b)反應模塊例如樣品擴增(例如PCR)模 塊，限制酶反應模塊，核酸序列化模塊，目標標示模塊，染色質免疫沉淀模塊，交聯模塊，和 甚至細胞培養模塊，(c)探測模塊例如微陣列的核酸，抗體或者其他非常特定的結合劑，和 熒光分子識別模塊，和(d)溶解模塊，用于溶解細胞，破壞病毒蛋白質表層，或者釋放小型 生命系統中的成分。每個這些模塊可以在磁性揀選機之前或者之后提供。這里可以有多個 相同的或者不同的類型的運行模塊，其與磁性揀選機整合到單個的流體系統中。此外，一個 或多個磁性揀選機可以相對于不同的其他運行模塊來平行的或者串聯的排列。這些運行模 塊中的一些可以設計或者配置作為俘獲模塊，在其中樣品中的目標物質保持固定或者通常 局限于具體的體積中。從上面的模塊的例子中應當很顯然的是，操作(該操作能夠在整合的流體裝置的 模塊中，在目標和/或非目標物質上進行)包括揀選，偶合到磁性粒子上(有時候在此稱作 “標示”)，結合，清洗，俘獲，擴增，除去不想要的物質，沉淀，分離，稀釋，結扎，序列化，合成， 標示(例如著色細胞)，交聯，培養，探測，成像，量化，溶解等等。生物化學操作(其能夠在整合的流體裝置的磁性揀選模塊中進行)具體的例子包 括質粒，適配子，蛋白質和肽的合成和/或篩選；評價酶活性；和衍生蛋白質和糖類。還可 以進行寬光譜的生物化學和電生理學化驗，包括(1)基因分析(猝滅，雜交)，用于DNAdn RNA低聚物的PCR和/或其他探測和擴增方案；(2)基因表達；(3)酶活性化驗；(4)受體結 合化驗；和(5)ELISA化驗。前述的化驗可以在多種形式中進行，例如均勻的、珠基的和表 面結合的形式。此外，此處所述的裝置可以用來使用指定的酶或者催化劑進行生物分子的 連續生產，以及生產和傳遞生物分子或者在生物系統中活性的分子例如治療劑。此處所述 的微流體裝置還可以用來進行肽，蛋白質和DNA和RNA低聚物的組合合成，如同目前在微流 體體積中所進行的那樣。在流體系統中的反應器和溶解模塊的例子本發明整合的微流體裝置可以使用具有不同特征的不同的反應器。準確的特征取 決于反應的類型，并且可以包括熱管理系統，微混合器，催化劑結構和傳感系統。熱管理系 統可以包括加熱器，溫度傳感器，和微型熱交換器。全部的這些部件可以整合來精確的控制溫度。這樣的溫度控制對于用于DNA擴增的PCR來說是至關重要的。微混合器可以用于混合兩種溶液。一種示例性的微混合器包括加壓一種流體穿過 在分離性材料中的孔或者狹縫，來引起兩種流體之間的擴散。該分離性材料是疏水性的，并 且分開了兩個相鄰的腔室。界面的疏水性允許兩個室用流體填充，而不混合。然后可以施 加壓力梯度來驅使流體穿過疏水性層中的孔，來引起擴散，這使得反應成為可能。催化劑結構被用來加速化學反應(例如交聯或者序列化)。在微反應器中，催化劑 可以是固定的，例如固定的珠子，絲線，薄膜或者多孔表面，或者是加入的。薄膜和多孔表面 催化劑可以容易的整合到微反應器的制作中。傳感系統可以使用例如化學微傳感器或者生 物傳感器。光學傳感還可以穿過玻璃或者塑料表面在外部進行。生物細胞的內容物經常進行處理和分析。在細胞內容物進行分析之前，溶解該細 胞，以使得細胞的成分能夠分離。細胞破壞方法(其用來釋放細胞和病毒中的生物分子) 包括例如電場，酶，超聲波降解，和使用清潔劑。機械力也可以用來剪切和破壞細胞壁。細胞溶解可以通過使得在反應室中俘獲的細胞經受高電場強度脈沖(典型的處 于大約lkV/cm-lOkV/cm的范圍)來進行。使用酶方法來除去細胞壁是廣泛接受的，其用于 制備用于破壞的細胞，或者用于制備原生質體(不具有細胞壁的細胞)，該原生質體用于其 他用途例如引入克隆的DNA或者亞細胞器分離。酶通常是市售的，并且在大部分情況中，其 來源于生物源(例如用于酵母的蝸牛內臟或者來自母雞雞蛋蛋白的溶解酵素)的分離。通 常使用的酶包括溶解酵素，溶葡球菌酶，消解酶，纖維素酶，變溶菌素，聚糖酶，蛋白酶，甘露 聚糖酶等等。除了酶穩定性潛在的問題之外，細胞對于酶的易感性會取決于細胞的狀態。例如， 生長到最大密度的酵母細胞(固定相)具有難以除去的細胞壁，而中等(midlog)生長相細 胞非常易于受到細胞壁酶除去的影響。如果使用酶，它在進一步分析之前必須進行揀選，并 從期望的材料中除去。超聲波降解使用高頻波，其機械破壞細胞壁。將典型的在20-50kHz的超聲波經由 金屬探針施加到樣品上，該探針是高頻振蕩的。將該探針放入含有細胞的樣品中，該高頻振 蕩引起局部的高壓區域，導致空穴和壓實現象，最后破開細胞。細胞破壞能夠在更小的樣品 (包括在200 μ L的微板孔中的多個樣品)中獲得，并且具有提高的控制超聲波降解參數的 能力。用于細胞破壞的機械方法使用玻璃或者陶瓷珠和高度攪拌來剪切和破壞細胞壁。 這種方法用于易于破壞的細胞，其是廉價的，但是對于微流體裝置來說具有整合的問題。在 一種實施方案中，將珠子用于帶有樣品的密封室中，并且用電力發動機進行攪拌。在其他實 施方案中，將高壓施加到含有細胞樣品的流體上，同時驅使該流體流過非常窄的通道。在這 樣的條件下，在細胞和通道壁之間的剪切將破壞細胞。清潔劑基細胞溶解是替代物理破壞細胞膜的一種選項，雖然它有時候是與均化和 機械研磨一起使用的。清潔劑通過破壞脂質脂質，脂質蛋白質和蛋白質蛋白質之間的 相互作用而破壞了包圍細胞的脂質屏障。用于細胞溶解的理想的清潔劑取決于細胞的類型 和來源以及取決于在細胞溶解之后的下游的應用。由于細胞壁的存在或者不存在，對于 最 佳的溶解來說，動物細胞，細菌和酵母全部都具有不同的要求。因為動物組織的致密和復雜 性質，它們需要清潔劑和機械溶解二者來有效的溶解細胞。
通常，非離子和兩性離子清潔劑是溫和的，在細胞溶解時產生了比離子性清潔劑更少的蛋白質變性，并且在保持蛋白質功能或者相互作用是關鍵的時，將非離子和兩性離 子清潔劑用于破壞細胞。CHAPS(—種兩性離子清潔劑)和Triton X系列的非離子清潔劑 通常用于這些目的。相反，離子性清潔劑是強的增溶劑，并且傾向于使蛋白質變性，由此破 壞了蛋白質活性和功能。SDS，和離子性清潔劑(其結合到蛋白質上，并且使其變性)被廣 泛的用于通過凝膠電泳和免疫印跡(Western blotting)來研究評價蛋白質程度。在整合的流動系統中的探測器的例子在觀察整合的微系統的不同應用中，必須要類似于傳統的試驗室測量方法來量化 存在于通道的一個或多個位置上的材料。典型的用于量化的技術包括但不限于光學吸收， 折射率變化，熒光發射，化學發光，不同形式的拉曼光譜，電導測量，阻抗測量(例如阻抗血 細胞計數)，電化學安培測量，和計算機輔助光學成像和計數。吸光率是在光穿過待量化的材料時，通過測量光強度來確定的。如果光學性質是 已知的，則穿過材料的衰減程度表示了材料的量。可選擇的方案包括光聲技術和光熱技術 和激光技術。微流體裝置可以包括光波導管和固態光源，例如LED和二極管激光器，來使得 該整合裝置的尺寸最小。與吸光率類似的是折射率。折射率探測器量化了樣品材料的折射率，其可以是與 樣品的量相關的；但是，這種技術沒有光學吸收靈敏。還可以利用激光基和熒光發射基執行 的折射率探測，并且其更靈敏。激光和熒光基方案可以與非常小的體積一起使用，并且適于 整合到微流體裝置中。用于超靈敏測量的激勵源可以是激光源，稀有氣體放電燈和發光二 極管(LED)。熒光發射可以通過光電倍增管，光敏二極管或者其他光學傳感器來探測。陣列探測器例如電荷耦合裝置(CCD)探測器可以用來成像被分析物的空間分布。 可以使用計算機程序來分析該圖像。如上所討論的，本發明的一個特征是形成單層目標粒 子的能力，這代表了均勻深度的聚焦。計算機程序能夠通過計數某些尺寸或者顏色的粒子 來分析所述圖像，并因此量化所述樣品。拉曼光譜依賴于非彈性散射，或者來自于與聲子或者系統中的其他激勵相互作用 (這導致了激光光子能量的上下偏移)的單色光拉曼散射。該能量偏移給出了關于系統中 的聲子模式的信息例如分子振動信息。具有增強的靈敏性的不同類型的拉曼光譜可用于顯 微鏡體積。電或者電化學探測方案可以容易的整合到微流體裝置上，并且會比其他方案更靈 敏。電或者電化學方案包括測量電離的被分析物中的導電率，測量在給定電壓時通過電極 的電流(其由在電極處還原或者氧化分子而產生)。所測量的電子數等于所存在的分子數。 電極還可以用來開始化學發光探測方法，在這里分子將它來自氧化還原過程的能量轉移給 被分析物分子，其發射了可探測出的光子。探測方法(其要求加入或者混合一種或多種試劑)可以容易的整合到微流體系 統上。衍生反應通常用于生物化學化驗中。例如，氨基酸，肽和蛋白質通常是用丹磺酰化 (dansylating)試劑或者鄰苯二甲醛進行標示的，來產生易于探測的熒光分子。可選擇的， 通過用作標示分子和試劑，包括基底，可以將酶加入來提供酶擴增的探測方案，即，酶產生 了可探測的產物。探測方法的第三個例子(其能夠受益于整合的混合方法)是化學發光探 測。在這些類型的探測情形中，將試劑和催化劑與適當的目標分子混合，來產生激勵態分子，其發射可探測的光子。這些探測和量化方法中的許多涉及樣品的某些改變。在一些情況中，發生了反應 例如氧化或者還原反應。在其他情況中，光通量具有降解樣品的可能。取決于待量化的樣 品的量和將樣品保存用于其他加工(例如發生反應或者甚至存檔)的必要性，可以選擇這 些方法中的單個或者其組合，來產生關于樣品的信息。結論 已經描述了本發明許多的實施方案。然而，應當理解可以進行不同的改變而不脫 離本發明的主旨和范圍。例如，上面的說明書集中于生物應用，并且特別是生物細胞探測和 俘獲，但是還應當注意的是同樣的原則可以應用于其他粒子，例如無機或者非生物有機材 料。因此，上述的設備和方法還可以用于液體中的非生物物質。因此，其他實施方案處于下 面的權利要求的范圍中。
權利要求
一種微流體揀選裝置，其用于將樣品揀選成基本為目標物質和基本為非目標物質，該裝置包含(a)俘獲模塊，該模塊包含具有兩個相對的壁的通道，在所述相對的壁的僅僅一個上的磁場梯度發生結構，該結構用于將磁力施加到樣品上來至少臨時地俘獲該樣品中的磁性粒子；和(b)與俘獲模塊一起整合到該微流體揀選裝置上的預加工和/或后加工站。
2.權利要求1的微流體揀選裝置，其中具有磁場梯度發生結構的相對壁處于不透明的壁上。
3.權利要求1的微流體揀選裝置，其進一步包含在俘獲模塊一側上的外部源來產生磁場。
4.權利要求3的微流體揀選裝置，其中該外部源位于俘獲模塊的與磁場梯度發生結構 相同的一側上。
5.權利要求3或者4的微流體揀選裝置，其進一步包含用于將磁場外部源相對于俘獲 模塊移動的機構。
6.權利要求3或者4的微流體揀選裝置，其中該磁場外部源包含一個或多個永磁體。
7.權利要求6的微流體揀選裝置，其中該永磁體是極性交替的。
8.權利要求3的微流體揀選裝置，其中該磁場外部源包含一個或多個電磁體。
9.權利要求1的微流體揀選裝置，其中該磁場梯度發生結構包含在它相對壁上的以圖 案布置的鐵磁性結構。
10.權利要求9的微流體揀選裝置，其中該圖案選自平行線、正交柵格、規則或者不規 則幾何形狀的長方陣列，及其組合。
11.權利要求1的微流體揀選裝置，其中該磁場梯度發生結構包含鐵磁性結構的無規 陣列。
12.權利要求9或者11的微流體揀選裝置，其中該鐵磁性結構材料是鎳、釩波明德合金 或者坡莫合金。
13.權利要求1的微流體揀選裝置，其中該通道在俘獲區域中具有更大的深度。
14.權利要求1的微流體揀選裝置，其中該俘獲模塊包含具有兩個或更多個俘獲區域 的分級俘獲系統。
15.權利要求1的微流體揀選裝置，其進一步包含第二平行的、獨立的俘獲模塊；和連 接俘獲模塊的共用緩沖劑歧管。
16.權利要求1的微流體揀選裝置，其中該預加工站包含標示站，其用于用磁性粒子來 標示樣品中的物質，該磁性粒子具有與所標示物質的親合性。
17.權利要求1的微流體揀選裝置，其中該后加工站包含探測站，用于探測目標物質。
18.權利要求1的微流體揀選裝置，其中至少一個預加工站或者后加工站包含(a)富集 模塊，用于提高通過揀選裝置的樣品中的目標物質的濃度，(b)反應模塊，(C)探測模塊，和 (d)溶解模塊，用于溶解細胞，破壞病毒蛋白質表層，或者釋放小型生命系統的成分。
19.權利要求1的微流體揀選裝置，其中該俘獲模塊被設計或者配置來進行選自下面 的操作⑴基因分析；(2)用于DNA或者RNA低聚物的探測和/或擴增方案；(3)基因表 達；(4)酶活性化驗；(5)受體結合化驗；和(6) ELISA化驗。
20.一種在微流體揀選裝置中揀選樣品的方法，該揀選裝置包括俘獲模塊和在該俘獲 模塊的兩個相對的壁中的僅僅一個上的磁場梯度發生結構，該方法包含將樣品流入俘獲模塊中，所述的樣品包含多個其上帶有分子識別因素的磁性粒子，目 標物質和非目標物質；在俘獲模塊中，通過將來自該模塊僅僅一側的外部磁場施加到磁場梯度發生結構上， 來產生磁場梯度；和在俘獲模塊緊鄰磁場梯度發生結構處俘獲磁性粒子，該磁場梯度發生結構位于俘獲模 塊的一個壁上。
21.權利要求20的揀選樣品的方法，其進一步包含將緩沖劑與樣品同時流入俘獲模 塊中。
22.權利要求21的揀選樣品的方法，其中該緩沖劑在每個操作過程中連續地流入到俘 獲模塊中。
23.權利要求20或者22的揀選樣品的方法，其進一步包含將磁場外部源相對于俘獲 模塊移動，同時將流體介質中的磁性粒子流過該模塊，由此以一種基本均勻的方式來俘獲 磁性粒子。
24.權利要求20或者22的揀選樣品的方法，其進一步包含從磁場梯度發生結構的一 個區域中釋放磁性粒子，來釋放任何的所俘獲的非磁性粒子；和在磁場梯度發生結構的另一個區域中俘獲磁性粒子。
25.權利要求20的揀選樣品的方法，其進一步包含用磁性粒子標示樣品中的目標物 質，該磁性粒子具有與目標物質的親合性。
26.權利要求20的揀選樣品的方法，其進一步包含用磁性粒子標示樣品中的非目標 物質，該磁性粒子具有與非目標物質的親合性。
27.權利要求20的揀選樣品的方法，其進一步包含在微陣列中探測目標物質。
28.權利要求20的揀選樣品的方法，其進一步包含溶解目標物質。
29.權利要求20的揀選樣品的方法，其進一步包含將目標物質進行反應，來擴增、排 序、雜交、標示、交聯或者培養該目標物質。
30.權利要求20的揀選樣品的方法，其進一步包含成像所俘獲的目標物質。
31.一種微流體揀選裝置，其用于將樣品揀選成基本為目標物質和基本為非目標物質， 該裝置包含(a)俘獲模塊，該模塊包含具有兩個相對的壁的通道，并且不具有磁場梯度發生結構；(b)與俘獲模塊一起整合到該微流體揀選裝置上的預加工和/或后加工站；(c)在俘獲模塊一側上的用于產生磁場的外部源；和(d)隨時間變化來改變磁場的機構。
全文摘要
一種用于揀選和俘獲磁性目標物質的系統，其包括微流體俘獲模塊，該模塊設計來接收磁性粒子，然后將該粒子臨時保持在模塊中的適當位置上。將流入該模塊的磁性粒子在其中俘獲，同時其他樣品成分(非磁性的)連續的流過并流出所述站，由此分離和濃縮俘獲在磁性粒子上的物質。在樣品通過俘獲模塊之后，可以釋放磁性粒子和/或它們的有效載荷，并且在出口處分別收集。
文檔編號B03C1/01GK101842161SQ200880112841
公開日2010年9月22日 申請日期2008年8月22日 優先權日2007年8月23日
發明者D·A·張-尹, H·T·索, J·達拉比, P·帕加諾, Y·張 申請人:辛溫尼奧生物系統公司