一種凝血因子Ⅷ親和層析樹脂的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種凝血因子Ⅷ親和層析樹脂的制備方法。首先稱取保存的瓊脂糖凝膠進行洗滌處理，然后采用環氧氯丙烷活化法進行活化凝膠，得到活化凝膠；將得到的活化凝膠與間隔臂分子N?羥基琥珀酰亞胺進行手臂連接反應，得到手臂連接的凝膠；將得到手臂連接的凝膠與肽配基進行配基偶聯反應；偶聯反應所得產物進行處理反應得到凝血因子Ⅷ親和層析樹脂；所得樹脂進行洗滌處理，最后于凝膠體積3倍的20％乙醇溶液中在4℃條件下存放。將本發明產品層析樹脂用于從血漿中提取凝血因子Ⅷ，能夠快速、特異、高效的純化凝血因子Ⅷ。
【專利說明】
一種凝血因子Vl親和層析樹脂的制備方法 一、
技術領域：
[0001] 本發明屬于生物制藥技術領域，具體涉及一種凝血因子珊親和層析樹脂的制備方 法。 二、
【背景技術】：
[0002] 凝血因子VI能夠十分有效地對甲型血友病患者進行替代治療。隨著各種層析工藝 的開發與應用，比活性可以達到lOIU/mg蛋白的中純凝血因子VI產品開始用于臨床治療。 1992年Baxter公司成功推出第一個基因重組的凝血因子VI產品。
[0003] 盡管基因重組類的凝血因子VI產品己經有了較好的臨床應用效果，但并不意味著 我們就要放棄血漿來源的凝血因子珊。一方面血漿來源的凝血因子Vi成本要低于重組類的 凝血因子珊，而且因為是從人血漿中提取的天然蛋白質，基本沒有臨床副反應的發生；另一 方面，血漿是一種寶貴的資源，除提取凝血因子VI外，還可以提取人免疫球蛋白、人血白蛋 白、人凝血酶原復合物、纖維蛋白原等產品。而且如果以低溫離心冷沉淀為起始原料提取凝 血因子Vi的話，基本對上述產品的提取沒有影響，既提高了血漿的綜合利用效率和使用價 值，又分攤了單個血液產品的成本。但是，目前從血漿中提取凝血因子Vi過程中，分離技術 不甚理想。1959年，美國醫生Pool首先觀察到在血漿冷沉淀中含有大部分FVIII促凝血活 性，并于1965年與Shannon等開發了從密閉無菌系統中自單份血楽;分離制備冷沉淀制劑的 方法。但是冷沉淀制劑比活不確定、純度較低、含有顆粒物和血型抗體、可導致過敏反應等。 20世紀70年代后開發了以冷沉淀為原料分離純化的制備方法，生產比活為0.2~lOIU/mg蛋 白的各種凍干FVIII制劑。到90年代，有兩種采用單克隆抗體親和層析制備的高純度FVIII 制劑面世，產品比活達700~3500IU/mg，幾乎不含其他雜蛋白，但容易造成單抗親和層析中 鼠類蛋白的污染。因此，本發明利用肽配基和靶蛋白之間類似抗原抗體結合反應的原理及 肽配基分子量小，即使脫落也容易在后續的純化中分離而不對產品造成污染的優勢，制備 瓊脂糖凝膠肽配基親和層析柱純化FVIII。
[0004] 瓊脂糖是瓊脂中不帶電荷的中性成分，瓊脂糖為白色或微黃色粉末，高親水性，含 有大量羥基，有特殊的膠凝性質，可制成多孔性凝膠，進而用于分離大分子物質，己廣泛應 用于醫藥食品、紡織化工等行業，由于其具有很好的生物相容性，又是優良的生物分離介 質。
[0005] 間隔臂又稱"手臂"，生物分子間的親和作用有立體特異性，配基結合位點通常位 于大分子內部或表面的裂隙深處，若配基直接固定于載體表面則會由于空間位阻導致結合 常數下降。不溶性載體親和純化的空間位阻大，通常需要引入一定長度的"手臂"分子，以保 證親和配基有合適的空間取向和伸展靈活性，常用的間隔臂分子一般為小于十個碳原子且 分子兩端具有活性基團的小分子有機物，如二氨基亞胺、氨基己酸、二氨基己烷、琥珀酸、乙 二胺等。
[0006] 載體偶聯配基后剩余的活性基團仍可通過基團共價結合或電荷離子交換引起不 可逆性吸附。因此，應對其進行掩蔽以降低載體的不可逆吸附，良好的封閉劑不僅能封閉載 體剩余活性基團和電荷，又不應產生新的活性基團、電荷，如巰基乙醇、氨基乙酸、乙醇胺、 巰基乙胺、半胱氨酸、醋酸酐等。為防止不可逆性吸附，應除去凝膠上的氨基及羧基基團，對 于氨基采用羧酸酐進行封閉；羧基掩蔽可采用乙醇胺進行封閉。 三、
【發明內容】
：
[0007] 本發明要解決的技術問題是:為了克服現有從血漿中提取凝血因子VI產品分離技 術中存在的缺陷，本發明提供一種凝血因子珊親和層析樹脂的制備方法。將本發明產品層 析樹脂用于從血漿中提取凝血因子珊，能夠快速、特異、高效的純化凝血因子珊。
[0008] 為了解決上述問題，本發明采取的技術方案為：
[0009] 本發明提供一種凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，所述制備方法包括以下步 驟：
[0010] a、首先稱取保存于冰箱中20 %乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊 脂糖凝膠CL-6B，采用過量蒸餾水進行反復洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂 糖凝膠；
[0011] b、環氧氯丙烷活化法活化凝膠：
[0012] 稱取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.1~0.5M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入 的體積量是濕瓊脂糖凝膠重量的3~5倍;然后在25~35°C(優選為30°C)條件下恒溫震蕩 0.5~2h，恒溫震蕩時振動速度為100~200轉/min(優選為150轉/min);
[0013]震蕩后取出凝膠進行充分水洗，水洗后進行真空抽濾(抽濾至無液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的3~5倍;然后在20 ~30°C(優選為25°C)、180~220轉/分(優選為190轉/分鐘)條件下恒溫振蕩30~40分鐘(優 選為35分鐘）；震蕩后靜置30~40min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠；
[0014] 得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50 %的二甲基亞礬或占沉淀凝膠體積 百分比50%的1，4_二氧六環為活化溶劑，并加入占沉淀凝膠體積百分比20%的環氧氯丙 烷，在25~35°C(優選為30°C)、180~220轉/分(優選為190轉/分鐘）條件下恒溫振蕩反應9 ~12h(優選為IOh);反應結束后對所得產物進行抽濾，抽濾后所得產物采用蒸餾水反復洗 滌至濾液為中性，洗滌后進行抽濾，得到活化凝膠；
[0015] c、手臂連接：
[0016]將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度 為9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:5~8(優 選為摩爾比1:6)，所述碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍;然后在55~65°C (優選為60°C )、180~220轉/分(優選為190轉/分鐘）條件下恒溫振蕩1~1.5h(優選為1小 時），進行"手臂"分子鍵合反應;反應后得到手臂連接的凝膠；
[0017] d、配基偶聯反應：
[0018] 稱取步驟c所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾 數的肽配基及碳化二亞胺EDC，在25~35°C (優選為30°C)、180~220轉/分(優選為190轉/分 鐘)條件下恒溫振蕩進行配基偶聯反應1.5~2.5h(優選為2小時）；
[0019] e、稱取步驟d偶聯反應所得產物，加入所得產物溶液體積1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在25~35°C (優選為30°C )、100~200轉/min條件下恒溫振蕩2~2.5h;震蕩后所得產 物裝入層析柱中將液體抽濾后，采用去離子水洗滌3~4次;每次加入去離子水的體積為濕 凝膠5倍體積;洗滌后加入濕凝膠體積1/2的lmol/L的乙醇胺，接著在25~35°C(優選為30 °C )、100~200轉/min條件下恒溫振蕩反應2~2.5h;所得產物即為凝血因子VI親和層析樹 脂；
[0020] f、將步驟e所得產物采用去離子水沖洗，最后再用20%乙醇溶液沖洗3~4次，每次 加入的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積;沖洗后將所得產物存放于凝膠體積3倍的20 %乙醇 溶液中在4°C條件下存放。
[0021] 根據上述的凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，步驟a中所述瓊脂糖凝膠 Sepharose CL-6B即瓊脂糖凝膠CL-6B由瓊脂糖凝膠微球或葡聚糖凝膠微球替代。
[0022] 根據上述的凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，步驟d中所述肽配基為肽配基 EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC中的至少一種。
[0023]根據上述的凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，所述肽配基EYCPC、肽配基 GCVSGCLCWEYC或肽配基RKWNCTDHEYC均按照常規多肽合成方法制備而成。
[0024]根據上述的凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，所述肽配基EYCPC、肽配基 GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC的純度均彡95 %。
[0025] 本發明的積極有益效果：
[0026] UFVIII是甲型血友病患者需要終身反復使用的一類藥品。隨著技術的革新，各種 層析技術、層析載體和方法的應用，制備高純度和高回收率的FVIII制品已成為可能，但是 國內生產血液制品的企業僅有上海萊士、華蘭生物等少數幾家回收FVIII，造成了原料血漿 大量浪費。本發明有效避免了冷沉淀制劑回收FVIII比活不確定、純度較低、含有顆粒物和 血型抗體、可導致過敏反應等問題、離子層析法對工藝條件要求較高及單克隆抗體親和層 析制備容易造成單抗親和層析中鼠類蛋白的污染問題，可豐富FVIII純化方法、有效提高原 料血漿的利用率。
[0027] 2、本發明技術方案選用了針對人凝血因子VI的特異、通用的肽配基，并通過試驗 證實所采用的肽配基偶聯物能快速、特異、高效的純化凝血因子珊。將本發明產品層析樹脂 用于從血漿中提取凝血因子珊，能夠快速、特異、高效的純化凝血因子珊。
[0028] 3、本發明采用肽配基理性設計篩選凝血因子VI特異性肽，開發了高效、廉價和易 制備的特異性親和配基。將該特異性親和配基偶聯在瓊脂糖微球載體上，可用于純化凝血 因子珊。偶聯方法采用環氧氯丙烷活化法活化凝膠并鍵和間隔臂，用碳二亞胺鹽酸鹽偶聯 肽配基后采用化學試劑掩蔽殘余基團電荷。對于氨基采用羧酸酐進行封閉；羧基掩蔽可采 用乙醇胺進行封閉。 四、【具體實施方式】：
[0029] 以下結合實施例進一步闡述本發明，但并不限制本發明的內容。
[0030] 以下實施例中采用的肽配基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC均 按照常規多肽合成方法制備而成。制備而成的肽配基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基 RKWNCTDHEYC的純度均彡95 %。
[0031] 實施例1:
[0032]本發明凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，該制備方法的詳細步驟如下：
[0033] a、首先稱取保存于冰箱中20%乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊 脂糖凝膠CL-6B，采用過量蒸餾水進行反復洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂 糖凝膠；
[0034] b、環氧氯丙烷活化法活化凝膠：
[0035] 稱取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.3M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積 量是濕瓊脂糖凝膠重量的4倍;然后在30°C條件下恒溫震蕩1.5h，恒溫震蕩時振動速度為 150車專/min;
[0036]震蕩后取出凝膠進行充分水洗，水洗后進行真空抽濾(抽濾至無液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的4倍;然后在25 °C、 190轉/分條件下恒溫振蕩30分鐘;震蕩后靜置30min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠；
[0037]得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50%的二甲基亞礬為活化溶劑，并加 入占沉淀凝膠體積百分比20%的環氧氯丙烷，在30°C、190轉/分的條件下恒溫振蕩反應 IOh;反應結束后對所得產物進行抽濾，抽濾后所得產物采用蒸餾水反復洗滌至濾液為中 性，洗滌后進行抽濾，得到活化凝膠；
[0038] c、手臂連接：
[0039]將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度 為9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:6,所述 碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍;然后在60°C、190轉/分的條件下恒溫振蕩 1小時，進行"手臂"分子鍵合反應;反應后得到手臂連接的凝膠；
[0040] d、配基偶聯反應：
[0041]稱取步驟c所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾 數的肽配基EYCPC及碳化二亞胺EDC，在30°C、190轉/分的條件下恒溫振蕩進行配基偶聯反 應2.Oh;
[0042] e、稱取步驟d偶聯反應所得產物，加入所得產物溶液體積1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在30 °C、150轉/min條件下恒溫振蕩2.2h;震蕩后所得產物裝入層析柱中將液體抽濾 后，采用去離子水洗滌3次;每次加入去離子水的體積為濕凝膠5倍體積;洗滌后加入濕凝膠 體積1/2的lmol/L的乙醇胺，接著在30°C、150轉/min條件下恒溫振蕩反應2.2h;所得產物即 為凝血因子VI親和層析樹脂；
[0043] f、將步驟e所得產物采用去離子水沖洗，最后再用20 %乙醇溶液沖洗3次，每次加 入的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積;沖洗后將所得產物存放于凝膠體積3倍的20%乙醇溶 液中在4°C條件下存放。
[0044] 實施例2:
[0045] 本發明凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，該制備方法的詳細步驟如下：
[0046] a、首先稱取保存于冰箱中20 %乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊 脂糖凝膠CL-6B，采用過量蒸餾水進行反復洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂 糖凝膠；
[0047] b、環氧氯丙烷活化法活化凝膠：
[0048] 稱取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.4M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積 量是濕瓊脂糖凝膠重量的5倍;然后在28°C條件下恒溫震蕩1.8h，恒溫震蕩時振動速度為 120轉/min;
[0049] 震蕩后取出凝膠進行充分水洗，水洗后進行真空抽濾(抽濾至無液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的5倍;然后在30 °C、 180轉/分條件下恒溫振蕩40分鐘;震蕩后靜置35min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠；
[0050] 得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50%的1，4_二氧六環為活化溶劑，并 加入占沉淀凝膠體積百分比20%的環氧氯丙烷，在25°C、180轉/分的條件下恒溫振蕩反應 12h;反應結束后對所得產物進行抽濾，抽濾后所得產物采用蒸餾水反復洗滌至濾液為中 性，洗滌后進行抽濾，得到活化凝膠；
[0051 ] c、手臂連接：
[0052]將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度 為9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:5,所述 碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍;然后在55°C、180轉/分的條件下恒溫振蕩 1.5小時，進行"手臂"分子鍵合反應;反應后得到手臂連接的凝膠；
[0053] d、配基偶聯反應：
[0054]稱取步驟c所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾 數的肽配基GCVSGCLCWEYC及碳化二亞胺EDC，在25°C、180轉/分的條件下恒溫振蕩進行配基 偶聯反應2.5h;
[0055] e、稱取步驟d偶聯反應所得產物，加入所得產物溶液體積1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在25°C、120轉/min條件下恒溫振蕩2.5h;震蕩后所得產物裝入層析柱中將液體抽濾 后，采用去離子水洗滌4次;每次加入去離子水的體積為濕凝膠5倍體積;洗滌后加入濕凝膠 體積1/2的lmol/L的乙醇胺，接著在25°C、120轉/min條件下恒溫振蕩反應2.5h;所得產物即 為凝血因子VI親和層析樹脂；
[0056] f、將步驟e所得產物采用去離子水沖洗，最后再用20 %乙醇溶液沖洗4次，每次加 入的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積;沖洗后將所得產物存放于凝膠體積3倍的20%乙醇溶 液中在4°C條件下存放。
[0057] 實施例3:
[0058]本發明凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，該制備方法的詳細步驟如下：
[0059] a、首先稱取保存于冰箱中20%乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊 脂糖凝膠CL-6B，采用過量蒸餾水進行反復洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂 糖凝膠；
[0060] b、環氧氯丙烷活化法活化凝膠：
[0061 ] 稱取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.2M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積 量是濕瓊脂糖凝膠重量的3倍;然后在35°C條件下恒溫震蕩0.8h，恒溫震蕩時振動速度為 100轉/min;
[0062]震蕩后取出凝膠進行充分水洗，水洗后進行真空抽濾(抽濾至無液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的3倍;然后在20 °C、 220轉/分條件下恒溫振蕩35分鐘;震蕩后靜置40min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠；
[0063]得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50%的1，4_二氧六環為活化溶劑，并 加入占沉淀凝膠體積百分比20%的環氧氯丙烷，在35°C、200轉/分的條件下恒溫振蕩反應 9h;反應結束后對所得產物進行抽濾，抽濾后所得產物采用蒸餾水反復洗滌至濾液為中性， 洗滌后進行抽濾，得到活化凝膠；
[0064] c、手臂連接：
[0065]將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度 為9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:7,所述 碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍;然后在65°C、200轉/分的條件下恒溫振蕩 1.2小時，進行"手臂"分子鍵合反應;反應后得到手臂連接的凝膠；
[0066] d、配基偶聯反應：
[0067]稱取步驟c所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾 數的肽配基RKWNCTDHEYC及碳化二亞胺EDC，在35 °C、200轉/分的條件下恒溫振蕩進行配基 偶聯反應1.5h;
[0068] e、稱取步驟d偶聯反應所得產物，加入所得產物溶液體積1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在35°C、100轉/min條件下恒溫振蕩2. Oh;震蕩后所得產物裝入層析柱中將液體抽濾 后，采用去離子水洗滌4次;每次加入去離子水的體積為濕凝膠5倍體積;洗滌后加入濕凝膠 體積1/2的lmol/L的乙醇胺，接著在35°C、100轉/min條件下恒溫振蕩反應2.Oh;所得產物即 為凝血因子VI親和層析樹脂；
[0069] f、將步驟e所得產物采用去離子水沖洗，最后再用20 %乙醇溶液沖洗4次，每次加 入的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積;沖洗后將所得產物存放于凝膠體積3倍的20%乙醇溶 液中在4°C條件下存放。
[0070] 實施例4:
[0071] 本發明凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，該制備方法的詳細步驟如下：
[0072] a、首先稱取保存于冰箱中20%乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊 脂糖凝膠CL-6B，采用過量蒸餾水進行反復洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂 糖凝膠；
[0073] b、環氧氯丙烷活化法活化凝膠：
[0074] 稱取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.5M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積 量是濕瓊脂糖凝膠重量的3倍;然后在25°C條件下恒溫震蕩2.0h，恒溫震蕩時振動速度為 180轉/min;
[0075]震蕩后取出凝膠進行充分水洗，水洗后進行真空抽濾(抽濾至無液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的4倍;然后在22 °C、 220轉/分條件下恒溫振蕩35分鐘;震蕩后靜置38min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠；
[0076]得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50%的二甲基亞礬為活化溶劑，并加 入占沉淀凝膠體積百分比20%的環氧氯丙烷，在28°C、220轉/分的條件下恒溫振蕩反應 I Ih;反應結束后對所得產物進行抽濾，抽濾后所得產物采用蒸餾水反復洗滌至濾液為中 性，洗滌后進行抽濾，得到活化凝膠；
[0077] c、手臂連接：
[0078]將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度 為9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:8,所述 碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍;然后在58°C、220轉/分的條件下恒溫振蕩 1小時，進行"手臂"分子鍵合反應;反應后得到手臂連接的凝膠；
[0079] d、配基偶聯反應：
[0080] 稱取步驟C所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾 數的肽配基EYCPC及碳化二亞胺EDC，在28°C、220轉/分的條件下恒溫振蕩進行配基偶聯反 應2.2h;
[0081] e、稱取步驟d偶聯反應所得產物，加入所得產物溶液體積1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在28°C、180轉/min條件下恒溫振蕩2.2h;震蕩后所得產物裝入層析柱中將液體抽濾 后，采用去離子水洗滌3次;每次加入去離子水的體積為濕凝膠5倍體積;洗滌后加入濕凝膠 體積1/2的lmol/L的乙醇胺，接著在28 °C、180轉/min條件下恒溫振蕩反應2.Oh;所得產物即 為凝血因子VI親和層析樹脂；
[0082] f、將步驟e所得產物采用去離子水沖洗，最后再用20 %乙醇溶液沖洗3次，每次加 入的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積;沖洗后將所得產物存放于凝膠體積3倍的20%乙醇溶 液中在4°C條件下存放。
[0083] 實施例5:
[0084]本發明凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，該制備方法的詳細步驟如下：
[0085] a、首先稱取保存于冰箱中20 %乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊 脂糖凝膠CL-6B，采用過量蒸餾水進行反復洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂 糖凝膠；
[0086] b、環氧氯丙烷活化法活化凝膠：
[0087] 稱取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.1 M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積 量是濕瓊脂糖凝膠重量的5倍;然后在32°C條件下恒溫震蕩0.5h，恒溫震蕩時振動速度為 200轉/min;
[0088]震蕩后取出凝膠進行充分水洗，水洗后進行真空抽濾(抽濾至無液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的4倍;然后在25 °C、 190轉/分條件下恒溫振蕩30分鐘;震蕩后靜置30min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠；
[0089]得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50%的二甲基亞礬為活化溶劑，并加 入占沉淀凝膠體積百分比20%的環氧氯丙烷，在30°C、190轉/分的條件下恒溫振蕩反應 IOh;反應結束后對所得產物進行抽濾，抽濾后所得產物采用蒸餾水反復洗滌至濾液為中 性，洗滌后進行抽濾，得到活化凝膠；
[0090] c、手臂連接：
[0091]將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度 為9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:6,所述 碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍;然后在60°C、190轉/分的條件下恒溫振蕩 1小時，進行"手臂"分子鍵合反應;反應后得到手臂連接的凝膠；
[0092] d、配基偶聯反應：
[0093]稱取步驟c所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾 數的肽配基(肽配基采用肽配基EYCPC和肽配基GCVSGCLCWEYC二者的混合物，混合時二者摩 爾比為1:1)及碳化二亞胺EDC，在30°C、190轉/分的條件下恒溫振蕩進行配基偶聯反應 2.Oh；
[0094] e、稱取步驟d偶聯反應所得產物，加入所得產物溶液體積1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在30 °C、150轉/min條件下恒溫振蕩2.2h;震蕩后所得產物裝入層析柱中將液體抽濾 后，采用去離子水洗滌3次;每次加入去離子水的體積為濕凝膠5倍體積;洗滌后加入濕凝膠 體積1/2的lmol/L的乙醇胺，接著在30°C、150轉/min條件下恒溫振蕩反應2.2h;所得產物即 為凝血因子VI親和層析樹脂；
[0095] f、將步驟e所得產物采用去離子水沖洗，最后再用20 %乙醇溶液沖洗3次，每次加 入的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積;沖洗后將所得產物存放于凝膠體積3倍的20%乙醇溶 液中在4°C條件下存放。
[0096] 實施例6:
[0097]本發明凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，該制備方法的詳細步驟如下：
[0098] a、首先稱取保存于冰箱中20 %乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊 脂糖凝膠CL-6B，采用過量蒸餾水進行反復洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂 糖凝膠；
[0099] b、環氧氯丙烷活化法活化凝膠：
[0100] 稱取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.3M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積 量是濕瓊脂糖凝膠重量的4倍;然后在30°C條件下恒溫震蕩1.2h，恒溫震蕩時振動速度為 120轉/min;
[0101]震蕩后取出凝膠進行充分水洗，水洗后進行真空抽濾(抽濾至無液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的3倍;然后在20 °C、 200轉/分條件下恒溫振蕩35分鐘;震蕩后靜置40min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠；
[0102] 得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50%的1，4_二氧六環為活化溶劑，并 加入占沉淀凝膠體積百分比20%的環氧氯丙烷，在30°C、200轉/分的條件下恒溫振蕩反應 IOh;反應結束后對所得產物進行抽濾，抽濾后所得產物采用蒸餾水反復洗滌至濾液為中 性，洗滌后進行抽濾，得到活化凝膠；
[0103] c、手臂連接：
[0104]將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度 為9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:6,所述 碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍;然后在60°C、200轉/分的條件下恒溫振蕩 1.0小時，進行"手臂"分子鍵合反應;反應后得到手臂連接的凝膠；
[0105] d、配基偶聯反應：
[0106] 稱取步驟C所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾 數的肽配基(肽配基采用肽配基RKWNCTDHEYC和肽配基GCVSGCLCWEYC二者的混合物，混合時 二者摩爾比為1:1)及碳化二亞胺H)C，在30°C、200轉/分的條件下恒溫振蕩進行配基偶聯反 應1.5h;
[0107] e、稱取步驟d偶聯反應所得產物，加入所得產物溶液體積1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在30°C、120轉/min條件下恒溫振蕩2. Oh;震蕩后所得產物裝入層析柱中將液體抽濾 后，采用去離子水洗滌4次;每次加入去離子水的體積為濕凝膠5倍體積;洗滌后加入濕凝膠 體積1/2的lmol/L的乙醇胺，接著在30°C、150轉/min條件下恒溫振蕩反應2.Oh;所得產物即 為凝血因子VI親和層析樹脂；
[0108] f、將步驟e所得產物采用去離子水沖洗，最后再用20 %乙醇溶液沖洗4次，每次加 入的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積;沖洗后將所得產物存放于凝膠體積3倍的20%乙醇溶 液中在4°C條件下存放。
【主權項】
1. 一種凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步 驟： a、 首先稱取保存于冰箱中20%乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊脂糖 凝膠CL-6B，采用過量蒸餾水進行反復洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂糖凝 膠； b、 環氧氯丙烷活化法活化凝膠： 稱取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.1~0.5M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體 積量是濕瓊脂糖凝膠重量的3~5倍;然后在25~35°C條件下恒溫震蕩0.5~2h，恒溫震蕩時 振動速度為100~200轉/min; 震蕩后取出凝膠進行充分水洗，水洗后進行真空抽濾，然后加入到lmol/L的NaOH溶液 中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的3~5倍;然后在20~30°C、180~220轉/分條 件下恒溫振蕩30~40分鐘;震蕩后靜置30~40min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠； 得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50 %的二甲基亞礬或占沉淀凝膠體積百分 比50%的1，4_二氧六環為活化溶劑，并加入占沉淀凝膠體積百分比20%的環氧氯丙烷，在 25~35°C、180~220轉/分條件下恒溫振蕩反應9~12h;反應結束后對所得產物進行抽濾， 抽濾后所得產物采用蒸餾水反復洗滌至濾液為中性，洗滌后進行抽濾，得到活化凝膠； c、 手臂連接： 將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度為 9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:5~8,所述 碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍;然后在55~65°C、180~220轉/分條件下 恒溫振蕩1~1.5h，進行"手臂"分子鍵合反應;反應后得到手臂連接的凝膠； d、 配基偶聯反應： 稱取步驟c所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾數的 肽配基及碳化二亞胺EDC，在25~35°C、180~220轉/分條件下恒溫振蕩進行配基偶聯反應 1.5~2.5h; e、 稱取步驟d偶聯反應所得產物，加入所得產物溶液體積1/10的lmol/L的醋酸水溶液， 在25~35°C、100~200轉/min條件下恒溫振蕩2~2.5h;震蕩后所得產物裝入層析柱中將液 體抽濾后，采用去離子水洗滌3~4次;每次加入去離子水的體積為濕凝膠5倍體積;洗滌后 加入濕凝膠體積1/2的lmol/L的乙醇胺，接著在25~35°C、100~200轉/min條件下恒溫振蕩 反應2~2.5h;所得產物即為凝血因子珊親和層析樹脂； f、 將步驟e所得產物采用去離子水沖洗，最后再用20%乙醇溶液沖洗3~4次，每次加入 的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積;沖洗后將所得產物存放于凝膠體積3倍的20%乙醇溶液 中在4°C條件下存放。2. 根據權利要求1所述的凝血因子珊親和層析樹脂的制備方法，其特征在于：步驟a中 所述瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊脂糖凝膠CL-6B由瓊脂糖凝膠微球或葡聚糖凝膠微 球替代。3. 根據權利要求1所述的凝血因子珊親和層析樹脂的制備方法，其特征在于：步驟d中 所述肽配基為肽配基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC中的至少一種。4. 根據權利要求3所述的凝血因子珊親和層析樹脂的制備方法，其特征在于:所述肽配 基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC或肽配基RKWNCTDHEYC均按照常規多肽合成方法制備而成。5.根據權利要求3所述的凝血因子珊親和層析樹脂的制備方法，其特征在于:所述肽配 基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC的純度均彡95 %。
【文檔編號】B01J20/30GK106040196SQ201610493721
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月27日
【發明人】陳正躍, 詹合琴, 陳美光, 王璐, 靳玫, 高夏歡
【申請人】新鄉醫學院