一種人IgG4抗體的吸附柱及其制備方法和用圖
【專利摘要】本發明涉及一種人IgG4抗體的吸附柱及其制備方法和用途，包括柱體，其特征在于：柱體的兩端封閉，在柱體的兩端封閉處各設有一連接管，在柱體的內腔設有吸附劑，所述吸附劑由配基與載體結合構成，配基為抗人IgG4抗體，載體為瓊脂糖微球、聚苯乙烯微球或磁珠。所述柱體為圓柱體形狀、橢圓柱形狀或多邊柱形狀；先將柱體的一端封閉并在封閉處設置連接管，然后將吸附劑裝入柱體的內腔，再將柱體的另一端封閉并在封閉處設置連接管，即制備成人IgG4抗體吸附柱。本發明通過利用人IgG4抗體吸附柱從人血中純化人IgG4，或者人IgG4抗體吸附柱的再利用。具有高效、特異的純化人IgG4抗體的特點，為IgG4的研究和應用奠定基礎。
【專利說明】
一種人I gG4抗體的吸附柱及其制備方法和用途
技術領域
[0001] 本發明涉及一種人IgG4抗體的吸附柱及其制備方法和用途。屬于醫療器械技術領 域。
【背景技術】
[0002] 免疫球蛋白G(Immun〇gl〇bulin G，IgG)是血清中免疫球蛋白的主要部分(約占 Ig 的75%)，分為四個亞型：1861(60%-70%)、1862(15%-20%)、以63(5%-10%)、1864(4%-6%)，而各亞型的免疫學特性和功能存在差異（Shakib F.The human IgG subclasses: molecular analysis of structure ,function and regulation.4th ed.Elsevier, 2013)。IgG4是IgG抗體的四個亞型之一，含量雖少(成人:0.08-1.40g/L)，但最具生物學獨 特性：① IgG4較鏈區（hinge region)的獨特結構(Arch Biochem Biophys,2012,526(2): 159-66)，決定了其顯著缺乏激活補體Clq和結合Fe γ Rs的能力（J Exp Med，1991，173(4): 1025-8)，不能誘導顯著的免疫應答;②IgG4可通過Fc-Fc結合其它IgG亞型，如IgGl、IgG2、 IgG3(PloS 〇1^，2008,3(2):61637);以及通過與另一1864的? &13段交換形成新的辦1^1(1(雜 合）IgG4，導致其單價有效，可阻止抗體形成免疫復合物（Science，2007，317(5844): 1554-7)，推測這種作用模式有助于負調控炎癥;③IgG4可競爭性抑制相同抗原特異性的IgE介導 的嗜堿性粒細胞和肥大細胞活化，發揮抗過敏作用;④IgG4結合靶抗原的能力與其它亞型 抗體無差異，因 B淋巴細胞克隆在分化過程中，通過恒定區CH基因節段的重排，僅可引起免 疫球蛋白類別轉換，即識別抗原特異性不變(周光炎.免疫學原理.第三版.上海:科學出版 社，2013)。
[0003] 最近研究發現，IgG4抗體作為一種"非致炎（non-inf Iammatory)"分子（Cl in ExpImmunol ,2015,181:191-206)，近年數個IgG4亞型的治療性抗體已獲FDA批準。但是如何 純化人IgG4抗體，尚未見相關專利。
[0004]為此，需要設計一種人IgG4抗體的吸附柱，并具有高效、特異的純化人IgG4抗體的 特點。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的之一，是為解決現有技術中不能高效純化人IgG4抗體的問題，提供 一種人IgG4抗體吸的附柱。具有高效、特異的純化人IgG4抗體的特點。具有高效純化人IgG4 抗體的特點。
[0006] 本發明的目的之二，是為了提供一種人IgG4抗體吸的附柱的制備方法。
[0007] 本發明的目的之三，是為了提供一種人IgG4抗體吸的附柱的用途。
[0008] 本發明的目的之一可以通過如下技術方案達到：
[0009] -種人IgG4抗體的吸附柱，包括柱體，其特征在于:柱體的兩端封閉，在柱體的兩 端封閉處各設有一連接管，在柱體的內腔設有吸附劑，所述吸附劑由配基與載體結合構成， 配基為抗人IgG4抗體，載體為瓊脂糖微球、聚苯乙稀微球或磁珠。
[0010] 本發明的目的之一還可以通過如下技術方案達到：
[0011] 作為一種優選方案，所述柱體呈圓柱體形狀、橢圓柱形狀或多邊柱形狀。
[0012 ]作為一種優選方案，所述抗人I gG4抗體，可以為人抗人I gG4抗體、小鼠抗人I gG4抗 體、兔抗人I gG4抗體、驢抗人I gG4抗體或羊抗人I gG4抗體中的一種或二種以上組合。
[0013] 作為一種優選方案，所述載體為氨基化或羧基化的瓊脂糖微球，或者所述載體為 氨基或羧基化的聚苯乙烯微球。
[0014] 作為一種優選方案，所述載體為氨基化或羧基化的磁珠。
[0015] 本發明的目的之二可以通過如下技術方案達到：
[0016] 一種人IgG4抗體的吸附柱的制備方法，其特征在于:包括以下步驟，
[0017] 1)制作形成柱體，使所述柱體為圓柱體形狀、橢圓柱形狀或多邊柱形狀；
[0018] 2)制作吸附劑，將抗人IgG4抗體偶聯在瓊脂糖微球或聚苯乙烯微球或磁珠上，形 成吸附劑；
[0019] 3)制作人IgG4抗體吸附柱，首先將柱體的一端封閉并在封閉處設置連接管，然后 將吸附劑裝入柱體的內腔，再將柱體的另一端封閉并在封閉處設置連接管，即制備成人 IgG4抗體吸附柱。
[0020] 本發明的目的之二還可以通過如下技術方案達到：
[0021] 進一步地，步驟2)中所述的制作吸附劑，具體方法如下：
[0022]稱適量溴化氫活化的瓊脂糖微球置于lmmol/L的Hcl中懸浮溶脹，用pH值為8.3,含 有0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaHC03溶液洗滌，并于漏斗抽干，加入抗人IgG4抗體（Iml的 微球加入5mg抗體），發生偶聯反應;再以pH值為8.0、濃度為0. lmol/L的Tris-Hcl封閉瓊脂 糖微球，形成吸附劑。
[0023] 進一步地，步驟3)中所述的制作吸附劑，具體方法如下：
[0024] 將吸附劑裝入二端封閉的柱體的內腔，并在二端封閉處設置連接管，制備成基本 吸附柱；依次用pH值為4 · 0，含0 · 5mol/l Nacl的0 · lmol/L醋酸鹽溶液和pH值為8 · 0，含有 0.5111〇1凡似(31的0.11]1〇1凡1'1^8-!1(31交替洗吸附柱，最后，用。!1值為7.4的0.051]1〇1凡的?133 平衡液洗滌吸附柱，得到偶聯了吸附劑為抗人IgG4抗體的瓊脂糖微球的人IgG4抗體吸附 柱。
[0025]本發明的目的之三可以通過如下技術方案達到：
[0026] -種人IgG4抗體的吸附柱的用途，其特征在于:利用人IgG4抗體吸附柱從人血中 純化人IgG4;或者所述人IgG4抗體吸附柱的再利用，先用酸性緩沖液洗滌吸附柱，再用中性 緩沖液平衡，最后于4度保存備用。
[0027] 本發明具有如下突出的有益效果：
[0028] 1、本發明由于設置了柱體，柱體的兩端封閉，在柱體的兩端封閉處各設有一連接 管，在柱體的內腔設有吸附劑，所述吸附劑由配基與載體結合構成，配基為抗人IgG4抗體， 載體為瓊脂糖微球、聚苯乙烯微球或磁珠，構成人IgG4抗體吸附柱;通過使用人IgG4抗體吸 附柱，能夠高效、特異的純化人IgG4抗體，因此能夠解決現有技術中不能高效純化人IgG4抗 體的問題，具有高效、特異的純化人IgG4抗體的特點，為IgG4的研究和應用奠定基礎。
[0029] 2、本發明通過人IgG4抗體吸附柱的再利用，先用酸性緩沖液洗滌吸附柱，再用中 性緩沖液平衡，最后于4度保存備用，因此，具有節約成本、經濟效益高的有益效果。
【附圖說明】
[0030]圖1為本發明具體實施例中人I gG4抗體吸附柱的結構示意圖。
【具體實施方式】 [0031] 具體實施例1
[0032]參照附圖1，本實施例涉及的人IgG4抗體的吸附柱，包括柱體1，柱體1的兩端封閉， 在柱體1的兩端封閉處各設有一連接管2,在柱體1的內腔設有吸附劑，所述吸附劑由配基與 載體結合構成，配基為抗人IgG4抗體，載體為瓊脂糖微球、聚苯乙稀微球或磁珠。
[0033] 本實施例中：
[0034]所述柱體1呈圓柱體形狀。所述抗人IgG4抗體為小鼠抗人IgG4抗體。所述載體為氨 基化的瓊脂糖微球。
[0035] 本實施例涉及的一種人IgG4抗體的吸附柱的制備方法，其特征在于:包括以下步 驟，
[0036] 1)制作形成柱體1，使所述柱體1為圓柱體形狀；
[0037] 2)制作吸附劑，將抗人IgG4抗體偶聯在氨基化的瓊脂糖微球上，形成吸附劑；
[0038] 3)制作人IgG4抗體吸附柱，首先將柱體1的一端封閉并在封閉處設置連接管2,然 后將吸附劑裝入柱體1的內腔，再將柱體1的另一端封閉并在封閉處設置連接管2,即制備成 人IgG4抗體吸附柱。
[0039] 本實施例中：
[0040]步驟2)中所述的制作吸附劑，具體方法如下：
[0041]稱適量溴化氫活化的瓊脂糖微球置于lmmol/L的Hcl中懸浮溶脹，用pH值為8.3，含 有0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaHC03溶液洗滌，并于漏斗抽干，加入抗人IgG4抗體（Iml的 微球加入5mg抗體），發生偶聯反應;再以pH值為8.0、濃度為0. lmol/L的Tris-Hcl封閉瓊脂 糖微球，形成吸附劑。
[0042] 進一步地，還可以稱適量溴化氫活化的瓊脂糖微球于lmmol/L Hcl中懸浮溶脹，用 pH值為8.3，含有0.5mol/L NaCL的0. lmol/L NaHC03溶液洗滌，并于漏斗抽干，加入小鼠抗 人IgG4抗體（Iml的微球加入5mg抗體），發生偶聯反應;再以pH值為8.0、濃度為0. lmol/L的 Tris-Hcl封閉瓊脂糖微球，并裝入呈圓柱體形狀且上下各有一根連接管道的柱體內，制備 成吸附柱;依次用pH值為4 · 0，含0 · 5mo 1/1 Nacl的0 · lmol/L醋酸鹽溶液和pH值為8 · 0，含有 0.5111〇1凡似(31的0.11]1〇1凡1'1^8-!1(31交替洗吸附柱，最后，用。!1值為7.4的0.051]1〇1凡的?133 平衡液洗滌吸附柱，得到偶聯了吸附劑為小鼠抗人IgG4抗體的瓊脂糖微球的人IgG4抗體吸 附柱。
[0043] 步驟3)中所述的制作吸附劑，具體方法如下：
[0044] 將吸附劑裝入二端封閉的柱體1的內腔，并在二端封閉處設置連接管2,制備成基 本吸附柱;依次用pH值為4 · 0，含0 · 5mo 1/1 Nacl的0 · lmol/L醋酸鹽溶液和pH值為8 · 0，含有 0.5111〇1凡似(31的0.11]1〇1凡1'1^8-!1(31交替洗吸附柱，最后，用。!1值為7.4的0.051]1〇1凡的?133 平衡液洗滌吸附柱，得到偶聯了吸附劑為抗人IgG4抗體的瓊脂糖微球的人IgG4抗體吸附 柱。
[0045] 本實施例涉及的人IgG4抗體吸附柱的應途，其特征在于:利用人IgG4抗體吸附柱 從人血中純化人IgG4;具體為"
[0046] 首先，將人血清或細胞培養上清加入人IgG4抗體的吸附柱中；其次，用pH值為7.4、 濃度為〇 . 〇5mol/L、且含有0.5mol/L NaCl的I3BS洗10個柱床體積;再用pH值為2.4、濃度為 0. lOmol/L的Gly-Hc 1洗脫人的IgG4抗體，檢測洗脫液中蛋白含量。收集洗脫液，并立即向其 中加入pH值為9.0、濃度為1.0m〇l/L的Tris-Hcl或者濃度為lmol/L的NaHC03將洗脫液中和 至pH值為7.2，并對洗脫的蛋白進行定量；
[0047]用人IgG4抗體吸附柱純化正常人血清(5ml)中的IgG4抗體結果如表一所示。
[0048]表一：
[0050]或者人IgG4抗體吸附柱的再利用，具體為：
[00511 先用pH值為2.4、濃度為0.1 OmoVL的Gly-Hcl洗滌3個柱床體積;再用pH值為7.4、 濃度為0.03mol/L、且含有0.5mol/L NaCl的PBS洗滌吸附柱3個柱床體積，至pH為7.4，保存 備用。
[0052] 具體實施例2
[0053]本實施例的特點是：
[0054]所述柱體1呈橢圓柱形狀或多邊柱形狀。所述抗人IgG4抗體，可以為人抗人IgG^A 體、兔抗人IgG4抗體、驢抗人IgG4抗體或羊抗人IgG4抗體中的一種或二種以上組合。所述載 體為氨基化或羧基化的瓊脂糖微球，或者所述載體為氨基或羧基化的聚苯乙烯微球;或者 所述載體為氨基化或羧基化的磁珠。
[0055]制備人IgG4抗體吸附柱的具體方法如下：
[0056]以制備的氨基化的磁珠(Si02包覆Fe304)作為吸附材料，將兔抗人IgG4抗體(終濃 度3mg/mL)與磁珠在含有0.5mol/L NaCL的0· lmol/L NaHC03溶液中混合，室溫反應12h(每1 小時混勾1次），用磁鐵分離磁珠;再以pH值為8.0、濃度為0. lmol/L的Tris-Hcl封閉磁珠，并 裝入呈圓柱體形狀且上下各有一根連接管道的柱體內，制備成吸附柱;依次用PH值為4.0， 含0.5mol/l Nacl的0· lmol/L醋酸鹽溶液和pH值為8.0,含有0.5mol/L Nacl的0· lmol/L Tris-Hcl交替洗吸附柱，最后，用pH值為7.4的0.05m〇VL的I3BS平衡液洗滌吸附柱，得到偶 聯了吸附劑為兔抗人I gG4抗體的磁珠的人I gG4抗體吸附柱；
[0057]本實施例涉及的用途如下：
[0058] 1)人IgG4抗體的純化
[0059]首先，將人血清或細胞培養上清加入人IgG4抗體的吸附柱中；其次，用pH值為7.2、 濃度為〇 . 〇2mol/L、且含有0.5mol/L NaCl的PBS洗6個柱床體積；再用pH值為2.5、濃度為 0.20mol/L的Gly-Hcl洗脫人的IgG4抗體，檢測洗脫液中蛋白含量。收集洗脫液，并立即向其 中加入pH值為8.5、濃度為0.8mol/L的Tris-Hcl或者濃度為0.5mol/L的NaHC03將洗脫液中 和至pH值為7.4，并對洗脫的蛋白進行定量。
[0060]用IgG4吸附磁珠純化SLE患者血清(5ml)中的IgG4抗體結果如表二所示。
[0061 ]表二 L0064」或者2)IgG4吸附磁珠的再利用
[0065] 先用pH值為2 · 2、濃度為0 · 05mo VL的Gly-Hcl洗滌磁珠為5次;再用pH值為7 · 2、濃 度為0.02mol/L、且含有0.5mol/L NaCl的PBS洗滌磁珠為5次，至pH為7.2，保存備用。
[0066]以上所述，僅為本發明較佳的具體實施例，但本發明的保護范圍并不局限于此，任 何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的范圍內，根據本發明的技術方案及其構思加 以等同替換或改變，都屬于本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種人IgG4抗體的吸附柱，包括柱體（1)，其特征在于:柱體（1)的兩端封閉，在柱體 (1)的兩端封閉處各設有一連接管(2)，在柱體(1)的內腔設有吸附劑，所述吸附劑由配基與 載體結合構成，配基為抗人IgG4抗體，載體為瓊脂糖微球、聚苯乙稀微球或磁珠。2. 根據權利要求1所述的一種人IgG4抗體的吸附柱，其特征在于:所述柱體（1)呈圓柱 體形狀、橢圓柱形狀或多邊柱形狀。3. 根據權利要求1所述的一種人IgG4抗體的吸附柱，其特征在于:所述抗人IgG4抗體， 可以為人抗人I gG4抗體、小鼠抗人I gG4抗體、兔抗人I gG4抗體、驢抗人I gG4抗體或羊抗人 IgG4抗體中的一種或二種以上組合。4. 根據權利要求1所述的一種人IgG4抗體的吸附柱，其特征在于:所述載體為氨基化或 羧基化的瓊脂糖微球，或者所述載體為氨基或羧基化的聚苯乙烯微球。5. 根據權利要求1所述的一種人IgG4抗體的吸附柱，其特征在于:所述載體為氨基化或 羧基化的磁珠。6. -種人IgG4抗體的吸附柱的制備方法，其特征在于:包括以下步驟， 1) 制作形成柱體1，使所述柱體1為圓柱體形狀、橢圓柱形狀或多邊柱形狀； 2) 制作吸附劑，將抗人IgG4抗體偶聯在瓊脂糖微球或聚苯乙烯微球或磁珠上，形成吸 附劑； 3) 制作人IgG4抗體吸附柱，首先將柱體1的一端封閉并在封閉處設置連接管2,然后將 吸附劑裝入柱體1的內腔，再將柱體1的另一端封閉并在封閉處設置連接管2,即制備成人 IgG4抗體吸附柱。7. 根據權利要求6所述的一種人IgG4抗體的吸附柱制備方法，其特征在于:步驟2)中所 述的制作吸附劑，具體方法如下:稱適量溴化氫活化的瓊脂糖微球置于lmmol/L的Hcl中懸 浮溶脹，用pH值為8.3，含有0.5mol/L NaCl的0. lmol/L NaHC03溶液洗滌，并于漏斗抽干，加 入抗人IgG4抗體(lml的微球加入5mg抗體），發生偶聯反應;再以pH值為8.0、濃度為0. lmol/ L的Tris-Hcl封閉瓊脂糖微球，形成吸附劑。8. 根據權利要求6所述的一種人IgG4抗體的吸附柱制備方法，其特征在于:步驟3)中所 述的制作吸附劑，具體方法如下:將吸附劑裝入二端封閉的柱體1的內腔，并在二端封閉處 設置連接管2，制備成基本吸附柱;依次用pH值為4.0，含0.5mol/l Nacl的0. lmol/L醋酸鹽 溶液和pH值為8 · 0，含有0 · 5mol/L Nacl的0 · lmol/L Tris-Hcl交替洗吸附柱，最后，用pH值 為7.4的0.05mol/L的PBS平衡液洗滌吸附柱，得到偶聯了吸附劑為抗人IgG4抗體的瓊脂糖 微球的人I gG4抗體吸附柱。9. 一種人IgG4抗體的吸附柱的用途，其特征在于:利用人IgG4抗體吸附柱從人血中純 化人IgG4;或者所述人IgG4抗體吸附柱的再利用，先用酸性緩沖液洗滌吸附柱，再用中性緩 沖液平衡，最后于4度保存備用。
【文檔編號】B01J20/26GK106040187SQ201610414289
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月14日
【發明人】潘慶軍, 劉華鋒, 郭林杰, 吳平, 廖煥金, 吳靜, 蔡珺, 彭艷霞, 張莉芳
【申請人】廣東醫學院附屬醫院