琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質及制備方法與應用

琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質及制備方法與應用
【專利摘要】本發明涉及一種琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質及制備方法與應用。琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質；其色譜介質是平均粒徑50?170μm的瓊脂糖凝膠顆粒，表面通過環氧基間隔臂引入聚乙烯亞胺接枝鏈，然后通過聚乙烯亞胺接枝鏈上的氨基與琥珀酸酐相結合，得到羧基離子交換容量為150?970mmol/L的琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質。本發明的琥珀酸酐修飾量的聚乙烯亞胺接枝介質或對蛋白質具有較高的吸附速率或對蛋白質具有很強的吸附特性，表現出了較高的靜態吸附容量，且對鹽濃度有較好的耐受性。介質清洗、除菌方便，易于再生，生物相容性好，制備方法簡單、價格低廉，在蛋白質的分離純化中將有廣闊的應用前景。
【專利說明】
琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質及制備方法與應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一種琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質及制備方法與應用，屬于生物
技術領域中的蛋白質色譜分離技術。
【背景技術】
[0002] 基因工程和重組DNA技術的發展促進了對重組或天然蛋白以及生物大分子如質粒 DNA和病毒樣顆粒的需求。對于生物制藥行業來說，核心問題就是向一個高要求和規范化的 市場提供這些新的治療產品。雖然這些生物大分子的上游加工過程在產品產量方面取得了 明顯的進步，但下游的生物加工和純化過程依然制約著生物大分子的生產，需要加以簡化 并降低生產成本。色譜技術尤其是離子交換色譜，因其分離精度高，設備簡單，操作方便，廣 泛用于生物大分子下游加工過程中。
[0003] 目前接枝型介質以其在高流速下仍具有高動態結合容量的特性而受到廣泛關注， 成為近年來研究的熱點。相較于傳統的非接枝介質，接枝層的存在，能夠使蛋白的吸附從二 維表面擴展到三維空間，提升了介質的靜態吸附容量。同時接枝層內部存在的靜電耦合，鏈 傳遞等傳質機理能夠極大的提尚蛋白質的吸附速率。
[0004] 聚乙烯亞胺是一種具有良好生物相容性的線性分支聚合物，其分支中伯仲叔胺的 比例為1:2: ULin-Ling Yu等人將適量的聚乙稀亞胺作為接枝鏈接枝到傳統的色譜介質 上，獲得了一種性質優良的具有高靜態吸附容量和吸附速率的陰離子交換色譜介質 (Protein adsorption to poly(ethylenimine)-modified Sepharose FF:I.A critical ionic capacity for drastically enhanced capacity and uptake kinetics[J] ? Journal of Chromatography A，2013，1305(l):76-84),同時此介質在高鹽條件下也有良 好的表現（Protein adsorption to poly (ethyl enimine )-modif ied Sepharose FF: II.Effect of ionic strength[J].Journal of Chromatography A,2013,1305(1):85-93)。為進一步擴展聚乙烯亞胺接枝介質在陽離子交換色譜中的應用，本發明利用琥珀酸酐 進一步修飾聚乙烯亞胺，使聚乙烯亞胺接枝介質轉化為表面帶有羧基基團的陽離子交換色 譜介質。通過調節琥珀酸酐的修飾量得到具有不同羧基離子交換容量的介質，該介質具有 高蛋白吸附速率或高靜態吸附容量。制備工藝簡單，生物相容性好，成本低廉，非常適用于 蛋白質的分離純化過程中。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于在聚乙烯亞胺接枝介質的基礎上，進一步開發一種具有羧基離 子交換基團的琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝陽離子交換色譜介質。所述介質或能明顯提 高蛋白的吸附速率，或能大幅提高蛋白的靜態吸附容量，且可在較寬的鹽濃度范圍內使用。 介質制備方法過程簡單，羧基離子交換容量可調節。
[0006] 本發明的技術方案概述如下：
[0007] 一種琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質；其色譜介質是平均粒徑50-170WI1的瓊脂 糖凝膠顆粒，表面通過環氧基間隔臂引入聚乙烯亞胺接枝鏈，然后通過聚乙烯亞胺接枝鏈 上的氨基與琥珀酸酐相結合，得到具有羧基離子交換基團的琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝 介質。
[0008] 本發明的琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質的制備方法;步驟如下：
[0009] 1)通過環氧基間隔臂在瓊脂糖凝膠表面引入聚乙烯亞胺接枝鏈，然后將離子交換 容量為740mmol/L的聚乙烯亞胺接枝介質利用N，N-二甲基甲酰胺浸泡，直至將孔內溶劑完 全替換為N，N-二甲基甲酰胺；
[0010] 2)將步驟1)得到的介質加入到N，N-二甲基甲酰胺中，制備介質懸浮液，N，N-二甲 基甲酰胺體積用量為介質體積量的4倍；
[0011] 3)向步驟2)得到的介質懸浮液中加入琥珀酸酐，琥珀酸酐用量為0.0222-0.74g/g 介質；混合均勻后置于室溫水浴過夜;然后依次用N，N-二甲基甲酰胺，乙醇和水沖洗介質， 制得琥泊酸酐修飾聚乙稀亞胺接枝介質。
[0012] 所述室溫過夜條件優選為:25°C的恒溫水浴，170rpm反應24h。
[0013]制得的琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質的羧基離子交換容量為150-970mmol/ L〇
[0014]本發明的琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質應用于蛋白質分離純化。
[0015]本發明的琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質，結構示意表達式如下，但不代表真 實的配基比例及分布：
[0017]其中黑色樹枝狀接枝層為簡化聚乙烯亞胺結構式，聚乙烯亞胺分子量（MW)為 1200-750000Da，結構式如下，
[0019]琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質應用于蛋白質分離純化中，合適的羧基離子交 換容量能夠提升蛋白質的吸附速率或寬鹽濃度范圍（20-150mol/L)內蛋白質的靜態吸附容 量。
[0020]離子交換容量為740mmol/L的聚乙烯亞胺接枝介質已經證實具有良好的蛋白吸附 性會泛（Protein adsorption to poly(ethylenimine)-modified Sepharose FF:I.A critical ionic capacity for drastically enhanced capacity and uptake kinetics [J].Journal of Chromatography A，2013，1305(l):76_84)〇
[0021]本發明主要是琥珀酸酐用量的選擇，合適的琥珀酸酐量有利于獲得具有不同羧基 離子交換容量的琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質。
[0022]經實驗證明，本發明的琥珀酸酐修飾量的聚乙烯亞胺接枝介質或對蛋白質具有較 高的吸附速率或對蛋白質具有很強的吸附特性，表現出了較高的靜態吸附容量，且對鹽濃 度有較好的耐受性。介質清洗、除菌方便，易于再生，生物相容性好，制備方法簡單、價格低 廉，在蛋白質的分離純化中將有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0023]圖1 :溶菌酶在實施例4中琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質和商品化SP Sepherose FF介質中的溶液溶度隨時間的變化曲線；
[0024]圖2:實施例5和實施例6所制備的琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質與商品化SP Sepharose FF介質在不同氯化鈉濃度下(0、20、50、100、150mmol/L)對溶菌酶的靜態吸附容 量。
【具體實施方式】
[0025] 下面的實例將對本發明的方法予以進一步的說明。
[0026] 實施例1
[0027] 1)通過環氧基間隔臂在瓊脂糖凝膠表面引入聚乙烯亞胺接枝鏈，然后取5g離子交 換容量為740mmol/L的聚乙烯亞胺接枝介質利用N，N-二甲基甲酰胺浸泡，直至將孔內溶劑 完全替換為N，N-二甲基甲酰胺；
[0028] 2)將步驟1)得到的介質利用G3漏斗抽干后置于50mL錐形瓶中，然后向錐形瓶中繼 續加入20mL N，N-二甲基甲酰胺，混合均勻，制備介質懸浮液；
[0029] 3)向步驟2)得到的介質懸浮液中加入0. lllg琥珀酸酐，混合均勻后置于25°C的恒 溫水浴，170rpm反應24h，之后依次用N，N-二甲基甲酰胺，乙醇和水沖洗介質，獲得羧基離子 交換容量為150mmol/L的琥泊酸酐修飾聚乙稀亞胺接枝介質。
[0030] 實施例2
[0031]將實施例1中琥珀酸酐的加入量變為〇.2294g，其他條件不變的情況下，獲得羧基 離子交換容量為240mmol/L的琥泊酸酐修飾聚乙稀亞胺接枝介質。
[0032] 實施例3
[0033]將實施例1中琥珀酸酐的加入量變為0.296g，其他條件不變的情況下，獲得羧基離 子交換容量為270mmol/L的琥泊酸酐修飾聚乙稀亞胺接枝介質。
[0034] 實施例4
[0035] 將實施例1中琥珀酸酐的加入量變為0.37g，其他條件不變的情況下，獲得羧基離 子交換容量為350mmol/L的琥泊酸酐修飾聚乙稀亞胺接枝介質。
[0036] 實施例5
[0037]將實施例1中琥珀酸酐的加入量變為0.555g，其他條件不變的情況下，獲得羧基離 子交換容量為570mmol/L的琥泊酸酐修飾聚乙稀亞胺接枝介質。
[0038] 實施例6
[0039] 將實施例1中琥珀酸酐的加入量變為3.7g，其他條件不變的情況下，獲得羧基離子 交換容量為970mmol/L的琥泊酸酐修飾聚乙稀亞胺接枝介質。
[0040] 實施例7
[00411 將實施例4中介質用20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8)平衡后，經G3漏斗抽干后稱 取0.3g加入100mL含有lmg/mL的溶菌酶的相應平衡緩沖液中，上述介質懸浮液置于25 °C恒 溫水浴，攪拌速度為280rpm，通過實時在線檢測蛋白質溶液在280nm下的吸光值，從而確定 蛋白質溶液濃度隨時間變化的曲線，求得蛋白質在介質中的傳質速率，用有效孔擴散系數 與溶菌酶在自由溶液中擴散系數的比值(D e/D0)來代表。在實驗條件下下，介質的De/D0值為 0.64±0.03。
[0042]將商品化介質SP Sepharose FF用20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8)平衡后，經G3 漏斗抽干后稱取〇.3g加入100mL含有lmg/mL的溶菌酶的相應的平衡緩沖液中，上述介質懸 浮液置于25 °C恒溫水浴，攪拌速度為280rpm，通過實時在線檢測蛋白質溶液在280nm下的吸 光值，從而確定蛋白質溶液濃度隨時間變化的曲線，求得蛋白質在介質中的傳質速率，用有 效孔擴散系數與溶菌酶在自由溶液中擴散系數的比值(D e/D〇)來代表。在實驗條件下下，介
[0043]溶菌酶在琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質（實施例4)和商品化SP Sepharose FF介質中的溶液溶度隨時間變化的曲線如圖1所示。
[0044]由結果可知，在上述實驗條件下，琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質(實施例4)對 溶菌酶的吸附速率是商品化介質SP Sepharose FF的5.33倍。這說明合適的琥珀酸酐修飾 密度的聚乙烯亞胺接枝介質能夠顯著提升蛋白質的吸附速率。
[0045] 實施例8
[0046]將實施例5中琥珀酸酐修飾的聚乙烯亞胺接枝介質分別用含有不同濃度（0、20、 50、100、150謹〇1/1)的氯化鈉的20111111〇1/11^8-11(：1緩沖液化118)平衡后，再將63漏斗抽干 的〇.〇5g平衡后介質分別加入到5mL用平衡緩沖液配制的含有不同濃度的溶菌酶溶液中，上 述介質懸浮液置于25°C，170rpm恒溫水浴震蕩24h后，離心收集上清液在280nm下測吸光值， 通過物料衡算確定蛋白質在介質上的吸附量。在0_150mmol/L氯化鈉濃度下，介質的靜態吸 附容量為101_307mg/mL。
[0047]將實施例6中琥珀酸酐修飾的聚乙烯亞胺接枝介質分別用含有不同濃度（0、20、 50、100、150謹〇1/1)的氯化鈉的20111111〇1/11^8-11(：1緩沖液化118)平衡后，再將63漏斗抽干 的〇.〇5g平衡后介質分別加入到5mL用平衡緩沖液配制的含有不同濃度的溶菌酶溶液中，上 述介質懸浮液置于25°C，170rpm恒溫水浴震蕩24h后，離心收集上清液在280nm下測吸光值， 通過物料衡算確定蛋白質在介質上的吸附量。在0_150mmol/L氯化鈉濃度下，介質的靜態吸 附容量為 217-280mg/mL。
[0048] 比較：將商品化介質SP Sepharose FF分別用含有不同濃度（0、20、50、100、 150mmol/L)的氯化鈉的20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8)平衡后，再將G3漏斗抽干的0.05g 平衡后介質分別加入到5mL用平衡緩沖液配制的含有不同濃度的溶菌酶溶液中，上述介質 懸浮液置于25°C，170rpm恒溫水浴震蕩24h后，離心收集上清液在280nm下測吸光值，通過物 料衡算確定蛋白質在介質上的吸附量。在〇-150mmol/L氯化鈉濃度下，介質的靜態吸附容量 為64_216mg/mL。
[0049] 琥泊酸酐修飾聚乙稀亞胺接枝介質（實施例5和實施例6 )與商品化介質SP Sepharose FF在不同氯化鈉濃度下對溶菌酶的靜態吸附容量如表1所示，相應的靜態吸附 容量隨鹽濃度的變化曲線如圖2所示。
[0050] 表1介質在不同氯化鈉濃度下對溶菌酶的靜態吸附容量(mg/mL)。
[0052]由結果可知，在上述實驗中的氯化鈉濃度下，琥珀酸酐修飾的聚乙烯亞胺接枝介 質（實施例5和實施例6中介質)對溶菌酶的靜態吸附容量及其對鹽濃度的耐受程度均高于 商品化介質SP Sepharose FF。這說明合適的琥泊酸酐修飾密度的聚乙稀亞胺接枝介質明 顯提高了蛋白質的靜態吸附容量。
[0053]本發明提出的琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質在提高蛋白質的吸附速率或靜 態吸附容量中的應用，已通過現場較佳實施例子進行了描述，相關技術人員明顯能在不脫 離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合，來實現本發 明技術。特別需要指出的是，所有相類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見 的，他們都被視為包括在本發明精神、范圍和內容中。
【主權項】
1. 一種琥泊酸酐修飾聚乙稀亞胺接枝介質;其特征是色譜介質是平均粒徑50-170μηι的 瓊脂糖凝膠顆粒，表面通過環氧基間隔臂引入聚乙烯亞胺接枝鏈，然后通過聚乙烯亞胺接 枝鏈上的氨基與琥珀酸酐相結合，得到具有羧基離子交換基團的琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺 接枝介質。2. 權利要求1的琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質，其特征是琥珀酸酐修飾聚乙烯亞 胺接枝介質的羧基離子交換容量為150-970mmol/L。3. 權利要求1或2的琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質的制備方法;其特征是： 1) 通過環氧基間隔臂在瓊脂糖凝膠表面引入聚乙烯亞胺接枝鏈，然后將離子交換容量 為740mmol/L的聚乙烯亞胺接枝介質利用N，N-二甲基甲酰胺浸泡，直至將孔內溶劑完全替 換為N，N-二甲基甲酰胺； 2) 將步驟1)得到的介質加入到N，N-二甲基甲酰胺中，制備介質懸浮液，N，N-二甲基甲 酰胺體積用量為介質體積量的4倍； 3) 向步驟2)得到的介質懸浮液中加入琥珀酸酐，琥珀酸酐用量為0.0222-0.74g/g介 質；混合均勻后置于室溫水浴過夜;然后依次用N，N-二甲基甲酰胺，乙醇和水沖洗介質，制 得琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質。4. 如權利要求3所述方法，其特征是所述室溫過夜條件為:25 °C的恒溫水浴，170rpm反 應 24h。5. 琥珀酸酐修飾聚乙烯亞胺接枝介質應用于蛋白質分離純化。
【文檔編號】B01D15/32GK106000364SQ201610348043
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月24日
【發明人】孫彥, 趙洋洋, 余林玲, 董曉燕
【申請人】天津大學