滅菌層析柱的制作方法

滅菌層析柱的制作方法
【專利摘要】如果將預先填充的塑料層析柱用適宜水平的γ輻照滅菌，形成的無菌層析柱維持充足的填料功能并維持柱機械性能和壓力等級。
【專利說明】
滅菌層析柱
技術領域
[0001] 本發明設及層析柱的滅菌。
【背景技術】
[0002] 柱層析是一種分離和/或純化技術，其中填料的固定"床"包含在硬管或柱中。填料 可W是固體顆粒的形式（"固定相"）或用液體固定相涂覆的固體支撐材料。不論哪種，填料 通常填充柱管件內體積。
[0003] 在分離層析中，隨著液體樣品（"移動相"）通過柱，樣品中的不同化合物可與固定 相不同結合使其相對于移動相較慢并W不同的速度通過柱移動。因此，那些與固定相結合 較多的化合物通過柱的移動比那些結合較少的化合物更慢，而運種速度的差別導致了化合 物隨著通過和流出柱而互相分離。
[0004] 在親和色譜法中，填料包括粘合劑，如抗原、抗體或配體，其特別粘合至一種或多 種液體樣品中希望的化合物或分子。因此，隨著液體樣品流動通過填料，僅希望的化合物或 分子保留在柱內。洗脫液之后，通過填料的流體從附著至填料的粘合劑分離希望的化合物 或分子，或從填料分離粘合劑。不論哪種方法，將希望的化合物或分子清洗出柱并收集入洗 脫流體。親和色譜法可用于多種應用，包括核酸純化、從無細胞提取物的蛋白質純化和從血 液的純化。
[0005] 生物工藝中新發展，如連續工藝和多產品工藝，對微生物控制要求更嚴格。需要從 細胞培養到下游純化的無菌流體通道W降低被污染的風險。因此，制造保持高水平性能的 無菌、一次性柱將是非常有用的。

【發明內容】

[0006] 本發明至少部分基于W下發現，如果用一定范圍的丫福照，例如8.0至35或40kGy 福照塑料層析柱，其將被滅菌至不同的無菌保證水平(SAL),同時仍明顯保持有用的功能。 例如，即便在高至35或40kGy的高水平福照下，塑料柱在福照之后仍保持其丫福照之前的初 始壓力等級和機械性能。此外，柱含有包含共價偶聯親和配體的填料，例如，固定化的蛋白 A，在用本文描述的滅菌方法處理之后保持適宜的性能。本文描述的方法抑制或避免粘合劑 的親和捕獲性能的任意降低，例如蛋白A，用于改變填料，其可能通常由福照導致，通過包含 填充入柱的保護液的特定添加劑W在福照時保護填料。
[0007] -方面，本公開的特征在于制造和填充層析柱并之后將運些柱使用本文所述的特 定的技術和參數滅菌的方法。運些方法包括選擇柱管，例如塑料材料或另外適合的彈性材 料，其具有適宜的內徑和長度W容納填料所需要的體積；（b)加入填料，例如，瓊脂糖或二氧 化娃小珠或任意其他適宜的層析填料，例如，共價偶聯至功能化劑或粘合劑，如蛋白A，例 如，全長野生型葡萄球菌蛋白A(SpA)或蛋白A的重組型；（C)通過用蓋或密封封閉管在管內 將填料封裝成填充床，所述蓋或密封可W例如用作管內"壓配合"或"過盈配合"，W獲得密 封的介質填充床；（d)任選地，將填充柱在氣密和水密的容器，例如塑料包、圓筒或盒子內封 裝或密封;和（e)用劑量為至少SkGy至約35或40kGy，例如，至少10、15、20、25、30、33、35或 40kGy的T福射來福照容器內的柱。
[0008] 之后將任選仍在氣密容器內的柱從福射源移開，并可W在密封的容器內運輸，從 而保持柱內和柱外的無菌性。僅當柱的外表面需要保持無菌時需要氣密或水密容器。即便 沒有運樣的容器，如果柱的入口和出口保持密封，無菌柱的內部和填料將保持無菌。
[0009] 運種水平的福照產生可W根據無菌保證水平(SAL)描述的無菌填充柱。SAL是單一 單元的可能性，例如，單一填充柱，在其經過滅菌之后不是無菌的，并且SAL取決于福射劑量 和福照之前材料的固有生物負載。當使用25kGy的劑量時，具有低生物負載的物品，如本文 描述的柱組分，將達到1(T6生物體/單元的無菌保證水平，其為相對高水平的無菌性(僅一個 單元，例如，一個柱，在1百萬個已經無菌化的單元中，將不是無菌的）。如果在福照之前在填 充的柱上存在更高的初始生物負載，可W使用更高水平的丫福照，例如30至40kGy，來實現 運種同樣的SAL。另一個，相對低的，但仍然有用的無菌化水平是使用SkGy劑量時可W實現 的 1〇-3生物體/單元（參見加ide to Irradiation and Sterilization Validation of Single-Use Systems(一次性體系的福照和滅菌驗證指南），Bioprocess International, 2008和其中的參考文獻）。其他水平包括1(T4生物體/單元和1(T5生物體/單元。
[0010] 在運些方法的各種實施中，塑料材料可W包括聚丙締、聚乙締、聚酷胺、縮醒類、玻 璃填充塑料類、碳填充塑料類、玻璃纖維塑料類或碳纖維塑料類或碳纖維塑料類。填料可W 包括瓊脂糖、二氧化娃、陶瓷或丙締酸醋的聚合物或纖維素基材料。
[0011] 在一些實施方案中，填料可W用W下一種或多種功能化:離子交換基團；具有疏水 和帶電性能的多元基團；金屬馨合基團；疏水基團；或能結合至免疫球蛋白IgG的葡萄球菌 蛋白A(SpA)多膚。例如，離子交換基團可W包括一種或多種季胺、硫酸鹽和簇酸鹽而疏水基 團可W包括一種或多種丙基、辛基和苯基基團。
[0012] 此外，在各種實施方案中，SpA多膚可W包括全長野生型SpA,重組SpA,包括選自 SpA域A、B、C、D、E或Z的SpA域的單體SpA多膚，或包括W選自SpA域A、B、C、D、E或Z的任意組合 的任意兩個、S個、四個、五個或更多SpA域的多聚體SpA多膚，或其功能等價物。例如，SpA多 膚可W是多聚體SpA多膚，例如，多聚體SpA多膚可W包括四或五個選自SpA域B、C和Z的SpA 域。例如，所有的SpA域可W是相同的，所有=個、四個或五個SpA域可W是C域。
[0013] 在各種實施方案中，本文所述的無菌柱制備方法可W進一步包括選擇適宜尺寸的 第一和第二流體分布器，其中至少第二流體分布器(或第一和第二流體分布器均)具有大于 管件的內徑的直徑，例如比管件的內徑大約0.25至5.0%;將第一流體分布器永久固定至管 件的第一端;在將填料加入柱管之后，通過應用軸向力將第二流體分布器插入管的第二端 來使得第二流體分布器進入柱管W形成過盈配合，例如，從而引起環周張力，其能充分有效 地形成密封，例如液壓密封，第一和第二流體分布器之間管內的腔室;調整第二流體分布器 在管內的縱向位置，通過（i)向第二流體分布器應用額外的軸向力直到其抵達柱管內希望 的位置，或（ii)使液體進入腔室W應用液壓使第二流體分布器返回向管件的第二端移動， 或（i)和(ii)的任意組合;并且當將第二流體分布器適當放置時，將第二流體分布器永久固 定在管內。
[0014] 在某些實施中，填料可W是在適宜的緩沖液中包含約40%至約70%的固體的漿 料。一旦將填料裝填入柱，就可W加入保護液。保護液可包含緩沖液或其他可W影響填料功 能性的添加劑。例如，如本文所述的，W低百分比（v/v)加入保護液的芳族醇類可W保持用 粘合劑如蛋白A功能化的T滅菌填料的親和捕獲性能。
[0015] 在各種實施方案中，加入至柱內填料的保護液可W包括0.1至25.0% (體積/體積） 的醇。例如，在一些實施方案中，保護液包括0.1至5.0% (體積/體積)的醇，其中所述醇包括 芳族醇，如苯甲醇。在其他的實施方案中，保護液包括2.0至25.0% (體積/體積）的醇，其中 所述醇包括脂肪族伯醇，如乙醇。
[0016] 另一方面，本公開的特征在于無菌層析柱本身。運些無菌填充層析柱包括(a)具有 兩端的無菌中空管;和(b)管內的無菌填充的層析介質，其中所述管在兩端都是封閉的W形 成填充柱;其中所述填充柱具有的無菌保證水平（SAL)為1(T3生物體/柱。在一些實施方案 中，SAL為1〇-6生物體/柱。
[0017] 在運些無菌填充層析柱中，所述層析柱包括管件、第一流體分布器和第二流體分 布器，并且運些組分可W各自由相同或不同的塑料材料制成。所述塑料材料可W包括一種 或多種聚丙締、聚乙締、聚酷胺類、縮醒類、玻璃填充塑料類、碳填充塑料類、玻璃纖維塑料 類或碳纖維塑料類或碳纖維塑料類。
[0018] 在各種實施方案中，柱內的填料可W包括瓊脂糖、二氧化娃、陶瓷或丙締酸醋的聚 合物或纖維素基材料。在某些實施方案中，填料用W下一種或多種功能化:離子交換基團； 具有疏水和帶電性能的多元基團；金屬馨合基團；疏水基團；或能結合至免疫球蛋白IgG的 葡萄球菌蛋白A(SpA)多膚。例如，離子交換基團可W包括一種或多種季胺類、硫酸鹽類和簇 酸鹽類，而疏水基團可W包括一種或多種丙基、辛基和苯基。
[0019] 在一些實施方案中，SpA多膚可W包括全長野生型SpA,重組SpA,包括選自SpA域A、 B、C、D、E或Z的SpA域的單體SpA多膚，或包括W選自SpA域A、B、C、D、E或Z的任意組合的任意 兩個、S個、四個、五個或更多SpA域的多聚體SpA多膚，或其功能等價物。例如，SpA多膚可W 是多聚體SpA多膚，例如，包括四或五個選自SpA域B、C和Z的SpA域。例如，所述SpA域可W都 是相同的，例如，多聚體SpA多膚可W包括=個、四個或五個SpA域C。
[0020] 在某些實施方案中，管件的兩端通過流體分布器封閉，所述流體分布器具有的外 徑略大于管件的內徑W提供過盈配合。此外，在任意的實施方案和本文所述的實施中，如本 文所述的，可W將柱在福照之前在氣密和水密容器中密封。此外，在丫福照之前，柱還可W 進一步密封在第二氣密和水密容器中W提供封裝結構的雙層。因此，最終產品是密封在氣 密和水密容器內的無菌預先填充的、塑料層析柱。運些高度功能性和經濟的柱可被視為一 次性的，但是具有多次再使用的功能整體性。
[0021] 在一些實施方案中，本公開的特征在于包括具有第一端和第二端的無菌中空管的 無菌填充層析柱;將無菌第一流體分布器固定至管件的第一端;具有大于管件內徑的外徑 的無菌第二流體分布器；W及在所述第一和第二流體分布器之間的管內填充的無菌填料； 其中將所述第二流體分布器固定至管件的第二端內W形成第一和第二流體分布器之間的 中空管內的腔室，其用填料填充;并且其中填充的層析柱具有無菌保證水平1(T3或1(T6生物 體/柱。
[0022] 在運些無菌層析柱中的填料可W具有特性吸附水平為在未經過丫福照的柱內的 同一種類型的填料的特性吸附水平的至少60%。此外，在各種實施方案中，填料可W包含 0.5至5.0 % (體積/體積)的芳族醇或2.0至25 % (體積/體積)的脂肪族伯醇。例如，所述填料 可W包含0.5至3.0 % (體積/體積）的苯甲醇或2.0至20 %的乙醇。
[0023] 在一些實施方案中，塑料管件還具有增加的末端直徑化eW在第一端形成凹槽，其 中第一流體分布器具有大于化1的外徑化3,并且其中將第一流體分布器用過盈配合固定在 管件的第一端內直接導致充分降低的環周張力。在某些實施方案中，所述第一流體分布器 永久結合至管件或者第一和第二流體分布器都可W用永久結合如焊接節點固定至管件的 內壁。
[0024] 在某些實施方案中，在柱或者管件的腔室內包含有填料的新的層析柱可W液壓密 封。在某些實施方案中，所述腔室被構建為承受至少50磅/平方英寸的內壓。在一些實施方 案中，運=個特征都存在。在一些實施方案中，塑料管件和第二流體分布器由相同類型的塑 料制成并且第一流體分布器是管件的組成特征。
[0025] 如本文所使用的，術語"塑料"指層析柱或層析柱的組分由各種聚合材料制成，如 熱塑性塑料，例如，丙締臘下二締苯乙締(ABS)、丙締酸，例如，聚甲基丙締酸甲醋(PMMA)、聚 締控、聚丙締(PP)、聚氯乙締(PVC)、聚四氣乙締(PTFE)、聚碳酸醋和各種由兩種或多種不同 類型的塑料和/或聚合材料制成的塑料復合物，W及熱固性塑料，例如環氧樹脂和纖維（例 如，玻璃、金屬(例如，不誘鋼），或碳纖維)增強塑料。
[0026] 如本文所使用的，術語"床高"指包含在完整層析柱內的填料床的線性高度。
[0027] 如本文所使用的，"填料"是固體材料的漿料或懸浮液，W不規則形狀或球形顆粒 形式，其之后在柱內形成"填料床"。填料可W有各種材料制成，如二氧化娃、陶瓷、瓊脂糖、 丙締酸或纖維素類聚合物。固體材料可W功能化為具有分子特征，提供例如離子性、疏水 性、或特異性親和特征(例如，用粘合劑如抗體或蛋白A)。
[0028] 如在本文使用的，"填料床"指層析柱內的層析填料的最終狀態。運種最終狀態W 各種方式實現。例如，一種方法是結合流體流動接著通過一個或所有兩個流體分布器的床 的軸向壓力。本領域已知的其他方法包括顆粒的重力沉降，震動沉降和/或單一機械軸向壓 縮。之后填充，填充床在通常包含抗菌劑添加劑的保護液中保持含水。如本文所描述的，此 保護液也可W或可選地包含一種或多種緩沖液或其他添加劑，其可W幫助針對丫福照的有 害作用保護功能化的固體載體的完整性和性能。例如，所述保護液可W包含低百分比(V/V) 的脂肪族或芳族醇，如乙醇或苯甲醇，或多元醇，如糖醇，W增強保護在福照之后介質的層 析性能。
[0029] 如本文使用的，"床載體"是網、屏、網眼或玻璃原料，其允許各種液體通過而保留 組成填充床的填料的小顆粒。可W將運些床載體直接連接至流體分布器。
[0030] 如本文使用的，術語"永久結合"和"將其永久結合"用于指所述兩組分之間的結合 不能被分離除非破壞所述結合或結合組分(例如，管件和流體分布器)之一或二者都破壞。
[0031] 本文描述的新方法和系統提供了很多優勢和好處。例如，所述新方法能夠制備具 有完全可定制的和各種層高和直徑，并具有希望的SAL，還具有完全功能化的填料的預先填 充的、一次性柱。驚奇的是，在標準緩沖水溶液中使用之后，本文描述的丫福照方法沒有明 顯降低填料或粘合劑的性能，并且沒有產生或提取任何污染物或導致所述污染物從用于組 合層析柱的材料中泄漏。
[0032] 除非另外限定，所有本文使用的技術和科學術語具有的含義同本發明所屬技術領 域的普通技術人員通常理解的含義相同。雖然在實踐和測試本發明中可W使用與本文描述 的類似或等價的方法和材料，適合的方法和材料在下文中描述。所有的公開文本、專利申 請、專利和其他本文設及的參考文獻都通過引用的方式W其整體并入本文。如有矛盾，本說 明書，包括定義將掌控。此外，材料、方法和實例僅是說明而不意為限制。
[0033] 本發明的一種或多種實施方案的細節將在附隨的附圖和W下描述中說明。本發明 的其他特征、目的和優勢將從說明書和附圖W及權利要求顯現。
【附圖說明】
[0034] 圖1是本文描述的一種層析柱的示意圖。
[0035] 圖2a是圖1的柱的橫截面示意圖。
[0036] 圖化是圖1的柱的分解示意的橫截面。
[0037] 圖3a是柱管件的示意圖。
[0038] 圖3b是橫截面中所示柱管件的示意圖。
[0039] 圖4a-4c分別為可用于本文描述的新型層析柱的流體分布器的一個實例的頂部、 前部和底部視圖的示意圖。
[0040] 圖5是流體分布器剛插入W橫截面所示的柱管件后的示意圖。
[0041] 圖6是壓力內的柱管件的示意圖，所述壓力用于向頂部流體分布器施加軸向力W 使其進入柱管件從而提供W橫截面所示的嚴密過盈配合。
[0042] 圖7是層析柱在頂部流體分布器在適當的位置焊接之后的示意圖。
[0043] 圖8是制造本文所述的一種層析柱的基本步驟的流程圖。
[0044] 圖9a是當將流體分布器壓入具有凹槽端的管件W形成過盈配合產生的力的示意 圖。
[0045] 圖9b是當將具有0型環的流體分布器壓入具有凹槽端的管件W形成過盈配合產生 的力的示意圖。
[0046] 圖IOa是在形成了過盈配合之后將流體分布器壓入管件產生的力的示意圖。
[0047] 圖IOb是在形成了過盈配合之后將具有0型環的流體分布器壓入管件產生的力的 示意圖。
[0048] 圖11是表示當將流體分布器壓入管件W形成過盈配合產生的力的實例的圖。
[0049] 圖12是被裝入管件的流體分布器的示意圖。
[0050] 圖13是丫福照的聚丙締和非丫福照的聚丙締的外觀的圖示。
[0051] 圖14A-J是示意了在曝露在水和乙醇之后，對于非福照和福照組分的保留時間和 峰面積的圖。
[0052] 圖15是示意了純聚丙締和福照聚丙締的拉伸應力應變曲線的圖。
[0053] 圖16是示意了純聚丙締和福照聚丙締的拉伸應力應變曲線(減少的應變范圍）的 圖。
[0054] 圖17是示意了純聚丙締和福照聚丙締的彎曲應力應變曲線的圖。
[0055] 圖18是示意了純聚丙締和福照聚丙締的拉伸應力應變曲線的圖。
[0056] 在各附圖中類似的參照符號指類似的元件。
【具體實施方式】
[0057] 本文描述的無菌層析柱可由相對便宜的塑料材料制成，因此可W被認為是一次性 的，但是也可特別設計為用于使用，甚至多次使用是足夠堅固的。本文描述的滅菌新方法提 供了希望的滅菌保證水平(SAL)，從而使得層析柱比現有的層析柱遠更有用，同時保持填充 介質的適宜的功能性W及所需的壓力等級和機械性能。因此，新型無菌、預先填充的一次性 柱準備好用于防腐或無菌的制造過程，例如蛋白質純化過程。由于通常已知電離福射通過 活性氧種類如徑基自由基或單線態氧可W降解包括多膚的材料，運些性能的結果是令人驚 奇的。
[0058] 本發明的實施方案包括組合物，所述組合物包括柱內的層析介質的填充床和用于 無菌的且可用于純化過程的蛋白質純化體系的適宜連接。實例顯示了用于層析柱的材料， 所述材料即便在通過丫福照滅菌之后仍保持層析性能。實例進一步顯示了多固體載體類型 的柱填料如二氧化娃和瓊脂糖，例如，將其功能化W實現W親和性為基礎的分離，其在足W 實現無菌的丫福照之后，保持適宜的分離性能。進一步的實例顯示構造的柱材料并沒有被 丫福照不利影響而增加源自柱材料的可提取的或可泄漏的污染物。實例還提供了獲得無菌 組合物的方式，所述組合物W適合用于通常用于生物醫學純化過程的生物分離的形式。
[0059] 無菌層析柱
[0060] 如本文所定義的，新型無菌層析柱由塑料制成，并因此整體可由廣泛可得的塑料/ 熱塑性塑料和/或復合材料(如聚丙締(PP)、聚乙締(PE)、聚酷胺類(如各種尼龍）、縮醒類或 玻璃填充、金屬填充或碳填充塑料，例如玻璃纖維、鋼纖維和碳纖維塑料)或彈性組分制成， 并用丫福射無菌化至希望的SAL。當然，運些材料可能通過過高劑量的丫福射破壞。此外，填 料和功能化材料，例如粘合劑，也可W通過不適宜水平的福射破壞。因此，驚奇的是可W制 造足夠無菌化W滿足SAL準則的預先填充的一次性層析柱，同時仍保持足夠的柱填料的功 能性能、柱機械性能和壓力等級。此外，驚奇的是福照沒有導致明顯通過通常使用的有機溶 劑提取或在標準緩沖水溶液中使用之后從材料中泄漏的污染物。
[0061] 通常，采用任意各種用二氧化娃、瓊脂糖、陶瓷或其他聚合物支柱的填充柱，可W 將其功能化，例如用一種或多種類型的親和配體或粘合劑(例如蛋白A配體，如重組天然結 構或設計的功能域）、離子相互作用配體、混合模式配體和疏水配體。通常，所述蛋白A配體 可W包括全長野生型葡萄球菌蛋白A(SpA),蛋白A的重組型（例如，如在化yser等，美國專利 號7691608中描述的），或包括任意一個、兩個、=個、四個、五個或多個SpA域的單體或多聚 體配體，例如，選自域A、B、C、D、E或蛋白質Z的任意一個或組合(例如，如在Spector,美國專 利號8592555和化11等，美國專利號8329860中描述的）。例如，多聚體多膚可由S個、四個、 五個或多個域制成，其可W相同或不同。例如，多聚體蛋白可W包括五個SpA C域W形成 Pen1:a C多膚。
[0062] 下文提供了關于柱和填料的進一步細節，W及如何組合層析柱的某些實施方案。
[0063] -旦將柱填充，將填料保持含水W用保護液保護，如本文描述的，將其設計為包含 某些組分，所述組分包括例如化學基團，如硫醇基(例如半脫氨酸)和脂肪碳上的徑基(例如 乙醇）。此外，保護液可W包含其他醇類，所述醇包含如聚乙締化咯燒酬(PVP)的化合物。
[0064] 當發現芳族化合物有時是福射增敏劑并增加福射破壞時，發現使用芳族醇、苯甲 醇的本方法對于固定在層析介質上的蛋白A多膚卻很有保護性。因此，填料的功能性能W及 任意功能化試劑，例如本文所述的粘合劑或配體，如蛋白A，當在包含低百分比(V/V)，例如1 至25%，例如1、2、3、5、7、8、10、12、15、18、20、23或25%的醇，如脂肪醇（例如乙醇和異丙 醇）、芳族醇(例如苯甲醇、色醇、酪醇和苯乙醇(苯基乙醇））或多元醇，如糖醇(例如山梨醇 和甘露醇）的保護液中福照時，可W被保護。
[0065] -旦將柱用填料和保護液填充，并將流體分布器固定在柱管件內，將整個預先填 充的柱任選地封裝在氣密和水密容器內，例如包、圓筒或塑料盒、橡膠或其他可W彎曲或堅 硬的材料，并且其可易于與內部的無菌柱傳輸。將此容器設計為足夠堅固從而允許無破裂 傳輸，W保持無菌預先填充柱在無菌條件下在容器內。在某些情況下，柱保持無菌化而不加 入容器。
[0066] -旦在容器中封裝，用一劑量的丫福射福照整個容器和內部的預先填充的柱W提 供所希望的SALeSAL的通常概念描述在，例如"Guide to Irradiation and Sterilization Validation of Single-Use Bioprocess Systems(一次性生物工藝體系的福照和滅菌驗 證指南r ,Bioprocess Int'1，10-22(2008年5月），其通過引用的方式W其整體并入本文。 丫福射劑量用千戈瑞化Gy)單位測量，其量化福射的吸收能。一戈瑞是一千克物質吸收的一 焦耳福射能量（IkGy = I焦耳/克）。至少SkGy的劑量通常足W消除低生物負載水平并提供 !(T3生物體/單元的無菌水平。使用至少25kGy劑量可W通常獲得1(T6生物體/單元的水平。 但是，過高的T福射劑量可W毀壞柱填料的功能性甚至毀壞柱本身。因此，預先填充的柱的 丫福射水平必須至少為8. OkGy并且可W高至約35kGy或更高，例如，福照水平選自約8和 40kGy 之間的劑量，例如 8、12、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、32.5、33、35、38和40467。
[0067] 所述福射劑量可W用高能光子實現，例如，從同位素源(例如，鉆60)放射出的，其 穿過福照產品產生離子化(電子干擾）。例如，可將其中密封填充柱的容器置于腔室中，在該 腔室中，將其曝露至福射源足夠長的時間W實現希望的SAL。之后，將柱(仍在氣密容器內） 從福射源移除，并可W在密封的容器內傳輸，從而保持柱的無菌性。通過使用密封管和流動 途徑可W將柱流動途徑的無菌性在盒子外或容器包之外保持，所述密封管和流動途徑提供 連接至制造過程中使用的其他設備的無菌連接端口。柱內的無菌性保持了很長使用時間， 例如一個月，兩個月或更長，部分取決于用于儲存無菌柱的容器的性質。W下實例表明在各 種水平的T福照下，存在柱物理性質的最小變化，并且機械性能和結構性能類似于非福照 的柱。其他實例表明在T福照下，層析介質的功能性能僅有非常微小的變化，并且層析介質 仍表現為適合用于生物制造的方式。
[00側層析柱和填料
[0069] 本文描述的層析柱主要由柱管件和一對流體分布器(或一個流體分布器和一個端 蓋)組成。流體分布器包括圓柱形盤和一個或多個入口 /出口管，其使液體流入和通過該盤。 此外，流體分布器可W包括連接至流體分布器盤的填料一側的床支架、屏和/或過濾器。
[0070] 可將流體分布器的流動途徑根據標準規程和已知設計來設計，并且流體分布器本 身可W由例如與管件同樣或類似的塑料材料制成，但是也可W由對于待通過柱流動的液體 和試劑為惰性的金屬、陶瓷或其他材料制成。
[0071] 管件是中空的，通常是圓形的、圓筒形的，允許流體(例如，液體)從第一端(例如， 較高端)流至第二端(例如，較低端）。管件的內徑的尺寸和結構能接受用于傳送流體至管件 和將流體從管件移出的流體分布器。基于各種層析柱的性能說明，管件可W W各種不同的 尺寸和結構制成。在一些實施方案中，管件的尺寸和結構，當能承受高至約185psi(例如，約 20、30、40、50或60口3。的內部壓力下，能在系統引發的內部操作壓力下保持結構完整性。在 一些實施方案中，管件通常為圓柱形并具有內徑約5cm至約IOOcm和長約5至約90cm。
[0072] 通常，管件的全部引發環周張力，基于各種因素，可W基于最終用戶的說明變化， 如期望的層析柱將經受的內壓力。組合和填充柱的方法的細節描述于US2013/0193052(其 對應于W02013/116367)，其通過引用的方式W其整體并入本文。
[0073] 圖4a-4c說明了在一些實施中，流體分布器24是盤狀元件，具有沿著第一側28的中 屯、區域形成的安裝孔26和沿著第二側32形成的多個槽和通道30的系統。安裝孔26是盲孔， 其尺寸和構造能接受配件。安裝孔26包括接受配件的一種或多種特征。在一個特定實施中， 安裝孔26具有螺紋W接受具有螺紋的配件(例如M30 X 3.5螺紋配件）。在一些實施方案中， 將配件W各種其他方式連接至流體分布器24,所述方式如粘合、焊接、卡銷或魯爾接口連 接，或其他充分連接的技術。在一些實施方案中，將配件制造為流體分布器24的整體組分。 流體分布器24還包括流體通道34 W將安裝孔26液壓連接至流體分布器24的第二側32,使得 流體可W穿過流體分布器24的第二側32和插入安裝孔26的配件之間。
[0074] 流體分布器24可W通過任意的各種制造技術形成，如模塑、鑄造、機械加工或其他 方法，并可W商業獲得。在一些實施方案中，將流體分布器24的通常形狀鑄造或模塑并從通 常形狀中機械加工出槽和通道30。為了緊密配合管件的內徑，在一些實施方案中，使用車床 形成流體分布器的外徑W保證外緣是圓的并至容限。
[0075] 配件是機械連接件，可W將其固定或穩固至流體分布器W向流體分布器和其中設 置流體分布器的管件傳輸流體或從流體分布器和其中設置流體分布器的管件移除流體。為 了傳輸流體，配件具有穿過配件沿其中屯、軸形成的流體傳輸孔。配件還包括接收在流體分 布器的安裝孔中的一個或多個特征W保持配件。如圖l、2a和化所示，在此實例中，配件38具 有螺紋端40(例如，M30X3.5螺紋端）W曬合安裝孔26。配件38也具有螺母部分42,其可W通 過工具(例如，轉矩扳手)緊密咬合W將配件38旋轉和固定在安裝孔26中。在一些實施方案 中，配件28包括其他類型的連接機械裝置，如粘合劑、焊接、卡銷或魯爾接口連接或其他充 分連接技術。
[0076] 配件38基于其安裝位置可W具有不同的額外特征。例如，安裝在頂部流體分布器 24a的入口配件38a可W在與螺紋端相對的配件末端具有連接特征。連接特征(如軟管連接） 允許軟管或管件W簡單的方式連接至配件。在此實例中，入口配件24a限定了凹進44,其尺 寸和構造能被軟管配件中接收，如衛生配件(例如，快裝式連接或凸輪鎖)類型的軟管配件。
[0077] 或者，連接至底部流體分布器24b的出口配件38b可W具有不同于入口配件的類型 的連接。在此實例中，將出口配件38b固定至軟管46W將出口配件38b液壓連接至遠程快速 斷開出口配件48。可將遠程快速斷開出口配件48安裝或設置在比出口配件38b用戶可W更 方便接觸的區域。
[0078] 層析柱組分(例如，管件20，流體分布器24a、24b，配件38a、38b和其他組分)可由任 意各種結構和化學適合的塑料材料制成。例如，所述組分可由一種或多種熱塑性塑料（例 如，丙締臘下二締苯乙締(ABS)、丙締酸(例如，PMMA)、聚丙締(PP)、聚氯乙締(PVC)、聚四氣 乙締(PTFE)、其他熱塑性塑料或復合材料)和熱固性塑料(例如環氧樹脂和纖維(例如，玻璃 或碳)增強塑料)制成。材料選擇考量包括材料的特定機械性能并且如果材料將承受系統引 發的內操作壓力。
[0079] 在制造和填充柱時，將頂部和底部流體分布器24a、24b安裝(例如，壓合)入管件20 的頂部和底部。在一些實施方案中，在插入頂部流體分布器24a和用填料填充管件20之前， 將管件20和流體分布器24a、24b中的一個或兩個都永久結合。之后為柱的滿意性測試，第二 (例如頂部)流體分布器24a永久結合到位。
[0080] 除非通過損壞連接或連接的物件（例如管件20和流體分布器24a、24b)，該永久結 合不能被輕易分開。在較高端，額外的蓋(例如頂蓋)54可W任選地坐落在管件20上并固定 至管件20,并且對齊W使安裝在柱頂部的流體分布器24a的入口配件38a穿過額外的頂部端 蓋54的入口配件孔56。運種任選的頂蓋54(其主要為美學特征)可W使用各種固定機械原理 (如緊固件、粘合劑、管件和頂蓋之間的摩擦力或其他機械原理)被固定至管件20。
[0081] 本文描述的層析柱的管件可用任意通過最終用戶指定的用于柱層析的固相柱填 料填充。運種潛在填料的多樣性延伸至基礎顆粒的組合W及其功能化學性(例如親和性、離 子交換和疏水相互作用）。柱填料可W包括加入至洗脫溶劑的固定相顆粒的漿料。固定相顆 粒可W包括瓊脂糖、硅膠（Si〇2)、氧化侶(AL2化）、纖維素和其他各種篩孔尺寸的適合材料。 洗脫可W包括一種或多種各種溶劑，如去離子水、乙醇或丙酬。
[0082] 填料的實例包括，但不限于瓊脂糖(例如，來自通用電子醫療(GE化alth Care)的 Sepharose|?中astFlow和Capto?)可控孔度玻璃（來自Millipore的ProS巧g|)、陶瓷?憐灰 石、聚甲基丙締酸醋(例如，來自Tosoh Bioscience的ToyoPearl?介質），和其他合成的聚合 物樹脂（例如，Life Technologies的化ros?介質和來自EMD的Rractogel?介質）。
[0083] 制造填充的層析柱的方法
[0084] 某些塑料/熱塑性塑料的一個已知的特性是其固有的順應性或彎曲能力，不隨著 施力破裂。使用利用塑料的"流動能力"（例如彈性)的組合過程制備新型層析柱，所述"流動 能方'通過引發環周張力界定，用于制備柱管件20。柱管件20由擠出的、鑄造、模塑地塑、變 形(roto)或其他)或機械加工的塑料/熱塑性塑料或特定內尺寸和外尺寸帶狀鋪設的復合 材料制造而成。本發明描述的用于流體分布器24的設計和方法包括大于柱管件20的名義內 徑的外徑，自此W后描述為過盈配合。
[0085] 當與圓筒柱管件20使用時，流體分布器24也必須是圓的，在外表面盡可能少（例 如，無)的非均勻性，來保證均勻引發環周張力和當壓配合入管件20時流體分布器24對管件 20的內壁表面的充分的不透液配合和密封。充分水平的均勻圓度或環形可W通過在機床上 旋轉流體分布器24輕易實現，但是本領域技術人員已知其他實現運種水平的均勻圓度的方 法。
[0086] 過盈配合的可接受水平由機械性質，即包圍管件20和流體分布器24的特定塑料/ 熱塑性塑料或復合物組分的彈性或流動性決定，因此，在聚丙締的情況下，管件20壁的厚 度，但是在所有的情況下，流體分布器24的外徑超過管件20的名義內徑W產生要求的過盈 配合W在將流體分布器24裝入管件20時保證令人滿意的引發環周張力。
[0087] 此種組合方式向新型層析柱提供了獨特的優勢。將由多個尺寸穩定的材料(鋼、玻 璃等)構造的常規柱設計為使得流體分布器24稍微小于柱管件，其對于允許此組分容易插 入和在柱管件內組裝時移動至希望的位置是必須的。在流體分布器24周圍使用0型環或類 似的密封結構W實現流體分布器24和管件20壁之間的不透液體的密封。在運些常規設計 中，具有比管件的內徑更小的外徑的流體分布器的組合和包括0型環的必要性必要導致了 稱為"死空間"的區域，該區域在流體分布器24和管件20的壁高至O型環坐落的點之間。運些 "死空間"很難曝露至柱流，因此造成柱清潔性和最終清潔度的風險。過盈配合的設計消除 或極大減少了常規柱的"死空間"從而最小化柱使用之間的污染物的攜帶。在一些實施方案 中，過盈配合也可W實現一起取消O型環，從而將柱的復雜程度、成本和由于密封失敗的整 體性風險最小化。此特征的另一個優勢在于減少將通過柱層析純化的有價值的產品曝露至 可從所述(通常是彈性體的）〇型環釋放的污染物，其需要昂貴并費時間的W可提取物和可 泄漏物的研究的形式的風險評估。
[0088] 如圖8所示，制造新型層析柱50的方法包括幾個步驟。
[0089] 首先，指定塑料柱管件20,其具有適宜的直徑和長度W容納最終柱需要的介質材 料的體積(802)，W及適宜的彈性，如本文其他部分所述的。管的長度應為最終柱中介質材 料的長度或"床高"的約兩倍。管件20的最終長度可W是約與內徑相同，例如，200和/或 199.90mm內徑管件20可具有最終長度約150至250mm，例如約200mm。還選擇沿管件每端的內 表面形成的凹槽。要求運種凹槽匹配并有助于插入流體分布器24使其裝入柱管件20內部。
[0090] 第二，應指定適宜尺寸的流體分布器24W具有稍大的外徑，例如，比管件(804)的 內徑r'ID")大約0.25 %，0.5至約1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或3.5 %。例如，對于具有內徑 199.90mm的聚丙締管件，流體分布器24應具有大于201.90mm的外徑r〇護），例如202和204、 202.5、203、203.5、204、204.5、205、205.5mm之間）。將流體分布器24設計為特定的名義OD使 其將在管件20壁引發足夠的環周張力。當選擇適宜的名義0D，考慮的關鍵因素包括構建材 料的物理性質(例如，摩擦系數、楊氏模量、彈性模量和屈服伸長)結合幾何尺寸包括柱管件 的ID和其壁厚W及流體分布器240D的公差。將組件壓配合到一起所需的力可由理論確定 (例如，通過先進的分析工具，如有限元分析)和作為替代方式，此種評估可W通過采用特定 構建材料的實證研究進行。
[0091] 在一些實施方案中，流體分布器可由與管件同樣的材料制成，W保證使用兼容性 和簡化流體分布器至管件內壁的固定，例如，焊接時固定。
[0092] 第S，如圖5所示，將第一（例如底部)流體分布器24b固定至管件20的第一端（例 如，底端）（806)。運可W通過任意已知的方式實現，或者可W使用本文描述的過盈配合方法 來幫助避免或減少任意與第一流體分布器關聯的死區域。例如，可W使用金屬夾、管件20內 的螺紋切割(或在內壁或在外壁上)和流體分布器周壁、粘合劑和各種類型的焊接將第一流 體分布器24b固定。要點是一旦將此第一流體分布器24b固定至管件20的第一端，該第一流 體分布器24b不需要移動。在一些實施方案中，第一流體分布器24b形成管件20的整體部分。 例如，可W使用已知技術將第一流體分布器模塑為管件20的特征。
[0093] 如果對于第一(例如底部)流體分布器使用過盈配合方法，可W通過引發環周張力 將其一開始定位在所希望的位置W提供在需要的壓力下的有效液壓密封，之后使用任意已 知方式(包括焊接、螺釘固定或粘合)將其永久固定在該位置。特別地，為了確定適宜的過盈 配合，將流體分布器24與管件的凹槽底端對齊，之后在流體分布器24上施加約IOOCUbf至 10,000化^例如1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000化門的軸向 力W使其裝入柱管件20，從而擴張管件的內徑。例如，當將流體分布器24插入管件20時，管 件20和流體分布器24都產生可塑性變性W-起配合，管件20的變形幅度大于流體分布器24 的變形幅度。
[0094]使流體分布器裝入管件所需的力取決于，例如形成于管件內的凹槽的角度，W及 特定于結合其幾何尺寸的（如上所述)構造的材料的其他物理性質的因素。例如，使第二流 體分布器裝入管件W建立管件內的過盈配合的軸向力是過盈配合、管壁厚度和管件特定機 械性能和流體分布器材料的函數。使流體分布器裝入管件的任一端所需的力可W通過測壓 元件或類似的拉力試驗儀測量，并應在每次組合時檢驗W確保流體分布器和管件壁之間充 分的過盈配合。使流體分布器裝入管件的軸向力必須大于并與管壁和流體分布器外周緣之 間的粘附和變形摩擦力產生的反向力相反。
[00M] W下等式1進一步描述了插入力。
[00%] F綱[|〉尸麵,插\+驗,變f=喃f,凈 （1)
[0097] 其中Fm加是克服與將流體分布器插入管件相反的摩擦力所需的軸向力，F??,m是 由于流體分布器和管壁材料之間的粘附的摩擦力，喃剪f是由于流體分布器和/或管壁的 變形的摩擦力，Fjs*,凈是凈摩擦力。如果需要，可W通過應用潤滑劑移除粘附摩擦力并從無 潤滑劑時插入流體分布器所需的總軸向力減去插入流體分布器所需的最終軸向力來區分 兩個相反的摩擦力。
[0098] 或者，可W確定使流體分布器裝入管件的最小軸向力W產生足夠的最終引發環周 張力。運種引發環周張力W徑向力起作用，其將流體分布器保持在管件內的特定位置。考慮 到熟知的過盈配合等式，導出表達式來代表對于所有管件和流體分布器尺寸的引發環周張 力。
[0099] 通過乘W流體分布器與管壁接觸的圓周面積，可W將引發環周張力與通過管壁施 加在流體分布器壁上的總徑向力關聯。W下等式2進一步將其解釋。
[0100] (2)
[0101] 其中F;前是圍繞管件壁均勻分布沿徑向向內作用于流體分布器壁的徑向力，As觸fd 是流體分布器與管壁接觸的面積。可W進一步看出此徑向力與流體分布器和管件內壁之間 的垂直摩擦力Fjs*,凈直接關聯。因此，可W將克服摩擦力將流體分布器裝入管件所需的力 F獅n與將流體分布器保持在管件內部希望位置的引發環周張力町邸巧關聯。W下等式4、5和6 進一步描述了運種關系。
[0102]
[0103]
[0104]
[0105] (5)
[0106] 其中胃是流體分布器材料和管壁材料之間的摩擦系數。
[0107] 作為此關聯的結果，只要實證檢驗可W保證給定的引發環周張力將提供防漏密封 到推薦的最大操作壓力，例如2X、3X或4X W上的足夠的安全因素，可W確保，并在與測壓 元件或類似設備組合時檢測，柱的充分的操作壓力。重要的是注意灰塵、濕度、氧化膜、表面 拋光、滑動速度、溫度、振動、柱和流體分布器壁污染范圍可W使摩擦系數胃的值變化，從 而影響記錄的插入力。在試圖減少此錯誤時，推薦在穩定的、可重復的制造/實驗室環境，即 干凈的室內進行所有的確定精確摩擦系數(胃)和之后W實現所需引發環周張力的應用負 載(F施ra)的初始測試。最后，優選的是設備具有非常少的灰塵、低的濕度、最小的UV光線（其 可影響材料的機械性能）、最小的振動、恒定溫度(接近室溫條件）、低程度污染和恒定的插 入速度。
[0108] 此外，使用W下等式確定在形成的過盈配合上的表面拋光的量級并且顯示在整個 過盈配合上表面拋光(對于我們的情況中的材料)是可W忽略的。
[0109] Seff = Sini;-A 5 (6)
[0110] 其中Seff是有效過盈，A S是考慮到內管壁的表面拋光和流體分布器的圓周表面的 測量過盈的修正。
[0111] A5 = 〇.l(2)(Rz^+Rz'fd) (7)
[0112]其中，Rz,部是管件內壁的表面拋光，Rz,fd是流體分布器的外壁的表面拋光。
[0113] 為了保證充分的引發環周應力來包含此壓力，可W首先進行試驗來形成流體分布 器和管壁之間的過盈量之間的關系W避免高至一定壓力的泄漏。等式（1)顯示引發環周張 力直接與產生流體分布器和管壁之間的防漏密封有關。假設恒定的管件和流體分布器材 料，=個主要的變量將對引發環周張力的量級有貢獻:過盈配合Sint、管件的外徑Dl件0和流 體分布器的外徑化d。一旦選擇了運些值中的兩個，改變第=個變量將允許測試針對泄漏的 內壓的插入流體分布器的施加力Fj咖的幾種情況。一旦在沒有任何泄漏穿過流體分布器時 獲得充分的內壓，可W使用施加力的值倒退計算包含所需壓力所必需的引發環周張力。一 旦發現對于一定層析柱尺寸(管的內部參數)所必須的引發環周張力，只要運些變量最終獲 得同樣的最終引發環周張力值，可W再次改變對引發環周張力有貢獻的=個主要變量W優 化設計。
[0114] 圖9a和9b示意表示了當將流體分布器24初始裝入管件20在其抵達凹槽22之前產 生的力的自由體圖。因為流體分布器24首先進入管件20,管件20還沒有膨脹。流體分布器24 和管20壁之間的過盈將使管20擴大而使流體分布器24壓縮。由于管件20的壁厚小于流體分 布器24的直徑和厚度，總的凈壓力將導致管壁的擴張(注意流體分布器24可相應經歷微量 壓縮）。為了運種現象發生，軸向的力必須足夠大W克服由于引發環周張力產生的力。軸向 力來自直線驅動器，水平或徑向力來自引發環周應力。軸向力簡單克服了摩擦力。摩擦力直 接與來自引發環周的力的值相關。
[0115] 圖IOa和IOb示意顯示了當流體分布器24穿過凹槽22之后使其沿著管件20的軸向 長度前進產生的力的自由體圖。雖然軸向力的一些組分有助于擴張管件20,壓力分布在3-5 個遠離流體分布器24和管件20之間的初始接觸點的特有維度上并且管件20已經在流體分 布器24之前擴張。因此，隨著流體分布器24沿著管件20的長度進一步軸向插入，推動流體分 布器24的軸向力大于克服不僅發生在與流體分布器24接觸的點，還發生在流體分布器24之 前的3-5個特有維度的更高的環周張力。在一些實施方案中，凹槽開始于管壁的最后并且例 如可W沿著管件的整個長度延伸。
[0116] 圖11顯示表明了在一個實施方案中，隨著流體分布器24進入管件20，將流體分布 器24壓入管件20所需的軸向力的圖。如所示，當流體分布器24的第一部分進入并穿過管件 凹槽22的初始處時，力開始增加到峰值。開始時，流體分布器24和管壁經歷靜摩擦并且克服 該靜摩擦的力是最大的。一旦流體分布器24和管20壁的變形使流體分布器24滑入管件20， 由于其經歷動力學摩擦，將流體分布器24繼續壓入管件所需的力下降。動力學摩擦遠比靜 摩擦易克服。在此圖中還出現了兩個額外的峰。第一個峰在約2 Imm，對應當凹槽22的底部在 流體分布器24的O型環凹槽26內（如圖12所示）。第二個峰對應的點是當整個流體分布器24 曬合在凹槽外的管件20的區域中。如所示，在此實施例中，最大軸向力是約1200-130(Ubf。
[0117] 對于某些實施方案，可W通過使用設置在流體分布器24的外壁中的0型環凹槽26 中的0型環改進密封。在某些實施方案中，壓配合或過盈配合足W將流體分布器保持到位， 但是在其他實施方案中，需要更持久的結合。
[0118] 一旦流體分布器24已經裝入管件的第一（例如，底）端約1至IOcm,例如6.0、6.5、 7.0、7.5、8.0或8.5cm，可W將流體分布器24永久固定到位，例如通過焊接，例如如果流體分 布器24和管件由相同或充分類似的材料制成。可W使用各種焊接技術來形成流體分布器和 柱管件之間的焊接，包括但不限于熱工具焊接、熱氣焊接(例如在42(TC)、超聲波、擠壓、激 光、傳導、高頻等。如果兩個部件由不同的材料制成，可W使用機械夾將其連接，如金屬軟管 夾，外部施加W壓縮管件并施加將流體分布器在該位置錯定入管件的力，或通過粘合劑或 通過穿過管壁進入流體分布器的機械固定件。
[0119] 第四，入口和出口配件38a、38b連接至第一(例如底部)和第二（例如頂部)流體分 布器24a、24b (808)。入口和出口配件38a、38b具有梓入頂部和底部流體分布器24a、24b的螺 紋配件孔26的螺紋區域40。可W在每個配件的底端（即，與流體分布器配合的一端)或在流 體分布器的螺紋配件孔26的末端形成凹進(例如，0型環密封壓蓋）。在此實例中，0型環設置 于配件38和流體分布器24之間W形成當其通過螺紋結合時配件38和流體分布器之間的密 封(例如，不透液體的密封）。可W使用轉矩扳手來保證0型環的充分壓縮W產生在此界面的 充分密封。
[0120] 接著，W液體漿料形式的填料在底部流體分布器24bW上的空間（腔室)裝載入柱 管件 20(810)。
[0121] 接著，如圖6和7所示，一旦第二（例如頂部)流體分布器24a垂直加入管件(并任選 地已經連接至液體源），當使用過盈配合方法時，將其W如插入第一流體分布器24b的基本 相同的方法插入管件20(812)。重要的是對于第二流體分布器使用過盈配合方法，因為此第 二(例如，頂部)流體分布器24a裝入管件20的初始位置不應被立即固定，因為有可能在測試 之后需要重新調整第二流體分布器的初始位置。因此，使用過盈配合方法，從而使第二（例 如，頂部)流體分布器24a可W在管件20內移動W做最終的調整。同樣重要的是設計并實施 過盈配合使其在測試柱期間使用的壓力下保證不透液體的密封。
[0122] 在此，使用適于特定介質的方法，例如具有適宜配制的溶液（"流動相"或"包裝緩 沖液"）的流體或從柱出口配件38b施加的抽吸、或任意其他已知的適宜技術或方法，可W將 填料靈活地裝入填充床。可W通過向流體分布器施加額外的軸向力直到其接觸填料并可W 壓縮填料至達到希望的位置，將第二(例如，頂部)流體分布器進一步裝入管件。取決于填料 的性質，所述壓力的范圍可W從無到填充床高的30%或W上。W通過肥TP(理論塔板當量高 度)測試和不對稱分析測量的柱性能將部分是床壓力的函數。如果適宜，也有可能將插入的 流體分布器24a朝管件的末端移出W降低床壓。運使用通過施加至第一和第二流體分布器 之間產生的腔室內的液體的力的流體靜壓實現。由于將第一流體分布器24B永久固定，一旦 通過柱管件內的液體施加針對它的足W克服壓配合的力，使用壓配合固定的第二流體分布 器24A將移動。
[0123 ] 接著，可W通過未保留的和已經可檢測的測試件(例如，通過UV監控的丙酬或通過 電導監測的氯化鋼）的注射脈沖檢測柱填料的適宜性(818)。基于填充測試的結果，頂部流 體分布器24a可W進一步向下進入(例如，可W被推入)填充床并且可W重復填充測試。如果 頂部流體分布器移入管件過深，可導致過度壓縮填充床，液體將通過入口配件被迫進入腔 室，出口配件密封關閉，從而使用液壓將頂部流體分布器24a沿著管件的頂端移動回去并減 少填充床的壓縮。一旦確定柱填料的適宜性，之后可W將柱消毒和/或用按照最終用戶指定 的抑制細菌的保護液沖洗。
[0124] 當第二(例如，頂部)流體分布器24a適當定位時，可W將其例如通過焊接或其他如 上所述的用于固定第一流體分布器的方式，永久固定(818)。在一些實施方案中，過盈配合 可W滿足將頂部(或第二)流體分布器24a固定至管件20的內壁。
[0125] 在一些實施方案中，可W之后用頂蓋、底座和/或側護板裝配填充的最終層析柱。 可將層析柱經過最終的殺菌并用于運送或包裝后運送。
[01%]使用方法
[0127] 本文描述的系統和方法提供給最終用戶一次性、預先填充的、預先通過審核并且 無菌的層析柱，其在性能上與其他通常存在于需要大量基本費用的持久硬件裝置的層析柱 具有可比性。新型無菌柱的使用方法與其他已知的層析柱相同，但是考慮到一次性和無菌 性，新型柱對于分離和純化有毒或另外有危險的試劑(例如病毒、病原體和毒素)是特別有 用的。此外，可W使用運些無菌柱而不用害怕經常發生在再次使用柱或沒有有效清洗柱時 的污染。例如，運些無菌柱可用于其中要求高水平的微生物控制時的無菌連續過程和多產 品設備。
[0128] 新型無菌柱可用于一次性體系中和多柱層析體系中。也可W通過無菌連接將新型 無菌柱連接至無菌體系。
[0129] 在一些用途中，可W將柱用各種具有兩種或多種不同SpA分子的親和捕獲介質預 先填充。
[0130] 實施例
[0131] 在W下實施例中進一步描述本發明，W下實施例不限制權利要求所描述的發明的 范圍。
[0。。實施例1- T福射對壓力容限的影響
[0133] 本實施例的目的在于確定本文描述的新型滅菌方法在塑料層析柱和其部件上的 影響。本測試設及不包含任何填料的組合層析柱的福照，W及層析柱部件的福照，W檢測丫 福射在每個元件的壓力容限上的影響。
[0134] 柱材料-OPUS?層析柱(Repligen公司)
[01巧]參14cm流體分布器
[0136] ?Hem床載體-聚丙締網
[0137] ^Hcm流體分布器0型環 [013引 ?端口 0型環（小0型環）
[0139] 參入口端口
[0140] 參端口夾
[0141] 參端口塞
[0142] 參14畑1擠出聚丙締管件
[0143] 方法
[0144] 通過滅菌承包公司，Steris公司，其在他們的Isomedix Services商業 (Northborough，MA)上提供承包滅菌服務，用25kGy的希望的目標，在15-40kGy之間的劑量 的丫福照層析柱元件。實際傳輸的劑量在21.3-25.3kGy之間。Steris Corp.使用從同位素 源(鉆60)發射的高能光子W產生穿過預先填充的柱的離子化（電子干擾）。在活細胞中，運 些干擾導致DNA和其他細胞結構的破壞。運些分子水平的光子引發的變化導致生物體的死 亡或使生物體不能繁殖，因此提供所希望的殺菌。
[0145] 對于福照之后的測試，將柱連接至用水填充的壓力箱。可W使用外部惰性氣體箱 將壓力箱加壓至高達l(K)psi(7己）。首先用水將柱填充，之后使柱經過升壓。將壓力計連接 至柱的入口W監控測試中的壓力升高。
[0146] ^
[0147] 將非福照的新型層析柱確定為最大壓力是4己。福照的柱沒有將頂部接合器焊接， 因此，預期其承受的最大壓力小于4己。
[0148] 頂部流體接合器直到壓力達到5.5己才移動。在5.5己下，頂部流體接合器開始緩 慢上移，直到其可W完全從柱移除。本測試表明福照柱具有與非福照柱相當的壓力容限。
[0149] 實施例2- 丫福射對可泄漏物和可提取物的影響
[0150] 本實施例的目的在于確定用通過T福照殺菌的層析柱的材料的兼容性。在本實施 例中，確定丫福射對來自柱部件的可泄漏物和可提取物的影響。
[0151] 柱材料-OPUS?層析柱(Repligen公司)
[0152] ^Hcm流體分布器-加工模塑的聚丙締
[0153] 參14cm床載體-聚丙締網
[0154] 參14cm流體分布器0型環-銷硫化娃橡膠(platinum cured silicone)
[0155] ?端口 0型環(小0型環)-銷硫化娃橡膠
[0156] ?入口端口-加工的聚丙締
[0157] 參14畑1擠出聚丙締管件 [015引方法
[0159] 如W上實施例1描述的，通過ST邸IS Isomedix(Nod^orou曲，MA)，用希望的目標 25kGy，在15-40kGy之間丫福照OPUS?層析柱元件。實際傳輸的劑量在21.3-25.3kGy之間。
[0160] 柱材料，福照的和非福照的，均分別在37°C浸泡在20%乙醇和水中72小時。在培養 期的末期，通過反相HPLC分析上清液。
[0161 ] 用于檢測可泄漏物和可提取物的HPLC方法：
[0162] -HPLC柱YMC Cl8-3皿，12nm
[0163] -緩沖液A:水中0.1 % TFA
[0164] -緩沖液B:乙臘中0.1%TFA [01 化]-流速 ImL/min
[0166] 表1:用于檢測可泄漏物和可提取物的HPLC方法
[0167] LUlOOJ 巧術
[0169] 參照圖14A-J，對于非福照和福照的柱部件，在20%乙醇中存在比在水中稍高水平 的可泄漏物和可提取物。所述圖顯示出在塑料制品經過福照之后，沒有明顯的可泄漏物和 可提取物存在。樣品之間可見的變化性在統計上不明顯。
[0170] 在20%乙醇中，所有檢測的柱部件顯示福照后比非福照的部件更低水平的可提取 物。在水中，柱體具有的福照后可提取物的水平稍高，但是差別在統計上不明顯。在水中福 照后，床載體顯示更高水平的可提取物。但是，整體變化甚微。在福照樣品中，一些化合物峰 下降，或完全消失，可能由于來自于丫福照的交聯。
[0171] 實施例3- T福射對物理外觀的影響
[0172] 本實施例的目的在于檢測丫福射對組合層析柱的物理外觀的影響。
[0173] 柱材料-OPUS?層析柱(Repligen公司)
[0174] 參14畑1流體分布器-加工模塑的聚丙締 [01巧]參14cm床載體-聚丙締網
[0176] ?Hem流體分布器0型環-銷硫化娃橡膠
[0177] ?端口 0型環(小0型環)-銷硫化娃橡膠 [017引參入口端口-加工的聚丙締
[0179] 參端口夾
[0180] 參端口塞
[0181] ^Hcm擠出聚丙締管件
[0182] 方法
[0183] 如實施例1 描述的，通過STERIS Isomedix(Northborough)MA)，用25kGy的希望的 目標，在15-40kGy之間丫福照組合的空OPUS?層析柱。實際傳輸的劑量在21.3-25.3kGy之 間。
[0184] 結果
[0185] 如圖13所示，與非福照的柱相比，福照的聚丙締柱具有近白色/黃色的色彩，但是 還是完整的。
[0186] 實施例4- T福射對機械性能的影響
[0187] 本實施例的目的在于檢測T福射對色譜柱管件機械性能的影響。具體地，目的在 于導出應力對應變曲線。拉伸屈服強度、屈服伸長、斷裂拉伸應力、斷裂伸長和彈性模量都 能從此曲線上找到。
[0188] 柱材料-OPUS?層析柱(Repligen公司)
[0189] 參14畑1擠出聚丙締管件
[0190] 方法
[0191 ]通過ST邸IS Isomedix(Northborough)MA)，用希望的目標是25kGy的 丫福照，在 15-40kGy之間丫福照OPUS?層析柱管件。實際傳輸的劑量在21.3-25.3kGy之間。
[0192] 福照之后，Intertek Pll(PittsfielcUM)根據ASTM D638-10進行拉伸試驗。準備 (從柱管件切出）并檢測五個非福照純擠出的PP管件樣品和五個福照的、擠出的PP管件樣 品。W下列出具體參數。
[0193] 樣品制備
[0194] 通過Inte;rtek ?化加工
[0195] 樣品類型
[0196] ASTM 1型拉力試棒
[0197] 樣品尺寸
[019引 0.500" XO. 125"(平均）
[0199] 十字頭速度
[0200] 50mm/min
[0201] 伸縮儀
[0202] 基于50mm標準長度的160%。符合實踐的最低要求
[020；3] E83:模量(類別B-2)/伸長(類別C)
[0204] 條件
[0205] 在 23°C±2°C/50%±10% 畑下 40+小時
[0206] 實驗條件
[0207] 23°C±2°C/50%±10% 畑 [020引緝里
[0209] 結了從運一系列試驗中獲得的數據。圖15和16顯示了純的和福照擠出的PP 管件之間可W忽略的差別。所有的樣品經歷看上去非常類似的彈性變性區域，其通過圖16 所示的第一最小值至最大值表示。在屈服之后，在應力的每個遞增變化，福照樣品傾向于拉 伸得稍多，其會為較堅初材料的特征(高至斷裂的曲線W下的區域），但是僅有的相關材料 包含在曲線的彈性區域，因為塑料在組裝中不會經歷永久變形。將所有的過盈設計為使得 材料不會經歷任何彈性變性。值得注意的是，由于處于拉力或壓力，材料隨時間將經歷輕微 蠕變，運是塑料的正常物理性質。
[0210] 表2對比了純的和福照的擠出PP管件的作為圖16的分析結果的最終工程性能。兩 個樣品都經過同樣的屈服伸長，而福照樣品實現稍大的拉伸屈服強度，140PSI。運小于總拉 伸屈服強度的3%，因此可W將其視為最小因子，特別是當考慮到純的和福照的樣品的標準 偏差分別是35PSI和49PSI。彈性模量，其通過在彈性變形區域內的應力對應變曲線的斜率 表示，對純的樣品，福照樣品是高于20,000PSI。高彈性模量表示更有彈性的材料，因此，材 料可W吸收更高量級的能量并仍然回到其初始形狀。該材料的回彈通過W下等式表示。
[0211]
[0212]其中，Ur是回彈模量，O是應力，墻應變，Ey是屈服應變的值。
[0213] 總而言之，兩種材料都顯示非常類似的彈性變形，但是福照樣品被認為比非福照 純樣品更有回彈力。運表示福照樣品會需要比非福照純樣品略大的壓力來到達實現屈服點 的應變的量級。
[0214] 表2.純的和福照的擠出PP管件的拉伸性能分析
[0215]
[0 恤|/」 頭她WO- 丫巧奶X了機娜性昵的駭啊
[0218] 本實施例的目的在于檢測丫福射對層析柱管件機械性能的影響。具體地，目的在 于導出應力對應變曲線。彎曲應力和5%應變和彎曲模量都能從此曲線上找到。
[0219] 柱材料-OPUS?層析柱(Repligen公司)
[0220] 參14畑1擠出聚丙締管件。
[0221] 方法
[0222] 如在實施例1 所述，通過STERIS Isomedix(Northborough)MA)，用25kGy的 丫福照 的希望的目標，在15-40kGy之間丫福照OPUS?層析柱管件。實際傳輸的劑量在21.3-25.3kGy 之間。
[0223] 福照之后，Intertek Pll(PittsfielcUM)根據ASTM D790-10進行彎曲試驗。準備 (從柱管件切出）并檢測五個純擠出的聚丙締管件樣品和五個福照的、擠出的聚丙締管件樣 品。W下列出具體參數。
[0224]樣品制備
[02巧]通過Intedek ?化加工
[02%]樣品類型
[0227] ASTM彎曲試棒
[0。引樣品尺寸
[0229] 0.500" XO. 125" X5"(平均）
[0230] 十字頭速度
[0231] 0.054in/min
[0232] 跨度距離
[0233] 2.016in
[0234] 伸縮儀
[0235] 基于50mm標準長度的160%。符合實踐的最低要求
[0236] E83:模量(類別B-2)伸長(類別C)
[0237] 跨厚比
[0238] 16±1:1
[0239] 載體半徑
[0240] 〇.197in
[0241 ]負載鼻半徑（Radius of Loading Nose)
[0242] 〇.197in
[0243] 條件
[0244] 在 23°C±2°C/50%±10% 畑下 40+小時
[0245] 實驗條件
[0246] 23°C±2°C/50%±10% 畑
[0247] ^
[0248] 圖17顯示了純的和福照擠出的PP管件之間可W忽略的差別。在所有樣品上進行S 個點的彎曲試驗高至6%的應變，福照樣品在與純的樣品拉伸同樣距離時需要稍高的壓力。
[0249] 表3對比了純的和福照的擠出PP管件的作為圖17的分析結果的最終工程性能。又 如預期的，福照樣品經歷比純的樣品稍高的彎曲模量，其表示擠出的PP管件在引入福射之 后變得稍微更有回彈性。
[0250] 總而言之，如圖17所表示的，在純的和福照的樣品之間存在非常微小的差別。在經 過福照之后，福照的樣品變得稍微更有回彈性。表3支持了之前所述的假設。
[0251] 表3.純的和福照的擠出PP管件的彎曲應力性質
[0 巧 2]
[0 巧 3]
[0254] 實施例6- T福射對機械性能的影響-流體分布器0型環
[0255] 本實施例的目的在于檢測丫福射對層析柱硅膠0型環的機械性能的影響。具體地， 目的在于導出對于每種材料應力對應變曲線。斷裂拉伸強度和斷裂伸長都能從此曲線上找 到。
[0巧6] 柱材料
[0257] ^Hcm流體分布器0型環
[0258] ^Hcm擠出聚丙締管件 [0巧9] 方法
[0260] 通過ST邸IS Isomedix(Northborough)MA)，用25kGy的 丫福照的希望的目標，在 15-40kGy之間丫福照具有流體分布器和0型環的組合的OPUS?層析柱管件。實際傳輸的劑量 在 21.3-25.3kGy之間。
[0261] 福照之后，Intertek ielcUMA)根據ASTM D412-06a進行拉伸試驗。準 備并檢測兩個純硅膠0型環樣品和兩個福照硅膠0型環樣品。將測試的0型環從經歷福照過 程的組合柱移除。如此，0型環在延長的時間段內處于拉力和壓力下并在福照過程中處于拉 力和壓力下。從庫存中取出純的0型環W也用于檢測。W下列出具體參數。
[0262] 樣品制備
[0263] 通過Inte;rtek ?化切割
[0264] 樣品類型
[02化]O型環部件 [0266]十字頭速度 [0%7] 20in/min [026引伸縮儀
[0269] 基于1.0"標準長度的1000 %
[0270] 條件
[0271] 在 23°C±2°C/50%±10% 畑下 40+小時
[0272] 實驗條件
[0273] 23°C±2°C/50%±10% 畑
[0274] ^
[0275] 圖18表示對于非福照純的和福照硅膠0型環的應力對應變的曲線。實驗之前，從庫 存中取出非福照的純的0型環，與從經過福照的組合柱移出的福照的樣品相比。換言之，福 照的樣品經歷了管壁和流體分布器之間的壓力（約20%壓力)和拉力(拉伸W配合流體分布 器內的0型環密封壓蓋），其可能有助于材料的一些內部蠕變。內部蠕變將產生稍長的樣品， 其不會伸長到屈服，其在圖17中顯明。福照樣品還具有更睹峭的彈性區域(彈性模量），更高 的屈服和斷裂應力，和更低的斷點應變(strain to break point),其都明顯表示稍硬且更 具回彈性的材料。福射和初始壓力/拉力的組合使得福照樣品稍微比純的硅膠0型環更具回 彈性并更硬。表4支持了之前所述的假設。
[0276] 表4.福照和非福照硅膠0型環的拉伸強度分析
[0277]
[
陶]實施例7- T福射對機械性能的影響-流體分布器0型環
[0280] 本實施例的目的在于檢測丫福射對層析柱硅膠0型環的機械性能的影響。具體地， 目的在于導出對于0型環樣品的硬度值。
[0281] 柱材料-OPUS?層析柱(Repligen公司)
[0282] ?Hem流體分布器0型環
[0283] 方法
[0284] 如實施例1所示，通過ST邸IS Isomedix(Northborough)MA)，用25kGy的丫 福照的 希望的目標，在15-40kGy之間丫福照OPUS?層析柱流體分布器0型環。實際傳輸的劑量在 21.3-25.3kGy之間。
[0285] 福照之后，Intertek PllXPittsfield,MA)根據ASTM 02240-05(2010)進行硬度試 驗。準備并檢測五個非福照的純硅膠0型環樣品和五個福照硅膠0型環樣品。W下列出具體 參數。
[0286] 樣品制備
[0287] 通過Intedek P化從0型環剖面切割 [0巧引縮進（indention)時間間隔
[0289] 1秒
[0290] 使用的硬度計壓頭
[0291] A
[0292] 條件
[0 巧 3]在 23。[±2。(：/50%±10%畑下40+小時
[0294]實驗條件
[0 巧 5] 23°C±2°C/50%±10% 畑
[0296] ^
[0297] 表5對比了純的和福照的硅膠0型環的硬度等級。通過硬度計單位描述材料的硬 度，假設恒定力，其代表特定儀器壓入材料的距離。例如，按照ASTM D2240類型A規模進行運 些試驗，其指定硬化鋼桿，直徑1.1-1.5mm，具有截斷的35°錐。錐的尖端用8.064N的力壓入 來自0型環的切割樣品。錐的尖端可W延伸至0-2.54mm的任意處，取決于材料的硬度。如果 尖端行進2.54mm，材料將具有0邵氏A硬度，相反地，如果尖端行進Ornm,材料將具有100邵氏A 硬度。
[0298] 福照樣品具有73邵氏A硬度而非福照純硅膠0型環具有77邵氏A硬度。供應商表示 硅膠0型環具有75邵氏A硬度，因此福照和非福照的純樣品都是從平均值偏離2標準偏差，可 W將其忽略，因為存在與此試驗相關的±5的誤差。
[0299] 表5.福照和非福照硅膠0型環的硬度分析
[0300]
[0301] 實施例8- T福射對填充有瓊脂糖介質的OPUS?柱的影響
[0302] 本實施例的目的在于確定填充床的流動性能是否會在T福照后變化。
[030引 材料和方法
[0304] 用Se地arose ehst Flow介質（通用電子醫療）填充OPUS?柱（R邱Iigen公司）至尺 寸為20cm內徑（id) X 20cm床高(BH)。進行初始測試，之后將柱在ST邸IS(Nod^orou曲，MA) 用36.3kGy和39.9kGy之間的劑量丫福照之后再次測試。
[0305] 對于該測試，理論塔板、不對稱性和壓力在lOOcm/hr下確定。在將1 %柱體積脈沖 的10%的丙酬溶液注入柱之前，在3個柱體積的IOOmM NaCl中平衡該柱。
[0306] 擊《 W垃瞄寸?前麻1寸?巨化枯右由於tW：臺b居
[0307]
[030引結果
[0309] 對于丫福照柱的填充床的理論塔板數的數量、不對稱性和壓降下降的變化每個都 小于20%。結果表明用瓊脂糖介質如S邱harose 6FF填充的20cm IDX20cm BH OPUS柱的整 體性在滅菌劑量的丫福射之后仍然完整。
[0310] 實施例9- 丫福射對結合力的影響
[0311] 本測試的目的在于確定丫福照之后各種填料的功能性水平。檢測用蛋白A功能化 的二氧化娃和瓊脂糖介質。使用在靜態結合力（SBC)和動態結合力(DBC)模式中的人多克隆 IgG化IgG)的能力評定丫福照在運些親和填料上的功能性影響。
[0312] 遞
[0313] 二氧化娃介質，Davi站晚(W.R.Grace)和S邱ha;rose?4Fast Flow特征用重組蛋白 A，rSPA(Repligen公司）使用還原胺化化學法固定。用不同的蛋白A配體，MB4(Repligen)也 將同樣的介質固定。MB4是包括四個B域的多聚體重組蛋白A配體，每個都具有G29A突變。用 rSPA固定的S邱harose 4FF通過1?6口11旨6]1公司在化口1:;[￥4了啤；1"11曰6了^商品名下出售。將所有 的介質樣品都儲存在20%乙醇溶液中。一半的固定樣品作為對照保存，另一半郵寄到 STERIS(Nodliborou曲，MA)進行 丫福照（28.6-33.5kGy)。
[0314]將100山體積的每種介質現慢入1.5ml離屯、管并用Iml憐酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗3 次W平衡介質。向介質中加入1 .Oml的lOg/L的IgG( Sera化re)并允許上下顛倒混合30分鐘。 解育后，介質用1.Oml PBS清洗5次。之后通過加入IOml的IOOmM憐酸鹽，pH2.8，洗脫hIgG。通 過在280皿的UV測量確定洗脫液中的hIgG的量。通過將UV280結果乘W100然后除W消光系 數1.3,計算結合力(g IgG/L介質）。
[0別引 IgG動態結合力
[0316] 將每種介質約3.42ml量填充入柱，形成IOcm的床高(Omnifit,0.66cm ID)。每個柱 用PBS在2.Oml/min的流速下使用AKTAE邱Iorer F化C(通用電子醫療)填充。在PBS中將IgG (SeraCare)稀釋至2.2mg/ml之后W提供的3分鐘停留時間的流速上柱。在5%hIgG穿透下確 定結合力。
[0317] 緝里
[031引結果在表7中顯示。
[0319]表7. Y福照之前和之后的蛋白A層析介質的結合力
[0320]
[0321]
[0322] 運些結果顯示了丫福照之后填料功能的百分比在非福照對比樣品的66.0和 90.0%之間。如果施加高水平的丫福照(28.6-33.5kGy)，運個結果意外地高。運些數據還顯 示了在所有的檢測介質中，保留了大于65%的初始力并且在某些情況下，保留了大于80% 的力。運種性能將從每升福照的蛋白A介質純化20g至4?抗體產品并因此支持蛋白質純化 過程。
[0城]實施例10-介質保護液組合物在丫福射中有關于結合力的影響
[0324] 本測試的目的在于確定填料保護液的組合物在丫福照中是否對于曝露之后的功 能能力具有影響。將用蛋白A功能化的瓊脂糖介質在多種不同溶液中丫福照。W動態(DBC) 模式的人多克隆IgG化IgG)的能力用于評定在動態結合試驗中丫福射對運些親和填料的性 能的影響
[0325]
[0326]將化PtivA?PriMab?(用rSPA固定的S邱harose 4FF，Repl igen公司）蛋白A介質的 13個20ml樣品洗入13種不同溶液。在50%漿料濃度下制備每一20ml樣品。將13個樣品中的 每一個寄送至ST邸IS(Ncxrt化orou曲，MA)用于40kGy劑量的目標丫福射。實際傳輸的劑量在 36.3kGy和39.9kGy之間。丫福照之后確定每個的DBC。
[0扣7] IgG動態結合力
[0328] 將每種介質約Iml量填充入柱(XK5,0.5cm ID)。每個柱用PBS在Iml/min的流速下 使用AKTA E邱Iorer F化C(通用電子醫療）填充。在PBS中將hlgG(SeraCare)稀釋至2.2mg/ ml之后W提供6分鐘停留時間的流速上柱。在10%hIgG穿透下確定結合力。
[0329] 緝里
[0330] 結果在表8中顯示。
[0331] 表8.在不同溶液中丫福照的蛋白A層析介質的結合力
E。。。。"I
[C
[0334]結果表明其中蛋白A介質經過丫福照的溶液對功能能力具有主要影響。在純去離 子水中，功能能力降低為原始的<10%。之前的實施例顯示在20%乙醇中在28.6-33.5kGy之 間的劑量下福照之后，結合力〉對照的65%。運表明脂肪族伯醇可有利于保持包含蛋白A分 子的親和介質的性能。在此實驗中，用存在于20%的乙醇溶液中的200mM抗壞血酸獲得了類 似的結果。
[0335] 出人意料的，在含有2%苯甲醇的溶液中福照的介質，其不含有醋酸鹽或乙醇，保 留了所有的功能結合。運證明了在T福射曝露期間，芳族醇的存在可提供保護優勢。存在醋 酸鹽的樣品在抑6不如在P冊穩定，但是與純水相比，其每一個都保留了更多的能力。在醋酸 鹽樣品中抗壞血酸的存在隨著濃度的升高提供了適度的保護作用。
[0336] 其他實施方案
[0337] 應理解當本發明已經結合其詳細說明來描述，之前的描述意為解釋而不是限制本 發明的范圍，本發明通過所附權利要求的范圍限定。其他方面、優勢、實施方案和改變都在 W下權利要求的范圍之內。
【主權項】
1. 一種制備無菌填充層析柱的方法，所述方法包括： (a) 選擇管件； (b) 將填料加入所述管件并封閉所述管件的兩端以形成填充柱;和 (c) 用一劑量從至少8kGy至約40kGy的γ福射福照所述柱以形成無菌填充層析柱。2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述層析柱包括所述管件、第一流體分布器和第二 流體分布器，并且其中所述管件、第一流體分布器和第二流體分布器各自由相同或不同的 塑料材料制成。3. 根據權利要求2所述的方法，其中所述塑料材料包括聚丙烯、聚乙烯、聚酰胺、縮醛 類、玻璃填充塑料類、碳填充塑料類、玻璃纖維塑料類或碳纖維塑料類或碳纖維塑料類。4. 根據權利要求1至3任一項所述的方法，其中所述填料包括瓊脂糖、二氧化硅、陶瓷或 丙烯酸酯的聚合物或纖維素基材料。5. 根據權利要求1至4任一項所述的方法，其中所述填料用以下一種或多種功能化:離 子交換基團；具有疏水和帶電性能的多元基團；金屬螯合基團；疏水基團；或能結合至免疫 球蛋白IgG的葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽。6. 根據權利要求5所述的方法，其中所述離子交換基團包括一種或多種季胺、硫酸鹽和 羧酸鹽。7. 根據權利要求5所述的方法，其中所述疏水基團包括一種或多種丙基、辛基和苯基基 團。8. 根據權利要求5所述的方法，其中所述SpA多肽包括全長野生型SpA，重組SpA，包括選 自SpAi或A、B、C、D、E或Z的SpA域的單體SpA多肽，或包括以選自SpA域A、B、C、D、E或Z的任意組 合的任意兩個、三個、四個、五個或更多SpA域的多聚體SpA多肽，或其功能等價物。9. 根據權利要求8所述的方法，其中所述SpA多肽包括多聚體SpA多肽。10. 根據權利要求9所述的方法，其中所述多聚體SpA多肽包括四或五個選自SpA域B、C 和Z的SpA域。11. 根據權利要求10所述的方法，其中所有的SpA域是相同的。12. 根據權利要求11所述的方法，其中所述多聚體SpA多肽包括五個SpA域C。13. 根據權利要求1至12任一項所述的方法，進一步包括向柱中的填料加入保護液，其 中所述保護液包括〇. 1至25.0 % (體積/體積)的醇。14. 根據權利要求13所述的方法，其中所述保護液包括0.1至5.0% (體積/體積）的醇， 并且其中所述醇包括芳族醇。15. 根據權利要求14所述的方法，其中所述芳族醇包括苯甲醇。16. 根據權利要求13所述的方法，其中所述保護液包括2.0至25.0% (體積/體積)的醇， 并且其中所述醇包括脂肪族伯醇。17. 根據權利要求16所述的方法，其中所述脂肪族伯醇包括乙醇。18. 根據權利要求1至17任一項所述的方法，其中封閉所述管件的兩端包括 向所述管件的一端插入略大于所述管件的流體分布器以形成一端的過盈配合； 向所述管件加入填料;和 插入另一個流體分布器以形成所述管件內的介質的填充床。19. 根據權利要求1至18任一項所述的方法，其中所述γ輻照的劑量包括至少8、10、15、 20、25、30、33、35S40kGy。20. 根據權利要求1至19任一項所述的方法，進一步包括在γ輻照之前在氣密和水密容 器內密封所述柱。21. 根據權利要求20所述的方法，進一步包括在γ輻照之前在第二氣密和水密容器內 密封所述柱以提供雙層封裝。22. -種無菌填充層析柱，其包括： (a) 具有兩端的無菌中空管件;和 (b) 在所述管件內的無菌填充層析介質，其中所述管件在兩端封閉以形成填充柱;并且 其中所述填充柱具有的無菌保證水平(SAL)為KT 3生物體/柱。23. 根據權利要求22所述的無菌填充層析柱，其中所述填充柱具有的SAL為HT6生物體/ 柱。24. 根據權利要求22和23任一項所述的無菌填充層析柱，其中所述層析柱包括所述管 件、第一流體分布器和第二流體分布器，并且其中所述管件、第一流體分布器和第二流體分 布器各自由相同或不同的塑料材料制成。25. 根據權利要求24所述的層析柱，其中所述塑料材料包括聚丙烯、聚乙烯、聚酰胺類、 縮醛類、玻璃填充塑料類、碳填充塑料類、玻璃纖維塑料類或碳纖維塑料類或碳纖維塑料 類。26. 根據權利要求22至25任一項所述的層析柱，其中所述填料包括瓊脂糖、二氧化硅、 陶瓷或丙烯酸酯的聚合物或纖維素基材料。27. 根據權利要求22至26任一項所述的層析柱，其中所述填料用以下一種或多種功能 化:離子交換基團；具有疏水和帶電性能的多元基團；金屬螯合基團；疏水基團；或能結合至 免疫球蛋白IgG的葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽。28. 根據權利要求27所述的層析柱，其中所述離子交換基團包括一種或多種季胺、硫酸 鹽和羧酸鹽。29. 根據權利要求27所述的層析柱，其中所述疏水基團包括一種或多種丙基、辛基和苯 基基團O30. 根據權利要求27所述的層析柱，其中所述SpA多肽包括全長野生型SpA，重組SpA，包 括選自SpA域A、B、C、D、E或Z的SpA域的單體SpA多肽，或包括以選自SpAi或A、B、C、D、E或Z的任 意組合的任意兩個、三個、四個、五個或更多SpA域的多聚體SpA多肽，或其功能等價物。31. 根據權利要求30所述的層析柱，其中所述SpA多肽包括多聚體SpA多肽。32. 根據權利要求31所述的層析柱，其中所述多聚體SpA多肽包括四或五個選自SpA域 B、C和Z的SpA域。33. 根據權利要求32所述的層析柱，其中所有的SpA域是相同的。34. 根據權利要求33所述的層析柱，其中所述多聚體SpA多肽包括五個SpA域C。35. 根據權利要求22至34任一項所述的層析柱，其中所述管件的兩端通過具有略大于 所述管件內徑的外徑的流體分布器封閉以提供過盈配合。36. 根據權利要求22至35任一項所述的層析柱，其中所述柱在氣密和水密容器內密封。37. 根據權利要求36所述的層析柱，其中在γ輻照之前在第二氣密和水密容器內進一 步密封所述柱以提供雙層封裝。38. -種無菌填充層析柱，其包括 具有第一端和第二端的無菌中空管件； 固定至所述管件的第一端的無菌第一流體分布器； 具有大于所述管件的內徑的外徑的無菌第二流體分布器;和 填充在所述第一和第二流體分布器之間的所述管件內的無菌填料； 其中所述第二流體分布器固定在所述管件的第二端內以形成所述第一和第二流體分 布器之間的用填料填充的中空管件內的腔室;并且其中所述填充層析柱具有的無菌保證水 平為10-3生物體/柱。39. 根據權利要求38所述的無菌填充層析柱，其中所述柱具有的SAL為KT6生物體/柱。40. 根據權利要求38所述的無菌層析柱，其中在所述柱內的所述填料具有特性吸附水 平為在未用γ射線輻照的柱內的同一種類型的填料的特性吸附水平的至少60%。41. 根據權利要求38所述的無菌層析柱，其中所述填料包含0.5至5.0% (體積/體積）的 芳族醇或2.0至25 % (體積/體積)的脂肪族伯醇。42. 根據權利要求38所述的無菌層析柱，其中所述填料包含0.5至3.0% (體積/體積）的 苯甲醇。43. 根據權利要求38所述的無菌層析柱，其中所述填料包含2.0至20 %的乙醇。
【文檔編號】B01D15/10GK105916561SQ201580004874
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2015年1月16日
【發明人】J·R·沛澤, D·C·彭迪亞
【申請人】瑞普利根公司