一種新型葡萄糖基離子液體固定相及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種新型葡萄糖基離子液體固定相，該固定相通過以下方法制備得到：首先對色譜用多孔球形硅膠表面進行酸化處理，水洗至中性，實現硅膠表面活化，然后利用環氧開環反應將葡甲胺和γ?(2,3?環氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷反應，并添加碘甲烷，將合成得到的葡萄糖基離子液體修飾到硅膠載體表面，實現固定相的高效率、高選擇性。本發明還公開了該新型葡萄糖基離子液體固定相在核苷分離方面的應用。
【專利說明】
-種新型葡萄糖基離子液體固定相及其應用
技術領域
[0001] 本發明設及一種新型葡萄糖基離子液體固定相及其應用，屬于高效液相色譜固定 相領域。
【背景技術】
[0002] 目前，大部分離子液體官能化的高效液相色譜固定相都是基于咪挫類或化晚類陽 離子合成的。含有葡萄糖基的離子液體是一類新型離子液體，據報道，對面代控和脫氧核糖 核酸(DNA)的萃取性能非常顯著。葡萄糖基離子液體的葡萄糖段屬高親水性，可W用于親水 作用色譜化ILIC)。
【發明內容】
[0003] 為解決采用現有技術制備的咪挫類離子液體官能化高效液相色譜固定相在溶劑、 緩沖液等條件下穩定性受限且目標分析物單一的問題，本發明提供了一種新型葡萄糖基離 子液體固定相，從而實現對同類生物分子化合物的高效率分離分析。
[0004] 本發明在環氧開環反應的基礎上提出了固定葡甲胺到硅膠上的新思路，制備的新 型葡萄糖基離子液體固定相對核巧包括胸巧(TMP)、尿巧(UMP)、腺巧(AMP)、肌巧（IMP)、胞 巧(CMP)和鳥巧(GMP)的分離選擇性顯著化ILIC)，并對色譜條件進行了優化(緩沖液濃度、 流動相組成、pH值和柱溫的變化）。
[0005] -種新型葡萄糖基離子液體固定相，其特征在于該固定相通過W下方法制備得 到： a、 色譜用多孔球形硅膠經鹽酸酸化處理后水洗至中性，然后真空干燥即得表面活化的 硅膠； b、 將葡甲胺（N-Methyl-D-glucamine)和丫 - (2,3-環氧丙氧基）丙基S甲氧基硅烷 化PTMS)溶解在甲醇里，加熱回流進行環氧開環反應； C、在步驟b中添加艦甲燒，繼續回流，進行甲基化反應； d、 將步驟C所得溶液進行機械攬拌，攬拌過程中添加硅膠的甲醇1勻漿，將所得懸浮液 進行加熱回流反應，目的是將新制備的葡萄糖基離子液體有效結合在活化的硅膠表面； e、 過濾，真空干燥，即得新型葡萄糖基離子液體固定相(Sil-GLU)。
[0006] 所述步驟a中硅膠的酸化條件為用濃鹽酸加熱回流4~6 h，用水洗至中性，在真空 120 °C W下干燥6~8 h。
[0007] 所述步驟b和C中加熱回流的溫度65~75°C，時間10~1化。
[000引所述步驟d在加入硅膠的甲醇勻漿，攬拌均勻后懸浮24 h，然后加熱至65~75°C，回 流24 h。
[0009] 所述步驟e中的干燥條件:溫度70~100 °C，時間8~12 h。
[0010] 所述葡甲胺、GPTMS、艦甲燒W及硅膠的用量比為7~9 mM:7~9 mM:8~12 mM:2.5~ 3.5 g。
[00川所述硅膠的甲醇勻漿中硅膠與甲醇的質量體積比為2.5~3.5 :15~25 g/mL。
[0012] 本發明的有益效果： 1、本發明所述Sil-GLU色譜填料既具有硅膠基質的優異物理結構又具有葡萄糖的特殊 色譜性能。
[0013] 2、由于硅膠表面鍵合的葡萄糖基長鏈的結構使得Sil-化U具有很強的親水性能， 因此對水溶性的生物大分子化合物具有較強的分離性能，流動相中乙臘的加入可W減弱對 某些核巧的保留。
[0014] 3、本發明通過將葡萄糖基鍵合的方法修飾到硅膠表面上，實現分離的穩定性，耐 高溫，耐有機溶劑等優勢，實現目標分離的高效性，從而獲得具有優良的分離分析性能的新 型葡萄糖基離子液體固定相。
【附圖說明】
[001引圖1是本發明所述Sil-GLU的制備過程圖。
[0016] 圖2是本發明所述Sil-GLU的紅外光譜圖。
[0017] 圖3是本發明所述Sil-GLU作為填料時不同濃度乙臘作為流動相對核巧分離的影 響(流動相流速：1 ml min-1;柱溫：25。0。
[0018] 圖4是本發明所述Sil-化U作為填料時鹽濃度對分析物的影響（色譜條件：MeCN/ 出0 = 92/8 (v/v)含有50 ml乙酸錠;流動相流速：1血/min;柱溫：化。C)。
[0019]圖5是本發明所述SU-^U作為填料時pH對分析物的影響（色譜條件：MeCN/此0 = 92/8 (v/v)含有50 mM乙酸錠；流動相流速：1 ml min-1;柱溫：25。0。
[0020] 圖6是本發明所述Sil-化U作為填料時溫度對分析物的影響（MeCN/出0 = 92/8 (v/v)含有50 mM乙酸錠;流動相流速：1 ml min-1)。
[0021] 圖7是本發明被檢測分析物的地a值。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0023] 下述實施例中所設及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現有技術中已有 的常規儀器、試劑、材料等，可通過正規商業途徑獲得。下述實施例中所設及的實驗方法，檢 測方法等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規實驗方法，檢測方法等。
[0024] 實施例1 Sil-GLU葡萄糖基離子液體固定相的制備 操作步驟： 制備合成的=個步驟在同一容器內進行。
[002引①稱重8 mM葡甲胺和同等摩爾的GPTMS，將二者同時溶解在80血的甲醇里，加熱 至70 °C，回流12 h。
[0026] ②步驟①中12 h回流結束后，在同一反應容器內繼續添加10 ml艦甲燒，然后繼續 加熱至70°C，并進一步回流12 h。
[0027] ③加入磁子進行機械攬拌，并加入硅膠(3 g)的甲醇勻漿（20 mL)，攬拌均勻后， 懸浮在24 h后，加熱至70°C，回流12 h。
[0028] ④將步驟③所得乳白色懸濁液進行過濾，過濾后用甲醇/水溶液(體積比1/1)進行 清洗，最后過濾后的所得物即為新型葡萄糖基離子液體固定相SU-化U。將Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥8 h，80 °C，并且在進行表征之前存儲在班巧色的小瓶中。
[0029] 實施例2 Sil-GLU葡萄糖基離子液體固定相的制備 操作步驟： 制備合成的=個步驟在同一容器內進行。
[0030] ①稱重7.5 ml葡甲胺和同等摩爾的GPTMS，將二者同時溶解在75 mL的甲醇里，加 熱至70 °C，回流13 h。
[0031] ②步驟①中12 h回流結束后，在同一反應容器內繼續添加9 mM艦甲燒，然后繼續 加熱至70°C，并進一步回流13 h。
[0032] ③加入磁子進行機械攬拌，并加入硅膠（3.2 g)的甲醇勻漿（20 mL)，攬拌均勻 后，懸浮24 h后，加熱至70 °C，回流13 h。
[0033] ④將步驟③所得乳白色懸濁液進行過濾，過濾后用甲醇/水溶液(體積比1/1)進行 清洗，最后過濾后的所得物即為新型葡萄糖基離子液體固定相SU-化U。將Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥10 h，80 °C，并且在進行表征之前存儲在班巧色的小瓶中。
[0034] 實施例3 Sil-GLU葡萄糖基離子液體固定相的制備 操作步驟： 制備合成的=個步驟在同一容器內進行。
[00對①稱重8 mM葡甲胺和同等摩爾的GPTMS，將二者同時溶解在80血的甲醇里，加熱 至75 °C，回流12 h。
[0036] ②步驟①中12 h回流結束后，在同一反應容器內繼續添加10 ml艦甲燒，然后繼續 加熱至75°C，并進一步回流12 h。
[0037] ③加入磁子進行機械攬拌，并加入硅膠（3 g)的甲醇勻漿（20 mL)，攬拌均勻 后，懸浮在24 h后，加熱至75°C，回流12 h。
[0038] ④將步驟③所得乳白色懸濁液進行過濾，過濾后用甲醇/水溶液(體積比1/1)進行 清洗，最后過濾后的所得物即為新型葡萄糖基離子液體固定相SU-化U。將Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥8 h，80 °C，并且在進行表征之前存儲在班巧色的小瓶中。
[0039] 實施例4 Sil-GLU葡萄糖基離子液體固定相的制備 操作步驟： 制備合成的=個步驟在同一容器內進行。
[0040] ①稱重8.5 ml葡甲胺和同等摩爾的GPTMS，將二者同時溶解在75 mL的甲醇里，加 熱至70 °C，回流15 h。
[0041] ②步驟①中12 h回流結束后，在同一反應容器內繼續添加10.5 mM艦甲燒，然后繼 續加熱至70°C，并進一步回流15 h。
[0042] ③加入磁子進行機械攬拌，并加入硅膠（2.5 g)的甲醇勻漿（20 mU，攬拌均勻 后，懸浮在24 h后，加熱至70 °C，回流15 h。
[0043] ④將步驟③所得乳白色懸濁液進行過濾，過濾后用甲醇/水溶液(體積比1/1)進行 清洗，最后過濾后的所得物即為新型葡萄糖基離子液體固定相SU-化U。將Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥8 h，100 °C，并且在進行表征之前存儲在班巧色的小瓶中。
[0044] 實施例5 Sil-GLU葡萄糖基離子液體固定相的制備 操作步驟： 制備合成的=個步驟在同一容器內進行。
[0045] ①稱重8 mM葡甲胺和同等摩爾的GPTMS，將二者同時溶解在80血的甲醇里，加熱 至65 °C，回流14 h。
[0046] ②步驟①中12 h回流結束后，在同一反應容器內繼續添加11 ml艦甲燒，然后繼續 加熱至65°C，并進一步回流14 h。
[0047] ③加入磁子進行機械攬拌，并加入硅膠（2.8 g)的甲醇勻漿（20 mU，攬拌均勻 后，懸浮在24 h后，加熱至65°C，回流14 h。
[0048] ④將步驟③所得乳白色懸濁液進行過濾，過濾后用甲醇/水溶液(體積比1/1)進行 清洗，最后過濾后的所得物即為新型葡萄糖基離子液體固定相SU-化U。將Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥10 h，80 °C，并且在進行表征之前存儲在班巧色的小瓶中。
[0049] 實施例6 Sil-GLU葡萄糖基離子液體固定相的制備 操作步驟： 制備合成的=個步驟在同一容器內進行。
[0050] ①稱重9 mM葡甲胺和同等摩爾的GPTMS，將二者同時溶解在85血的甲醇里，加熱 至70 °C，回流12 h。
[0051] ②步驟①中12 h回流結束后，在同一反應容器內繼續添加10.5 mM艦甲燒，然后繼 續加熱至7〇°C，并進一步回流12 h。
[0052] ③加入磁子進行機械攬拌，并加入硅膠（2.7 g)的甲醇勻漿（20 mU，攬拌均勻 后，懸浮在24 h后，加熱至70°C，回流12 h。
[0053] ④將步驟③所得乳白色懸濁液進行過濾，過濾后用甲醇/水溶液(體積比1/1)進行 清洗，最后過濾后的所得物即為新型葡萄糖基離子液體固定相SU-化U。將Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥8 h，90 °C，并且在進行表征之前存儲在班巧色的小瓶中。
[0054] 實施例7 Sil-GLU葡萄糖基離子液體固定相的制備 操作步驟： 制備合成的=個步驟在同一容器內進行。
[0055] ①稱重8 mM葡甲胺和同等摩爾的GPTMS，將二者同時溶解在80血的甲醇里，加熱 至70 °C，回流10 h。
[0056] ②步驟①中12 h回流結束后，在同一反應容器內繼續添加10 ml艦甲燒，然后繼續 加熱至70°C，并進一步回流10 h。
[0057] ③加入磁子進行機械攬拌，并加入硅膠（3 g)的甲醇勻漿（20 mL)，攬拌均勻 后，懸浮在24 h后，加熱至70°C，回流10 h。
[0058]④將步驟③所得乳白色懸濁液進行過濾，過濾后用甲醇/水溶液(體積比1/1)進行 清洗，最后過濾后的所得物即為新型葡萄糖基離子液體固定相SU-化U。將Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥12 h，70 °C，并且在進行表征之前存儲在班巧色的小瓶中。
[0化9] 實施例8 Sil-GLU葡萄糖基離子液體固定相的制備 操作步驟： 制備合成的=個步驟在同一容器內進行。
[0060] ①稱重8.5 ml葡甲胺和同等摩爾的GPTMS，將二者同時溶解在85 mL的甲醇里，加 熱至75 °C，回流12 h。
[0061] ②步驟①中12 h回流結束后，在同一反應容器內繼續添加12 ml艦甲燒，然后繼續 加熱至75°C，并進一步回流12 h。
[0062] ③加入磁子進行機械攬拌，并加入硅膠（3 g)的甲醇勻漿（20 mL)，攬拌均勻 后，懸浮在24 h后，加熱至75°C，回流12 h。
[0063] ④將步驟③所得乳白色懸濁液進行過濾，過濾后用甲醇/水溶液(體積比1/1)進行 清洗，最后過濾后的所得物即為新型葡萄糖基離子液體固定相SU-化U。將Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥12 h，80 °C，并且在進行表征之前存儲在班巧色的小瓶中。
[0064] 實施例9 Sil-GLU葡萄糖基離子液體固定相的制備 操作步驟： 制備合成的=個步驟在同一容器內進行。
[0065] ①稱重7.5 ml葡甲胺和同等摩爾的GPTMS，將二者同時溶解在80 mL的甲醇里，加 熱至70 °C，回流12 h。
[0066] ②步驟①中12 h回流結束后，在同一反應容器內繼續添加9 mM艦甲燒，然后繼續 加熱至70°C，并進一步回流12 h。
[0067] ③加入磁子進行機械攬拌，并加入硅膠（3.5 g)的甲醇勻漿（15 mU，攬拌均勻 后，懸浮在24 h后，加熱至70°C，回流12 h。
[0068] ④將步驟③所得乳白色懸濁液進行過濾，過濾后用甲醇/水溶液(體積比1/1)進行 清洗，最后過濾后的所得物即為新型葡萄糖基離子液體固定相SU-化U。將Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥9 h，80 °C，并且在進行表征之前存儲在班巧色的小瓶中。
[0069] 實施例10 Sil-GLU葡萄糖基離子液體固定相的制備 操作步驟： 制備合成的=個步驟在同一容器內進行。
[0070] ①稱重8 mM葡甲胺和同等摩爾的GPTMS，將二者同時溶解在80血的甲醇里，加熱 至70 °C，回流11 h。
[0071] ②步驟①中12 h回流結束后，在同一反應容器內繼續添加8 mM艦甲燒，然后繼續 加熱至70°C，并進一步回流11 h。
[0072] ③加入磁子進行機械攬拌，并加入硅膠（3 g)的甲醇勻漿（25 mL)，攬拌均勻 后，懸浮在24 h后，加熱至70°C，回流11 h。
[0073] ④將步驟③所得乳白色懸濁液進行過濾，過濾后用甲醇/水溶液(體積比1/1)進行 清洗，最后過濾后的所得物即為新型葡萄糖基離子液體固定相SU-化U。將Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥12 h，80 °C，并且在進行表征之前存儲在班巧色的小瓶中。
[0074] 實施例11 本發明對制備的Sil-GLU葡萄糖基離子液體固定相抽樣進行參數表征。
[00巧]表征的方法和結果如下。
[0076] 紅外光譜表征：從紅外光譜圖（圖2)可W看出，SiI-GLU有點難W觀察特征波段 (3400-3500cm-i)，因為葡萄糖基與娃醇基的特征波段重疊。然而，CH3-拉伸振動峰值出現 在約2940 cnfi。對應于錠鹽的特征峰都幾乎不明顯，可能由于比較多的OH-的低峰的影響， 根據表征結果考慮一個硅烷分子內C冊-:0H-的比例是1:6。
[0077] 元素分析表征：制備反應設及S個步驟，在第一步反應里定量生產叔胺葡甲胺和 環氧組。由于新硅烷產生在均相條件下，運一步驟可W確保錠/碳水化合物基團在娃表面上 的統一形態。Sil-GLU元素分析表明，碳、氮、氨含量分別為6.38%、0.36%和1.48%，高轉化 率的叔胺是計算和實驗碳氮比含量較少的原因。根據氮（N)含量的值（兩個測試的平均 值)計算可得，Sil-GLU表面覆層材料的密度是0.64WI1O1 nf2。根據公式：
公巧里的C%，N%和H%分別表不制備的Sil-GLU里的碳、氮、S曾量；0%和Si%分別代 表氧和娃的含量;Mi是碳原子的摩爾質量;n是一個硅烷分子里的碳原子數目；S是硅膠的 表面積。
[007引接下來W實施例1為例，對制備的Sil-GLU葡萄糖基離子液體固定相進行分離性能 考察。
[0079] 考察的方法和結果如下。
[0080] 制備的新型葡萄糖基離子液體鍵合硅膠固定相與高效液相色譜儀聯用，實現對其 性能的考察，W及對實際樣品的分析。
[0081 ]乙臘濃度的影響 對不同濃度乙臘作為流動相對核巧的分離進行了研究。如圖3顯示，核巧的保留因子隨 著乙臘（70~95%)/水濃度的增加而增強，與HILIC保留機理一致。當乙臘的濃度為90% 時，六個核巧樣品的分離達到最佳效果。
[0082] 因為固定相帶電荷，固定相和溶質之間除了親水作用還存在存在靜電相互作用， 即為靜電斥力一一親水作用色譜巧化1C)。親水作用保留機理基于固定相表面的水富集層 和流動相的高有機質含量。高乙臘濃度不僅會大幅度的將親水溶質趕到水富集層，也有可 能誘發更大量的水富集層作用，從而導致更強的保留效果。
[0083] 鹽濃度的影響 乙酸錠濃度的變化對核巧保留的影響如圖4所示。乙酸錠濃度的增加（25 ml~150 mM) 使得肌巧、胞巧和鳥嚷嶺的保留時間增長，但胸巧、尿巧、腺巧的影響十分微弱。運種現象 歸因于鹽析效應。胸巧、尿巧、腺巧具有相對較低的親水性，當高鹽濃度降低洗脫液的溶解 度，也就是說，隨鹽濃度在流動相中增加，肌巧、胞巧和鳥巧=種物質的洗脫能力漸漸減弱， 導致運=種物質保留系數逐漸增大。但是，肌巧、胞巧與鳥巧在水中的溶解度相對較大，對 溶解度的鹽析效應的影響并不明顯，所W流動相鹽的濃度對運=種物質幾乎沒有影響。
[0084] 抑的影響 pH的變化對核巧保留的影響如圖5所示。pH值（3~7)W 0.1 M (pH 5.95)，lM(pH 5.0)和50 M (pH 4.0)乙酸水溶液調節，乙酸（抑3.1)和0.1 M氨（pH 7.0)調整pH 值，流動相為9?)乙臘8 %50mM乙酸錠。如圖5所示，樣品胸巧、尿巧k值隨流動相pH值的變化 較明顯，保留略有減弱。從圖7中列出的地a值可看出，帶正電，與固定相之間存在靜電斥力。 隨著pH值增加，固定相正電荷增加，樣品胸巧、尿巧的靜電排斥力增加，保留減弱。而其余樣 品處于分子狀態，可能不存在非帶電溶質的靜電相互作用。
[00化]溫度的影響 柱溫對分析物的影響如圖6所示。溫度的升高，核巧k值逐漸下降。運種現象是反應出吸 附動力學的特征。溫度越高，分析物的溶解度越大，運意味著增加柱溫可W增強流動相洗脫 能力。
【主權項】
1. 一種新型葡萄糖基離子液體固定相，其特征在于該固定相通過以下方法制備得到： a、 色譜用多孔球形硅膠經鹽酸酸化處理后水洗至中性，然后真空干燥即得表面活化的 硅膠； b、 將葡甲胺和γ-(2,3-環氧丙氧基）丙基三甲氧基硅烷溶解在甲醇里，加熱回流進行 環氧開環反應； c、 在步驟b中添加碘甲烷，繼續回流，進行甲基化反應； d、 將步驟c所得溶液進行機械攪拌，攪拌過程中添加硅膠的甲醇勻漿，將所得懸浮液進 行加熱回流反應； e、 過濾，真空干燥，即得新型葡萄糖基離子液體固定相。2. 如權利要求1所述的離子液體固定相，其特征在于所述步驟a中硅膠的酸化條件為用 濃鹽酸加熱回流4~6 h，用水洗至中性，在真空120 °C以下干燥6~8 h。3. 如權利要求1所述的離子液體固定相，其特征在于所述步驟b和c中加熱回流的溫度 65~75°C，時間 10~15h。4. 如權利要求1所述的離子液體固定相，其特征在于所述步驟d在加入硅膠的甲醇勻 漿，攪拌均勻后懸浮24 h，然后加熱至65~75°C，回流24 h。5. 如權利要求1所述的離子液體固定相，其特征在于所述步驟e中的干燥條件:溫度70~ 100 °C，時間8~12 h。6. 如權利要求1所述的離子液體固定相，其特征在于所述葡甲胺、GPTMS、碘甲烷以及硅 膠的用量比為7~9 mM:7~9 mM:8~12 mM:2.5~3.5 g。7. 如權利要求1所述的離子液體固定相，其特征在于所述硅膠的甲醇勻漿中硅膠與甲 醇的質量體積比為2.5~3.5 :15~25 g/mL。8. 如權利要求1所述的新型葡萄糖基離子液體固定相在核苷分離方面的應用。9. 如權利要求8所述的應用，其特征在于所述核苷為胸苷、尿苷、腺苷、肌苷、胞苷或鳥 苷。
【文檔編號】B01D15/30GK105903455SQ201610398361
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月7日
【發明人】王旭生, 蔣瓊, 梁曉靜, 王磊, 郭勇
【申請人】中國科學院蘭州化學物理研究所