脂肪酸的色譜純化方法
【專利摘要】本發明涉及一種利用初始混合物純化第一脂肪酸，優選多不飽和脂肪酸的方法，所述初始混合物還包含至少一種第二脂肪酸、可選的第三脂肪酸和可選的第四脂肪酸，其中，所述方法包括：第一液相色譜分離步驟，利用所述初始混合物，在第一色譜分離單元中進行，使得可以在一方面回收富集有第一脂肪酸的第一物流，并在另一方面回收富集有第二脂肪酸的物流；可選地，第二液相色譜分離步驟，利用所述富集有第一脂肪酸的第一物流，在第二色譜分離單元中進行，使得可以在一方面回收富集有第一脂肪酸的第二物流，并在另一方面回收富集有第三脂肪酸的物流；可選地，第三液相色譜分離步驟，利用所述富集有第一脂肪酸的第三物流，在第三色譜分離單元中進行，使得可以在一方面回收富集有第一脂肪酸的第三物流，并在另一方面回收富集有第四脂肪酸的物流。所述第一色譜分離單元、所述第二色譜分離單元和所述第三色譜分離單元中的至少一個為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元。
【專利說明】
脂肪酸的色譜純化方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種生產脂肪酸，特別是多不飽和脂肪酸，例如二十碳五烯酸的色譜方法，以及一種適于實現該方法的設備。
【背景技術】
[0002]脂肪酸(包括多不飽和脂肪酸(縮寫為PUFA))是特別重要的生物學化合物，這是因為他們介入多種生物進程，如細胞膜的構建和維持、在血小板聚集中起作用的激素類(例如前列腺素類)的合成、炎癥過程和免疫應答等等。
[0003]除了必須通過食物攝取的兩個PUFA家族(稱為必需脂肪酸)之外，大部分的PUFA可由人體合成。
[0004]這兩個必需脂肪酸家族為:
[0005]-歐米伽-6，其在核桃、向日葵、大豆、葡萄籽或玉米的油以及高脂家禽(如鴨)中特別豐富；
[0006]-歐米伽-3，其尤其存在于核桃的油中、植物(如油菜籽和亞麻籽)中以及高脂魚(如鮭魚、金槍魚、沙丁魚、鯖魚或鯡魚)中。近期已開發出了采用養殖微藻類、轉基因酵母菌或磷蝦來生產歐米伽-3的方法。
[0007]歐米伽-3由于其抗氧化性的優點而成為特別令人感興趣的PUFA。在這些歐米伽-3中，純化的EPA(二十碳五烯酸，C20-5 ω 3)和DHA(二十二碳六烯酸，C22-6 ω 3)及其富集組合是極其常用的膳食增補劑或藥物，以降低甘油三酯水平、心血管風險，改善認知或視覺，等等。
[0008]近來臨床研究表明，以每日4克的不含DHA的96%的EPA的乙基酯治療甘油三酯水平在500mL/dL以上的患者可降低甘油三酯水平，而不會增高LDL水平(“壞”膽固醇)，而以每日4克的EPA的乙基酯和DHA的乙基酯的混合物(分別為約50 %和35 % )治療時，則導致LDL水平的增高并伴隨著甘油三酯的減少。
[0009]迄今為止，所用的PUFA膳食增補劑(尤其是歐米伽-3)基本上是基于含有30%至60%的EPA和DHA混合物的混合物。在目前所用的分離方法中，所述混合物是通過甘油三酯向乙基酯的酯交換反應，然后通過經由分子蒸餾和/或飽和和單不飽和脂肪酸與尿素的重結晶來富集歐米伽-3而獲得的。所富集的乙基酯可以化學方法或優選酶促法重新轉化為甘油三酯。
[0010]然而，對于以大于80%，甚至大于96%的歐米伽-3(如EPA、DHA或十八碳四烯酸(stearidonic acid，SDA，C18_S ω 3))(特別是酯化形式)的生產來說，這些分離的方法并不能令人滿意。
[0011]然而，歐米伽-3的純化是脆弱的，因為這些化合物包含若干碳碳雙鍵，這使得它們易于氧化或降解。在氧氣的存在下且當它們被加熱時，這些PUFA尤其會經歷異構化、氧化、過氧化和低聚化的反應。
[0012]因此，上文提及的分離技術使得可以以良好的產量和可接受的純化程度獲得PUFA的混合物;但它們不能實現這些PUFA的單獨分離。因而它們不可能在這些PUFA中分離歐米伽-3。事實上，例如，分子蒸餾不能經濟地從EPA或SDA中去除DHA;其不能允許C20和C22型長鏈歐米伽-3的有效分離。尿素包合與分子蒸餾的組合可獲得更高純度的歐米伽-3混合物，代價是通常更低的產量和高的運行成本，但其不能用于從它們中，特別是從EPA和DHA中分離長鏈歐米伽-3。
[0013]因此，需要提供用于工業純化極高純度的酯化形式的歐米伽-3的方法。
[0014]色譜是一種精細分離技術，其允許在避光避空氣的溫和條件下有效純化或富集分子。
[0015]此技術基于使得與固定相接觸而與之具有不同的相互作用的分子的分離。使用一種或若干種流體(稱為流動相或洗脫液)使得各種分子以不同的速度滲濾。這些不同的速度使得可以物理分離這些分子，并可在使用一個或若干個色譜柱的色譜方法的末尾以純化的形式收集它們。純化的餾分通常通過如真空蒸發或膜方法的方式在環境或中等溫度的溫和條件下濃縮。
[0016]在某些情況下，色譜純化的起始產物為包含已通過分子蒸餾富集的脂肪酸酯的油，優選包含大于30%的目的歐米伽-3，所述油已進行處理以除去氧化的化合物，例如通過最近的分子蒸餾或者通過吸附，優選在二氧化硅衍生物(硅膠、膨潤土、硅藻土)上或在活性炭上。
[0017]已有一些用于獲得高純歐米伽-3的色譜方法的描述。
[0018]對此，文獻US5，719，302描述了一種方法，其中特別是利用超臨界洗脫液(壓力下的二氧化碳氣體)且特別是在SMB( “模擬移動床”)上分離PUFA的方法。
[0019]文獻US2011/0091947描述了另一種純化歐米伽-3的方法，其采用模擬移動床色譜技術。所述文獻尤其描述了連續進行一個酶促酯交換反應步驟、兩個分子蒸餾步驟以及一個SMB類型步驟，這最后三個步驟可通過保留時間的次序將產物分離為兩個餾分
[0020]文獻WO 2011/080503描述了利用如下裝置來純化歐米伽-3，該裝置包括串聯設置的兩個SMB色譜裝置和一個洗滌區域，每個SMB色譜裝置都限定了分離區域且由若干色譜柱組成。將待處理的裝填物進樣到第一分離區域中以獲得提取物流和提余液流，然后將包含目的化合物的所述提余液流進樣到并不臨接所述第一區域的色譜柱的第二分離區域的色譜柱中。
[0021]文獻WO 2013/005051描述了通過二級色譜分離進行歐米伽-3的純化，所述二級色譜分離用水-有機洗脫液通過反相SMB或AMB(真實移動床)進行，其中，所述通過SMB或AMB進行的二級分離在相同的色譜裝置上或在兩個不同的裝置上相繼進行，由第一裝置純化的中間產物被引入到第二裝置中。
[0022]文獻WO 2013/005048描述了以大于90%的純度純化EPA，所述純化進行第一色譜分離，然后進行通過反相SMB或AMB進行的兩級色譜分離，在每個步驟中都采用水-有機洗脫液，由所述第一色譜分離純化的中間產物被引入到第二色譜分離中，并且由所述第二色譜分離純化的中間產物被引入到第三色譜分離中。
[0023]仍然需要提供一種純化脂肪酸，特別是多不飽和脂肪酸的方法，所述方法能夠在比現有技術更簡單的色譜設備中實現，并且具有高的單位生產率(純化產物的質量除以固定相的質量并除以單位時間)和低的溶劑消耗，由此來降低投資成本。
【發明內容】
[0024]首先，本發明涉及一種利用初始混合物純化第一脂肪酸的方法，所述初始混合物還包含至少一種第二脂肪酸、可選的第三脂肪酸和可選的第四脂肪酸，其中，所述方法包括:
[0025]-第一液相色譜分離步驟，利用所述初始混合物，在第一色譜分離單元中進行，使得可以在一方面回收富集有第一脂肪酸的第一物流，并在另一方面回收富集有第二脂肪酸的物流；
[0026]-可選地，第二液相色譜分離步驟，利用所述富集有第一脂肪酸的第一物流，在第二色譜分離單元中進行，使得可以在一方面回收富集有第一脂肪酸的第二物流，并在另一方面回收富集有第三脂肪酸的物流；
[0027]-可選地，第三液相色譜分離步驟，利用所述富集有第一脂肪酸的第三物流，在第三色譜分離單元中進行，使得可以在一方面回收富集有第一脂肪酸的第三物流，并在另一方面回收富集有第四脂肪酸的物流。
[0028]所述第一色譜分離單元、所述第二色譜分離單元和所述第三色譜分離單元中的至少一個為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元。
[0029]根據一個實施方式，所述第一色譜分離單元為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元;和/或所述第二色譜分離單元為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元;和/或所述第三色譜分離單元為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元。
[0030]根據一個實施方式，所述第一色譜分離單元、所述第二色譜分離單元和所述第三色譜分離單元中的至少兩個單元為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元。
[0031]根據一個實施方式，所述第一色譜分離單元、所述第二色譜分離單元和所述第三色譜分離單元中的至少一個，且優選所述第一色譜分離單元，為具有若干個色譜柱的色譜分離單元;且更特別優選地為模擬移動床或真實移動床系統，或者為以非同步的方式定期更改物流的進樣點和收集點的系統。
[0032]根據一個實施方式:
[0033]-所述第一色譜分離步驟使用第一洗脫液進行，所述第一洗脫液為水-有機洗脫液；以及/或者
[0034]-適用時，所述第二色譜分離步驟使用第二洗脫液進行，所述第二洗脫液為水-有機洗脫液;以及/或者
[0035]-適用時，所述第三色譜分離步驟使用第三洗脫液進行，所述第三洗脫液為水-有機洗脫液。
[0036]根據一個實施方式:
[0037]-所述第一洗脫液為酮/水混合物，更特別優選地，為丙酮/水；
[0038]-適用時，所述第二洗脫液為醇/水混合物，更特別優選地，為甲醇/水；
[0039]-適用時，優選地，所述第三洗脫液為酮/水混合物，更特別優選地，為丙酮/水；
[0040]-適用時，優選地，所述第一洗脫液不同于所述第二洗脫液，以及適用時，優選地，所述第三洗脫液不同于所述第一洗脫液且不同于所述第二洗脫液。[0041 ]根據一個實施方式:
[0042]-將第一洗脫液的有機溶劑的質量濃度控制為在2%以內，優選在I%以內，或在0.5%以內，或在0.2%以內，或在0.1%以內；
[0043]-適用時，優選地，將第二洗脫液的有機溶劑的質量濃度控制為在2%以內，優選在1%以內，或在0.5%以內，或在0.2%以內，或在0.1%以內；
[0044]-適用時，優選地，將第三洗脫液的有機溶劑的質量濃度控制為在2%以內，優選在1%以內，或在0.5%以內，或在0.2%以內，或在0.1%以內。
[0045]根據一個實施方式，所述第一脂肪酸為第一多不飽和脂肪酸。
[0046]根據實例:
[0047]-所述第一多不飽和脂肪酸為二十碳五烯酸，且優選在所述方法的末尾以大于或等于80%、或大于或等于90%、或大于或等于96%的純度被回收;或者
[0048]-所述第一多不飽和脂肪酸為二十二碳六烯酸，且優選在所述方法的末尾以大于或等于70%、或大于或等于80%、或大于或等于90%、或大于或等于95%的純度被回收;或者
[0049]-所述第一多不飽和脂肪酸為花生四烯酸，且優選在所述方法的末尾以大于或等于70%、或大于或等于80%、或大于或等于90%、或大于或等于95%的純度被回收;或者
[0050]-所述第一多不飽和脂肪酸為二十二碳五烯酸，且優選在所述方法的末尾以大于或等于70%、或大于或等于80%、或大于或等于90%、或大于或等于95%的純度被回收。
[0051]根據一個實施方式，所述方法包括:
[0052]-至少一個在所述第一脂肪酸與比所述第一脂肪酸保留更久的一種或多種化合物之間的色譜分離步驟，以及優選至少兩個在所述第一脂肪酸與比所述第一脂肪酸保留更久的一種或多種化合物之間的色譜分離步驟;以及/或者
[0053]-至少一個在所述第一脂肪酸與比所述第一脂肪酸保留更短的一種或多種化合物之間的色譜分離步驟；以及
[0054]其中所述方法優選包括:
[0055]-第一色譜分離步驟，其為在所述第一脂肪酸與比所述第一脂肪酸保留更久的一種或多種化合物之間的色譜分離步驟;然后第二色譜分離步驟，其為在所述第一脂肪酸與比所述第一脂肪酸保留更久的一種或多種化合物之間的色譜分離步驟;然后第三色譜分離步驟，其為在所述第一脂肪酸與比所述第一脂肪酸保留更短的一種或多種化合物之間的色譜分離步驟。
[0056]根據一個實施方式，所述第一色譜分離單元、所述第二色譜分離單元和所述第三色譜分離單元中的至少一個包括具有大于或等于5cm、或大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的長度;和/或具有大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的直徑的分離色譜柱。
[0057]根據一個實施方式:
[0058]-供料至所述第一色譜分離單元的初始混合物包含小于80%的有機溶劑，優選小于60%，或小于40%，或小于20%，或小于10%，或小于5%，或小于2%，或小于I %的有機溶劑，以及更加特別優選地為基本上沒有有機溶劑的脂肪酸的混合物；以及/或者
[0059]-適用時，供料至所述第二色譜分離單元的富集有第一脂肪酸的第一物流包含小于80%的有機溶劑，優選小于60%，或小于40%，或小于20%，或小于10%，或小于5%，或小于2%，或小于1%的有機溶劑，以及更加特別優選地為基本上沒有有機溶劑的脂肪酸的混合物；以及/或者
[0060]-適用時，供料至所述第三色譜分離單元的富集有第一脂肪酸的第二物流包含小于80%的有機溶劑，優選小于60%，或小于40%，或小于20%，或小于10%，或小于5%，或小于2%，或小于1%的有機溶劑，以及更加特別優選地為基本上沒有有機溶劑的脂肪酸的混合物。
[0061]本發明的目的還在于一種利用初始混合物純化第一脂肪酸的設備，其中，所述設備包括:
[0062]-第一液相色譜分離單元，其通過初始混合物的供料管道供料，以及在出口處一方面連接富集有第一脂肪酸的物流的第一管道，且另一方面連接富集有第二脂肪酸的物流的管道；
[0063]-可選地，第二液相色譜分離單元，其通過富集有第一脂肪酸的物流的第一管道供料，以及在出口處一方面連接富集有第一脂肪酸的物流的第二管道，且另一方面連接富集有第三脂肪酸的物流的管道；
[0064]-可選地，第三液相色譜分離單元，其通過富集有第一脂肪酸的物流的第二管道供料，以及在出口處一方面連接富集有第一脂肪酸的物流的第三管道，且另一方面連接富集有第四脂肪酸的物流的管道；
[0065]其中，所述第一色譜分離單元、所述第二色譜分離單元和所述第三色譜分離單元中的至少一個為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元。
[0066]根據一個實施方式，所述第一色譜分離單元為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元;和/或所述第二色譜分離單元為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元;和/或所述第三色譜分離單元為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元；以及優選地，所述第一色譜分離單元、所述第二色譜分離單元和所述第三色譜分離單元中的至少兩個單元為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元。
[0067]根據一個實施方式，所述第一色譜分離單元、所述第二色譜分離單元和所述第三色譜分離單元中的至少一個，且優選所述第一色譜分離單元，為具有若干個色譜柱的色譜分離單元;且更特別優選地為模擬移動床或真實移動床系統，或者為以非同步的方式定期更改物流的進樣點和收集點的系統。
[0068]根據一個實施方式，所述第一色譜分離單元、所述第二色譜分離單元和所述第三色譜分離單元中的至少一個包括具有大于或等于5cm、或大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的長度;和/或具有大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的直徑的分離色譜柱。
[0069]本發明可克服現有技術的缺點。其更特別地提供了一種純化脂肪酸，且特別是多不飽和脂肪酸的方法，所述方法能夠在比現有技術更簡單的色譜設備中實現，并且具有高的單位生產率和低的溶劑消耗。
[0070]此方法的實現歸功于在穩態循環的固定床單一色譜柱分離單元中進行分離步驟。
[0071]本發明由此可利用多種化合物裝填物且通過使所用色譜柱的數量最小化來提供一種允許被用于膳食增補劑或藥物組合物中的高純度脂肪酸(特別是多不飽和脂肪酸)。
【附圖說明】
[0072]圖1示意性圖示了用于實施本發明的設備的一個實施方式。
【具體實施方式】
[0073]現在，將在以下敘述中更加詳細地且以非限定性的方式描述本發明。
[0074]—般而言，除非另有規定，所表述的比例為質量比例。
[0075]結合其中所述第一脂肪酸為PUFA(稱為“第一PUFA”)的優選實施方式進行以下的全部敘述。但是，當所述第一脂肪酸并非多不飽和脂肪酸時，該敘述以類似的方式是有效的。則在以下敘述中，適當地將“第一PUFA”替換為更加上位的術語“第一脂肪酸”。由此，所述第一脂肪酸也可以是飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸或脂肪酸衍生物，如枝化的、天然或改性的脂肪酸。
[0076]制備方法
[0077]本發明的方法使得可利用初始混合物獲得純化形式的第一PUFA。除了第一 PUFA之夕卜，所述初始混合物還包括其它非所需的脂肪酸，即普通的飽和或單不飽和脂肪酸和其它PUFA，以及其它可能的雜質。上文提及的第二脂肪酸、第三脂肪酸和第四脂肪酸即為其它非所需的脂肪酸的一部分。
[0078]所述初始混合物可以是來自魚、植物、藻類和/或酵母(且優選來自魚)的脂肪酸的混合物。其可以是粗產物，例如魚油或藻油，或者酵母油。其還可以是來自上述原材料的產物，例如來自魚油、藻油和/或酵母油的產物。所述油可以，例如，提取自天然的或遺傳修飾的植物、藻類或酵母。
[0079]“來自原材料的產物”是指經歷過一步或若干步處理的原材料。這些處理步驟包括一步或若干步的細胞解體、研磨、分離或純化(例如，分餾)，和/或水解步驟以將甘油三酯轉化為游離脂肪酸，和/或酯交換步驟以將所述脂肪酸轉化為烷基酯(且優選為乙基酯)，和/或降低過氧化物指標和/或茴香胺指標(參見下文)的步驟，和/或分子蒸餾的步驟，和/或一步或若干步的色譜分離，等等。
[0080]根據一個有利的實施方式，所述初始混合物為酯化的或酯交換的產物，如魚油、植物油、藻油或酯交換的酵母油。
[0081]由此，在本發明的方法中獲得或使用的每個脂肪酸(特別是每個PUFA)都可以是脂肪酸衍生物，特別是甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯形式的脂肪酸衍生物，酯形式的脂肪酸衍生物，磷脂形式的脂肪酸衍生物，酰胺形式的脂肪酸衍生物，內酯形式的脂肪酸衍生物，或鹽形式的脂肪酸衍生物。
[0082]游離脂肪酸及酯形式是優選的，且更尤其是酯。所述酯通常為烷基酯，例如，C1-C6烷基酯，尤其是C1-C4烷基酯，例如，甲酯和乙酯。乙酯是優選的。
[0083]由此，本申請中提及的第一PUFA、第二脂肪酸、第三脂肪酸和第四脂肪酸可以是，例如，游離脂肪酸或酯的形式，且優選乙基酯化合物的形式。
[0084]參照圖1，根據本發明的方法可在包括第一色譜分離單元3的設備中進行。第一色譜分離單元3提供了所述第一 PUFA與所述第二脂肪酸之間的分離。
[0085]每次在本申請中提及所述第一PUFA與規定的脂肪酸之間的分離，應當理解的是，其它的脂肪酸也可在針對所述規定的脂肪酸的分離的同時與所述第一 PUFA分離。
[0086]—般而言，每個色譜分離都使所述第一 PUFA與極性比它更大或極性比它更小的一組化合物分離。所述分離也可根據脂族鏈長度的大小和不飽和度的數目的標準來進行。更普遍地，由于其效果可隨著所用的洗脫液而定，所述分離根據依情況不同的保留時間的標準來進行，由此可使所述第一 PUFA與比它保留更久或比它保留更短的雜質分離。
[0087]所述分離的溫度可根據本領域技術人員公知的標準在5°C與90°C之間，優選15°C與60°C之間，更優選環境溫度與45°C之間的范圍內調節。適用時，調節壓力以在色譜柱中維持單相狀態，優選液態或超臨界狀態。
[0088]第一色譜分離單元3通過含有脂肪酸的混合物的供料管道I并通過含有第一洗脫液的供料管道2供料。
[0089]在第一色譜分離單元3的出口處，一方面連接富集有第一PUFA的物流的第一管道5，且另一方面連接富集有第二脂肪酸的物流的管道4。
[0090]在本申請上下文中，術語“富集”具有相對性的含義:從初始物流開始的物種A與物種B之間的分離，其可回收富集有物種A的物流，如此意味著由此回收的物流具有大于所述初始物流的A/B質量比。
[0091]所述初始混合物可已經歷如上文所述的那些預處理步驟，在此情況下相應的處理單元(未顯示)可包括于本發明的設備中。
[0092]優選地，第二色譜分離單元6設置在下游，以確保所述第一PUFA與第三脂肪酸之間的分離。此第二色譜分離單元6通過富集有第一 PUFA的物流的第一管道5并通過含有第二洗脫液的供料管道7供料。
[0093]在第二色譜分離單元6的出口處，一方面連接富集有第一PUFA的物流的第二管道9，且另一方面連接富集有第三脂肪酸的物流的管道8。
[0094]優選地，設置第三色譜分離單元10，以確保所述第一PUFA與第四脂肪酸之間的分離。此第三色譜分離單元10通過富集有第一 PUFA的物流的第二管道9并通過含有第三洗脫液的供料管道11供料。
[0095]在第三色譜分離單元10的出口處，一方面連接富集有第一PUFA的物流的第三管道12，且另一方面連接富集有第四脂肪酸的物流的管道13。
[0096]優選地，所述方法正好包括在上文所述的三個單元中的三個色譜分離步驟。
[0097]或者，所述方法僅包括兩個色譜分離步驟，在此情況下省略第三色譜分離單元10。純化形式的第一 PUFA因而在富集有第一 PUFA的物流的第二管道9中被直接回收。
[0098]再或者，所述方法僅包括一個色譜分離步驟，在此情況下第二色譜分離單元6和第三色譜分離單元10都被省略。純化形式的第一 PUFA因而在富集有第一 PUFA的物流的第一管道5中被直接回收。
[0099]再或者，所述方法可包括四個連續的色譜分離步驟(或者更多)，在此情況下，以類似的方式增添額外的色譜分離單元。
[0100]術語“色譜分離單元”表示具有單一色譜柱的色譜系統或具有若干色譜柱的色譜系統。
[0101]其可以是或不是固定床色譜系統。在固定床色譜系統中，待分離化合物的混合物在通常為圓柱形的殼體(或色譜柱)中滲濾。所述色譜柱包括對流體可滲透的多孔性材料床層(固定相)。所述混合物中每種化合物的滲濾速度隨所述化合物的物理性質而定。在所述固定相上保留最久的化合物比在所述固定相上保留最短的化合物更慢地滲濾。此原理使得可實現所需的分離。
[0102]可在串聯或并聯的若干色譜柱中進行此處理，但通常利用單一色譜柱實施在固定床系統中的一個色譜分離。
[0103]此固定床色譜系統的實例為HPLC(高效液相色譜)或CYCL0JET?(S卩，穩態循環的系統)系統。
[0104]所述CYCLOJET?系統例如描述在文獻US6，063，284中，對該文獻明確進行引用。這是一種單一色譜柱的間歇色譜分離系統，其中，在色譜柱的出口處分別收集最久保留的物種(i)以及最短保留的物種(ii)，其中色譜未分離的部分通過主栗再循環。待分離的混合物在色譜再循環部分憑借進樣環定期進樣。所述進樣環優選連接在所述主栗與所述色譜柱之間。在若干色譜循環之后，所述方法達到了周期性穩態，其中進樣的產物的量等于在所述色譜柱的出口處分別收集的產物的量。
[0105]根據一個實施方式，在穩態循環的單一色譜柱固定床系統中的色譜分離是周期性的，且包括以下步驟:
[0106]-憑借洗脫液栗在色譜柱中建立和維持循環的色譜曲線；
[0107]-間歇地且在每個循環向所述循環的色譜曲線中進樣包含至少兩種待分離化合物的樣品，其中，所述進樣憑借由進樣閥控制于進樣點處的進樣環進行，以將存在于所述環中的樣品進樣到所述循環的色譜曲線中，其中，所述進樣閥從開始所述進樣直至全部所述曲線從色譜柱洗脫之時在進樣點處保持不變，然后將所述進樣閥切換至加載位置，以在整個曲線位于所述色譜柱中時加載所述進樣環，以及
[0108]-以間歇和定期的方式，利用循環的曲線收集至少兩個富集的餾分。
[0109]此分離也可包括以下步驟:
[0110]-憑借洗脫液栗，在循環期間以大致連續的方式使洗脫液通過所述色譜柱作為流動相。
[0111]此分離也可包括以下步驟:
[0112]-記錄自開始收集第一餾分直至下次開始收集第一餾分為止發生的事項；
[0113]-在收集第三餾分期間中斷所述洗脫液栗，其中，此中斷持續到循環結束為止，由此可在時間上再現所述循環。
[0114]根據一個實施方式，在所維持的循環曲線中在進樣期間沒有損失循環的曲線。
[0115]此系統的詳細實施方式在前述文獻US6，063，284中的第5欄第36行至第10欄第41行被提及。
[0116]所述色譜分離單元也可以是非固定床色譜系統。非固定床系統為多色譜柱系統，其中固定相床層與物流的進樣點和/或收集點的相對位置隨時間更改。
[0117]這種非固定床色譜系統的實例為5]\?、丨5]\?、55]\?、41?、￥41?^017']\100^(^?、POWERFEED?、DCC 或 MCSGP 系統。
[0118]SMB系統包括串聯連接的多個包含吸附劑的獨立色譜柱。洗脫液流根據第一方向經過所述色譜柱。供料的物流和洗脫液的進樣點以及分離的化合物的收集點憑借一組閥門定期且同時地改變。整體效果是為了模擬包含固體吸附劑移動床的單一色譜柱的運行，同時所述固體吸附劑以與洗脫液流的流動相反的方向移動。照此，SMB系統是由包含洗脫液流經的固體吸附劑固定床的色譜柱組成，但所述運行是模擬逆流的連續移動床。
[0119]SMB系統最為常規的形式為具有四個區域的SMB系統。其它可能的形式為具有三個區域的SMB系統和具有兩個區域的SMB系統(如在Kwangnam Lee的論文“Two Sect1nSimulated Moving Bed Process，，，Separat1n Science and Technology 35(4): 519-534，2000中所述，對該論文明確進行引用)。
[0120]iSMB系統例如描述在文獻EP 0342629和US 5，064，539中，對所述文獻明確進行引用。SSMB系統將物流的引入和收集削減成周期性應用的子序列。在所述iSMB和SSMB系統中，存在至少一個步驟，其中所述系統作為閉合回路運行，沒有產物的入口和出口。
[οι 21 ] 所述SMB系統的其它選擇為:隨時間變化的SMB系統以及Powerfeedtm^S，如在文獻US 5，102，553和Zhang等人的論文〃PowerFeed operat1n of simulated moving bedunits: changing f low-rates during the switching interval,, ,Journal ofChromatography A,1006:87-99，2003中所述，對所述文獻明確進行引用;M0DIC0N?系統，如文獻US 7，479，228中所述，對該文獻明確進行引用；以及具備內循環的SMB系統，如文獻US8，282，831中所述，對該文獻明確進行引用。
[0122]DCC色譜系統例如描述在文獻FR 2889077中，對該文獻明確進行引用。DCC系統為用于周期性變換流動相和待分離混合物的進樣點的連續方法，具有始終處于開放回路中的特征。其采用兩個以上的色譜柱。
[0123]AMB系統的運行類似于SMB系統。不過，不是改變供料物流和洗脫液的進樣點以及收集點，而是憑借閥門系統，相對于供料和收集點物理變換一組吸附單元(色譜柱)。再一次，所述運行使得可模擬逆流的連續移動床。
[0124]VARIC0L?色譜系統例如描述在文獻US 6，136，198、US 6，375，839、US 6,413,419和US 6,712,973中，對所述文獻明確進行引用。VARIC0L?色譜系統包括串聯連接的多個包含吸附劑的獨立色譜柱。使洗脫液根據第一方向經過所述色譜柱。與所述SMB系統相反，憑借一組閥門定期但非同步地變換在系統中待分離混合物和洗脫液的進樣點以及分離的化合物的收集點。整體效果是為了產生具有隨時間變化的長度的分離區域，由此在最為有用的區域中動態分配固定相，并允許與較少的色譜分離單元相似的分離動力以及提高生產率。與SMB系統相反，VARIC0L?系統沒有模擬包含固體吸附劑移動床的單一色譜柱的運行，所述固體吸附劑在與洗脫液流相反的方向上移動，由此所述VARIC0L?系統的運行原理不能在等價的AMB系統中貫徹。
[0125]本發明提供了至少一個將在穩態循環的固定床單一色譜柱單元(特別是例如上文所述的CYCLO JET?單元)中進行的色譜分離步驟。
[0126]當所述方法包括在第一色譜分離單元3中的單個色譜分離步驟時，則此第一色譜分離單元3為穩態循環的固定床單一色譜柱單元。
[0127]當所述方法僅包括相繼在第一色譜分離單元3中和在第二色譜分離單元6中的兩個色譜分離步驟時，則:
[0128]-僅第一色譜分離單元3為穩態循環的固定床單一色譜柱單元；
[0129]-或者僅第二色譜分離單元6為穩態循環的固定床單一色譜柱單元；
[0130]-或者第一色譜分離單元3和第二色譜分離單元6均為穩態循環的固定床單一色譜柱單元。
[0131]當所述方法包括相繼在第一色譜分離單元3、第二色譜分離單元6和第三色譜分離單元10中的三個色譜分離步驟時，則:
[0132]-僅第一色譜分離單元3為穩態循環的固定床單一色譜柱單元；
[0133]-或者僅第二色譜分離單元6為穩態循環的固定床單一色譜柱單元；
[0134]-或者僅第三色譜分離單元10為穩態循環的固定床單一色譜柱單元；
[0135]-或者僅第一色譜分離單元3和第二色譜分離單元6為穩態循環的固定床單一色譜柱單元；
[0136]-或者僅第一色譜分離單元3和第三色譜分離單元10為穩態循環的固定床單一色譜柱單元；
[0137]-或者僅第二色譜分離單元6和第三色譜分離單元10為穩態循環的固定床單一色譜柱單元；
[0138]-或者第一色譜分離單元3、第二色譜分離單元6和第三色譜分離單元10均為穩態循環的固定床單一色譜柱單元；
[0139]不是穩態循環的固定床單元的色譜分離單元可以是固定床分離單元(單一色譜柱或不是)或者非固定床分離單元(多色譜柱)，特別是VARIC0L?或SMB或AMB類型。
[0140]由此，根據一個實施方式，所述第一步驟在非固定床單元中進行，所述第二步驟在固定床單元中進行，以及適用時，所述第三步驟在固定床單元中進行。
[0141]術語“適用時”是指“在所討論的色譜分離步驟實際存在的前提下”。
[0142]根據一個實施方式，所述第一步驟在VARIC0L?或SMB或AMB單元中進行，所述第二步驟在CYCLOJET?單元中進行，以及所述第三步驟在VARIC0L?或SMB或AMB單元中進行。
[0143]根據一個可選且優選的實施方式，所述第一步驟在VARIC0L?或SMB或AMB單元中進行，所述第二步驟在HPLC或CYCLOJET?單元中進行，以及所述第三步驟在HPLC或CYCLOJET?單元中進行(其中，后兩個步驟中的至少一個在CYCLOJET?單元中進行)。
[0144]在一個優選的可選方案中，所述第一步驟在VARI⑶L?單元中進行，所述第二步驟在CYCLO JET?單元中進行，以及所述第三步驟在CYCLO JET?單元中進行。
[0145]根據另一個可選方案，所述步驟中的每一個都在HPLC或CYCLOJET?單元中進行，前提是所述步驟中的至少一個在CYCL0JET?單元中進行；優選所述步驟中的兩個在CYCLOJET?單元中進行；以及可能的話，所述三個步驟都在CYCLOJET?單元中進行。
[0146]所述分離步驟可在物理分離的單元中同時進行，或者可在物理分離的單元中或在相同的單元中依次進行。
[0147]應當注意的是，當兩個色譜分離步驟在SMB或AMB型系統中進行時，其可在相同的SMB或AMB系統上同時進行。在相同的裝置上同時進行的實例描述于文獻WO 2011/080503或文獻WO 2013/005048，或文獻WO 2013/005051中，對所述文獻明確進行引用。
[0148]優選地，全部的色譜分離單元都為物理分離的。
[0149]根據一個實施方式，第一色譜分離單元3的一個或多個分離色譜柱(優選多個分離色譜柱)具有大于或等于5cm、或大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的總的或累積長度;和/或具有大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的直徑。
[0150]根據一個實施方式，第二色譜分離單元6的一個或多個分離色譜柱(優選多個分離色譜柱)具有大于或等于5cm、或大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的總的或累積長度;和/或具有大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的直徑。
[0151]根據一個實施方式，第三色譜分離單元10的一個或多個分離色譜柱(優選多個分離色譜柱)具有大于或等于5cm、或大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的總的或累積長度;和/或具有大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的直徑。
[0152]根據一個實施方式，本發明的方法或設備中所用的全部色譜柱具有大于或等于5cm、或大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的總的或累積長度;和/或具有大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的直徑。
[0153]所述色譜柱的長度和直徑為所述色譜柱的有效尺寸，即，所述色譜柱中固定相床層的尺寸。存在不同的色譜柱幾何形狀，包括軸向或徑向圓柱形色譜柱，但也包括具有非圓柱形截面的腔室，對此明確進行引用(在此情況下，所述直徑指的是所述截面的最大尺度)。
[0154]每個色譜分離步驟都可在作為吸附劑(固定相)的反相上進行。例如，可采用基于微極性樹脂的或用有機基團化學改性的基于二氧化硅的固定相的吸附劑，所述有機基團如烷基(特別是04丄8、(:18、024、030)、苯基，等等。
[0155]每個色譜分離步驟都可利用水-有機洗脫液(即一種或若干有機溶劑與水的混合物)來進行。優選地，全部色譜分離步驟都利用水-有機洗脫液來進行。或者，可利用純粹的有機洗脫液來進行某些色譜分離步驟。
[0156]可在本發明的框架內使用的有機溶劑(特別是用于形成水-有機洗脫液的有機溶劑)為，例如，醇類，如乙醇、丙醇，且更優選為甲醇;酮類，如丙酮或甲乙酮;腈類，如乙腈;酯類，如乙酸甲酯或乙酸乙酯；呋喃類，如四氫呋喃；醚類，如二乙醚或甲乙醚；以及所述實例中的兩種或大于兩種溶劑的組合。甲醇和丙酮是優選的有機溶劑。
[0157]每個水-有機洗脫液的特征在于水/有機比，其為所述洗脫液中水相對于有機溶劑的體積比。
[0158]每個水-有機洗脫液的水/有機比優選可在0.01:99.99至30: 70，且優選在5:95至25:75變化。
[0159]各個色譜分離步驟可利用具有相同組成或不同組成的洗脫液進行。
[0160]優選采用具有不同組成，特別是具有不同水/有機比的洗脫液，這使得可在每個分離步驟調節洗脫液的洗脫強度，由此在每個步驟獲得不同組分的分離。還可期望的是，在各個步驟中采用由不同有機溶劑組成的洗脫液，以在每個分離步驟調節要分離的某些物種之間的色譜選擇性，并由此在每個步驟獲得不同化合物的分離。
[0161]優選地，將第一洗脫液的有機溶劑的質量濃度控制為在2%以內，優選在1%以內，或在0.5 %以內，或在0.2 %以內，或在0.1 %以內；適用時，優選將第二洗脫液的有機溶劑的質量濃度控制為在2%以內，優選在1%以內，或在0.5%以內，或在0.2%以內，或在0.1%以內；適用時，優選將第三洗脫液的有機溶劑的質量濃度控制為在2%以內，優選在I %以內，或在0.5 %以內，或在0.2%以內，或在0.1 %以內。所述洗脫液的組成的控制通過確保水和/或有機溶劑的供應來進行以開展所需的調節。
[0162]在所述第一色譜分離步驟中，第一PUFA優選與比其保留更久的化合物(特別是第二脂肪酸)分離。在此情況下，當第一色譜分離單元3為非固定床單元時，富集有第一 PUFA的物流為提余物，而富集有第二脂肪酸的物流為提取物。
[0163]在所述第二色譜分離步驟中，第一PUFA優選與比其保留更久的化合物(特別是第三脂肪酸)分離。
[0164]在所述第三色譜分離步驟中，第一PUFA優選與比其保留更短的化合物(特別是第四脂肪酸)分離。
[0165]來自色譜分離步驟的每個物流都優選經歷濃縮步驟。將所述物流濃縮，由此除去洗脫液(有機溶劑和水)，或將該物流的有機溶劑和水的質量含量降低至小于90%、或小于80%、或小于70%、或小于60%、或小于50%、或小于40%、或小于30%、或小于20%、或小于10%、或小于5%、或小于2%、或小于I %、或小于0.5%、或小于0.1 %的水平。
[0166]由此，在一個優選實施方式中，將至少一個濃縮單元(圖中未顯示)連接每個色譜分離單元3、6、10。
[0167]由此，優選地，在第一色譜分離的末尾收集的富集有第一PUFA的第一物流為濃縮物流(洗脫液減少，或者沒有或基本沒有有機溶劑和水)；同樣地，適用時，在第二色譜分離的末尾收集的富集有第一 PUFA的第二物流優選為濃縮物流(洗脫液減少，或者沒有或基本沒有有機溶劑和水)；同樣地，適用時，在第三色譜分離的末尾收集的富集有第一PUFA的第三物流優選為濃縮物流(洗脫液減少，或者沒有或基本沒有有機溶劑和水)。
[0168]可能地，富集有第二脂肪酸的物流、適用時富集有第三脂肪酸的物流以及適用時，富集有第四脂肪酸的物流為濃縮物流(洗脫液減少，或者沒有或基本沒有有機溶劑和水)。
[0169]在每個濃縮單元中，所述洗脫液可被蒸發和冷凝，由此來將其與脂肪酸的混合物分離。例如，可采用再循環降膜蒸發器、升流蒸發器、刮膜蒸發器、薄層蒸發器、熱虹吸蒸發器、旋轉蒸發器、蒸餾塔、精餾塔或者在裝置底部允許洗脫液蒸發和濃縮脂肪酸濃縮的任何其它蒸發器或蒸發器的組合。所述蒸發優選在比大氣壓低的壓力下，特別是在小于或等于750毫巴，或小于或等于500毫巴，或小于或等于300毫巴的壓力下進行。
[0170]或者，可采用膜分離裝置，其具有一個或若干個分離階段，或蒸發和膜分離裝置的組合。
[0171]在濃縮步驟的末尾獲得的洗脫液(例如，蒸發的和冷凝的，或者其它方式分離的)可被再循環至所述方法的一個或若干個步驟中，特別是一個或若干個色譜分離步驟中。
[0172]由此，優選本發明的方法提供了在第一色譜分離步驟中所用的洗脫液的再循環。更加特別優選地，再循環洗脫液以在第一色譜分離步驟中再使用。
[0173]優選本發明的方法提供了在第二色譜分離步驟中所用的洗脫液的再循環。更加特別優選地，再循環洗脫液以在第二色譜分離步驟中再使用。
[0174]由此，優選本發明的方法提供了在第三色譜分離步驟中所用的洗脫液的再循環。更加特別優選地，再循環洗脫液以在第三色譜分離步驟中再使用。
[0175]根據特別的實施方式，再循環大于50%，優選大于60%，優選大于70%，優選大于80 %，優選大于90 %，優選大于95 %，優選大于98 %，優選大于99 %的由富集有第一PUFA的第一物流分離的洗脫液。
[0176]根據特別的實施方式，再循環大于50%，優選大于60%，優選大于70%，優選大于80 %，優選大于90 %，優選大于95 %，優選大于98 %，優選大于99 %的由富集有第一PUFA的第二物流分離的洗脫液。
[0177]根據特別的實施方式，再循環大于50%，優選大于60%，優選大于70%，優選大于80 %，優選大于90 %，優選大于95 %，優選大于98 %，優選大于99 %的由富集有第一PUFA的第三物流分離的洗脫液。
[0178]根據特別的實施方式，再循環大于50%，優選大于60%，優選大于70%，優選大于80 %，優選大于90 %，優選大于95 %，優選大于98 %，優選大于99 %的由富集有第二脂肪酸的物流分離的洗脫液。
[0179]根據特別的實施方式，再循環大于50%，優選大于60%，優選大于70%，優選大于80 %，優選大于90 %，優選大于95 %，優選大于98 %，優選大于99 %的由富集有第三脂肪酸的物流分離的洗脫液。
[0180]根據特別的實施方式，再循環大于50%，優選大于60%，優選大于70%，優選大于80 %，優選大于90 %，優選大于95 %，優選大于98 %，優選大于99 %的由富集有第四脂肪酸的物流分離的洗脫液。
[0181]優選地，在每個色譜分離單元的進口處供給的且意欲被分離的供給產物是盡可能沒有溶劑的。
[0182]由此:
[0183]-所述初始混合物包含小于80%的有機溶劑，優選小于60%，或小于40%，或小于20%，或小于10%，或小于5%，或小于2%，或小于1%的有機溶劑，以及更加特別優選地為基本上沒有有機溶劑的脂肪酸的混合物；以及/或者
[0184]-適用時，供料至第二色譜分離單元6的富集有第一PUFA的第一物流包含小于80%的有機溶劑，優選小于60%，或小于40%，或小于20%，或小于10%，或小于5%，或小于2%，或小于I %的有機溶劑，以及更加特別優選地為基本上沒有有機溶劑的脂肪酸的混合物；以及/或者
[0185]-供料至第三色譜分離單元10的富集有第一PUFA的第二物流包含小于80%的有機溶劑，優選小于60%，或小于40%，或小于20%，或小于10%，或小于5%，或小于2%，或小于I %的有機溶劑，以及更加特別優選地為基本上沒有有機溶劑的脂肪酸的混合物。
[0186]根據本發明的方法可選地提供了在一個色譜分離之后或在多個色譜分離之后除去(或在數量上減少)被氧化的化合物的步驟。
[0187]優選地，此步驟并非一個色譜分離步驟，且不在色譜分離單元中進行。
[0188]優選地，此步驟基本上不使所述第一PUFA與在該物流中存在的其它脂肪酸分離(除了醛或過氧化物類型的被氧化的化合物之外)。
[0189]所述除去被氧化的化合物的步驟可在處理單元14中進行，處理單元14由富集有第一 PUFA的物流的第三管道12(或如果僅存在兩個色譜分離步驟時由富集有第一 PUFA的物流的第二管道9，或如果僅存在一個色譜分離步驟時由富集有第一 PUFA的物流的第二管道5)直接或間接供料。此單元的出口處連接用于收集第一純化的PUFA的管道15。
[0190]處理單元14可特別地為分子蒸餾單元或短程蒸發器。短程蒸發器設置有內部冷凝器，且可在小于或等于200°C，優選小于或等于150°C，優選小于或等于120°C，優選小于或等于100°C，優選小于或等于80°C的溫度，在優選小于10毫巴，優選小于I毫巴，優選小于0.1毫巴，優選小于0.01毫巴，優選小于0.001毫巴的壓力下，以優選小于1000s，優選小于100s，優選小于1s的停留時間進行蒸餾。
[0191]或者處理單元14可以是用于接觸吸附基質的單元。
[0192]所述吸附基質為能吸附被氧化的化合物(如過氧化物或醛類化合物)的任意基質。其可選自，例如，二氧化硅、氧化鋁、活性炭及它們的衍生物(特別是硅膠、硅酸鹽、鋁酸鹽和鋁硅酸鹽)。粘土 (如膨潤土)為適合的基質的一個實例，類似的還有硅藻土。
[0193]所述吸附可通過經吸附床層的滲濾而間歇(S卩，“分批”)或連續進行。優選地，所述脂肪酸在此步驟期間不被稀釋，且特別地，不添加溶劑。所述接觸可持續，例如，5分鐘至24小時，且特別地，10分鐘至10小時、20分鐘至5小時、30分鐘至2小時以及45分鐘至I小時30分鐘。
[0194]所用吸附劑的量隨吸附劑的性質及其俘獲所述被氧化的化合物的能力而定。其可以是，例如，I至100g吸附劑/kg待處理物流(脂肪酸的混合物)，特別是10至500g/kg，且更特別是25至200g/kg。
[0195]在所述接觸之后，將所述吸附劑與所述脂肪酸的混合物分離，可將所述脂肪酸的混合物過濾以防止由殘余吸附劑導致的任何污染。
[0196]優選地，所述被氧化的化合物與所述吸附劑的結合基本上是不可逆的，即所述吸附劑是不可再生的。不過，例如，可通過熱處理來再生所述吸附劑，以限制處理廢物的體積和/或成本。
[0197]處理單元14中的處理步驟可使處理過的物流的過氧化物指標降低至少25%，優選至少50%，優選至少75%，優選至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%。
[0198]處理單元14中的處理步驟可使處理過的物流的茴香胺指標降低至少25%，優選至少50%，優選至少75%，優選至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%。
[0199]所述過氧化物指標測量在脂肪酸混合物中的過氧化物化合物的量。所用的分析方法優選為Eur Ph 2.5.5方法A。
[0200]所述茴香胺指標測量在脂肪酸混合物中的醛類化合物的量。所用的分析方法優選為Eur Ph 2.5.36。
[0201]根據一個實施方式，來自處理步驟的物流(在用于收集第一純化的PUFA的管道15中收集的產物)的過氧化物指標為小于或等于10，或小于或等于9，或小于或等于8，或小于或等于7，或小于或等于6，或小于或等于5，或小于或等于4，或小于或等于3，或小于或等于2，或小于或等于1.5，或小于或等于I。
[0202]根據一個實施方式，來自處理步驟的物流(在用于收集第一純化的PUFA的管道15中收集的產物)的茴香胺指標為小于或等于20，或小于或等于18，或小于或等于16，或小于或等于14，或小于或等于12，或小于或等于10，或小于或等于9，或小于或等于8，或小于或等于7，或小于或等于6，或小于或等于5。
[0203]類似于上文所述的另一處理步驟，且更加特別地，分子蒸餾步驟，也可被設置在上游，特別是在任何的色譜分離步驟之前。
[0204]獲得的產物
[0205]根據一個實施方式，所述第一PUFA為歐米伽-3脂肪酸。
[0206]根據不同的實施方式，所述第一 PUFA可以是EPA，或DHA，或ARA，或DPA，或SDA。
[0207]根據一個實施方式，所述第一PUFA為EPA，所述第二脂肪酸為飽和或單不飽和脂肪酸，所述第三脂肪酸為DHA或SDA，以及所述第四脂肪酸為不同于所述第三脂肪酸的DHA或SDA。例如，所述第三脂肪酸為DHA而所述第四脂肪酸為SDA。
[0208]所述方法末尾處獲得的最終產物(在用于收集第一純化的PUFA的管道15中，或者如果不存在除去被氧化的化合物的步驟時在用于收集富集有第一 PUFA的物流的第三管道12中，或者如果不存在第三色譜分離步驟或除去被氧化的化合物的步驟時在用于收集富集有第一PUFA的物流的第二管道9中，或者如果不存在第二色譜分離步驟或第三色譜分離步驟或除去被氧化的化合物的步驟時在用于收集富集有第一 PUFA的物流的第一管道5中收集的)中第一PUFA的濃度可大于或等于約80%，優選大于或等于約90%，或大于或等于約95%，或大于或等于約97%，或大于或等于約98%，或大于或等于約99% (相對于全部的脂肪酸)。
[0209]此最終產物中第二脂肪酸的濃度可以是小于或等于約I%，或小于或等于約0.1%,或小于或等于約0.05%,或小于或等于約0.03%,或小于或等于約0.01%(相對于全部的脂肪酸)。
[0210]此最終產物中第三脂肪酸的濃度可以是小于或等于約I%，或小于或等于約0.1%,或小于或等于約0.05%,或小于或等于約0.03%,或小于或等于約0.01%(相對于全部的脂肪酸)。
[0211]此最終產物中第四脂肪酸的濃度可以是小于或等于約I%，或小于或等于約0.1%,或小于或等于約0.05%,或小于或等于約0.03%,或小于或等于約0.01%(相對于全部的脂肪酸)。
[0212]例如，所述方法末尾處獲得的最終產物可包含大于或等于約80%，或大于或等于約95%，或大于或等于約97%，或大于或等于約98%，或大于或等于約99%的比例的EPA(相對于全部的脂肪酸)，以及小于或等于約I %，或小于或等于約0.1%，或小于或等于約0.05%，或小于或等于約0.03%，或小于或等于約0.01%的比例的DHA。
[0213]富集有第一PUFA的油在包裝和/或使用(包括，例如，最終的制劑和/或封裝)之前避空氣避光儲存。
[0214]根據一個實施方式，所述最終產物與藥學上和/或膳食上可接受的載體和/或與賦形劑和/或稀釋劑相結合。由此可以將該產物形成，例如，明膠膠囊劑、膠囊劑或片劑的形式(或以適于口服或局部或非消化道給藥的任何其它形式)。
[0215]每個形式的單個劑量(例如膠囊劑或明膠膠囊劑)可包含，例如，250至1500mg，優選300至100mg的上文的產物。
[0216]所述產物可由此被用于制備藥物組合物，所述藥物組合物用于防治和/或治療和/或預防如高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥和高血壓的心血管疾病；以及如心律不齊、心房和/或心室顫動、心臟代償失調和衰竭的心血管疾病的危險因素;用于梗塞和再梗塞的一級和二級防治；用于治療可由前述PUFA治療的其它任何病變，例如，自身免疫性疾病、潰瘍性結腸炎、腫瘤病變、神經系統疾病、細胞老化、腦梗塞、缺血性疾病、銀肩病。
[0217]或者，所述產物可被用于準藥物用途，特別是膳食用途。
[0218]實施例
[0219]以下實施例非限制性地顯示了本發明。
[0220]實施例1a-實驗室規模的純化步驟
[0221 ]在此實施例中，采用包含大于70%的EPA的乙基酯的混合物通過2個色譜步驟獲得了大于94%的EPA的乙基酯。
[0222]所述EPA在C18反相二氧化硅(其中顆粒具有20μπι的平均直徑)上通過色譜步驟進行純化。所述色譜條件如下:
[0223]-設置有軸向動態壓縮色譜柱(長39cm，直徑5cm)的CYCLOJET?。
[0224]-洗脫液:93/7v/v的甲醇/水。
[0225]收集包含約94%的EPA(CPG中的面積)和小于0.1 %的DHA的餾分。此餾分中的EPA的回收率大于95%。單位生產率為2.76kg純EPA/kg固定相/日。洗脫液的單位消耗量為224L/kg純EPA。
[0226]在真空下運行的旋轉蒸發儀中濃縮之后，濃縮餾分包含小于1%的殘余溶劑。
[0227]實施例1b (對比)
[0228]在此實施例中，利用93/7v/v的甲醇/水洗脫液，在設置有5根色譜柱(長9cm，直徑4.8cm)的VARIC0L?系統中純化前述實施例的包含大于70 %的EPA的乙基酯的混合物。
[0229]所述提余液包含約92 %的EPA(CPG中的面積)和小于0.1 %的DHA。所述提余液中的EPA的回收率大于95%。單位生產率為2.46kg純EPA/kg固定相/日。洗脫液的單位消耗量為258L/kg純EPA。
[0230]所述CYCL0JET?的單位生產率因此比所述VARIC0L?的單位生產率高12%，且其洗脫液的單位消耗量相對于所述VARIC0L?少13%。令人意想不到地，對于此一步純化來說，所述CYCLO JET?產生了比所述VARIC0L?更好的效果。
[0231]實施例2a_實驗室規模的利用CYCL0JETT%^超純化
[0232]在此實施例中，采用實施例1a中獲得的產物通過色譜步驟獲得了大于96%的EPA的乙基酯。
[0233]所述EPA在C18反相二氧化硅(其中顆粒具有20μπι的平均直徑)上進行純化。所述色譜條件如下:
[0234]-設置有軸向動態壓縮色譜柱(長39cm，直徑5cm)的Cyclojet。
[0235]-洗脫液:79/21v/v的丙酮/水。
[0236]收集的餾分之一包含約96.8%的EPA(CPG中的面積)和小于0.1%的DHA。此提取物中的EPA的回收率為約95%。單位生產率為3.58kg純EPA/kg固定相/日。洗脫液的單位消耗量為 153L/kg 純 EPA。
[0237]在真空下運行的旋轉蒸發儀中濃縮之后，濃縮餾分包含小于1%的殘余溶劑。
[0238]實施例2b (對比)
[0239]在此實施例中，利用79/21v/v的丙酮/水洗脫液，在設置有5根色譜柱(長9cm，直徑
4.8cm)的VARIC0L?中純化實施例1a中獲得的濃縮提余液。
[0240]提取物包含約97 %的EPA(CPG中的面積)和小于0.1 %的DHA。所述提取物中的EPA的回收率為約95 % ο單位生產率為3.35kg純EPA/kg固定相/日。
[0241]所述Cyclo jet的單位生產率比所述VARIC0L?的單位生產率高7 %。令人意想不到地，對于第二步純化來說，所述Cyclo jet產生了比所述VARIC0L?更好的生產率。
[0242]實施例3-中試規模的三步純化
[0243]在此實施例中，采用包含大于50%的EPA的乙基酯的混合物通過三個色譜步驟獲得了大于96 %的EPA的乙基酯。
[0244]所述EPA在C18反相二氧化硅上通過三個色譜步驟進行純化。所述色譜條件如下:
[0245]步驟I:
[0246]-設置有5根色譜柱(長9cm，直徑59cm)的VARIC0L?。色譜柱的配置:在區域1/2/3/4中分別為 1/1.6/1.6/0.8。
[0247]-洗脫液:90/10v/v的丙酮/水。
[0248]提余液包含約70%的EPA(CPG中的面積)。在真空下運行的旋轉蒸發儀中濃縮之后，濃縮提余液包含小于I %的殘余溶劑。
[0249]步驟2:
[0250]-設置有軸向動態壓縮色譜柱(長49cm，直徑30cm)的Cyclojet。
[0251]-洗脫液:93/7v/v的甲醇/水。
[0252]收集的餾分包含約94%的EPA(CPG中的面積)和小于0.1 %的DHA。此餾分中的EPA的回收率大于95 %。
[0253]在真空下運行的旋轉蒸發儀中濃縮之后，濃縮餾分包含小于1%的殘余溶劑。
[0254]步驟3:
[0255]-設置有軸向動態壓縮色譜柱(長49cm，直徑30cm)的Cyclojet。
[0256]-洗脫液:79/21v/v的丙酮/水。
[0257]收集的餾分包含約96.8%的EPA(CPG中的面積)和小于0.1 %的DHA。此餾分中的EPA的回收率大于95 %。
[0258]在真空下運行的旋轉蒸發儀中濃縮之后，濃縮餾分包含小于1%的殘余溶劑。
【主權項】
1.一種利用初始混合物純化第一脂肪酸的方法，所述初始混合物還包含至少一種第二脂肪酸、可選的第三脂肪酸和可選的第四脂肪酸，其中，所述方法包括: -第一液相色譜分離步驟，利用所述初始混合物，在第一色譜分離單元中進行，使得可以在一方面回收富集有第一脂肪酸的第一物流，并在另一方面回收富集有第二脂肪酸的物流； -可選地，第二液相色譜分離步驟，利用所述富集有第一脂肪酸的第一物流，在第二色譜分離單元中進行，使得可以在一方面回收富集有第一脂肪酸的第二物流，并在另一方面回收富集有第三脂肪酸的物流； -可選地，第三液相色譜分離步驟，利用所述富集有第一脂肪酸的第三物流，在第三色譜分離單元中進行，使得可以在一方面回收富集有第一脂肪酸的第三物流，并在另一方面回收富集有第四脂肪酸的物流， 所述第一色譜分離單元、所述第二色譜分離單元和所述第三色譜分離單元中的至少一個為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元。2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述第一色譜分離單元為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元;和/或所述第二色譜分離單元為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元;和/或所述第三色譜分離單元為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元。3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述第一色譜分離單元、所述第二色譜分離單元和所述第三色譜分離單元中的至少兩個單元為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元。4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中，所述第一色譜分離單元、所述第二色譜分離單元和所述第三色譜分離單元中的至少一個，且優選所述第一色譜分離單元，為具有若干個色譜柱的色譜分離單元;且更特別優選地，為模擬移動床或真實移動床系統，或者為以非同步的方式定期更改物流的進樣點和收集點的系統。5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中: -所述第一色譜分離步驟使用第一洗脫液進行，所述第一洗脫液為水-有機洗脫液；以及/或者 -適用時，所述第二色譜分離步驟使用第二洗脫液進行，所述第二洗脫液為水-有機洗脫液；以及/或者 -適用時，所述第三色譜分離步驟使用第三洗脫液進行，所述第三洗脫液為水-有機洗脫液。6.根據權利要求5所述的方法，其中: -所述第一洗脫液為酮/水混合物，更特別優選地，為丙酮/水； -適用時，所述第二洗脫液為醇/水混合物，更特別優選地，為甲醇/水； -適用時，優選地，所述第三洗脫液為酮/水混合物，更特別優選地，為丙酮/水； -適用時，優選地，所述第一洗脫液不同于所述第二洗脫液，以及適用時，優選地，所述第三洗脫液不同于所述第一洗脫液且不同于所述第二洗脫液。7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中: -將第一洗脫液的有機溶劑的質量濃度控制為在2%以內，優選為在I %以內，或為在0.5%以內，或為在0.2%以內，或為在0.1%以內； -適用時，優選地，將第二洗脫液的有機溶劑的質量濃度控制為在2%以內，優選為在1%以內，或為在0.5%以內，或為在0.2%以內，或為在0.1%以內； -適用時，優選地，將第三洗脫液的有機溶劑的質量濃度控制為在2%以內，優選為在1%以內，或為在0.5%以內，或為在0.2%以內，或為在0.1%以內。8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中，所述第一脂肪酸為第一多不飽和脂肪酸，并且，例如: -所述第一多不飽和脂肪酸為二十碳五烯酸，且優選在所述方法的末尾以大于或等于80%、或大于或等于90%、或大于或等于96%的純度被回收;或者 -所述第一多不飽和脂肪酸為二十二碳六烯酸，且優選在所述方法的末尾以大于或等于70%、或大于或等于80%、或大于或等于90%、或大于或等于95%的純度被回收;或者-所述第一多不飽和脂肪酸為花生四烯酸，且優選在所述方法的末尾以大于或等于70%、或大于或等于80%、或大于或等于90%、或大于或等于95%的純度被回收;或者 -所述第一多不飽和脂肪酸為二十二碳五烯酸，且優選在所述方法的末尾以大于或等于70%、或大于或等于80%、或大于或等于90%、或大于或等于95%的純度被回收。9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，包括: -至少一個在所述第一脂肪酸與比所述第一脂肪酸保留更久的一種或多種化合物之間的色譜分離步驟，以及優選至少兩個在所述第一脂肪酸與比所述第一脂肪酸保留更久的一種或多種化合物之間的色譜分離步驟;以及/或者 -至少一個在所述第一脂肪酸與比所述第一脂肪酸保留更短的一種或多種化合物之間的色譜分離步驟;以及其中所述方法優選包括: -第一色譜分離步驟，其為所述第一脂肪酸與比所述第一脂肪酸保留更久的一種或多種化合物之間的色譜分離步驟;然后第二色譜分離步驟，其為所述第一脂肪酸與比所述第一脂肪酸保留更久的一種或多種化合物之間的色譜分離步驟；以及第三色譜分離步驟，其為所述第一脂肪酸與比所述第一脂肪酸保留更短的一種或多種化合物之間的色譜分離步驟。10.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中，所述第一色譜分離單元、所述第二色譜分離單元和所述第三色譜分離單元中的至少一個包括具有大于或等于5cm、或大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的長度;和/或具有大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的直徑的分離色譜柱。11.根據權利要求1至10中任一項所述的方法，其中: -供料至所述第一色譜分離單元的初始混合物包含小于80%的有機溶劑，優選小于60%，或小于40%，或小于20%，或小于10%，或小于5%，或小于2%，或小于I %的有機溶劑，以及更加特別優選地為基本上沒有有機溶劑的脂肪酸的混合物；以及/或者 -適用時，供料至所述第二色譜分離單元的富集有第一脂肪酸的第一物流包含小于80 %的有機溶劑，優選小于60 %，或小于40 %，或小于20 %，或小于10 %，或小于5 %，或小于2%，或小于1%的有機溶劑，以及更加特別優選地為基本上沒有有機溶劑的脂肪酸的混合物；以及/或者 -適用時，供料至所述第三色譜分離單元的富集有第一脂肪酸的第二物流包含小于80 %的有機溶劑，優選小于60 %，或小于40 %，或小于20 %，或小于10 %，或小于5 %，或小于2%，或小于1%的有機溶劑，以及更加特別優選地為基本上沒有有機溶劑的脂肪酸的混合物。12.—種利用初始混合物純化第一脂肪酸的設備，其中，所述設備包括: -第一液相色譜分離單元(3)，其通過初始混合物的供料管道(I)供料，以及在出口處一方面連接富集有第一脂肪酸的物流的第一管道(5)，且另一方面連接富集有第二脂肪酸的物流的管道(4); -可選地，第二液相色譜分離單元(6)，其通過富集有第一脂肪酸的物流的第一管道(5)供料，以及在出口處一方面連接富集有第一脂肪酸的物流的第二管道(9)，且另一方面連接富集有第三脂肪酸的物流的管道(8); -可選地，第三液相色譜分離單元(10)，其通過富集有第一脂肪酸的物流的第二管道(9)供料，以及在出口處一方面連接富集有第一脂肪酸的物流的第三管道(12)，且另一方面連接富集有第四脂肪酸的物流的管道(13); 其中，所述第一色譜分離單元(3)、所述第二色譜分離單元(6)和所述第三色譜分離單元(10)中的至少一個為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元。13.根據權利要求12所述的設備，其中，所述第一色譜分離單元(3)為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元;和/或所述第二色譜分離單元(6)為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元;和/或所述第三色譜分離單元(10)為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元；以及優選地，所述第一色譜分離單元(3)、所述第二色譜分離單元(6)和所述第三色譜分離單元(10)中的至少兩個單元為穩態循環的具有單一色譜柱的固定床色譜分離單元。14.根據權利要求12或13所述的設備，其中，所述第一色譜分離單元(3)、所述第二色譜分離單元(6)和所述第三色譜分離單元(10)中的至少一個，且優選所述第一色譜分離單元(3)，為具有若干個色譜柱的色譜分離單元;且更特別優選地為模擬移動床或真實移動床系統，或者為以非同步的方式定期更改物流的進樣點和收集點的系統。15.根據權利要求12至14中任一項所述的設備，其中，所述第一色譜分離單元(3)、所述第二色譜分離單元(6)和所述第三色譜分離單元(10)中的至少一個包括具有大于或等于5cm、或大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的長度;和/或具有大于或等于大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的直徑的分離色譜柱。
【文檔編號】C07C57/03GK105848748SQ201480071100
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年12月9日
【發明人】讓·布萊奧, 埃里克·瓦萊里
【申請人】諾瓦塞普工藝公司