多孔性吸附介質，含有該介質的吸附裝置和層析系統的制作方法
【專利說明】多孔性吸附介質，含有該介質的吸附裝置和層析系統
[0001 ]本申請為一項發明專利申請的分案申請，其母案的申請日為2008年8月14日、申請 號為200810171406.0、發明名稱為"多孔性吸附介質，含有該介質的吸附裝置和層析系統"。
[0002] 本申請優先權為2007年8月14日提交的U. S.臨時申請系列no. 60/964653和2008年 3月25日提交的U.S.臨時申請系列no.61/070708,其通過參考文獻并入本申請。
【背景技術】
[0003] 本申請涉及基于聚合性伯胺的陰離子交換層析介質，包括那種介質的陰離子吸附 器，以及包括這種吸附器的層析系統。吸收指的是通過滲透到吸附材料的體內吸收物質。吸 附指的是分子從體相運動到吸附介質的表面上。吸附作用是包括吸附和吸收的總稱。同樣 的，這里的吸附材料或吸附裝置表示吸附器，指的是吸附或吸收、或者吸附和吸收的材料或 裝置。這種介質特別應用為用于流通模塊的多孔性膜吸附器以及更特別的不含單獨外室的 模塊。
[0004] 強的陰離子交換器，例如那些基于季銨鹽的陰離子交換器，作為拋光介質用于下 游過程以捕獲帶負電荷的大型雜質，例如內毒素、病毒、核酸和宿主細胞蛋白質(HCP)，它們 存在于流體例如生物流體，特別是人造生物治療劑的溶液中。習慣上，陰離子交換器以小球 的形式提供和使用，例如從GE Healthcare Bio-sciences AB商購獲得的Q Sepharose1"。但 是小球基系統的生產量限制需要大體積的柱子以便有效的捕獲雜質。
[0005] 在小球基的層析中，大部分可用于吸附的表面積在小球的內部。因此，由于傳質速 率典型的被孔隙擴散所控制，分離過程實質上很緩慢。為了使這種擴散抵抗性最小化且伴 隨著最大化的動態結合容量，可以使用小直徑的小球。但是，小直徑小球的使用在提高了價 格的同時使柱壓下降。因此，制備層析分離的最優化通常包括在效率/動態容量(小型小球 易出現)和柱壓下降(大型小球易出現)之間折衷。
[0006] 相反，膜基層析系統(還稱為膜吸附器)具有直接與對流膜孔隙相連的配體，由此 消除了傳質上內部孔隙擴散的影響。此外，與有效的流動分配器結合使用的具有致密的孔 隙尺寸分布的微孔膜基質的使用可以使軸向分散最小化，并提供所有活性位點的均一利 用。因此，膜吸附器介質的傳質速率會比標準的小球基層析介質高一個數量級，這便允許了 高的效率和高通量分離。由于單一的或甚至堆疊的膜與用小球基介質堆積的柱子相比是非 常薄的，發現沿著層析床的壓力降減小了，從而使得流動速率和生產率增加。通過使用具有 足夠內表面積的膜，生產具有非常大的直徑與長度比（d/h)外形的裝置來達到必要的結合 容量。
[0007] 設計合適的膜吸附器具有比標準預制的小球基樹脂好10-100倍的層析效率。因 此，為了在膜吸附器上獲得相同水平的分離，可以使用打10次折以下的床高。對于膜吸附器 來說，與10-30cm床高的小球基系統相比，1-5_的床長是標準的。由于大體積的膜吸附器要 求極端的柱形比例，裝置的設計是關鍵性的。為了保持與膜吸附器相關聯的內在行為的優 勢，要求適當的進口和出口分配器以高效地且有效地利用獲得的膜體積。膜吸附器技術理 想的適用于這一應用。但是現在的膜吸附器有各種各樣的缺點，包括低的結合強度，在去除 病毒、內毒素和核酸方面所表現出的難度。
[0008] 當后者流動通過它的孔隙時，高多孔性的、介質相互連接的膜吸附器具有除去(吸 附和/或吸收)一些溶液組分的能力。膜吸附器的這種性質和它在必需的應用中表現良好的 能力取決于介質（骨架）的孔隙結構以及暴露于溶液中的表面的性質。典型的，首先由不溶 于水或在水中溶脹的聚合物形成多孔性介質，且其具有可接受的機械性質。多孔性介質優 選為通過現有技術公知的相分離方法制備的多孔性膜片。參見，例如Zeman LJ，Zydney AL， Microfiltration and Ultraf iltration:Principles and Applications ?NewYork: Marcel Dekker，1996。中空纖維和管狀膜也是可接受的骨架。通常要求分離處理步驟以改 性形成的多孔性結構的外部或正面表面以及內部孔隙表面以便賦予其必要的吸附特性。因 為膜結構經常由疏水性聚合物形成，表面改性步驟的另一個目的在于使表面成為親水性的 或水可潤濕的。
[0009] 這里存在著大量的改性膜的外部或正面表面以及內部孔隙表面的方法。那些本領 域的技術人員將會容易的認識到具有代表性的方法，包括吸附、等離子氧化、原位自由基聚 合、接枝和涂布。這些方法的大多數都導致在膜的表面上相成類似單層的結構，這在大多數 時候獲得了使其親水的目標，但是卻不能賦予其可接受的吸附特性，例如對于被吸附物的 高容量。這一容量定義為可以被給定的介質體積保留的被吸附物的量(重量）。既然吸附發 生在膜的表面，這一容量將會受到膜表面積的限制。由于它們的特性，微孔膜與層析小球相 比具有較低的表面積。一種增加其表面積的方法為降低孔隙尺寸，這明顯的導致失去大量 的通量。例如，不考慮表面相互作用的類型，在〇 .65μηι聚乙稀膜(Entegris Corp，Billerica ΜΑ)上蛋白質吸附的最大值(單層)為大約20mg/ml。這遠遠少于例如瓊脂糖層析小球，其典 型的容量為大約80mg/ml。
[0010] 推動吸附的表面相互作用的類型是通過其中所使用的給定的膜吸附器產品的特 定應用定義的。現在，存在著從單克隆抗體(MABs)的溶液中除去病毒、核酸、內毒素和宿主 細胞蛋白質(HCPs)的高容量、高親合力吸附器的需要。這些雜質傾向于具有比MABs更低的 等電點，這就意味著在某一pH值下它們將會是負電性的而MAB降是正電性的。要求用陰離子 交換器，即承載正電荷并且吸引陰離子的介質除去這些雜質。許多化學成分在水溶液中都 帶有正電荷，包括伯、仲和叔胺以及季銨鹽。這些胺在pH值低于11時都是正電性的，而季銨 鹽在所有pH值下都帶有正電荷，因此這些基團通常分別被稱為弱的或強的陰離子交換器。
[0011] 陰離子交換器具有多個吸引并保留多種雜質和污染物的正電性結合位點。可以潛 在除去的雜質的量是膜上這些結合位點濃度的函數，且由于配體的化學特性（以及這些配 體的濃度)決定了其對不同雜質的結合強度。高強度的結合是對提高雜質，例如宿主細胞蛋 白質，去除的關鍵性貢獻。結合強度(SB)涉及洗脫結合的雜質所需要的溶液離子強度。膜吸 附器的SB(用傳導單元衡量，mS/cm)按照如下方法測定。首先，使少量的被吸附物的溶液通 過膜吸附器以使被吸附物結合在膜吸附器上。第二，用增加梯度的無機鹽，例如氯化鈉，洗 脫膜吸附器。記錄需要將被吸附物洗脫掉的洗脫溶液的最小傳導性并將其定義為膜吸附器 的SB。通過增加吸附器的結合強度，可以使負電性雜質不可逆轉的結合在膜吸附器上，由此 顯著的提高了去除的功效。這對于從抗體流中除去宿主細胞蛋白質的弱結合種群是特別重 要的。
[0012] 常規的流通陰離子交換器典型地含有負責吸引和結合負電性雜質，卻排斥正電性 產物分子的季銨鹽配體。常識要求為了通過電荷的相互作用較強地與雜質結合，強的陰離 子交換器即在所有pH值都具有正電荷的陰離子交換器是必要的。而本發明證明了其它的方 式。本發明發現聚合性伯胺，優選為具有共價連接在聚合物主鏈上的伯胺的脂肪族聚合物、 更優選具有通過至少一個脂肪族基團共價連接在聚合物主鏈上的伯胺，優選為亞甲基基 團，較強的與除去電負性雜質的物質結合并且因此是優選的用于在膜吸附器的表面形成吸 附性水凝膠的材料種類。
[0013]單克隆抗體作為治療和診斷試劑持續具有重要性。用于候選mABs的篩選雜種細胞 庫的方法既耗時又費工。一旦表示出合適mABs的雜種細胞鏈建立起來，就必須發展純化方 法學以制備足夠的用于進一步表征的mAB。用于純化的傳統的方法包括使用蛋白質A或蛋白 質G親合層析。使純化的抗體除鹽并在生物緩沖液中使用透析交換。如果多重mABs平行的進 行評價，全部的過程典型的需要幾天來完成并且特別麻煩。
[0014] U. S.專利No.6090288教導了含有用于多肽和核酸分離的層析介質的氨基基團的 制備。其揭示了與強的陰離子交換配體相比，從弱陰離子交換配體中洗脫蛋白質需要更高 的離子強度。公開的分離介質的重要的結構特征在于"在距離氨基氮2到3個原子處存在羥 基基團或伯、仲或叔胺基團"。在這里，例如，我們指出純聚烯丙胺聚合物的松散交聯涂層并 不需要任何促進與蛋白質更高強度結合的額外基團。
[0015] U.S.專利No. 5304638教導了使用包含載有眾多聚胺基團的水不溶性基體的分離 蛋白質的方法。其中一個實施例展示了制備聚烯丙胺改性的瓊脂糖層析凝膠。但是5304638 發明沒有認識到使用伯胺與使用仲胺和叔胺相比的重要性。沒有與控制涂層厚度以最優化 吸附作用相關的或與用于穩定交聯涂層相關的努力或描述。他們強調優選的氮原子對之間 的碳原子數不超過3個。他們介紹了一個基于聚胺基團的結構和pH計算的經驗函數Q，且其 具有優選的至少1.5的值。在聚烯丙胺中，相鄰最近的氮原子之間有5個碳原子，且用于它的 Q函數應當接近0.1。
[0016] U. S.專利No. 5547576教導了制備一種具有固定聚胺涂層并且可以用于從水溶液 中除去病毒的多孔性膜。涂層的制備包括首先在膜的表面接枝自由基，并且然后使自由基 與聚胺化合物反應。由于內在的復雜性，接枝改性經常是不切實際的：它們對自由基接枝的 特別的基質敏感，并且在制造環境中實施起來是