氧化石墨烯-重組鏈球菌蛋白a復合材料及其制備方法和應用
【專利說明】氧化石墨烯-重組鏈球菌蛋白A復合材料及其制備方法和應用
[0001]
技術領域
[0002]本發明屬于化學合成技術領域，涉及石墨烯復合材料制備技術及其在蛋白質富集中的應用，具體的說是一種基于氧化石墨烯-重組鏈球菌蛋白A復合材料的制備及其功能化應用。
【背景技術】
[0003]傳染病病原體本身作為抗原在生物機體內可產生相應特異的抗體，現有檢測方法多是通過抗原-抗體間的特異識別來檢測病原體的，如酶聯免疫吸附技術、免疫熒光和免疫膠體金技術等。這些免疫學技術具有操作簡便，結果易于分析等特點，然而免疫學檢測方法的靈敏度相對較低，易造成結果的假陰性。為了提高免疫學檢測方法對傳染病病原體的檢測靈敏度，通常對樣品進行富集。對樣品進行有效的前處理，可提高待檢測樣品中抗體的濃度，從而間接提高檢測方法的靈敏度。目前針對抗體富集的商品化試劑多以瓊脂糖、海藻糖為載體固載吸附抗體的重組鏈球菌蛋白A，如瓊脂糖固載Protein G約為80ug/mL，其固載蛋白量較低。因此研制對目標蛋白固載量大的載體，并通過有效固載重組鏈球菌蛋白A，對于實現抗體富集具有重要意義。
[0004]石墨烯是一種僅有一個碳原子厚度的二維納米材料，是碳原子以SP2雜化軌道組成的六角形蜂巢晶格的平面薄膜。2004年由Novoselov等用膠帶層層剝離法從石墨中分離得到，其理論厚度僅為0.335 nm。單層石墨烯成為繼碳納米管之后的新型碳納米材料，在物理、化學、材料、生物等眾多領域掀起了巨大的研究熱潮。石墨烯中無碳原子缺失，機械強度高、結構穩定、熱穩定性好、化學穩定性高、比表面積大(2600 m2*g-l)，而且具有良好的生物相容性，使其容易吸附其他生物分子，特別是氧化石墨烯除擁有大比表面積外，在其表面還存在大量的含氧基團，使氧化石墨烯更適用于吸附擁有較多化學基團的生物分子，如蛋白質、核酸等。當石墨烯材料與其他材料相復合時，利用其他材料的相關性質，即可實現生物分子的富集。
【發明內容】
[0005]有鑒于此，本發明利用氧化石墨烯的高比表面積的特性，通過共價結合的方法，將重組鏈球菌蛋白A固載到氧化石墨烯材料上，制備出具有抗體吸附生物活性的高容量抗體富集材料。具體技術方案如下。
[0006]本申請提供的氧化石墨烯-重組鏈球菌蛋白A復合材料為重組鏈球菌蛋白A(PA)與固載聚乙烯亞胺的氧化石墨烯的共價結合物，所述固載聚乙烯亞胺(PEI)的氧化石墨烯與重組鏈球菌蛋白A的質量數之比為1:1.5-2ο
[0007]本申請中所述氧化石墨烯-重組鏈球菌蛋白A復合材料的制備方法包括如下步驟:
1)活化氧化石墨烯；
2)向I份活化的氧化石墨烯GO中加入15-30份聚乙烯亞胺(PEI)，室溫震蕩，離心后去上清，沉淀，即得固載PEI的氧化石墨烯材料(GOOPEI);
3)活化PA;
4)按照GOOPEI與活化的PA質量數之比為:1:1.5-2的比例，將上述GOOPEI與活化的PA，混合進行振蕩孵育；離心后去上清，材料洗滌，所得材料即為氧化石墨烯-重組鏈球菌蛋白A復合材料(GO-PA)。
[0008]進一步地，上述步驟I)中所述活化氧化石墨烯的具體步驟為:將GO重懸于去離子水中，室溫超聲將充分分散；按I份GO材料中同時加入15-25份N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和5-10份1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)混勻后進行活化；材料洗滌后，即得活化的氧化石墨烯G0。
[0009]進一步地，上述步驟3)中所述重組鏈球菌蛋白A的活化過程為:將PA溶于2- (N-嗎啉基)乙磺酸4-嗎啉乙磺酸(MES)溶液中；按I份PA中同時加入3_5份N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和7-10份1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)混勻后進行活化，材料洗滌后，即得活化的PA。
[0010]本申請提供的氧化石墨烯-重組鏈球菌蛋白A復合材料可以用在抗體純化、抗體富集、病原體檢測和/或生物樣品前處理等領域中。
[0011]本發明具有如下優點:
1.本發明了優化了氧化石墨烯材料對重組鏈球菌蛋白A的固載條件，保持了蛋白的活性，并且提高了蛋白的固載量；
2.該方法的制備步驟簡便、易于推廣、重現性好；
3.該方法制備氧化石墨烯-重組鏈球菌蛋白A復合材料易于大規模生產，成本低。
【附圖說明】
[0012]圖1.制備材料抗體吸附檢測。
【具體實施方式】
[0013]下面結合實施例對本發明做進一步說明。
[0014]實施例1
(一)氧化石墨烯(GO)的活化
1.1mg GO重懸于ImL的去離子水中，室溫超聲3h，充分分散；
2.加入500mM (pH6.1)MES 500 μ L，然后同時 30mg/ml NHS 500 μ L 和 10mg/ml EDC600uL,混勻，室溫快速攪拌30min ；
3.材料用500mM(pH6.1) MES反復洗滌，除去殘余的NHS和EDC，終體積為lmL。
[0015](二)將活化的氧化石墨烯材料進行PEI修飾
1.在上述材料中加入15mgPEI，室溫震蕩Ih ;
2.16400Xg/10min離心后去上清，沉淀即為GOOPEI。
[0016](三)重組鏈球菌蛋白A的活化 1.取500ug PA 溶于 500mM (pH6.1) MES ImL 中；
2.然后同時加入1.5mg NHS和3.5mg EDC混勻，快速攪拌30min ；
3.溶液即為活化的PA。
[0017](四)氧化石墨烯固載重組鏈球菌蛋白A
1.選擇按照1:1.5的比例，將上述(二)制備的材料GOOPEI與(三)制備的活化的PA，混合進行4°C振蕩過夜孵育；
2.16400Xg/10min離心后去上清，加入500mM (pH6.1)MES洗滌三次，所得材料即為氧化石墨烯-重組鏈球菌蛋白A (GO-PA)復合材料。
[0018](五)固載材料功能檢測
將制備的GO-PA復合材料經牛血清白蛋白封閉后，與異硫氰酸熒光素(FITC)標記的免疫球蛋白A (IgA)孵育2h，通過倒置熒光顯微鏡觀察，如圖1所示，A圖為白光場，不規則狀物質即為GO-PA復合材料，B圖為相應位置的綠色熒光場，在400倍視野下通過左右對比可見，GO-PA復合材料周邊有明顯的熒光表達，說明FITC標記的IgA被吸附在材料上，提示GO-PA復合材料上蛋白A的活性保持良好。
[0019]實施例2
氧化石墨稀(GO)的活化方案中，NHS濃度改為50mg/ml，其他同實施例1，可制備得GO-PA復合材料。
[0020]實施例3
氧化石墨稀(GO)的活化方案中，NHS濃度改為40mg/ml，其他同實施例1，可制備得GO-PA復合材料。
[0021]實施例4
氧化石墨稀(GO)的活化方案中，EDC濃度改為20mg/ml，其他同實施例1，可制備得GO-PA復合材料。
[0022]實施例5
氧化石墨稀(GO)的活化方案中，EDC濃度改為15mg/ml，其他同實施例1，可制備得GO-PA復合材料。
[0023]實施例6
將活化的氧化石墨烯材料進行PEI修飾方案中，PEI調整為30mg，其他同實施例1，可制備得GO-PA復合材料。
[0024]實施例7
將活化的氧化石墨烯材料進行PEI修飾方案中，PEI調整為20mg，其他同實施例1，可制備得GO-PA復合材料。
[0025]實施例8
將活化的氧化石墨烯材料進行PEI修飾方案中，PEI調整為25mg，其他同實施例1，可制備得GO-PA復合材料。
[0026]實施例9
重組鏈球菌蛋白A的活化方案中，NHS調整為2.5mg，其他同實施例1，可制備得GO-PA復合材料。
[0027]實施例10 重組鏈球菌蛋白A的活化方案中，NHS調整為2.0mg，其他同實施例1，可制備得GO-PA復合材料。
[0028]實施例11
重組鏈球菌蛋白A的活化方案中，EDC調整為5mg，其他同實施例1，可制備得GO-PA復合材料。
[0029]實施例12
重組鏈球菌蛋白A的活化方案中，EDC調整為4.0mg,其他同實施例1，可制備得GO-PA復合材料。
[0030]實施例13
氧化石墨烯固載重組鏈球菌蛋白A方案中，比例調整為1:2，其他同實施例1，可制備得GO-PA復合材料。
[0031]實施例14
氧化石墨烯固載重組鏈球菌蛋白A方案中，比例調整為1:1.7，其他同實施例1，可制備得GO-PA復合材料。
[0032]實施例15
GOOPG材料蛋白A固載量分析。在實施例1的固載條件下，利用BCA蛋白定量原理，測定材料GO與PA混合孵育后不同時間上清的蛋白A含量，可間接測得材料蛋白A的固載量為1.5mg/mg0按照商品試劑瓊脂糖固載ProteinG 80ug/mL比較，lmg/ml石墨稀固載蛋白G 1500ug，其固載量可大大提高。
[0033]實施例16
GOOPG材料蛋白A固載量分析。在實施例2-實施例14的固載條件下，利用BCA蛋白定量原理，測定材料GO與PA混合孵育后不同時間上清的蛋白A含量，可間接測得材料蛋白A的固載量在0.5mg/mg-l.5mg/mg之間，與商品試劑瓊脂糖固載ProteinG 80ug/mL比較，其固載量大大提高。
[0034]以上所述，僅為本發明的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應所述以權利要求的保護范圍為準。
【主權項】
1.氧化石墨烯-重組鏈球菌蛋白A復合材料，其特征在于，所述復合材料為重組鏈球菌蛋白A與固載聚乙烯亞胺的氧化石墨烯的共價結合物，所述固載聚乙烯亞胺的氧化石墨烯與重組鏈球菌蛋白A的質量數之比為1:1.5-2ο2.一種權利要求1所述復合材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: O活化氧化石墨烯； 2)向I份活化的氧化石墨烯中加入15-30份聚乙烯亞胺，室溫震蕩，離心后去上清，沉淀即得固載聚乙烯亞胺的氧化石墨烯材料； 3)活化重組鏈球菌蛋白A; 4)按照比例，將上述固載聚乙烯亞胺的氧化石墨烯材料與活化的重組鏈球菌蛋白A混合并進行振蕩孵育；離心后去上清，洗滌材料后，即得氧化石墨烯-重組鏈球菌蛋白A復合材料。3.根據權利要求2所述復合材料的制備方法，其特征在于，步驟I)所述活化氧化石墨烯的具體步驟為:將氧化石墨烯重懸于去離子水中，室溫超聲將充分分散；按I份氧化石墨烯材料中同時加入15-25份N-羥基丁二酰亞胺和5-10份1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽混勻后進行活化；洗滌材料后，即得活化的氧化石墨烯。4.根據權利要求2所述復合材料的制備方法，其特征在于，步驟3)所述重組鏈球菌蛋白A的活化過程為:將重組鏈球菌蛋白A溶于2-(N-嗎啉基)乙磺酸4-嗎啉乙磺酸溶液中；按I份重組鏈球菌蛋白A中同時加入3-5份N-羥基丁二酰亞胺和7-10份1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽混勻后進行活化，洗滌材料后，即得活化的重組鏈球菌蛋白A。5.一種權利要求1所述的氧化石墨烯-重組鏈球菌蛋白A復合材料在抗體純化、抗體富集、病原體檢測和/或生物樣品前處理過程中的應用。
【專利摘要】本發明涉及一種氧化石墨烯-重組鏈球菌蛋白A復合物材料及其制備方法和應用。本申請利用氧化石墨烯的高比表面積的特性，通過共價結合的方法，將重組鏈球菌蛋白A固載到氧化石墨烯材料上，制備出具有抗體吸附生物活性的高容量抗體富集材料。制得的氧化石墨烯-重組鏈球菌蛋白A復合材料可用于抗體純化、抗體富集、病原體檢測、生物樣品前處理等領域。
【IPC分類】B01J20/26, C07K1/22, B01J20/30
【公開號】CN105195106
【申請號】CN201510581795
【發明人】李云峰
【申請人】李云峰
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月15日