專利名稱：雙水相分配和溶劑變溫反萃提取黃芩黃酮類物質的方法
技術領域：
本發明涉及提取方法，尤其涉及雙水相分配和溶劑變溫反萃提取黃芩黃酮類物質的方法。
雙水相系統(ATPS)就是當兩種聚合物或一種聚合物與一種鹽溶于水中而形成溶液時，由于聚合物溶液間或聚合物與無機鹽溶液間具有不相容性，致使當聚合物和無機鹽的濃度達到一定值以上時，就會分成互不相溶的兩相系統，由于其共同溶劑是水，就稱此系統為雙水相系統。常見的用于生物物質分離的聚合物/聚合物系統有聚乙二醇(PEG)/葡聚糖，聚合物/無機鹽系統有PEG/磷酸鹽，PEG/硫酸銨等。相對于葡聚糖來說，無機鹽價格便宜，所以聚合物/無機鹽系統在工業應用上具有更為廣闊的前景。
ATPS的應用減少了分離過程的步驟，具有較高產率，低能耗和設備投資少等優點。但它的缺點是化學品的消耗量大。顯然，要使它成為一種有競爭力的大規模分離手段，就必須降低化學品的成本或減少使用量。因此，開發新型、廉價的成相劑和研究聚合物回收的方法顯得極為重要。事實上，經雙水相分配后的物質仍留在上相或下相，往往與系統中的聚合物一起存在。而無論從純化的角度或是聚合物回收的角度來看，都要求目的產物與聚合物分開。一般來說，脫除聚合物的方法主要有萃取、超濾、電泳和色譜分離等，但是這些方法既費時，且費用又大。而溫度誘導雙水相相分配技術，能不借助于其它手段，就可達到將目標產物和成相聚合物分離，是一種價廉、實用的方法。
目前，用以構筑溫度誘導雙水相系統的聚合物主要是環氧乙烷和環氧丙烷的無規共聚物(EOPO)。EOPO具有較低的濁點(Cloud point)，在水溶液中，當溫度超過濁點(50℃)時會發生溫度誘導相分離，形成新的兩相系統，此時上相為水相而下相則富含EOPO。通常目的產物分配在水相，而富含EOPO的相得以回收利用。已有一此報導利用溫度誘導效應的ATPE技術對酶、甾族化合物和氨基酸等的分離進行了研究。這一新型的ATPS已越來越受到人們的關注。
黃芩自古以來就被作為傳統醫藥，黃芩中的化學成分大約有60～70多種，一般認為黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)中所含的黃芩甙和黃芩素等黃酮類物質是具有藥用價值的主要有效成分。我國多年來對黃芩的利用，主要是將黃芩經簡單的處理，以切片形式作中藥制劑利用，或將黃芩直接與其它中草藥配伍制成復方制劑。有關提取黃芩中的有效成分(黃芩甙和黃芩素)的報道很少。國內一般采用“酸沉淀法”，其工藝過程為將黃芩粉末用水煎煮兩次，每次1小時，過濾并合并濾液，加酸使溶液pH至1～2，在80℃下保溫24小時，使黃酮類物質凝聚析出，過濾得沉淀物，用40％氫氧化鈉溶解，調節pH至7，加1.5倍的乙醇攪勻，過濾，再加酸調節pH至1～2，加熱到80℃，使黃酮類物質析出，沉淀物以少量的50％乙醇洗滌后，再以5倍量乙醇洗滌，干燥即得成品。該工藝的收率一般為2～4％左右，黃酮類物質含量為90％(按中國藥典1990年版測定)。其它的一些在“酸沉淀法”基礎上的改進工作也有報道，但收效甚微。實踐證明“酸沉淀法”等工藝提取黃芩中的有效成分，存在以下問題操作繁瑣，提取率較低，雜質多且工藝不穩定。
本發明的目的是提供一種提取率高，產品質量好，既經濟又操作簡單的雙水相分配結合有機溶劑變溫反萃提取黃芩黃酮類物質的方法。
為了達到上述目的本發明采取下列措施一種雙水相分配結合有機溶劑變溫反萃提取黃苓黃酮類物質的方法，其特征在于它的步驟如下(1)固液浸取稱取黃芩粉末，分別加入水、環氧乙烷-環氧丙烷無規共聚物、乙醇，配制成PH為6.0～6.8，含3～6％黃芩、10～20％環氧乙烷-環氧丙烷無規共聚物、10～20％乙醇的水溶液，常溫下浸泡12～36小時，過濾后得濾液；(2)雙水相萃取取上述濾液，加入(NH4)2SO4或混合磷酸鉀和水，配制成含8～15％環氧乙烷-環氧丙烷無規共聚物和10～20％(NH4)2SO4雙水相系統(約含8～15％乙醇)，充分混勻，在15～30下靜℃置分相2～4小時。
(3)醋酸丁酯反萃取出富含環氧乙烷-環氧丙烷無規共聚物的上相，加水、醋酸丁酯和無機鹽Na2SO4或KCL，充分混勻，系統有機相和水相之比為0.5～1.5，Na2SO4的濃度為0.05～0.2M。在50～60℃下靜置分相1～3小時，此時，上相富含醋酸丁酯、環氧乙烷-環氧丙烷無規共聚物和黃酮類物質，而下相主要是含Na2SO4的水溶液，棄去下相。
(4)醋酸丁酯反萃取出上相(醋酸丁酯相)，加入水，充分混勻，系統有機相和水相之比為0.5～1.5，在1～5℃下靜置分相10～30小時，將上、下相分開，含大量黃酮類物質的醋酸丁酯相待進一步處理，而下相(水和環氧乙烷-環氧丙烷無規共聚物)可以回收使用。
(5)濃縮、干燥制得成品將上述上相進行濃縮，濃縮液置于60～80℃下真空干燥，得到黃芩黃酮類固體。
本發明提取黃酮類物質的方法，具有明顯的優點。
①浸取效果好采用本發明的固液浸取方式，比常規的煎煮方式更好，且在常溫下進行，既降低了能耗，又可避免中草藥有效成分的破壞。
②分相迅速在實驗中觀察到，采用ATPE處理，約30分鐘既可分相，且無乳化層，縮短了整個工藝周期。
③過程集成雙水相萃取既達到了預處理的目的，又濃縮了料液。表現為大量的雜質(如親水性物質、細胞碎片等)進入下相，黃酮類物質進入上相，上相體積較原始處理液大為減少，濃縮倍數達到了4以上，充分體現了雙水相技術適用于生物產品粗分離的特點。
④降低物耗通過變溫反萃處理，不僅使黃酮類得以與EOPO完全分離，而且大量的聚合物(EOPO)可直接循環利用。醋酸丁酯在濃縮過程中通過冷卻也可回收利用，因此，本工藝大大降低了原材料的消耗。
⑤本發明方法簡單，易于掌握，不受環境影響，見效快。
⑥按中國藥典規定的方法測定，本方法所得的產品中黃酮類物質的含量比常規的酸沉淀法高出20～30個百分點。
下面結合實施作詳細說明實施例1(1)固液浸取稱取得30g黃芩粉末，分別加入412g水、100g EOPO 4000、100g95％乙醇、及6.8KH2PO4和17.9gNa2HPO4·12H2O(溶液pH6.0～6.8)，常溫下浸泡24小時，過濾后得濾液605g。(2)雙水相萃取取上述濾液，加入150g(NH4)2SO4和246g水，充分混勻，在25℃下靜置分相2～4小時至分相徹底，黃酮類物質進入上相(EOPO相)。(3)醋酸丁酯(BA)/H2O(50～60℃)反萃取出富含EOPO的上相185ml，加入215ml水、200ml醋酸丁酯(BA)和少量的無機鹽(Na2SO4，濃度為0.1M)。充分混勻，在50～60℃下靜置分相1～3小時，此時，上相富含BA、EOPO和黃酮類物質，而下相主要是含Na2SO4的水溶液，棄去下相。(4)醋酸丁酯(BA)/H2O(1～5℃)反萃取出上相(BA相)292ml，加入水208ml，充分混勻，在1～5℃下靜置分相20小時，將上、下相分開，含大量黃酮類物質的BA相待進一步處理，而下相(H2O+EOPO)得以回收使用。
取出上(BA相)，加入等體積的水，重復該步驟1～2次。(5)濃縮、干燥制得成品將上述上相(BA相)230ml進行濃縮(回收BA)，濃縮液50ml置于65℃下真空干燥，得成品。
實施例2(1)固液浸取稱取30g黃芩粉末，分別加入625g水、100gEOPO4000、100g95％乙醇、及6.8gKH2PO4和17.9gNa2HPO4·12H2O(溶液pH為6.0～6.8)，常溫下浸泡12小時，過濾后得濾液808g。(2)雙水相萃取取上述濾液，加入150g(NH4)2SO4和242g水，充分混勻，在15℃下靜置分相2～4小時至分相徹底，黃酮類物質進入上相(EOPO相)。(3)醋酸丁酯(BA)/H2O(50～60℃)反萃取出富含EOPO的上相305ml，加入195ml水、150ml醋酸丁酯(BA)和少量的無機鹽(Na2SO4，濃度為0.05M)。充分混勻，在50～60℃下靜置分相1～3小時，此時，上相富含BA、EOPO和黃酮類物質，而下相主要是含Na2SO4的水溶液，棄去下相。(4)醋酸丁酯(BA)/H2O(1～5℃)反萃取出上相(BA相)250ml，加入水300ml，充分混勻，在1～5℃下靜置分相12小時，將上、下相分開，含大量黃酮類物質的BA相待進一步處理，而下相(H2O+EOPO)得以回收使用。取出上相(BA相)，加入等體積的水，重復該步驟1～2次。(5)濃縮、干燥制得成品將上述上相(BA相)190ml進行濃縮(回收BA)，濃縮液50ml置于65℃下真空干燥，得成品。
實施例3(1)固液浸取稱取30g黃芩粉末，分別加入265g水、100gEOPO4000、100g95％乙醇、及1.7gKH2PO4和2.85gK2HPO4·3H2O(溶液pH為6.0～6.8)，常溫下浸泡36小時，過濾后得濾液448g。(2)雙水相萃取取上述濾液，加入135.5g混合磷酸鉀(KHPO4+K2HPO4·3H2O)和116.5g水，充分混勻，在30℃下靜置分相2～4小時至分相徹底，黃酮類物質進入上相(EOPO相)。(3)醋酸丁酯(BA)/H2O(50～60℃)反萃取出富含EOPO的上相150ml，加入120ml水、180ml醋酸丁酯(BA)和少量的無機鹽(Na2SO4，濃度為0.2M)。充分混分，在50～60℃下靜置分相1～3小時，此時，上相富含BA、EOPO和黃酮類物質，而下相主要是含Na2SO4水溶液，棄去下相。(4)醋酸丁酯(BA)/H2O(1～5℃)反萃取出上相(BA相)250ml，加入水100ml，充分混勻，在1～5℃下靜置分相30小時，將上、下相分開，含大量黃酮類物質的BA相待進一步處理，而下相(H2O+EOPO)得以回收使用。
取出上相(BA相)，加入等體積的水，重復該步驟1～2次。(5)濃縮、干燥制得成品將上述上相(BA相)200ml進行濃縮(回收BA)，濃縮液45ml置于65℃下真空干燥，得成品。
所得產品按中國藥典的標準檢測，黃酮類物質含量大地100％(分光光度。法)，產品中的黃芩甙含量為40.5％(HPLC法)。產品收率為8.0～8.5％。
本發明基于以下三方面的發現①在常溫下，利用含一定量的EOPO和乙醇的水溶液可有效地將黃芩根中的黃酮類物質浸取出來。采用這一固液浸取方式，黃酮類物質浸出率比常規的煎煮方式更高。②黃酮類物質在EOPO/硫酸銨雙水相系統中分配的極大不對稱性。表1給出了黃芩甙(黃酮類物質的主要成分之一)在EOPO4000/硫酸銨雙水相系統中的分配數據。黃芩甙是強憎水性物質，根據相似相溶原則，黃芩甙對EOPO具有某種親和性，使黃芩甙能較易溶解在富含EOPO的上相中。而一些雜質分配在下相，黃芩甙分配系數一般大于18，黃芩甙的萃取率在86.70～96.94％之間。③采用有機溶劑變溫反萃技術，有效地解決了雙水相萃取技術中目的產物與聚合物分離的問題。既提純了黃酮類物質，又使聚合物EOPO得以回收利用。表1黃苓甙在EOPO4000/硫酸銨雙水相系統中的分配行為序號總組成％wt 相比分配系數 萃取率％EOPO4000(NH4)2SO4(R) (K) (Y)110 8 0.362 18.0 86.70210 10 0.324 43.2 93.33310 12 0.288 75.2 95.59410 14 0.260 95.7 96.14510 16 0.268 118.2 96.94表中相比R＝Vt/Vb分配系數K＝Ct/Cb萃取率Y＝VtCt/(VtCt+VbCb)式中Vt，Vb-上相，下相的體積；Ct，Cb-黃芩甙在上，下相中的濃度；因此，經上述固液浸取、EOPO/硫酸銨雙水相系統萃取、有機溶劑變溫反萃等過程的處理，使黃酮類物質得以濃縮和提純，最終得到黃酮類物質的成品。
權利要求
1.一種雙水相分配結合有機溶劑變溫反萃提取黃芩黃酮類物質的方法，其特征在于它的步驟如下(1)固液浸取稱取黃芩粉末，分別加入水、環氧乙烷-環氧丙烷無規共聚物、乙醇，配制成PH為6.0～6.8，含3～6％黃芩、10～20％環氧乙烷-環氧丙烷無規共聚物、10～20％乙醇的水溶液，常溫下浸泡12～36小時，過濾后得濾液；(2)雙水相萃取取上述濾液，加入(NH4)2SO4或混合磷酸鉀和水，配制成含8～15％環氧乙烷-環氧丙烷無規共聚物和10～20％(NH4)2SO4雙水相系統，充分混勻，在15～30℃下靜置分相2～4小時。(3)醋酸丁酯反萃取出富含環氧乙烷-環氧丙烷無規共聚物的上相，加水、醋酸丁酯和無機鹽Na2SO4或KCL，充分混勻，系統有機相和水相之比為0.5～1.5，Na2SO4的濃度為0.05～0.2M，在50～60℃下靜置分相1～3小時，此時，上相富含醋酸丁酯、環氧乙烷-環氧丙烷無規共聚物和黃酮類物質，而下相主要是含Na2SO4的水溶液，棄去下相。(4)醋酸丁酯反萃取出上相，加入水，充分混勻，系統有機相和水相之比為0.5～1.5，在1～5℃下靜置分相10～30小時，將上、下相分開，含大量黃酮類物質的醋酸丁酯相待進一步處理，而下相中的水和環氧乙烷--環氧丙烷無規共聚物可以回收使用。(5)濃縮、干燥制得成品將上述上相進行濃縮，濃縮液置于60～80℃下真空干燥，得到黃芩黃酮類固體。
2.根據權利要求1所述的一種雙水相分配結合有機溶劑變溫反萃提取黃芩黃酮類物質的方法，其特征在于所指的環氧乙烷-環氧丙烷無規共聚物的分子量在2000～8000范圍內。
全文摘要
本發明公開了一種雙水相分配結合有機溶劑變溫反萃提取黃芩黃酮類物質的方法。常溫下用含環氧乙烷—環氧丙烷無規共聚物(EOPO)和乙醇的水溶液將黃芩根中的黃酮類物質浸取出來,以EOPO/硫酸銨雙水相系統,通過調節成相劑組成,使黃酮類物質主要分配在含EOPO的上相,并得到濃縮和純化,再利用變溫反萃技術,使其得以分離和提純。本發明提取效率高,產品質量好,既經濟又操作簡單。
文檔編號B01D11/02GK1241447SQ9910420
公開日2000年1月19日 申請日期1999年3月17日 優先權日1999年3月17日
發明者李偉, 朱自強, 姚善涇 申請人:浙江大學