原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增系統(tǒng)的制作方法

專利名稱：原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的系統(tǒng)，更具體地，涉及在DNA或RNA樣品上直接進(jìn)行PCR而不必將樣品從原來的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中分離的方法及設(shè)備。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(典型的為Taq聚合酶)，四種DNA核苷酸堿基和二種或更多種單鏈DNA引物的存在下，通過熱循環(huán)一個(gè)或多個(gè)該DNA(模板DNA)的分子的方法制備極其大量雙鏈DNA片段的忠實(shí)拷貝的過程(擴(kuò)增)。這些引物是長度約20堿基的短片段，其堿基順序與構(gòu)成雙鏈模板的兩條互補(bǔ)DNA單鏈的5′末端是互補(bǔ)的。
PCR是一種極其有價(jià)值而且應(yīng)用廣泛的技術(shù)，并且導(dǎo)致了分子生物學(xué)領(lǐng)域的革命。該技術(shù)在美國專利No.4，683，195、4，683，202和4，965，188中有詳細(xì)的公開。直至現(xiàn)在，反應(yīng)是在小的反應(yīng)管中于溶液中進(jìn)行的，其中待擴(kuò)增的DNA是懸浮著的。用于這種過程的設(shè)備公開于美國專利No.5，038，852和1992年4月20日提出的美國專利申請No.07/871，274。
最近發(fā)現(xiàn)，有可能應(yīng)用PCR去擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的特異的DNA片段，而不必首先將DNA從細(xì)胞中抽提出來。該技術(shù)叫原位PCR。細(xì)胞可以是單細(xì)胞，或部分組織樣品。在絕大多數(shù)情況下，是在顯微鏡上的載玻片上的細(xì)胞或組織薄切片上進(jìn)行原位PCR的。細(xì)胞或組織通常用福爾馬林或其他試劑處理而固定，從而保留其形態(tài)，便于處理后識別。
如果被選擇的DNA片段是以這樣的方式擴(kuò)增的，那么被擴(kuò)增的產(chǎn)物DNA就能被選擇性地染色，其后對PCR處理過的細(xì)胞顯微鏡檢查就能鑒別出組織樣品中含有特定的DNA片段(甚至在細(xì)胞內(nèi)僅局限存在)的那一種細(xì)胞(如果存在的話)。如果存在的話使細(xì)胞中的擴(kuò)增DNA變得可見可以通過兩種方法中的任一種達(dá)到。一種方法是使用互補(bǔ)的單鏈DNA探針，探針上附著有標(biāo)記分子。該探針會與擴(kuò)增樣品中特異DNA順序(如果存在的話)雜交，多余的探針和標(biāo)記物被洗去。接著留有標(biāo)記分子的部位通過顯影劑處理而變得可見。這種使之可見的技術(shù)叫“原位雜交”，或原位擴(kuò)增DNA的“間接測定”。
另一種使之可見的方法是在PCR過程中，使用包括附著有標(biāo)記分子的經(jīng)修飾的DNA核苷酸堿基在內(nèi)的PCR試劑。許多攜帶標(biāo)記分子的經(jīng)修飾的堿基會通過DNA聚合酶直接摻入擴(kuò)增產(chǎn)物。接著與前面一樣用顯影劑處理載玻片，便使擴(kuò)增DNA的部位置變得可見了。這種技術(shù)叫原位擴(kuò)增DNA的“直接摻入測定”。
在兩種方法中，典型地，顯影劑包括偶合于某分子的上一種酶，例如堿性磷酸酶，該分子牢固和特異地與擴(kuò)增DNA或雜交探針上的標(biāo)記分子結(jié)合;以及一種底物，酶可以將其轉(zhuǎn)變成不溶的，強(qiáng)吸收的染料。如果擴(kuò)增DNA上的標(biāo)記分子是生物素，那么典型的與酶偶合的結(jié)合分子是抗生物素蛋白。如果標(biāo)記分子是地高辛，那么結(jié)合分子是抗一地高辛抗體。兩類顯影劑都已用于兩種原位雜交的間接測定和直接摻入測定。標(biāo)記分子上的標(biāo)記物可以是顯色性，熒光性或放射性的。
測定原位擴(kuò)增DNA的兩種方法都是非常敏感的，能測到每個(gè)細(xì)胞中10～幾百個(gè)擴(kuò)增DNA片段的拷貝。兩種方法都需要在原位PCR熱循環(huán)結(jié)束之后進(jìn)行某些載玻片的PCR后處理。
完整細(xì)胞的原位PCR的熱循環(huán)方法因細(xì)胞來源的不同而有差異。不形成組織的細(xì)胞，例如白細(xì)胞和多種培養(yǎng)細(xì)胞(如HeLa細(xì)胞)，并不一定需要特殊的儀器操作來進(jìn)行原位PCR循環(huán)。Hasse等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，4971-4975(1990)，報(bào)導(dǎo)，這樣的固定細(xì)胞的懸浮液可以在正常用于液相PCR的相同反應(yīng)管中進(jìn)行熱循環(huán)，然后，細(xì)胞涂布于載玻片上以便測定擴(kuò)增產(chǎn)物。
然而，更常用是這樣的細(xì)胞可以在載玻片上進(jìn)行熱循環(huán)。它們通過離心涂布于載玻片上，產(chǎn)生所謂的“細(xì)胞旋轉(zhuǎn)”(cytospin)制備物。使細(xì)胞涂布有助于固定方法及其他前PCR樣品處理。這并不需要額外多費(fèi)功夫，因?yàn)榉駝t的話為了使載玻片上的擴(kuò)增產(chǎn)物變得可見，細(xì)胞旋轉(zhuǎn)步驟在隨后也是必需的。細(xì)胞旋轉(zhuǎn)與載玻片上的組織一樣，被擴(kuò)增。
當(dāng)待研究的是組織切片中的細(xì)胞時(shí)，它們必須被直接在表面上擴(kuò)增，因?yàn)榉駝t的話，薄切片將不能顯示組織的形態(tài)。與這些組織的熱循環(huán)相關(guān)的主要問題在于維持組織形態(tài)以及細(xì)胞形態(tài)，抑制樣品上的PCR反應(yīng)混合物的蒸發(fā)，以及獲得均一的，重復(fù)性高的結(jié)果。
為了在玻璃質(zhì)的顯微鏡載玻片上固定的細(xì)胞或組織樣品上進(jìn)行原位PCR，人們必須使用經(jīng)處理的載玻片，使得細(xì)胞會粘于載玻片上而不會被PCR過程或隨后為了使擴(kuò)增DNA變得可見而進(jìn)行處理的過程中所用的水溶性試劑沖洗掉或漂浮掉。典型地，用將3-氨基丙基三乙氧基硅烷分子共價(jià)結(jié)合于其表面的方式處理過硅化載玻片符合要求，或者，使用聚(賴氨酸)或凝膠/鉻明礬涂層。
接著，帶有待擴(kuò)增樣本的載玻片區(qū)域必須用過量的，含有適當(dāng)濃度的DNA聚合酶，核苷酸，引物和其他成份的PCR試劑覆蓋。然后，載玻片和試劑在典型的溫度范圍，近90℃和68℃之間，有時(shí)也可低至37℃，典型地進(jìn)行10-30次循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)中的兩個(gè)或三個(gè)選定的溫度的任一處都停留至少一分鐘的若干分之一或更長。
為了使原位PCR成功，有幾個(gè)在熱循環(huán)中必須達(dá)到的重要要求。其一是水從試劑中的蒸發(fā)必須幾乎被完全防止。在不降低擴(kuò)增產(chǎn)量或降低特異性的情況下，不超過最適試劑濃度的約5%的變化是可以容忍的。另一個(gè)要求是在反應(yīng)過程中，任何對PCR反應(yīng)有害的物質(zhì)不能與試劑接觸。還有一點(diǎn)是加熱時(shí)試劑釋放出的氣泡或溶解氣體不妨礙液體試劑進(jìn)入到待反應(yīng)的整個(gè)區(qū)域。
最后，有關(guān)原位PCR的出版物已表明，為了保持高特異的擴(kuò)增，對反應(yīng)進(jìn)行“裝配”(assemble)常常是重要的，以便實(shí)現(xiàn)“熱啟動(dòng)”或其化學(xué)等價(jià)的啟動(dòng)。在物理熱啟動(dòng)中，整了試劑既不經(jīng)“裝配”也不首先與樣品DNA接觸，直到反應(yīng)所需的全部成分都處于高溫才進(jìn)行裝配和接觸。溫度必須足夠高，使得甚至是引物的部分雜交都不能發(fā)生于任何位置(除了在所期望的模板位置)，盡管細(xì)胞的整個(gè)基因組是能與引物非特異地部分雜交。溫度也必須高得足以防止。引物分子互相結(jié)合，形成可擴(kuò)增的產(chǎn)物，叫“引物二聚物”。這種可靠的起始溫度典型地在68℃～75℃之間，而且通常比PCR中所用的退火溫度高10℃左右。
在PCR中能實(shí)現(xiàn)“化學(xué)熱啟動(dòng)”的一種方法是通過在試劑中加入熱不穩(wěn)定成分如單鏈結(jié)合蛋白(SSB)，它防止任何由聚合酶產(chǎn)生的延伸，直至反應(yīng)混合物在第一個(gè)PCR循環(huán)中被加熱到某溫度，該溫度高得足以防止非特異雜交，同時(shí)也破壞了熱不穩(wěn)定SSB組分。另一種實(shí)現(xiàn)化學(xué)熱啟動(dòng)的方法是用尿嘧啶替代dUTP，并在試劑中加入熱不穩(wěn)定的酶UNG(尿嘧啶-N-糖基化酶)，它會破壞在第一個(gè)PCR循環(huán)之前在低溫保溫時(shí)形成的任何的PCR的產(chǎn)物。
還有一種實(shí)現(xiàn)化學(xué)熱啟動(dòng)的方法是在加入到試劑之前將Taq聚合酶與Taq抗體相混合。這樣的一種Taq單克隆抗體最近由Kodak Clinical Products Division的John Findlay博士于1992 San Diego會議Genetic Recognition，十一月 18-20，1992，在題為“Development of PCR for In Vitro Dignostics”，的論文中宣布。Taq抗體與Taq聚合酶結(jié)合并抑制其在常溫下發(fā)揮其功能。然而，一旦加熱受抑制的Taq聚合酶至近95℃，則Taq抗體，一種正常蛋白，即變性了，釋放出Taq聚合酶并允許其在PCR過程中正常作用。
這些類型的化學(xué)熱啟動(dòng)需要在試劑中包含有一種通常是昂貴的組份(如UNG或Taq抗體)，而且對于PCR的操作可能會設(shè)置一些不合需要的限制，例如在試劑制備好之后在一段相對短暫的時(shí)間界限前，其必須被使用或者是較低的擴(kuò)增效率。因此，如果一切可能的話，通常優(yōu)選進(jìn)行物理熱啟動(dòng)。
今天使用原位PCR的技術(shù)人員常常是用他們在自己的實(shí)驗(yàn)室中發(fā)展起來的各種不同的方式來達(dá)到上述的要求。他們用原位PCR獲得的信息常常不能以其他的方式獲得，因而他們經(jīng)歷了異乎尋常的煩擾及技術(shù)投資來獲得信息便顯得如此有價(jià)值。
如Komminoth等人，在Diagnostic Molecular Pathology 1，＃2，85-97(1992)中所教授的那樣。一種相當(dāng)普通的策略是將一個(gè)蓋玻片蓋住待擴(kuò)增的樣品，并用指甲油(nail polish)或類似的粘附劑封住，對于這樣的布置發(fā)生滲漏是不足為奇的，因?yàn)橹讣子筒荒芾卫蔚卣掣接诮M織樣品。因?yàn)樗泻噭┑牟考际莿傂缘模虼嗽谧冃詼囟?典型的為94℃)產(chǎn)生的高壓會使指甲油移位。硬的蓋玻片如果與細(xì)胞接觸的話還會破壞脆弱的下面的細(xì)胞的形態(tài)。這種方法不適于方便的熱啟動(dòng)。另一個(gè)缺點(diǎn)在于需要在循環(huán)之后用氯仿處理裝置以溶解指甲油。
這些載玻片通常位于熱循環(huán)儀器的樣品板(block)上，這些循環(huán)器并不是明確地為載玻片而設(shè)計(jì)的。這了獲得好的熱接觸，Komminoth等人在循環(huán)器的樣品隔間覆蓋物和載波片之間使用墊片，以便將載玻片壓向樣品區(qū)。此外，現(xiàn)有的在加熱區(qū)帶有適用于反應(yīng)器的小孔的熱循環(huán)器不能均勻地?zé)峤佑|，對載玻片沒有溫度的均勻性。
一種相關(guān)技術(shù)由Chiu等人，J.Histochemistry and Cytochemistry 40，＃3，331-341(1992)所揭示，他們在分隔間的載玻片上培養(yǎng)待研究的細(xì)胞，并在同一載玻片上對細(xì)胞進(jìn)行原位PCR。在培養(yǎng)之后，去除樣品隔墻，但是載玻片以及隔間之間的墊片被保留在載玻片上。為了進(jìn)行原位PCR，細(xì)胞先用含2.5%熱瓊脂糖的PCR反應(yīng)混合物覆蓋，然后將玻片用Saran包裹紙(wrap)密封地包裹起來。這種方法提供了一種韌性的細(xì)胞覆蓋物，覆蓋物置于防止細(xì)胞損傷的墊片上。Saran包裹物提供了蒸發(fā)控制手段。整個(gè)裝置置于樣品間的長槽中的注水的Perkin-Elmer Cetus DNA熱循環(huán)儀上，在循環(huán)之前，用塑料膜和塑料蓋覆蓋裝置。
Nuovc等人，American Journal of Pathology 139，＃6，1239-1244(1992)，用韌性的，熱穩(wěn)定的聚丙烯制得的蓋玻片覆蓋樣品。典型地，蓋玻片通過每個(gè)角落的一滴指甲油而固定于所期望的組織切片上。載玻片典型地是置于放在Perkin-Elmer Cetus DNA熱循環(huán)儀的樣品區(qū)上的鋁“船”中。該“船”主要起保留礦物油的功能，礦物油隨后加入載玻片裝置中以防止試劑的蒸發(fā)。在用不含Taq DNA聚合酶的PCR反應(yīng)混合物覆蓋樣品之后，樣品溫度典型地升至約65℃，接著稍提起蓋玻片，以便將Taq DNA聚合酶加入反應(yīng)混合物從而引發(fā)PCR反應(yīng)。
提升蓋玻片的能力使得熱啟動(dòng)在原位PCR擴(kuò)增中的特異性和特異的PCR產(chǎn)物的獲得方面表現(xiàn)出重大的改進(jìn)。在加入酶之后，將預(yù)熱的礦物油加到蓋玻片的頂部和邊緣。部分油也通過毛細(xì)作用被吸到蓋玻片下。它的存在減少了蓋玻片下的PCR試劑的液滴的直徑，同時(shí)也降低了對PCR試劑液滴的精確定位的控制。該方法獲得了出色的結(jié)果，但是需要一個(gè)或多個(gè)技術(shù)高超的操作人員，而且該方法繁復(fù)，不適于大量的載玻片。
另一種用于熱循環(huán)和減少蒸發(fā)和濃縮問題的方法是將載玻片置于塑料袋中并且在空氣爐型的熱循環(huán)器中進(jìn)行熱循環(huán)。例如，Staskus等人，Microbial Pathogenesis 1991，11，67-76(1991)和Emberto等人，Proc.Natl Acad，Sci，U.S.A.90，357-361(1993)用蓋玻片覆蓋組織，然后在將載玻片置于在空氣爐型熱循環(huán)儀中的熱可封閉的塑料小袋中之前用礦物油覆蓋?？諝鉅t方法避免了水從固定于蓋玻片上的樣品上蒸發(fā)的可能問題，因?yàn)檎麄€(gè)裝置在熱循環(huán)中大體是等溫的。
空氣爐法的主要缺點(diǎn)是該系統(tǒng)的差的熱傳遞性能導(dǎo)致很慢的熱循環(huán)次數(shù)。這樣的系統(tǒng)也沉淀表現(xiàn)出爐中樣品與樣品之間的溫度均一性差。
總而言而之，沒有一種現(xiàn)存的方法揉合了所有所期望的性能，如熱均一性好，不用礦物油進(jìn)行蒸發(fā)控制，試劑體積小，保持細(xì)胞形態(tài)，能熱啟動(dòng)和能方便地在水平放置之外熱循環(huán)大量的載玻片。今天，幾乎所有的人將制備好的載玻片放在礦物油中以防熱循環(huán)過程中水從試劑中蒸發(fā)掉。
油層是一個(gè)主要的麻煩，因?yàn)樵跓嵫h(huán)之后以及在用測定試劑進(jìn)一步處理之前必須小心而完全地用額外步驟將其去除。油有時(shí)也是那些會抑制PCR的污染物的載體。
在實(shí)驗(yàn)工作我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品上的水溶試劑的容納(containment)是通過將塑料蓋玻片蓋在樣品上并在角落或四周用粘附劑粘于載玻片而實(shí)現(xiàn)時(shí)，表面張力作用和氣體的淘析使得液體試劑在循環(huán)中四處流動(dòng)。因此，這些方法常常不是完全可靠的。通常，它們要求載玻片呈水平，從而限制了其在熱循環(huán)中放置的方式。通過封閉性的粘附劑圖在蓋玻片周圍而將試劑密封于蓋玻片下的努力常常失敗，因?yàn)閮H使用粘附劑是不可能或難以做到密不透風(fēng)。此外，載玻片表面至少在蓋玻片的周邊的部分通常為一薄層樣品覆蓋因此，對載玻片的粘附性差。
因此，很需要一種新且改良的用于操作原位PCR的完善的樣品容納裝置。也需要一套裝置，它能為樣品提供對試劑合適的物理容量，以物理式地保護(hù)，該裝置能防止熱循環(huán)過程中試劑和樣品的蒸發(fā)。也需要一種裝置，它不必使用油，也不使用粘附劑，而且也不需要載玻片在熱循環(huán)過程中保持水平。
下面將闡述的本發(fā)明符合上述要求。根據(jù)本發(fā)明的容納裝置含有常用的玻璃載玻片，其上面有含靶核酸的組織樣品，一個(gè)覆蓋在樣品上的柔軟的蓋件和固定裝置，它機(jī)械式地固定于載玻片從而將試劑和樣品保留在載玻片之上和蓋件之下。
在根據(jù)本發(fā)明的裝置中，試劑被薄的，柔性的，被機(jī)械夾于載玻片的蓋件所包含，處于與樣品標(biāo)本的被選擇出的部分接觸之中。蓋膜可以是不透明的或透明的，因?yàn)榕c其說要透過裝置中的玻璃還不如說要通過蓋件觀察試劑，而且蓋件必須與PCR試劑及樣品不起化學(xué)反應(yīng)。一個(gè)位于蓋膜周圍的通常為環(huán)形密封環(huán)將蓋件壓于載玻片，得到密不透風(fēng)的密封。壓力由彈性夾和橫梁裝置維持。載玻片上的被擴(kuò)增樣品可以在蓋件和固定組件去除后用習(xí)用的方法通過顯微鏡觀察。
該裝置使得載玻片上的完整反應(yīng)的裝置快速、方便和可重復(fù)，而且只需要最少的技術(shù)。裝置操作程序能輕易地與物理熱啟動(dòng)相匹配。最后，本發(fā)明的系統(tǒng)適合習(xí)用的顯微鏡測定技術(shù)。
本發(fā)明的這些以及其他特征，目的和優(yōu)點(diǎn)，能夠通過結(jié)合附圖閱讀下面詳細(xì)的描述而變得更明顯。


圖1是一根據(jù)本發(fā)明的樣品容納裝置的透視圖;
圖2是一顛倒過來看的圖1所示的該裝置的部件分解視圖，以及組裝的方法;
圖3是一顛倒過來看的圖1所示的裝置的部分放大頂視圖;
圖4是一沿圖3中4-4線所作的裝置的截面視圖;
圖5是一沿圖3的5-5線所作的裝置截面圖;
圖6是一根據(jù)本發(fā)明的彈性卡夾之一的端視圖;
圖7是一圖6所示的彈性卡夾的頂視圖;
圖8是一根據(jù)本發(fā)明的裝置中使用的較佳橫梁的底視圖;
圖9是一圖8所示橫梁的側(cè)視圖;
圖10是一在圖8中沿著10-10線所作的橫梁的截面視圖;
圖11是本發(fā)明容納裝置的手工裝配安裝用具一透視圖;
圖12是根據(jù)本發(fā)明的容納裝置的機(jī)械裝置設(shè)備的一透視圖;
圖13是從圖12的設(shè)備中分離出來的夾鉗裝置的一透視圖;
圖14是一現(xiàn)有熱循環(huán)儀的槽式配接板的頂視圖;
圖15是一圖14所示槽式配接板的截面視圖;
圖16是一熱循環(huán)儀的透視圖，而該裝置具有適合于接納根據(jù)本發(fā)明的樣品容納裝置的改進(jìn)的熱交換區(qū);
圖17是一圖16所示的熱循環(huán)儀熱交換區(qū)放大的部分截面視圖;
圖18是根據(jù)本發(fā)明的一橫梁和蓋件的第一可替換實(shí)施例的頂視圖;
圖19是根據(jù)本發(fā)明的一橫梁和蓋件的第二可替換實(shí)施例的頂視圖;
圖20是根據(jù)本發(fā)明的一裝配好的容納裝置的截面視圖，裝置包括一在圖18-19中所示的可替換的橫梁和一可替換的蓋件;
圖21是一圖20中所示容納裝置沿著21-21線所作的放大的部分截面視圖;
圖22是根據(jù)本發(fā)明裝配到載玻片上的容納裝置的端視圖，該裝置采用了橫梁和蓋件的第三可替換的較佳實(shí)施例;
圖23是一圖22中所示的，按23-23線所作的本發(fā)明的部分截面視圖;
圖24是一圖22中所示的，沿線24-24所作的部分截面視圖。
在圖1中示出了根據(jù)本發(fā)明的容納裝置10，它容納固定在玻璃載玻片14上的含靶核酸的樣品12及樣品12上的試劑13。該裝置10包括載玻片14、一蓋住樣品12的柔性蓋件16和一把蓋件16夾緊到載玻片14上的固定組件18。
在圖1的透視圖中示出了這個(gè)裝置10的組合，圖2表示各個(gè)部件的一分解視圖，圖3表示圖1所示的組合裝置經(jīng)放大的一俯視圖，而圖4和5則表示圖3所示的裝置10的截面視圖。
約一滴試劑13，其通過周圍的柔性密封件或密封墊封入蓋件16和載玻片14之間的容積中。密封件可件是一分離部件或可以是一蓋件16的整體部分。密封口最好是蓋件16的柔性邊沿部分19，而該蓋件則由在化學(xué)上與PCR試劑相容的彈性材料制成。在最佳實(shí)施例中，蓋件是由硅橡膠制成的。蓋件是足夠?qū)挼?，并且受到剛性密封環(huán)20以每單位面積足夠大的力緊壓住載玻片14，因此即使密封環(huán)下的載玻片表面復(fù)蓋著一薄層樣品12的細(xì)胞或組織，但在熱循環(huán)過程中也很少有水，液體或蒸汽可從蓋件16下的空隙中溢出。甚至在沸騰溫度條件下，仍能保持密封墊密封。
把柔性蓋件16加工成形，以使在放松后柔性蓋件在接觸試劑的一側(cè)上為微微下凹的。蓋件凹度可加以選擇，以限定密封環(huán)20將蓋件16的邊緣部分19緊壓住載玻片14時(shí)蓋件16和載玻片之間可保留的試劑的容積。一般，對于直徑約12毫米的圓形蓋來說，其容積約為10微升。容積可以如下方式進(jìn)行選擇。若容積太大，所需的試劑13的量將不必要地耗費(fèi)且需用稍長時(shí)間來加熱和冷卻。若容積太小，那么蓋件之下的表面容積比將變成不適當(dāng)?shù)拇?，并且由于表面上酶的吸收而具有較大不良擴(kuò)增的危險(xiǎn)，或通過部件或樣品12上抑制性污染的痕量而毒化試劑13。
一般，待檢驗(yàn)樣品12的受關(guān)注的區(qū)域直徑不大于10毫米。載玻片的清潔區(qū)紅25毫米×27毫米，因?yàn)橥ǔ０哑湟欢擞米鳂?biāo)記而凍結(jié)起來。由于把僅幾個(gè)微米厚組織片段(部分)精確地沉積在載玻片的預(yù)先位置是十分困難的，所以使蓋件16能[安置在清潔區(qū)的任何地方是最好的。此外，在載玻片上可以有超過一個(gè)受關(guān)注的區(qū)域，因這對于在載玻片上能放置多于一個(gè)樣品和裝置10是一好處，如圖1所示。
將蓋件16夾緊到載玻片14上的新的固定組件18使蓋件16有更廣的可變位置。在載玻片清潔區(qū)邊緣的幾個(gè)毫米范圍內(nèi)的任何位置上所安放的樣本都可能被容納的擴(kuò)增。對于密封環(huán)20來說幾個(gè)毫米范圍是需要的。蓋件16的邊沿部分19在其四周通過剛性密封環(huán)20而得以加強(qiáng)，并且若使蓋件的兩相對邊緣上的密封環(huán)20緊壓住載玻片14以形成充分的密封，那么該密封在蓋件四周圍其它各部分上將是充分的。因此，剛性密封環(huán)20可迫使蓋件的周圍保持在一平面上。
蓋件16最好是一橡膠薄板的圓盤。剛性密封環(huán)20是一粘接到橡膠蓋件16邊沿19上的不銹鋼環(huán)。該環(huán)20可具有矩形、不規(guī)則四邊形、三角形或其它多邊形橫截面形狀，因而，至少有一與蓋件16粘接的平端。更具體地說，環(huán)20具有矩形成不規(guī)則四邊形的橫截面形狀?！癉”形橫截面也是允許的。此外，環(huán)不必是圓的。它可以是長方形的或其它連續(xù)的形狀，只要蓋件16可對載玻片表面加以密封。因此，連接到不銹鋼環(huán)20上的盤形橡膠蓋件16的邊沿19構(gòu)成了一密封墊，該密封墊與盤的托架是連續(xù)作用的。本實(shí)施例要求橡膠薄板蓋件16可防止水蒸汽通過它擴(kuò)散，同時(shí)，對PCR試劑沒有害處的。盡管硅橡膠對PCR無害，但它對水蒸汽則是于透過的。因此，如圖4和5中所示的蓋件材料既可以選硅橡膠那樣的無害彈性材料和聚丙烯那樣的非滲透性彈性材料的夾層板或復(fù)合材料板，也可以選至少在非滲透性彈性材料下面用聯(lián)合碳化合物公司的派雷里恩(Parylene)C那樣的無害涂覆層或薄層。
蓋件16必需的凹面形狀可以在平的蓋件16模壓過程中形成或通過把蓋件連接到剛性環(huán)20上時(shí)使平的蓋件16變形，或通過把蓋件16的外表面中央連接到固定在環(huán)20(圖中未畫出)的連接板上使盤的中央微微伸出環(huán)20平面而加以形成。
蓋件16通過帶有平行橫條24的剛性橫梁22相對載玻片固定，該平行橫條則僅與密封環(huán)20的兩相對部分接觸。橫梁22的橫條24從一長邊緣到另一長邊(緣)延伸過載玻片。這樣，蓋件16可位于橫梁22的任何地方，如圖3所示。此外，沿著載片長度的任何地方都可以把橫梁22夾緊到載玻片上。因此，在本發(fā)明中蓋件16可安裝在載玻片清潔區(qū)內(nèi)的任何位置。
橫梁22的橫條24最好具有如圖5所示的L形截面以增加其剛性。橫條24通過兩扁平端部26連接起來，該扁平端部通過圖1、3和4所示的兩卡夾28夾緊到載玻片14上。這些卡夾28各伸過載玻片14背側(cè)30的，即裝有樣品12的相反側(cè)的縱向邊緣。橫梁22的各端26略加以彎折以形成傾斜平面。在把卡夾28推壓入應(yīng)有的位置上時(shí)，它們可在這些傾斜平面端26上滑動(dòng)并將相當(dāng)大的壓力施加在橫梁22和密封環(huán)20上，以便把蓋16的邊沿部分19壓緊且使它緊，貼住載玻片14。
雖然卡夾28和橫梁22可由相對薄的材料(可能是不銹鋼)制成，但它們是足夠硬的，因此在組裝過程中它們很少撓曲。維持夾緊力的儲能最好大量地來自橡膠密封墊(在密封環(huán)20下面的蓋件16的邊沿19)的壓縮，而不是從橫梁22或夾板28的扭曲中產(chǎn)生。這種密封墊的有益的作用在于蓋件16不論使安裝在載玻片14何處，橫梁22的橫條24始終平行于載玻片且邊沿19沿其整個(gè)周邊過量均勻地受壓。將蓋件16夾緊到載玻片14上的橫梁22和卡夾28也是足夠硬的，以便經(jīng)受得住將試劑13加熱到將近沸騰溫度下所引起的壓力增加。蓋件16是柔性的，大大地減少了可在蓋件下面引起的最大壓力。另外，在加熱期間柔性蓋件16承受得住流體的膨脹，而不會使有效地加壓密閉容積的載玻片14破裂。在加熱循環(huán)過程中使用本發(fā)明的高度獨(dú)立容納裝置可以防止或至少可使這一試劑13中的氣泡形成減至最小。通過橫梁施加到環(huán)20上的壓力處在四磅壓力的范圍內(nèi)且形成橡膠邊沿19約20%的壓縮。
圖6和7示出了卡夾28之一的放大的頂視圖和則視圖?？▕A28是一變成“J”形的不銹鋼金屬片以形成一長側(cè)壁32、一短側(cè)壁34和一垂直連接的壁36。壁32可以設(shè)有一對實(shí)向短側(cè)壁34的凹陷38。這些凹陷38被隔開以約束和咬住在橫梁22傾斜表面端26的內(nèi)緣上把卡夾28、橫梁22和載玻片14鎖住在一起，如圖1和4所示。另一方面，凹陷38的功能可通過固定裝配18部件之間突起的脊部或其它干涉機(jī)構(gòu)來加以實(shí)現(xiàn)。
在圖8、9和10中示出了橫梁22的一可替換的實(shí)施例。橫梁22a通常是一帶有矩形開孔的沖切式矩形金屬板體，該矩形金屬板體形成兩由橫向端部26a所連接的平行橫條24a。橫梁22a的橫條24a具有圖10所示的L形截面。在裝配時(shí)，由平的端部26a所連接的橫條24a夾緊到上述載玻片14上。與圖3至圖5所示的第一橫梁22的主要不同是端部26a以雙彎曲部27a與橫條24a連接。雙彎部27a使卡夾28長的腿部能摩擦地與端部26a的表面接合。這種雙彎曲部27a還差不多形成一臺階，因此，在卡夾28安裝好后，裝配好的載玻片和蓋件裝置的總厚度是最小的。
朝著端部26a近似3°的傾斜就足以在橫梁端部26a、載玻片14和卡夾28之間提供必要的夾緊力，并且可確保對剛性環(huán)20施加足夠的壓力。這樣，當(dāng)采用圖8-10所示的替換橫梁時(shí)，在卡夾28上的凹陷38就成為不必要的。
由于蓋件16不比所必需的大，故所需的試劑容積僅是必要的，而且用密封環(huán)作不滲漏密封所需要的力也被減至最小。所有這些特性都是很有益的密封。因?yàn)樗寡b配成為較容易的，所以不需要大的密封力是所希望的，而必需剛性地承受得住較大力的機(jī)構(gòu)會使裝置變成不必要的粗厚的苯重，而倘若把苯重機(jī)構(gòu)安裝在邊緣上的話，那么這也會限止可在循環(huán)儀中容納的載玻片的數(shù)目。它還增加了裝置的熱時(shí)間常數(shù)且減慢循環(huán)過程。
原位聚合酶鏈反應(yīng)的載玻片的裝配在蓋件16下適當(dāng)位置裝有試劑13的載玻片14上的整個(gè)容納裝置10的裝配是通過一獨(dú)特的程序加以完成的，該獨(dú)特程序也是本發(fā)明的一部分。在一最佳實(shí)施中，使用了一手工裝配的安裝工具40。這種安裝用具40示于圖11。在另一最佳實(shí)施例中，采用一機(jī)械輔助裝配的安裝用具或工具。在圖12中示出了這樣一種工具。
在圖11中所示的手工裝配安裝用具40基本上由一固定于底座45上的裝配支柱42和一可移動(dòng)地安裝在底座45上的滑動(dòng)導(dǎo)向件44組成?；瑒?dòng)導(dǎo)向件44是彈簧向上偏壓的，以便在支柱42周圍垂直移動(dòng)。支住42的頂端具有加工成形的凹陷區(qū)域46和48可松動(dòng)地容納卡夾28和橫梁22且使它們保持在載玻片14的裝配位置上。支住42還具有一中心空氣通孔43。
滑動(dòng)導(dǎo)向件44是一U形體，它通常具有兩位于緊靠支柱42兩側(cè)的平的盤部50。這些盤部50具有一依一定尺寸制造的通道以安放一標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡載玻片。兩盤部50通過整體的U形架52連接在一起。各個(gè)盤部50具有一與其下側(cè)固定的套筒54，套筒可在固定于底座45上的配合支桿56上滑動(dòng)。圍繞支桿56所安裝的彈簧58把導(dǎo)向件向上偏壓到某一位置上，在此位置上，由盤部44所支持的載玻片14將位于支柱42頂端的凹陷區(qū)域46和48上面。
容納裝置10的配裝方式如下。首先，把兩卡夾28安裝在裝配支柱42頂端的凹陷區(qū)域46中，而它們的長的側(cè)壁32向下朝向支柱42。然后，將它們定位，使得它們相對的兩短側(cè)壁34之間的間隔正好比標(biāo)準(zhǔn)的一英寸顯微鏡載玻片的寬度稍度一點(diǎn)。接著，將橫梁22安放在裝配支柱上并進(jìn)入凹陷區(qū)域46間，而其橫條邊緣如圖2向上且橫條24處于凹陷區(qū)域48中。各部件的尺寸是這樣的，即由橫梁22的端部26所形成的各傾斜表面的部分處在卡夾28的長側(cè)壁32的頂端。這樣，構(gòu)成了卡夾28與橫梁22的初始嚙合。
在另一方面，可以提供由微弱粘附力保持初始接合和適當(dāng)間隔關(guān)系的橫梁22和卡夾28的預(yù)裝配結(jié)合來減少制備裝置的所必需的操作量。另外，如果卡夾28由磁不銹鋼制成，那么埋在裝配支柱中的小永義磁鐵可以以最少操作自動(dòng)地把卡夾放在適當(dāng)位置。
然后，在密封環(huán)20固定到邊沿部分19上后，把蓋件16安裝在橫梁22的橫條24之間，而凹部、蓋件16的密封墊側(cè)向上，密封環(huán)20擱靠在橫梁22的橫條24上。接著，使蓋件16定位，并使蓋件對準(zhǔn)載玻片14上受關(guān)注的(含有試樣)的區(qū)域的中心。蓋件的尺寸是那樣的，即其邊沿19，也就是密封墊或密封表面以大于裝配好后密封墊將受壓縮的量突出于橫梁22的橫條上，因而即使在邊沿受到擠壓后，橫梁22將令人滿意地實(shí)際上不接觸載玻片14，如圖4和5所示。
于是，把一滴試劑13滴放在蓋件16上。最好使用一可用手調(diào)整移送所需試劑容量的吸液管，以便把一滴液的試劑滴送到接近凹部表面的中心。由于蓋件的表面只可部分地濕潤，故擴(kuò)散不明顯。它還很好的停滯在蓋件16的邊沿19上方。
然后，將具有至少一個(gè)預(yù)先固定在其上的試樣12的載玻片14安放在裝置的安裝用具的滑動(dòng)導(dǎo)向件44上，樣品側(cè)向下、直接位于試劑13液滴上。先使滑動(dòng)導(dǎo)向部件44定位，以使載玻片的底部總是由彈簧58保持在試劑滴13的頂端以上至少幾毫米處。通過將載玻片14縱向滑動(dòng)使其定位，以便使待處理的樣品區(qū)域?qū)?zhǔn)蓋件16上的液滴中心。這可透過載玻片14的后部觀察得到(后部現(xiàn)在處在上端)。正如通常作法，如若所受關(guān)注的區(qū)域(部位)隨在載玻片14的背部30上的鏈?zhǔn)綐?biāo)志而進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，那末使操作變得極其容易。
接著，使用者可把一手指(戴了手套的)放在直接位于裝置支柱42上的載玻片14的背部，以足夠大的力直接撳壓以克服向上推壓的彈簧58的彈性力且使滑動(dòng)導(dǎo)向件44下移。這使載玻片14的樣品側(cè)與試劑液滴13接觸，并且迫使液滴13擴(kuò)散散布在邊沿19內(nèi)的載玻片14和蓋件表面上。試劑液滴的容積已經(jīng)被選定為稍大于蓋件16的凹入表面和與其邊沿19接觸的面(載玻片表面)之間的容積。因此，在載玻片表面剛好與邊沿19進(jìn)行接觸之前，該液滴達(dá)到和越過邊沿19的邊緣。在載玻片14和蓋件邊沿19形成密封前，以上所述作用將所有或幾乎所有空氣從蓋件下排出。對于少量試劑的過度容量通過蓋件16的邊沿19流出是可接受的。流出的試劑(它)最后會完全變干。在載玻片14上的另一向下力開始將邊沿19壓緊。
當(dāng)邊沿19已經(jīng)部分地受到擠壓時(shí)，載玻片14的背側(cè)30應(yīng)該恰好處在或低于各卡夾28短的側(cè)壁34的底緣。此時(shí)，操作者用它的另一手(戴手套的)大姆指和手指在載玻片14的邊緣上和在橫梁22的端部26上彼此相對地?cái)D壓兩卡夾28直到卡板28以其相對載玻片14的邊緣垂直連接壁36而停止為止。這種作用完成了蓋件16邊沿19的擠壓。由于使橫梁22的端部26嚙合的諸小棘爪38，和/或因?yàn)闄M梁部各端26上的傾斜表面切線角度小于卡夾28和橫梁端部26向摩擦系數(shù)，故卡夾28保持安裝就位直到有意加以移去為止。
在根據(jù)本發(fā)明的裝配好的裝置10中，載玻片14和蓋件16之間所截留容積完全由不可壓縮試液13所填滿。因此，因要把蓋件16的邊沿部分19緊壓到(反應(yīng))結(jié)束，故蓋件本身最好是柔性的，它能夠擴(kuò)張以調(diào)節(jié)裝入的試劑量而在壓力上增加不大，否則，這會使裝配成為很困難的。為什么蓋件16應(yīng)該是柔性的另一原因是在把試劑13加熱到接近或超過其沸點(diǎn)的溫度時(shí)，它發(fā)生膨脹、其蒸汽氣上升，其中所熔解的氣體趨向于從溶液中出來。如果蓋件不是全部柔性的情況下，在其內(nèi)的壓力可能升高到足以將載玻片或蓋件密封破壞且造成試劑的丟失。然而，足以容納任何形成的氣體氣泡的容積的少量可塑性可使壓力不升高太多。一般來說，壓力將升高到只稍大于試劑蒸汽壓超過外部大氣壓力的量。這將確保裝置甚至在高空(高的海拔)還能很好工作，在高空上，游離的試劑的沸點(diǎn)變成低于PCR變性溫度。
在圖12中示出了一機(jī)械輔助裝配用具或工具80。這種工具除了實(shí)際上省去了用手指裝卸本裝置外與圖11所示的工具相類似。尤其是若要完成物理熱啟動(dòng)的話，這種工具80是最好的。在圖12中所示的工具80具有一底座45和一象圖11所示的安裝到其上的支柱42，并且利用一形狀有點(diǎn)與圖11所示的導(dǎo)向件44類似的滑動(dòng)導(dǎo)向件82。此外，工具80具有一壓臂84和一卡夾安裝機(jī)構(gòu)86，因而，在裝置操作過程中使用者不必實(shí)際接觸固定裝置18的熱部件(或成分)。
滑動(dòng)導(dǎo)向件82具有一對依一定尺寸制成的間隔的平盤部88以接納載玻片14。兩盤部通過整體的U形支架90加以連接，這種U形支架90可繞著水平軸銷92轉(zhuǎn)動(dòng)。軸銷92由約同支柱42的頂端一樣高度的兩固定支座94水平地支承在底座45上。
在臂84的一端也以樞軸安裝在軸銷92的支架90內(nèi)。壓臂84中一扁平、細(xì)長件并在支柱42的頂端上方設(shè)有一通常的矩形開孔96，而支柱的頂端則接納和支承橫梁22和卡夾28。當(dāng)將壓臂84從支柱42上方下放到載玻片14上時(shí)，開孔96使對載玻片14上的蓋件16，橫梁22和樣品12能進(jìn)行觀察。在壓臂94緊貼住載玻片14時(shí)一繞著開孔96的橡膠墊片98則用來防止載玻片破裂。壓臂84最好是向彈性偏壓時(shí)，以使它保持抬起(離開)直到需要的位置為止。同樣，載玻片導(dǎo)向件82彈性向上偏壓以使載玻片14保持在橫梁22、卡夾28、蓋件16和試劑液滴13上直至壓臂被放入，使固定組件18最后安裝到載玻板14上。壓臂84和載玻片導(dǎo)向件82可以設(shè)有安裝在軸銷90上的普通彈簧(圖中未畫出)或彈簧可從底座45中伸出以提供所需的向上偏壓。
卡夾安裝機(jī)構(gòu)86最好為一對安裝在支柱42上的負(fù)荷彈簧鉗100，該彈簧鉗具有兩各彎向凹入?yún)^(qū)域(部位)46的相對鉗爪102，凹入?yún)^(qū)域則在緊鄰安裝在導(dǎo)向件82中的載玻片14的邊緣處旋轉(zhuǎn)一卡夾該彈簧鉗還有一構(gòu)成整體的、相對的鉗柄部104。彈簧鉗100的相對鉗柄部104用手工擠壓在一起而把卡夾28從載玻片邊緣和橫梁22的端部26上方推壓到載玻片的兩側(cè)邊上，從而完成了容納裝置10的裝配。各彈簧鉗樞軸地安裝在一固定的軸銷106上，該軸銷穿過支柱42的側(cè)壁正處在鉗爪102和卡夾28之間的接觸點(diǎn)下。
在圖13中以透視方法獨(dú)立地示出了卡夾安裝機(jī)構(gòu)84。各L形鉗爪102具有一短腿，該短腿可裝配入支柱42頂端的凹入?yún)^(qū)域46之一中。各平的柄部104繞著支柱42的兩鄰接側(cè)圍起來。在各鉗柄部104和支柱42(未畫出)之間安裝的彈簧(未畫出)使彈簧鉗100的柄部104和鉗爪部102向外偏置，以使固定卡夾28能安裝在凹陷部分46中。在相對柄部104擠合在一起時(shí)，端部(鉗爪)102彼此相對移動(dòng)，使卡夾28壓在載玻片14上。
工具80以如下方式進(jìn)行操作。卡夾28如前所述安裝在凹陷部分46中。將橫梁22，密封環(huán)20，蓋件16和試劑13順序地安放在支柱42上，然后，將一其上放有試樣12的載玻片14放在導(dǎo)向件82的盤部86上，并使試樣側(cè)朝下且使域樣垂直處于蓋件16中的試劑13的上面。于是，壓臂94繞著樞軸相對于載玻片向下轉(zhuǎn)動(dòng)，以將載玻片14降到蓋件16上且使試劑和酶散布于載玻片14上的試樣上。當(dāng)壓臂94充分地壓降下來后，擠壓彈簧鉗100，使鉗爪102彼此相對移動(dòng)，把固定卡夾28推壓到載玻片14和橫梁端部26上。再者，將整個(gè)載玻片容納裝置10從工具80上移去，把它放置在一改進(jìn)的熱循環(huán)儀上且進(jìn)行以上所述的熱循環(huán)。
熱啟動(dòng)應(yīng)用為了實(shí)現(xiàn)使用本發(fā)明的熱啟動(dòng)，我們只需要將一加熱系統(tǒng)加裝到手工裝配安裝用具40上或機(jī)械輔助工具80上且使已加熱的容器蓄有系統(tǒng)的部件。此外，如上所述，某些載玻片和固定裝置部件可以暫時(shí)組裝在一起且在安裝用具上放置和在所有容納裝置部件最后連結(jié)之前給予加熱。
下列說明適用于圖11所示的手工加熱裝配安裝用具40和類似于圖12所示的機(jī)械輔助裝配工具80。裝配支柱42設(shè)有透過它的一垂直孔或空氣通孔43，通孔經(jīng)底部同周圍的空氣交換。在電源接通后，一內(nèi)部恒溫控制加熱器使支柱42柱體溫度保持在約75℃，這比熱啟動(dòng)溫度在近似70℃要熱。這種加熱器可以是一在中心孔43周圍纏繞的阻抗線圈，或可以簡單將加熱器埋在底座45或支柱42中。為了有助于加熱垂直通孔中上升的空氣可以在孔43的內(nèi)部設(shè)置助片。對流可維持一象在煙囪中那樣的熱空氣的提升圓柱，它可在最后裝配前洗滌安裝在支柱42的頂端上的橫梁22和蓋件16。橫梁22和卡夾28也通過與金屬裝配支柱42接觸而加以加熱。
在一經(jīng)加熱載體中存放著待處理的一些載玻片14，而該載體使載玻片保持在約75℃?？▕A28，蓋件16和橫梁22可在工作場所的小型加熱容器中進(jìn)行貯存且用鑷子來裝卸。對于把兩預(yù)加熱卡夾，一橫梁22和一蓋件16安裝到已加熱的裝配支柱42上所需的時(shí)間一般可為10至15秒。對于使用一預(yù)熱的移液管夾端輸送預(yù)熱的試劑13的時(shí)間小于10秒。在把預(yù)熱載玻片推壓下之前已加熱的試劑13需要接觸不超過又一10秒，使它密封和把固定組件18的諸部件夾緊在一起。幾秒鐘以后，裝配好的載玻片可退回到其已加熱載體上，決不要冷至70℃以下。因?yàn)楸┞稌r(shí)間是如此短，所以由于蒸發(fā)試劑濃度(變化)應(yīng)該是最小的。
一確切的物理性熱啟動(dòng)可僅通過把裝配工具加熱和把載玻片、諸容納部件、試劑和諸吸管尖端儲藏在裝置工作部分的加熱載體中而加以獲得。其它程序上的變化是不必要的。這種程序隨圖12所示的裝配工具80的使用而得到簡化，因?yàn)榕懦艘鸭訜岵考膬Υ婧驼訜岵考蛯?dǎo)向件82接觸。對于熱啟動(dòng)而言如果諸部件通過粘結(jié)劑固定在一起，那么也可使用卡夾28和橫梁22的預(yù)裝配，粘結(jié)劑在環(huán)境溫度下是很堅(jiān)硬的，使裝配和裝運(yùn)方便，但這在熱啟動(dòng)溫度下易于削弱最終裝配。
容納裝置10的諸卡夾28伸出載玻片14的邊緣外，而占有其背面30向個(gè)毫米。由于這個(gè)原因，任何一種放有新的容納裝置的熱循環(huán)儀的平熱交換表面必須設(shè)有一些槽，槽的濃度略小于1毫米，寬為3毫米以容納卡夾28。
根據(jù)本發(fā)明，若將一塊配接板放在熱循環(huán)儀部分的平的上表面上，那么現(xiàn)有的一些熱循環(huán)儀，例如Perkin Elmer DNA熱循環(huán)儀，Perkin Elmer480型，或Perkin Elmer9600型都可用來使載玻片裝置熱循環(huán)。在圖14和15的頂視和截面視圖中示出了這樣一配接板110。這種配接板110具有一平的底表面112和一具有被間隔的平行槽116的上表面114。這些槽116為接納卡夾28而依一定尺寸制作，使得槽116之間的平的表面部分118可與放在配接板上的載玻片14的玻璃表面充分接觸。配接板110可用來接納3或4塊載玻片組件。
最好將象油那樣的導(dǎo)熱液或?qū)嶂⒉荚谏媳砻娌糠忠栽黾釉谳d玻片14的背側(cè)30和槽116之間平的熱交換表面118之間的界面的熱接觸。在熱循環(huán)儀裝置和配接板110之間也應(yīng)使用硅脂和礦物油以確保這種界面的良好的熱接觸。乙二醇或其聚合物也能有益地用來提供二個(gè)界面之間的良好熱接觸。乙二醇或其聚合物具有可水溶的優(yōu)點(diǎn)，因而簡化了裝置部件和熱循環(huán)儀裝置部分的清洗。在載玻片和配接板之間及在熱循環(huán)儀裝置和配接板之間使用不是油、脂，就是乙二醇或其聚合物的另一優(yōu)點(diǎn)是液體層起到一吸緊作用，因而將載玻片固定到配接板上和裝配接板保持在熱循環(huán)儀裝置部分適當(dāng)位置上，從而使處理過程中跌落的機(jī)率減至最小。
目前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明調(diào)節(jié)DNA熱循環(huán)儀的熱校準(zhǔn)，或規(guī)定稍高的原位擴(kuò)增溫度，以便補(bǔ)償整個(gè)系統(tǒng)的熱量的變化可能是必要的。舉例來說，已經(jīng)觀察到從樣品區(qū)段到載玻片頂面有不到1℃的小溫差。這種溫差可通過使用以上所述的油、脂或乙二醇而減至最小。
DNA熱循環(huán)儀的原位型式本發(fā)明的容納裝置10適用于比上面剛提到的還要多的載玻片進(jìn)行循環(huán)，因?yàn)?，各個(gè)裝置10其厚度均小于4毫米，可在任何實(shí)際場合加以循環(huán)，而不需要浸污在油中。例如，裝置10可在改進(jìn)的熱循環(huán)儀部件垂直布置以接納大量的載玻片組件。在圖16中示出了一種含有一改進(jìn)的金屬架122的熱循環(huán)儀120。金屬架122含有8條狹槽124，后者處在金屬隔板126之間，其中心間相距10毫米。各個(gè)狹槽124寬約5毫米，各個(gè)隔板126在各金屬隔板126的左手側(cè)上具有一平的、垂直的熱交換表面128以及一對接納卡夾28所必需的凹槽130。
圖17是通過安裝在一個(gè)這種狹槽124的邊緣上的載玻片裝置10所作的(金屬)架122的一部分截面圖。底槽130的頂連132加以平滑倒角，防止因載玻片14垂直移出時(shí)其碰著卡夾28。根據(jù)同樣的原理，上槽130不設(shè)有上邊緣。很顯然，當(dāng)載玻片以這種方式安裝后，我們不能依賴重力使載玻片14對著平的金屬熱交換表面128固定。因此，可將傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)的小葉簧(在圖中未畫出)安置在各狹槽124的端部以使載玻片平緩但牢固地貼靠在垂直的金屬表面128上。
再者，在載玻片14和平的金屬熱金屬表面之間應(yīng)該使用礦物油、脂、乙二醇或其它的導(dǎo)熱液體以使傳熱增至最大。彈簧可在載玻片裝載后加以接合，在它們卸載前加以脫開，或者可永久地安裝在狹槽124中，以便將載玻片14及其裝置10連接地壓入與表面128接合。
當(dāng)熱循環(huán)完成之后，被裝入的載玻片容納裝置10從其狹槽124中移出，用作進(jìn)一步分析。諸容納裝置部件易于通過將卡夾28自載玻片14上滑出而加以分離。如果諸容納裝置部件和載玻片14被放入-5%的漂白劑的容器中使它們消毒，再進(jìn)行淋洗和干燥的話，它們可以重復(fù)使用多次。對復(fù)復(fù)使用的限制將由蓋件16和/或邊沿19的磨損來確定，其狀況在蓋件16被夾緊到載波片14上之前和之后通過目測很檢驗(yàn)出來。值得注意的是不像對溶液中樣本所進(jìn)行的PCR，對于原位PCR而言，不希望的DNA的沾污問題是要小得多。其原因是使DNA沾污不進(jìn)入適當(dāng)固定的細(xì)胞的內(nèi)部。此外，任何沾污的DNA可在熱循環(huán)后的加工步驟之前用試劑來清洗掉。有關(guān)原位PCR的這種事實(shí)使可清洗和重復(fù)使用的另件比它們在溶液中作PCR更可接受。
原位PCR的試劑在我們的工作中，我們發(fā)現(xiàn)原位PCR用的最佳試劑數(shù)量與溶液中PCR用的試劑數(shù)量不同。首先，存在一表面與容積比的問題。在MicroAmpTM試管中的10微升試劑具有17毫米2左右的容器接觸表面。在一載玻片14和一10毫米直徑的蓋件之間同樣容量的試劑約有157毫米2接觸表面，也就是約大9倍。因此，在原位情況下任何由表面狀況，所引起的對PCR的有害影響例如聚合酶的吸附被擴(kuò)大了。如果表面條件比經(jīng)仔細(xì)選擇的PCR反應(yīng)試管的聚丙烯材料更有害，那么這種有害影響被大大地?cái)U(kuò)大且能容易地把PCR完全摧毀。例如廣泛采用的硅烷處理的玻璃載玻片實(shí)質(zhì)上是一比例如聚丙烯更有害的表面。
我們還發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明對硅烷在載玻片上的PCR試劑，在容器的溶液中獲得聚合酶鏈反應(yīng)的成功擴(kuò)增，我們需在反應(yīng)中增加Tag聚合酶的數(shù)量，從溶液PCR中典型的每100μl2.5單位增至每100μl12.5單位。我們也發(fā)現(xiàn)往試劑中加入1mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)會保護(hù)PCR免受載玻片表面的影響。我們認(rèn)為牛血清白蛋白(BSA)通過在所有接觸的表面上迅速地形成至少一單層蛋白質(zhì)而產(chǎn)生作用。因而，這個(gè)單層提供了一Tag聚合酶不強(qiáng)烈的粘附的表面。
我們已討論過在循環(huán)過程由反應(yīng)而失水。盡管工作十分小心和迅速，在熱啟動(dòng)負(fù)荷過程中，總有一些水要失去。還有一些水汽因擴(kuò)散到柔性橡膠或塑料蓋件16中或甚至通過柔性橡膠或塑料蓋件16的薄壁而散失掉。由于這些少量的額外損失，原位擴(kuò)增的PCR試劑的配方應(yīng)該是處在各組分的最佳濃度范圍的最大稀釋點(diǎn)，因?yàn)樵谑┮詿嶝?fù)載和循環(huán)時(shí)濃度的唯一變化，即使有的話，由于水的失去而有可能使?jié)舛壬倭吭黾印?br> 這樣，原位聚合酶鏈反應(yīng)裝置的整體包括載玻片和容納裝置10、裝配安裝用具40或80、一個(gè)或多個(gè)附有容納裝置10的載玻片14的改進(jìn)的熱循環(huán)儀以及以上所述的改良的試劑13。這種結(jié)合的新穎和不可預(yù)料的結(jié)果是、對細(xì)胞和組織樣品內(nèi)的特異DNA序列的方便、可靠、靈敏的檢測和定位。
倘若在載玻片14的邊緣之間的試樣12的側(cè)方位和間隔是恒定的話，環(huán)20可被整合入橫梁22。這將簡化部件結(jié)構(gòu)，固定組件18和容納裝置10的裝配。
容納裝置10的結(jié)構(gòu)通過幾個(gè)途徑可加以簡化。例如，橫梁和固定環(huán)可被整合。本發(fā)明中的橫梁和蓋件的第一個(gè)可選擇的具體實(shí)施例見于圖18?？蛇x擇的橫梁的變化描述于圖19。在下面的描述中類似的數(shù)字也可被利用來描述在上面已闡述的原位PCR容納裝置中的同一或可替換的部件。
現(xiàn)參閱圖18和19，各示出了裝配到可替換蓋件122上的可替換橫梁120和140的頂視圖。橫梁120和140之間的區(qū)別僅僅是圓孔124和142的方位不同。橫梁120和孔124是位于中央相比較的話，橫梁140的孔142是位于緊靠橫梁140的一端144。兩橫梁120和140的結(jié)合有可能使蓋件122蓋住載玻片14任何位置上安放的樣品12，而這種作用僅需改變橫梁140的方位或僅需選擇有中心配置孔124的橫梁120。在這些實(shí)施例中，密封環(huán)與橫梁成一體。橫梁120通常具有一圓的環(huán)部126，當(dāng)容納裝置10按圖20和21部分截面視圖安裝好后，該環(huán)部將壓緊在蓋件122的邊沿部128。
最好，橫梁120是一不銹鋼板的一沖壓件。橫梁120具有一對平行、豎直的彎折邊，彎折邊形成在相對端132之間延伸的橫條130，而相對端則以約3°的小角向下彎曲以與以上所述第一實(shí)施例中卡夾28相類似的方式接納卡夾134。如圖21所示，各卡夾134在安裝過程中將端部132和載玻片14擠壓在一起，因而將蓋件122的邊沿部分128壓貼到載玻片14上。
這種橫梁120和蓋件122布置的可替換實(shí)施例的最獨(dú)特特點(diǎn)是在邊沿部分128和中心拱曲或凹面部分138之間具有一環(huán)形助或脊136，在拱曲或凹后面部138下盛放試劑混合物13。這種環(huán)形脊136最好具有一放大的鱗莖頂部137，頂部則咬入把各片件固定在一起的孔124中。蓋件122和橫梁120可作為分離單元加以安裝，以便簡化圖21所示本替換實(shí)施例的容納裝置10的部件的最后組裝。
橫梁120可以設(shè)有切去區(qū)域139，以節(jié)約為余的金屬材料。在另一方面，這些切去區(qū)域139可以用肋或波紋板(未畫出)替代以提高橫梁的剛性。
現(xiàn)參閱圖19，橫梁140具有平行升高的橫條邊緣146和一單個(gè)切去區(qū)域148，這與在橫梁120上的兩個(gè)切去區(qū)域不同。橫梁140可從圖19所示的載玻片14的方位轉(zhuǎn)動(dòng)180°，使得橫梁140和橫梁120的結(jié)合允許覆蓋載玻片14上實(shí)際上所有的各可能性的樣本位置。
圖18-21所示的可替換容納裝置10的裝配類似于以上第一實(shí)施例所述的裝配情況，只是固定環(huán)20不再需要，也不必及先將蓋件122和橫梁120裝配在一起。如先前所述，可以利用手工或機(jī)械輔助裝配工具40和和80，以便把容納裝置10安裝到載玻片上和進(jìn)行熱啟動(dòng)。
圖22至24表示根據(jù)本發(fā)明容納裝置10的第三個(gè)實(shí)施例，此實(shí)施例中利用了另一可替換的蓋件和橫梁150。在圖22的頂視圖中所示的這個(gè)實(shí)施例的橫梁150又是一個(gè)沖壓的薄片狀金屬片件，片件具有平行隆起的橫條152和兩個(gè)彎折端部154。不過，這個(gè)實(shí)施例中不設(shè)有蓋件156的中心部分伸過的中心孔。代之以金屬片橫梁150中的環(huán)狀槽或凹陷158，起到第一實(shí)施例中固定環(huán)20的作用和第二實(shí)施例中環(huán)部分126的作用。這個(gè)環(huán)狀槽158被制成一定尺寸，因此蓋件156的邊沿部分160與槽158的下邊得以充分接合。就像第二實(shí)施例的蓋件那樣，隆起的脊162在蓋件156的邊沿部分160和中心部分164之間向上突出。蓋件156可以任選地包括一中心隆起物或小丘166，它是用來咬配入環(huán)狀槽內(nèi)中心配置的開孔168以把蓋件156和橫梁150固定在一起。如按所示的提供這種中心隆起物166，那么就不必在蓋件156設(shè)置脊162。此外，不必模塑帶凹面形中心部164的蓋件156。隆起物166咬配入開孔168將使中心部對著橫梁的150的中心部向上拉起，以產(chǎn)生容納試劑13的必要的彎曲。盡管在這種情況下不需要脊162，但脊162可有助于形成這種中心彎曲。
橫梁150也可具有多個(gè)壓入金屬板材的波槽或肋條170，如圖22所示以增加結(jié)構(gòu)的剛性，使之能用很薄的金屬板材進(jìn)行制造，從而減少其熱質(zhì)量和整個(gè)厚度。
該可替換的第三實(shí)施例比起以前所述的實(shí)施例來具有明顯的優(yōu)點(diǎn)。由于橫梁150完全覆蓋在柔性蓋件156上，故蓋件材料對水汽擴(kuò)散的不滲透以及對PCR反應(yīng)無害的要求大大地得到減小。因此，這可使材料的選擇范圍較寬。舉例來說，蓋件156可以是一種硅校膠的單個(gè)模壓體。不必用含有象聚丙烯那樣的不滲透彈性體的硅橡膠夾層或復(fù)合材料。因?yàn)樗ㄟ^蓋件156的中心部位164擴(kuò)散到密閉空間172會很快因容量很小而達(dá)到平衡，因而形成這種特征。通過取消所示的任選的隆起物166和任選的開孔168可進(jìn)一步使蒸發(fā)減少。如去除中心小丘166(隆起物)，隆起脊162可用來把蓋件156臨時(shí)緊固在橫梁下應(yīng)有位置上。
但是，空檔區(qū)172是必需的，以使在裝配卡夾28或134時(shí)邊沿部分160負(fù)壓過程中蓋件156位移，因而起到密封作用以有效地保持試劑13針對著樣品12。截留的容積172也用來控制在熱循環(huán)過程中蓋件156下的壓力。這可減少或可防止在接近95℃的變性溫度下的保溫過程中在試劑中形成氣泡。
在圖24的部分截面示圖中清楚地示出了橫條152的構(gòu)形。這些位于形成橫梁150的金屬板件邊緣上的平行橫條152基本上是成雙的。這種結(jié)構(gòu)有相當(dāng)大剛性并可以使用最小厚度的板材。另外，橫條成雙處在邊緣可使尖銳邊緣存在減至最小，這種尖銳邊緣用薄的金屬材料可能有礙使用。同理，兩橫條154與可象橫條152那樣彎折過來。
橫梁150可設(shè)有與容納在載玻片中心位置試樣同心地配置的環(huán)狀槽158。由于從圖22所示的變換來看這是一種明顯的變化，這種可變換就不加以圖解。
雖然上述說明是本發(fā)明最佳實(shí)施例的圖解說明，但應(yīng)該理解到除了作特別說明外本發(fā)明的原位PCR容納裝置的發(fā)明概念可以加以實(shí)際操作。例如，橫梁和凹陷或卡夾體可由硬塑料制成，或可將卡夾28之一構(gòu)成橫梁一端的一整體部分，因而僅需要一個(gè)卡夾28以裝配在橫梁22的相對端上。這樣，本發(fā)明的諸實(shí)施例經(jīng)歷了變動(dòng)、變化和改變而不偏離所附的權(quán)利要求的適當(dāng)范圍和明晰的含義。因此，意欲包含所有這樣的改變、變動(dòng)和變化，這多應(yīng)看作落在所附權(quán)利要求的精神和其寬的范圍內(nèi)。
在本文中所援引的專利申請、專利和其它出版材料作為其完整的參考而結(jié)合在一起。
權(quán)利要求
1.一種含靶核酸序列原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的容納裝置包括一玻璃顯微鏡載玻片；一含有所述目標(biāo)序列的試樣，該試樣則放置在載玻片上；一處在所述試樣上的試劑紅合物；一放在所述載玻片上，蓋住所述試樣和所述試劑紅合物的蓋件；一用機(jī)械方法夾緊到所述載玻片上和夾緊到所述蓋件上的固定組件，該組件使所述樣品和所述混合物保持在所述蓋件和所述載玻片之間并使所述蓋件相對于所述載玻片密封是切實(shí)可行的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于所述的固定組件包括至少一可相對于所述載玻片可卸地固定所述蓋件的卡夾機(jī)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其特征在于所述的蓋件是柔性的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的裝置，其特征在于進(jìn)一步包括一圍繞所述蓋件的邊沿部分的密封件。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于所述蓋件具有有彈性和可塑性凹面的形狀。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的裝置，其特征在于所述蓋件形狀構(gòu)成了一在所述凹面內(nèi)保持所述試劑紅合物的預(yù)定體積度。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于所述蓋件是一橡膠板材。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的裝置，其特征在于所述密封件包括一固定到所述邊沿部分的剛性環(huán)形密封件。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的裝置，其特征在于所述密封件包括所述蓋件的邊沿部分。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的裝置，其特征在于蓋件是一橡膠板的圓盤，該圓盤含有連接到不銹鋼環(huán)上的所述邊沿部分。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的裝置，其特征在于不銹鋼環(huán)具有通常多邊形截面以及連接到所述邊沿部分上的平的基底部。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的裝置，其特征在于進(jìn)一步包括一適合于裝在所述卡夾機(jī)構(gòu)和所述玻璃片之間和放在所述環(huán)的部分上的橫梁件。
13.根據(jù)權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于所述卡夾機(jī)構(gòu)包括-U形薄鋼板卡夾，該卡夾具有一對制成一定尺寸的相對隔開的側(cè)壁以彈性地將所述蓋件夾緊到所述載玻片上。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其特征在于卡夾機(jī)構(gòu)是一對U形夾板，各個(gè)卡夾具有一對制成一定尺寸的相對隔開的側(cè)壁，可彈性地把所述橫梁件的一端部夾緊到所述載玻片的邊緣部分上。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的裝置，其特征在于所述橫梁件具有一對與所述密封環(huán)隔開部分嚙合或接合的被此隔開的橫條和兩連接所述橫條的相對端部，而所述相對端部與所述卡夾嚙合。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的裝置，其特征在于各所述端部加以彎曲以形成一與所述卡夾之一嚙合的傾斜表面，因此，當(dāng)所述卡夾安裝在所述端部和所述載玻片邊緣上時(shí)，所述橫梁件用在橫梁件下所置配的邊沿部分緊壓住載玻片。
17.根據(jù)權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于所述蓋件用復(fù)合材料制成，復(fù)合材料包括一與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑不起化學(xué)作用的層和一不滲透層。
18.一種使流體相對于載玻片保持的固定組件，其特征在于包括一柔性蓋件，至少一圍繞著所述蓋件的一部分的環(huán)形密封件和至少一將所述的蓋件和密封件相對于所述載玻片可卸地固定的卡夾機(jī)構(gòu)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組件，其特征在于所述蓋件是有彈性和塑性形式的凹面體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組件，其特征在于所述凹面形蓋件構(gòu)成了保持特定試劑量的預(yù)定容積。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組件，其特征在于所述蓋件由橡膠板材制成。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組件，其特征在于所述蓋件是夾緊到所述密封件上的。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組件，其特征在于所述密封件與所述蓋件是整體的。
24.根據(jù)權(quán)利注23所述的組件，其特征在于所述蓋件是一橡膠板材的圓盤，而所述密封件是連接到剛性環(huán)的所述圓盤的一邊沿部分。
25.根據(jù)權(quán)利村注24所述的組件，其特征在于所述剛性環(huán)由不銹鋼環(huán)制成。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組件，其特征在于所述剛性環(huán)具有一連接到所述蓋件的邊沿部分上的平的基底部。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組件，其特征在于進(jìn)一步包括一橫梁件，它適合于裝配在所述卡夾機(jī)構(gòu)和所述玻璃片之間并蓋住至少所述的環(huán)的一部分。
28.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組件，其特征在于所述卡夾機(jī)構(gòu)為一普通U形板金屬夾板，該卡夾具有一對依一定尺寸制成的相對隔開的側(cè)壁以把所述蓋件夾緊到所述載玻片上。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的組件，其特征在于所述卡夾機(jī)構(gòu)是一對普通U形夾板，各個(gè)卡夾具有一對依一定尺寸制成的相對隔開的側(cè)壁，因而彈性地把所述橫梁件的一端和所述載玻片的一邊緣部夾緊在其間。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組件，其特征在于所述橫梁件具有一對與所述環(huán)的間隔部分嚙合的間隔橫條，以及連接與所述卡夾接合的所述橫條的兩相對平的端部。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的組件，其特征在于各個(gè)所述端部加以彎曲以形成一傾斜表面。
32.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組件，其特征在于所述蓋件包括一不滲透層和一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑不起化學(xué)作用的層。
33.一種在試樣中含有核酸序列的原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的裝置，其特征在于包括一使所述試樣放置在其上的顯微鏡載玻片;一處在所述試樣上的試劑紅合物;一蓋住所述載玻片上的所述試樣和試劑紅合物的柔性塑料蓋件;一夾緊到所述載玻片上和夾緊到所述蓋件上的固定組件，該組件可將所述試樣和所述混合物保持和密封在所述蓋件和所述載玻片之間，以及一具有溫度控制部件的熱循環(huán)儀，該部件適合于接納所述顯微鏡載玻片并使它靠在所述部件的部分，因此，在載玻片上試樣的溫度將伴隨溫度控制部件的溫度的改變而變化。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的裝置，其特征在于所述固定組件包括一柔性蓋件，一環(huán)形密封件和至少一將所述蓋件和所述密封件相對于所述載玻片可卸地固定的卡夾。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的裝置，其特征在于所述蓋件具有有彈性和塑性凹面的形狀。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的裝置，其特征在于所述蓋件的形狀構(gòu)成在所述凹面內(nèi)保持所述試劑紅合物的預(yù)定體積度。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的裝置，其特征在于所述蓋件由橡膠板材制成。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的裝置，其特征在于所述密封件包括一所述蓋件的邊沿部分和一夾緊到所述邊沿部分上的剛性密封環(huán)。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的裝置，其特征在于所述的密封件包括所述蓋件的一邊沿部分。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的裝置，其特征在于所述的邊沿部分粘連到所述環(huán)上。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的裝置，其特征在于所述環(huán)具有一粘連到所述邊沿部分上的平的基底部。
42.根據(jù)權(quán)利要求34所述的裝置，其特征在于進(jìn)一步包括一具有兩相對端部的橫梁，這些端部適合于裝配在所述卡夾件和所述載玻片之間，所述橫梁件伸過所述密封件的一部分。
43.根據(jù)權(quán)利要求34所述的裝置，其特征在于所述卡夾是一普通U形卡板，卡夾具有一對依一定尺寸制成的相對隔開的側(cè)壁，以使彈性地把所述蓋件夾緊到所述載玻片上。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的裝置，其特征在于所述卡夾機(jī)構(gòu)為一對普通U形卡板，各個(gè)卡夾則具有一對依一定尺寸制成的相對隔開的側(cè)壁，而使所述橫梁件端部之一彈性地夾緊到所述玻璃片的一邊緣部分上。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的裝置，其特征在于所述橫梁件具有一對一般間隔平行的橫條，所述橫條連接與所述密封伯隔開部分接合的所述兩相對端部。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的裝置，其特征在于將各所述端部彎曲以形成與所述卡夾相嚙合的傾斜表面，因此，當(dāng)所述一對卡夾安裝在所述端部上和所述載玻片的邊沿部分上時(shí)，所述橫梁件用其下所裝配的所述密封件緊貼住所述載玻片的沿邊部分。
47.根據(jù)權(quán)利要求44所述的裝置，其特征在于所述部件是一金屬體，它具有多個(gè)垂直的狹槽，各個(gè)狹槽可容納至少所述諸載玻片，蓋件和固定組件之中的一件，所述狹槽其間還形成隔板，各隔板上具有一平的熱交換表面和一對容納所述卡夾的所述表面上橫向隔開的凹槽，因此，所述狹槽中的載玻片的一側(cè)可靠在所述熱交換表面安放。
48.根據(jù)權(quán)利要求33所述的裝置，其特征在于進(jìn)一步包括一可卸地安裝在所述熱控制部件上的平的配接板以在熱循環(huán)過程中支承至少一個(gè)所述載玻片。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的裝置，其特征在于所述配接板在一個(gè)表面上具有多個(gè)凹槽。
50.一種將至少一載玻片安裝在熱循環(huán)儀中的配接板，其特征在于所述載玻片具有多個(gè)邊緣和一由一對所述邊緣上的卡夾而夾緊在所述載玻片上的試樣容納裝置，所述配接板具有一與所述部件配合的平滑底面和一具有至少一平載玻片容納部分的上表面。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的配接板，其特征在于載玻片容納部分具有至少一對凹槽，以接納一對安裝到所述載玻片邊緣上的卡夾。
52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的配接板，其特征在于所述的板是一平的金屬體。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的配接板，其特征在于所述的板由鋁制成。
54.根據(jù)權(quán)利要求51所述的配接板，其特征在于所述凹槽是平底槽。
55.一種在載玻片上的原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試樣和試劑液體容納裝置的安裝工具，其特征在于所述的容納裝置包括一蓋件和固定組件，所述工具包括一底座;一安裝在所述底座上的支承支柱，所述支承支柱具有一以預(yù)定間隔關(guān)系接納和支承所述固定組件的部件的水平的上表面;一可垂直移動(dòng)的載玻片支承臺板，所述臺板可在支柱的上表面和所述臺板部分之間移動(dòng)，所述臺板部分緊靠所述支柱的上表面。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的工具，其特征在于進(jìn)一步包括一與所述支柱聯(lián)結(jié)的加熱機(jī)構(gòu)，因此，在將所述蓋件和固定組件裝配到所述載玻片上前加熱機(jī)構(gòu)可加熱安裝在其上的所述蓋件和所述試液。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的工具，其特征在于所述加熱機(jī)構(gòu)包括一穿過所述支柱的通孔，它使加熱空氣通道從所述加熱機(jī)構(gòu)朝向上通過以使所述蓋件和所述試液加熱。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的工具，其特征在于所述支柱具有多個(gè)向孔中心突入所述孔的助片，以便增強(qiáng)所述支柱和通過所述孔的空氣之間的傳熱。
59.一種載玻片上的原位聚合酶試樣和試液容納裝置的裝配工具，其特征在于所述的容納裝置包括一蓋件和一固定組件，所述工具包括一底座;一安裝在所述底座上的支承支柱，所述支承支柱具有一以預(yù)定間隔關(guān)系接納和支承所述固定組件的部件的水平上表面;一可垂直移動(dòng)的載玻片支承臺板，所述臺板可在支柱的上表面和所述臺板部分之間移動(dòng)，所述臺板部分緊靠所述支柱的上表面;一處于與所述支柱隔開位置上由所述底座可移動(dòng)支承的長的壓臂，所述壓臂可使與安放在所述支承臺板上的載玻片接觸且使所述臺板和載玻片壓降下直到所述載玻片與所述固定裝置嚙合為止;一樞軸地安裝到所述支柱上的彈簧偏置固定組件裝配安裝機(jī)構(gòu)，所述機(jī)構(gòu)具有一對彈簧鉗，所述彈簧鉗具有一些位于所述支柱水平上表面的兩相對邊緣鄰近或上方的鉗爪部分，并經(jīng)操縱可使鉗爪部分彼此相對移動(dòng)。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的工具，其特征在于所述安裝機(jī)構(gòu)進(jìn)一步包括各個(gè)所述彈簧鉗，彈簧鉗具有從各個(gè)所述鉗爪部分伸出的鉗柄部，而各個(gè)所述彈簧鉗樞軸地安裝到所述支柱上。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的工具，其特征在于所述鉗柄部至少各圍包在所述支柱兩側(cè)的一部分上。
62.根據(jù)權(quán)利要求59所述的工具，其特征在于所述壓臂具有一對準(zhǔn)所述支承支柱上方設(shè)置的通孔。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的工具，其特征在于所述壓臂在與所述載玻片接觸的通孔周圍具有一緩沖墊片。
64.一種相對載玻片固定流體的固定組件，其特征在于包括一柔性的蓋件，一至少圍繞所述蓋件的一部分的環(huán)形密封件和至少一可卸地相對載玻片固定所述蓋件和密封件的卡夾，所述蓋件在所述蓋件的部分和所述蓋件的中心部分之間具有一環(huán)形脊。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的裝置，其特征在于進(jìn)一步包括一具有中心部的橫梁件，其中心部具有一適于接納所述環(huán)形脊的通孔以可卸地將所述橫梁件和蓋件固定在一起。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的裝置，其特征在于所述橫梁件包括一對其間含有中心部的平行橫條。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的裝置，其特征在于所述密封件包括一位于所述孔周圍和所述橫條之間的平的環(huán)部。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的裝置，其特征在于所述橫梁件由金屬板材制成。
69.根據(jù)權(quán)利要求67所述的裝置，其特征在于所述橫梁件的中心部是平的。
70.根據(jù)權(quán)利要求67所述的裝置，其特征在于所述通孔周圍的平環(huán)部是所述橫梁中心部分中的環(huán)槽的一部分。
全文摘要
一種制備細(xì)胞和組織試樣中所含有的核酸擴(kuò)增的成套原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的容納裝置包括顯微鏡載玻片，一安放在載玻片上的含有目標(biāo)核酸序列的試樣，一蓋在試樣上的柔性塑料蓋件和一夾緊到載玻片上和夾緊到蓋件上的固定組件，以便在加熱循環(huán)過程中使反應(yīng)混合物相對試樣固定和密封。固定組件包括一位于蓋件的邊沿部分上的剛性環(huán)，一具有兩由相對兩平端部所連接的間隔平行橫條的橫梁和一對卡夾，它緊壓住兩端部和載玻片兩相對側(cè)上以把橫梁和蓋件夾緊到載玻片上。
文檔編號B01L3/00GK1095759SQ94102008
公開日1994年11月30日 申請日期1994年2月16日 優(yōu)先權(quán)日1993年2月16日
發(fā)明者約翰·G·阿特伍德, 拉里哈夫 申請人:帕金-埃爾默有限公司