專利名稱:用於色譜分離的磷酸鈣型羥基磷灰石及其生產方法
本發明涉及色譜分離用的磷酸鈣型羥基磷灰石及其生產方法。
特別是，本發明涉及一種新的、具有特種晶體參數的磷酸鈣型羥基磷灰石，並在生物聚合物的分離中可用作柱填充材料。
術語磷灰石-結構化合物，一般常常是指具有通式M10(ZO4)6·X2的一大組化合物，其中M代表一金屬原子，如Ca、Ba、Sn、Mg、Na、K、pb、cd、Zn、Ni、Fe、Al……或諸如此類，ZO4代表一種酸基團，如PO4、A5O4、VO4、SO4或SiO4，而X代表-OH或F原子(基團)。本發明是指具有上述通式的磷酸鈣化合物，其中M主要是Ca，ZO4主要是PO4，而X主要是OH。
磷酸鈣型羥基磷灰石，Ca10(PO4)6(OH)2(以下除了另有注明外，都稱為“羥基磷灰石”)，作為生物醫學材料用，代表性的是人造牙和骨，在近年來日益受人注意。這是因為，就成分而言，它很相似於脊椎動物的牙和骨的無機組成，並且對有生命體具有很好的親和力。對活生物體的親和力使得它在色譜分離生物聚合物，如蛋白質、酶和核酸中可用作充填色譜柱的填充材料。
按常規，這種羥基磷灰石大都是按下面的方法合成(1)使用水溶液反應的濕法合成，其中，一種水溶性鈣鹽和磷酸鹽在水溶液中進行反應;
(2)使用高溫固相反應的干法合成，其中，磷酸鈣和碳酸鈣在900°～1400℃條件下，在有水蒸汽存在時進行反應;
(3)使用在高溫、高壓水蒸汽的條件下反應的水熱合成，其中磷酸氫鈣，例如在200℃和15個大氣壓條件下，就進行水解。
除此之外，例如在專利申請公告No 500447/1980年，還提出了一種新的合成方法。
在上述方法制得的羥基磷灰石是呈片狀的、尤其在色譜分離中用作填充材料時，就必須很好地分碎。
這樣，片狀就分成不同形狀，不同大小的小塊。不規則塊狀的羥基磷灰石不能均勻地或致密地充填色譜分離用的色譜柱。這樣得到的填充材料是難於設想能滿足於可分離性和選擇性兩者的性能。
為努力克服一般羥基磷灰石，在色譜分離中，用作柱填充材料的困難，我們做了廣泛的研究和實驗。結果，現在發現，當這樣一種羥基磷灰石在色譜分離中，用作填充材料時，很好分碎的產品結構的大小和形狀是非常重要的因素，特別是，形狀必須是球形的，粒度大小的分布也必須在狹小的范圍內，此外，具有平均粒徑為0.5～50微米，最好是1～10微米的球粒狀羥基磷灰石能達到合適的可分離性和選擇性。
本發明是根據這些新發現的事實。
由于到目前為止提供的羥基磷灰石在色譜分離生物聚合物中用作柱填充材料時，具有很不合適的可分離性和選擇性，因此，本發明的目的是提供一種用於色譜分離的，具有同樣形狀和大小的，並擅長於可分離性和選擇性的、新型磷酸鈣型磷灰石。
簡言之，本發明提供一種用於色譜分離、具有平均粒徑為0.5～50微米，最好為1～10微米的球粒狀磷酸鈣型磷灰石。
這樣一種羥基磷灰石能滿意地如下生產將膠體狀的磷酸鈣型羥基磷灰石粒化，然后在400°～700℃溫度范圍下將粒狀磷灰石焙燒。
圖1到圖3是液體色譜圖，指出了，按發明制備的羥基磷灰石比現有技術中的羥基磷灰石，在可分離性方面，是有明顯的改進。
本發明是屬於一種用於色譜分離的，具有平均粒徑為0.5～50微米，最好為1～10微米的球粒狀磷酸鈣型羥基磷灰石。我們現在揭示的另一個研究是具有以下晶體參數的羥基磷灰石，即該晶體結構是屬六方晶系，有P63/m的空間群，對a軸是9.58±0.08
的單元晶格常數，對c軸是7.00±0.05
，當在色譜分離，尤其是在生物聚合物分離中用作柱填充材料時，能經常不變地保持合適的可分離性和選擇性。
具有所要求的，獨特的晶體參數的羥基磷灰石現在將詳細描述於下。
這里所用的，術語“單元晶格”意思是一個晶胞作為一個晶體最小的可重復的單元，其中原子，原子群和分子是有規則地按三維空間排列。晶胞的幾何對稱性是由晶系和空間群表示，而晶胞的大小由晶格常數表示。磷灰石結構化合物的晶胞是由六方晶系的晶格表示，例如，用Ca2+、PO3-4或OH-排列其中。
已揭示的磷灰石結構化合物的單元晶格常數，例如磷酸鈣型羥基磷灰石，a軸是9.432
，c軸是6.881
。
作為本發明優選方案的羥基磷灰石，相形之下，a軸的單元晶格常數是9.58±0.08，而c軸是7.00±0.05。這樣，根據本發明結構的羥基磷灰石，與現有技術的那些比較，在晶體參數方面是完全不相同的，而是一種新的，在現有技術中是未知的。
單元晶格常數可以用X-射線衍射技術測定，更具體地說，根據粉末X-射線衍射法測定衍射角(Bragg角)。衍射角可以由備有衍射計(用CukαX-射線)的X-射線衍射儀所自動記錄在圖中的X-射線衍射花樣來得到。此外，由布勒格(Bragg)方程式λ＝2α sinθ，其中λ是Cukα射線的波長(1.54184
)，可以求得以埃表示的點陣間距d(
)。羥基磷灰石的晶系是六方晶系，當放在粉末X-射線衍射行列，JCPDS(粉末衍射標準聯合委員會Joint Committee on powder Diffraction Standard)9-432上，對每個點陣間距d(
)都給出密勒(Miller)指數。點陣間距d(
)，是由晶格常數a和c以及由密勒指數(hkl)按下式表示d=1(4/3a2)(h2+k2+hk)+(l2/c2)]]>利用布勒格方程式，可以寫成Sin2θ＝ 1/3 ( (λ)/(a) )2(h2+k2+hk)+( (λ)/(2c) )2l2作為本發明優選方案的羥基磷灰石，其單元晶格常數a和b，是由六方晶系的理論方程式，利用由X-射線衍射儀測得的各個衍射線的布勒格角和已知密勒指數求得的。單元晶格常數a和c的最概值和誤差范圍是由最小二乘法求得。表1列出了本發明的羥基磷灰石用X-射線衍射測得的點陣間距d(
)。
本發明優選方案的羥基磷灰石，對a軸的單元晶格常數是9.58±0.08
，對c軸是7.00±0.05
，它在生物聚合物，例如蛋白質的分離中具有特別優越的性能。當磷灰石的單元晶格常數不在上面給定的范圍內，其分離性能是很低的。
具有特定范圍的單元晶格常數(a和c)的本發明羥基磷灰石，尤其在生物聚合物分離中起優越作用的原因，尚待弄清楚。然而，可以說，通常在生物聚合物，例如，諸如DNA這樣的核酸或蛋白質的分離中，在羥基磷灰石基質中存在的吸附點和在核酸分子中的磷酰基之間，或吸附點與蛋白質的氨基和羧基基團之間的相互作用起了重要的作用。
這里要指出，在羥基磷灰石的表面，主要呈現二個不同的面，一個平行於晶格ac或bc的面(各稱為面b或a)，該面在結晶學上是相當的，而一個面是平行於ab面(稱為c面)。在晶體a面或b面上排列有吸附點(稱為吸附點c)，每個由2個帶正電荷的鈣原子構成，而在晶體的c面上，吸附點(稱為點P)，每個由6個氧原子構成，該氧原子來自帶負電荷的磷酰離子。位於晶體的這些點是有規則地排列，並在單位面積上的存在數是一個常數。由此得出，單元晶格常數a和c(值)是不同的，吸附點c之間和吸附點P之間的距離也是不同的。
如上所述，對生物聚合物的色譜分離來說，羥基磷灰石的吸附點和生物聚合物的各種功能團之間的相互作用是重要的，顯然，吸附點c之間和吸附點P之間或者這些吸附點之間的距離是影響諸如生物聚合物的吸附或解吸這樣的相互作用。在這些吸附點之間必須具有適當的距離。認為，具有符合本發明單元晶格常數的羥基磷灰石是滿足上述條件，並能出色地在生物聚合物分離中使用。
作為本發明優先方案的羥基磷灰石是具有這種獨特的晶體參數，要求有這樣的組成，即Ca對P的原子比，或Ca/p，是在1.5～1.9的范圍內。
在色譜分離中，用作柱填充材料的本發明的羥基磷灰石具有特效的吡啶吸附，此外，還具有特定的，如上所定義的單元晶格常數。我們的研究還揭示了，羥基磷灰石在每克能吸附0.003～0.01毫摩爾的吡啶時，在生物聚合物的分離中能卓越地使用。這估計歸因於酸量的控制，在功能團OH-、Ca2+和PO3-4中，尤其是OH-功能團，在羥基磷灰石基質和核酸中的磷酰基之間的作用或在基質和蛋白的氨基和羧基之間的作用中，如上所述，起有極重要的作用。
吡啶吸附主要是通過基於上述功能團的固體酸量來表示。如果吡啶吸附少於0.003毫摩爾/克，則羥基磷灰石在實際使用中就具有太低的蛋白質分離能力。如果吡啶吸附超過0.01毫摩爾/克，則分離的實施又不合適。
作為本發明優選方案的羥基磷灰石，取主要由小針狀晶體構成的微晶聚集體的形式。其尺寸是100～500
的寬和500～3000
的長度。根據本發明，針狀微晶是易於粒化成球粒，該球粒具有平均粒徑為0.5～50微米，最好是1～10微米的微晶聚集體。粒化成球粒使它具有增加機械強度的優點，並在分離柱內能更均勻地填充。
能用色譜法分離的蛋白質的例子是免疫球蛋白G、反式土曲酶酮、骨髓瘤免疫球蛋白D、血清白蛋白和卵清蛋白。
根據本發明的羥基磷灰石的生產方法，現將描述如下。
本發明的方法是將膠狀或粉狀的羥基磷灰石，在400～700℃的溫度下焙燒而成，該膠狀或粉狀羥基磷灰石是由上面簡述的，一般的，使用溶液反應的濕法，使用高溫固相反應的干法或使用水解的水熱法制得。最好的本發明方法是將膠狀的羥基磷灰石粒化，然后在400～700℃溫度下焙燒粒狀的羥基磷灰石。
我們廣泛地研究了有關磷灰石結構化合物的晶體參數和焙燒溫度之間的關系。結果發現，磷灰石結構化合物的單元晶格常數隨著焙燒溫度的上升而增加，約在600℃的瞬間達到極大，然后轉而隨著溫度超過該點繼續上升而下降。本發明是根據這個發現的。
用於這里的“膠狀磷灰石”的說法意思是指一種懸浮體或淤漿，羥基磷灰石的針狀微晶是以水或含有鈣離子，磷酸等的水溶液懸浮或成漿。這可以用任何上述的合成羥基磷灰石的方法制備。同時，膠狀羥基磷灰石也可以用在水溶液中分散或混和粉末微晶而制得。
粒化羥基磷灰石膠體的一種合意的方法是用噴霧干燥。噴霧干燥是將羥基磷灰石的懸浮體或淤漿噴入高溫空氣流中、因而立即干燥。至於噴霧干燥的條件，懸浮體或淤漿的濃度是0.1～20%(重量)，最好是1～10%(重量)，高溫空氣流的溫度是100～200℃，最好是110～170℃。噴咀的結構、空氣的量和其他條件可以按要求適當選用。實驗表明，粒化生產的產品的粒徑，控制在約0.5～約50微米范圍內，最好控制在約1～約20微米內。發現，合適的粒化可以給出甚至更狹范圍約1～約10微米粒徑的球粒。
在本發明的方法中，焙燒是將膠狀或粉狀羥基磷灰石在加熱區內加熱到予定溫度，然后保持在同樣溫度而進行的。焙燒溫度是在400～700℃的范圍內，最好是在500～600℃，焙燒時間並不嚴格，但一般是0.1～20小時，最好是1～3小時。理想的焙燒是在有氧或空氣存在的條件下進行。干燥條件沒有特定的限制，但在80～120℃下加熱0.1～10小時，一般可以得到好的結果。
用上述方法焙燒膠狀的起始磷灰石所得到的這種羥基磷灰石在現有技術中是沒有的化合物，它是新型的，具有下列特定的單元晶格常數和性質粒徑，微米 0.5-50Ca/p比 1.5-1.9粒狀 球形(針狀微晶聚集體)吡啶吸附，毫摩/克. 0.003-0.01以下，本發明用下列實例進行說明。
例1在一個一升的三頸瓶中加入氫氧化鈣懸浮體(由15.6克的95%Ca(OH)2和400克蒸餾水組成)。注入氮氣並劇烈攪拌，慢慢加入磷酸水溶液(由13.8克85%H3PO4和400克蒸餾水組成)，加完后，再加入含水磷酸以調節pH值到8.2。將混合液放置在油浴上，並在90℃保持約18小時。得到一種含產品的白色微晶或膠態羥基磷灰石。
冷卻后，部分產品用噴霧干燥器制成粒徑為約1～約10微米的球形顆粒或微晶聚集體。
產品在100℃進行干燥，並在580℃焙燒制成用於分離柱的顆粒。用顆粒的X-射線衍射測得的點陣間距列于表1。顆粒的參數值如下(1)用X-射線衍射測定的單元晶格常數
a＝9.58
c＝7.01
(2)吡啶吸收＝0.0056毫摩爾/克(3)Ca/p比＝1.67X-射線衍射是用由Rigaku Denki公司生產的“RAD-rD”型的儀器進行測定的。所用的測定條件如下功率輸出＝40KV，30mA Cukα.
DS/RS/SS＝1/6℃/0.15毫米/1/6℃給定時間間隔＝0.1秒步距＝1/100
表1密勒指數點陣間距d(
)
吡啶吸附是按下法測定將粒徑為1～10微米的粒化的羥基磷灰石用一壓力鎮壓器輕輕壓實。壓塊在瑪瑙研缽中磨成30～100篩孔大小的細粉。正確稱取0.075克的磨過的磷灰石並裝入柱式樣品管，在氮氣氛中，100℃條件下干燥。同時，將含有吡啶的擴散器浸入保持在15.5℃恒溫的水浴中，鼓入氮氣泡，使裝在反應器中的羥基磷灰石在100℃吸附吡啶15分鐘。然后，在氮氣流中將溫度慢慢增加到200℃，然后保持該溫度以引起物理吸附的含量解吸，用氫離子監測型的氣體色譜法，可以肯定不再有吡啶的解吸可檢出。然后，按5℃/分的速度將溫度由200℃升高到950℃。從而用氣體色譜法測定了吡啶解吸量。測得的所除去的吡啶量可作為吡啶的吸附量。
例2將例1所用的同樣材料用於在同樣反應條件下制備顆粒。顆粒產品在100℃干燥，然后在400℃焙燒3小時。用X-射線衍射測定焙燒過的顆粒的點陣間距列于表1。
產品的參數值如下(1)單元晶格常數a＝9.51
c＝6.96
(2)吡啶吸附＝0.0092毫摩爾/克(3)Ca/p比＝1.67例3使用在例1中所用的同樣材料和同樣反應條件制備顆粒。產品在100℃干燥並在700℃焙燒3小時。用X-射線衍射測定顆粒的點陣間距列于表1參數值如下(1)單元晶格常數a＝9.55
c＝6.99
(2)吡啶吸附＝0.0038毫摩爾/克(3)Ca/p比＝1.67參考例將在例1-例3中所得到的羥基磷灰石用於細胞色素c，溶菌酶和牛的血清白蛋白的混合物的樣品分離。色譜分離操作所用的條件如下液體色譜儀由Wafers公司生產的“LC244”型溶劑(梯度溶液)磷酸鈉水溶液(pH6.8)0.01-0.3摩爾/小時梯度。
流速0.8毫升/分樣品量各100微升(例2的羥基磷灰石是用50微升)檢測器由日本光譜公司(Specfroscopic Co)生產的“UVDEC-100-Ⅲ”型檢測波長＝280毫微米色譜記錄自動記錄圖速率＝2.5毫米/分結果用圖示法列于圖1-3。能清楚看到，根據本發明制備的羥基磷灰石具有比已知羥基磷灰石大得多的分離能力。
在細胞色素C的分離中求得理論塔板數以便測定分離能力。所得結果列于表2。對發明來說，術語“理論塔板數”是根據在色譜儀中的分辨時間(tR)和色譜圖中的半寬度由以下方程式計算出來的N(理論塔板數)＝16(tR/ω)2表2例1 2 3Ca/p比 16.7點陣空間常數a(
) 9.58 9.51 9.55c(
) 7.01 6.96 6.99吡啶吸附 0.0056 0.0092 0.0038(毫摩爾/克)在細胞色素c分離 14000 13000 11000的理論塔板數 ～20000根據本發明的羥基磷灰石具有獨特的形狀、大小和晶體參數，並在色譜分離生物聚合物，如蛋白質中作為柱填充材料是十分有用的，在色譜分離性方面獲得顯著的改進。
權利要求
1.用於色譜分離的磷酸鈣型羥基磷灰石是具有平均粒徑為0.5-50微米的球粒。
2.按權利要求
1的用於色譜分離的磷酸鈣型羥基磷灰石，其特征在于，球粒的平均粒徑是1-10微米。
3.按權利要求
1或2的用於色譜分離的磷酸鈣型羥基磷灰石，其特征在于，球粒各為主要是針狀微晶的聚集體，微晶屬六方晶系，並對a軸的單元晶格常數是9.58±0.08
，而對c軸為7.00±0.05
。
4.按權利要求
1-3的任一項用於色譜分離的磷酸鈣型羥基磷灰石，其特征在于，吡啶吸附是在0.003-0.01毫摩爾/克。
5.按權利要求
1-3的任一項磷酸鈣型羥基磷灰石，其特征在于，羥基磷灰石的Ca/p比是在1.50-1.90的范圍內。
6.生產用於色譜分離的磷酸鈣型羥基磷灰石的方法包括粒化膠狀磷酸鈣型羥基磷灰石，然后在400°-700℃的范圍內焙燒粒狀磷灰石。
7.按權利要求
6的方法，其特征在于，焙燒溫度是在500°-600℃的范圍內。
8.按權利要求
6或7的方法，其特征在于，焙燒粒狀磷酸鈣型羥基磷灰石是在有氧氣或空氣存在下，加熱顆粒一給定的時間而實施的。
9.按權利要求
6-8的任一項方法，其特征在于，顆粒的平均粒徑為0.1-50微米。
10.按權利要求
9的用於色譜分離的磷酸鈣型羥基磷灰石，其特征在于，顆粒的平均粒徑為1-10微米。
專利摘要
用于色譜分離的磷酸鈣型羥基磷灰石是具有平 均粒徑為0.5—50微米，最好為1—10微米的球粒。球 粒主要是屬六方晶系的針狀微晶聚集體，對a軸的單 元晶格常數是9.58±0.08，對C軸為7.00±0.05。 羥基磷灰石是將膠狀磷酸鈣型磷灰石粒化，然后在 氧氣或空氣存在下，于400—700℃最好500—600℃ 下焙燒一給定時間而完成的。
文檔編號B01J20/28GK86107584SQ86107584
公開日1987年7月15日 申請日期1986年9月22日
發明者多賀谷宜秋, 桑原秀行, 橋本孝雄, 小松紀子, 深町圭子, 前島次男, 石川利弘, 小川哲明 申請人:東亞燃料工業株式會社, 旭光學工業株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan