高通量三維微流控芯片免疫測定裝置及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種高通量三維微流控芯片免疫測定裝置及其制備方法，疫測定裝置典型例子包括導流管和立體玻璃芯體，玻璃芯體的側面上修飾有共聚物刷，共聚物刷上點印有檢測探針；本檢測裝置將傳統的二維芯片變為三維的微陣列芯片，并極大地提高了芯片的檢測通量，同時促進傳質過程、加快目標和探針分子的結合或反應速率，大幅度縮短檢測時間。本發明中制備方法包括清潔活化玻璃芯體的表面，并進一步修飾PEGMA-GMA共聚物刷，然后在聚物刷上點印檢測探針，置于導流管中形成三維微流控芯片免疫測定裝置，比較現有微陣列免疫芯片本發明免疫測定裝置檢測通量高，檢測時間短，且不需要微加工，制造成本低。
【專利說明】高通量三維微流控芯片免疫測定裝置及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種免疫測定裝置，特別涉及一種新概念的高通量三維微流控芯片免疫測定裝置及其制備方法。
【背景技術】
[0002]免疫分析是一種利用抗原抗體之間特異性結合反應對小分子化合物、生物大分子以及微生物等進行定性和定量檢測的方法，已廣泛應用于生物醫學診斷、環境評價、食品安全檢測等領域。近年來，微陣列和微流控免疫芯片因其樣品和試劑用量少、分析通量高、易于自動化等特征被普遍用于科研和日常生活中。對于微陣列技術，雖然市場上有成熟的點樣儀器和分析軟件，但在靜止的反應狀態下傳質過程比較緩慢，微陣列芯片上抗原-抗體反應時間較長。對于微流控技術，流動的檢測體系加快了傳質過程從而縮短了抗體-抗原的反應時間，但因芯片的微加工需要嚴格的條件和昂貴的儀器，抑制了微流控技術的發展。
[0003]目前雖然有研究者將微陣列和微流控技術結合用以免疫檢測，但現有裝置仍然沒有解決微流體平臺的微加工技術要求苛刻、費用昂貴的缺點；另外，現有微陣列檢測僅在一個平面上進行，芯片的有效利用面積小，檢測通量相對較低。
【發明內容】
[0004]有鑒于此，本發明的目的是提供一種高通量三維微流控芯片免疫測定裝置及其制備方法，以提高免疫檢測通量、提高檢測信噪比和靈敏度和提高檢測工作效率。
[0005]本發明高通量三維微流控芯片免疫測定裝置，包括導流管和設置于導流管內的玻璃芯體,所述玻璃芯體為正棱柱體、正棱柱管形、圓柱形或圓柱管形,所述玻璃芯體的外側面上修飾有共聚物刷，所述共聚物刷上點印有檢測探針。
[0006]進一步，所述玻璃芯體為長方體形。
[0007]進一步，所述檢測探針為目標檢測物的單克隆抗體。
[0008]進一步，所述單克隆抗體為抗人癌胚抗原單克隆抗體或/和抗人甲胎蛋白單克隆抗體。
[0009]本發明高通量三維微流控芯片免疫測定裝置的制備方法，包括如下步驟:
[0010]a.將玻璃芯體的側面清洗活化；
[0011]b.在活化后的玻璃芯體的側面上修飾PEGMA-GMA共聚物刷；
[0012]c.在玻璃芯體側面上的PEGMA-GMA共聚物刷上點印檢測探針；
[0013]d.將步驟c中結合了檢測探針的玻璃芯體放置于導流管中形成三維微流控芯片免疫測定裝置。
[0014]進一步，所述步驟a中，將玻璃芯體的側面清洗活化的步驟包括:先將玻璃芯體用體積分數為3 %的3-氨丙基三乙氧基硅烷浸泡2個小時后清洗干凈，再放入真空干燥箱，在110°C下真空退火2個小時。
[0015]進一步，所述步驟b中，在玻璃芯體的側面修飾PEGMA-GMA共聚物刷的步驟包括:[0016]將側面清洗活化后的玻璃芯體放入含三氯甲烷、三乙胺和2-溴異丁酰溴的混合溶液中，先在0°c冰浴中孵育20分鐘，后放置室溫下繼續孵育2個小時；所述混合溶液中每20mL的三氯甲烷混合溶液中三乙胺的終濃度為55禮，2-溴異丁酰溴的終濃度為50mM ;然后將玻璃芯體從混合溶液中取出清洗干凈后再放入聚合溶液中孵育6個小時，所述聚合溶液中甲醇和水的最終體積分數為50%,溴化銅的最終濃度為3.35mg/mL,聯卩比唳的最終濃度為4.6mg/mL,抗壞血酸的最終濃度為2.38mg/mL,甲基丙烯酸縮水甘油酯的最終體積分數為2%，聚乙二醇甲基丙烯酸酯的最終體積分數為20%。
[0017]進一步，所述步驟c中，在修飾了 PEGMA-GMA共聚物刷的玻璃芯體的側面上結合檢測探針的步驟包括:
[0018]將玻璃芯體用乙醇和去離子水依次沖洗，再干燥，然后通過芯片點樣儀將10yg/mL的檢測探針以微陣列形式點在玻璃芯體的的四個側面上，并在室溫下放入真空箱干燥2個小時，最后用Tris緩沖液清洗和浸泡。
[0019]本發明的有益效果:
[0020]1、本發明高通量三維微流控芯片免疫測定裝置，其玻璃芯體的四個側面均具有聚合物刷和微陣列的檢測探針，聚合物刷可有效提高固定抗體的數量并降低非特異性吸附，相對于現有微陣列免疫芯片本免疫測定裝置的有效使用面積大大提高，且檢測靈敏度高。
[0021]2、本發明高通量三維微流控芯片免疫測定裝置，其通過在玻璃芯體外套導流管，檢測對象可在流動泵的驅動下在導流管的微通道內流動，實現流動檢測，從而可很大的縮短抗體-抗原的反應時間；因此本三維微流控芯片免疫測定裝置不僅兼具了微陣列和微流控的檢測優勢，而且其檢測效率現對于現有微陣列和微流控免疫芯片有了很大的提高，非常適用于大規模快速篩查，可在疾病早期篩查、食品安全分析、環境污染物監控等方面得到廣泛應用。
[0022]3、本發明高通量三維微流控芯片免疫測定裝置，其玻璃芯體和導流管結構簡單，且不要通過專門的微加工設備制造，制造成本低。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為本高通量三維微流控芯片免疫測定裝置的立體結構示意圖；
[0024]圖2為本高通量三維微流控芯片免疫測定裝置的縱向剖視示意圖；
[0025]圖3為本高通量三維微流控芯片免疫測定裝置在靜止和不同流速的流通條件下，抗體-抗原結合與反應時間的關系圖；
[0026]圖4為本高通量三維微流控芯片免疫測定裝置對多個腫瘤標志物檢測的特異性和選擇性的柱狀圖和熒光照片；
[0027]圖5為本高通量三維微流控芯片免疫測定裝置對腫瘤標志物AFP和CEA檢測得到的標準曲線和熒光照片。
【具體實施方式】
[0028]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步描述。
[0029]實施例一，本實施例高通量三維微流控芯片免疫測定裝置，包括導流管I和設置于導流管I內的玻璃芯體2，所述玻璃芯體2為長方體形，所述玻璃芯體2的側面上修飾有共聚物刷，所述共聚物刷上點印有檢測探針。長方體形的玻璃芯體2在點印檢測探針時，可將多個玻璃芯體并列布置同時點印，可提高工作效率。當然在不同實施例中，所述玻璃芯體2還可是其它形狀的正棱柱體、正棱柱管形、圓柱形或圓柱管形。
[0030]本實施例高通量三維微流控芯片免疫測定裝置，其玻璃芯體2的四個側面均具有聚合物刷和微陣列的檢測探針，聚合物刷可有效提高固定抗體的數量并降低非特異性吸附，相對于現有微陣列免疫芯片本免疫測定裝置的有效使用面積大大提高，且檢測靈敏度高。進一步，本高通量三維微流控芯片免疫測定裝置，其通過在玻璃芯體2外套導流管1，檢測對象可在流動泵的驅動下在導流管I的微通道內流動(玻璃芯體2和導流管I間的間隙小，可使所需的檢測對象用量較少)，實現流動檢測，從而可很大的縮短抗體-抗原的反應時間；因此本三維微流控芯片免疫測定裝置不僅兼具了微陣列和微流控的檢測優勢，而且其檢測效率現對于現有微陣列和微流控免疫芯片有了很大的提高，非常適用于大規模快速篩查，可在疾病早期篩查、食品安全分析、環境污染物監控等方面得到廣泛應用。進一步，本高通量三維微流控芯片免疫測定裝置，其玻璃芯體2和導流管I結構簡單，且不要通過專門的微加工設備制造，制造成本低。
[0031]本實施例中，所述檢測探針為目標檢測物的單克隆抗體。
[0032]本實施例中，所述單克隆抗體為抗人癌胚抗原單克隆抗體，當然在不同實施例中，所述單克隆抗體還可為抗人甲胎蛋白單克隆抗體。
[0033]實施例二、本實施例高通量三維微流控芯片免疫測定裝置的制備方法，包括如下步驟:
[0034]a.將玻璃芯體的側面清洗活化；
[0035]b.在活化后的玻璃芯體的側面上修飾PEGMA-GMA共聚物刷；
[0036]c.在玻璃芯體側面上的PEGMA-GMA共聚物刷上點印檢測探針；
[0037]d.將步驟c中結合了檢測探針的玻璃芯體2放置于導流管I中形成三維微流控芯片免疫測定裝置。
[0038]所述步驟a中，將玻璃芯體的側面清洗活化的步驟包括:先將玻璃芯體用體積分數為3%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)乙醇熔液浸泡2個小時，然后用乙醇和去離子水依次清洗干凈，然后用氮氣吹干，再放入真空干燥箱，在110°C下真空退火2個小時。
[0039]所述步驟b中，在玻璃芯體的側面修飾PEGMA-GMA共聚物刷的步驟包括:
[0040]將側面清洗活化后的玻璃芯體放入含三乙胺(TEA)和2-溴異丁酰溴(BIB)的三氯甲烷混合溶液中，先在0°c冰浴中孵育20分鐘，后放置室溫下繼續孵育2個小時；所述混合溶液中每20mL的三氯甲烷混合溶液中三乙胺的終濃度為55mM，2-溴異丁酰溴的終濃度為50mM ;然后將玻璃芯體從混合溶液中取出清洗干凈后再放入聚合溶液中孵育6個小時，所述聚合溶液中甲醇和水的最終體積分數為50%,溴化銅的最終濃度為3.35mg/mL,聯批唳的最終濃度為4.6mg/mL,抗壞血酸的最終濃度為2.38mg/mL,甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)的最終體積分數為2%，聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)的最終體積分數為20%。
[0041]所述步驟c中，在修飾了 PEGMA-GMA共聚物刷的玻璃芯體的側面上結合檢測探針的步驟包括:
[0042]將玻璃芯體用乙醇和去離子水依次沖洗，再干燥，然后通過芯片點樣儀將100 μ g/mL的檢測探針以微陣列形式點在玻璃芯體的的四個側面上，并在室溫下放入真空箱干燥2個小時，最后用Tris緩沖液清洗和浸泡；本實施例中所述檢測探針為鼠抗人CEA(癌胚抗原,carcino-embryonic antigen)單克隆抗體，PEGMA-GMA共聚物刷中的甲基丙烯酸縮水甘油酯的環氧鍵與單克隆抗體上的氨基反應形成化學鍵，使單克隆抗體共價固定于玻璃毛細
管表面。
[0043]本實施例高通量三維微流控芯片免疫測定裝置的檢測腫瘤標志物CEA的具體步驟如下:
[0044]將分別含Opg/mL, 0.lpg/mL, lpg/mL, 10pg/mL, lOOpg/mL, Ing/mL, lOng/mL, 10ng/mL, I μ g/mL, 10 μ g/mL腫瘤標志物CEA的PBS溶液采用流動泵分別泵入此裝置，在流速為15μ L/min流動反應30分鐘，再將I μ g/mLCy3標記的鼠抗人CEA單克隆抗體泵入此裝置30分鐘，最后將TBS溶液和去離子水分別流過此裝置，干燥后，用熒光掃描儀讀取熒光信號，然后以熒光強度為縱坐標，腫瘤標志物CEA的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，如圖5所示。
[0045]實施例三、本實施例高通量三維微流控芯片免疫測定裝置的制備方法與實施例一的區別在于:所述檢測探針為鼠抗人AFP (甲胎蛋白，alpha-fetalprotein)單克隆抗體，本實施例的其它步驟與實施例二相同，在此不再贅述。
[0046]本實施例高通量三維微流控芯片免疫測定裝置的檢測腫瘤標志物AFP的具體步驟如下:
[0047]將分別含有0pg/mL,0.lpg/mL,lpg/mL,10pg/mL,100pg/mL,Ing/mL,10ng/mL,lOOng/mL, I μ g/mL, 10 μ g/mL腫瘤標志物APF的PBS溶液分別采用流動泵將樣品溶液以流速為15 μ L/min流經此裝置30分鐘，再將I μ g/mL Cy3標記的鼠抗人AFP多克隆抗體泵入此裝置30分鐘，最后將TBS溶液和去離子水分別流過此裝置，干燥后，用熒光掃描儀讀取熒光信號，然后以熒光強度為縱坐標，腫瘤標志物AFP濃度為橫坐標，繪制標準曲線，如圖5所
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[0048]實施例四、本實施例高通量三維微流控芯片免疫測定裝置的制備方法與實施例一的區別在于:所述檢測探針為鼠抗人AFP(甲胎蛋白，alpha-fetal protein)單克隆抗體和鼠抗人CEA(癌胚抗原，carcino-embryonic antigen)單克隆抗體,本實施例的其它步驟與實施例二相同，在此不再贅述。
[0049]本實施例高通量三維微流控芯片免疫測定裝置同時檢測多組分腫瘤標志物的具體步驟如下:
[0050]采用流動泵將含有100ng/mL腫瘤標志物APF和CEA的PBS混合溶液或血清以流速為15 μ L/min流經此裝置30分鐘，再將I μ g/mL Cy3標記的鼠抗人AFP單克隆抗體和I μ g/mL Cy3標記的鼠抗人CEA單克隆抗體的PBS混合溶液泵入此裝置30分鐘，最后將TBS溶液和去離子水分別流過此裝置，干燥后，用熒光掃描儀讀取熒光信號，然后以熒光強度為縱坐標，腫瘤標志物AFP和CEA為橫坐標,繪制柱狀圖,如圖4所示。
[0051]最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。
【權利要求】
1.一種高通量三維微流控芯片免疫測定裝置，其特征在于:包括導流管和設置于導流管內的玻璃芯體，所述玻璃芯體為正棱柱體、正棱柱管形、圓柱形或圓管形，所述玻璃芯體的外側面上修飾有共聚物刷，所述共聚物刷上點印有檢測探針。
2.根據權利要求1所述的高通量三維微流控芯片免疫測定裝置，其特征在于:所述玻璃芯體為長方體形。
3.根據權利要求1所述的高通量三維微流控芯片免疫測定裝置，其特征在于:所述檢測探針為目標檢測物的單克隆抗體。
4.根據權利要求3所述的高通量三維微流控芯片免疫測定裝置，其特征在于:所述單克隆抗體為抗人癌胚抗原單克隆抗體或/和抗人甲胎蛋白單克隆抗體。
5.一種權利要求1-4中任一所述的高通量三維微流控芯片免疫測定裝置的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: a.將玻璃芯體的側面清洗活化； b.在活化后的玻璃芯體的側面上修飾PEGMA-GMA共聚物刷； c.在玻璃芯體側面上的PEGMA-GMA共聚物刷上點印檢測探針； d.將步驟c中結合了檢測探針的玻璃芯體放置于導流管中形成三維微流控芯片免疫測定裝置。
6.根據權利要求5所述的高通量三維微流控芯片免疫測定裝置的制備方法，其特征在于:所述步驟a中，將玻璃芯體的側面清洗活化的步驟包括:先將玻璃芯體用體積分數為3%的3-氨丙基三乙氧基硅烷浸泡2個小時后清洗干凈，再放入真空干燥箱，在110°C下真空退火2個小時。
7.根據權利要求5所述的高通量三維微流控芯片免疫測定裝置的制備方法，其特征在于:所述步驟b中，在玻璃芯體的側面修飾PEGMA-GMA共聚物刷的步驟包括: 將側面清洗活化后的玻璃芯體放入含三氯甲烷、三乙胺和2-溴異丁酰溴的混合溶液中，先在(TC冰浴中孵育20分鐘，后放置室溫下繼續孵育2個小時；所述混合溶液中每20mL的三氯甲烷混合溶液中三乙胺的終濃度為55mM，2-溴異丁酰溴的終濃度為50mM;然后將玻璃芯體從混合溶液中取出清洗干凈后再放入聚合溶液中孵育6個小時，所述聚合溶液中甲醇和水的最終體積分數為50%,溴化銅的最終濃度為3.35mg/mL,聯卩比唳的最終濃度為4.6mg/mL,抗壞血酸的最終濃度為2.38mg/mL,甲基丙烯酸縮水甘油酯的最終體積分數為2%，聚乙二醇甲基丙烯酸酯的最終體積分數為20%。
8.根據權利要求5所述的高通量三維微流控芯片免疫測定裝置的制備方法，其特征在于:所述步驟c中，在修飾了 PEGMA-GMA共聚物刷的玻璃芯體的側面上結合檢測探針的步驟包括: 將玻璃芯體用乙醇和去離子水依次沖洗,再干燥,然后通過芯片點樣儀將100μ g/mL的檢測探針以微陣列形式點在玻璃芯體的的四個側面上，并在室溫下放入真空箱干燥2個小時，最后用Tris緩沖液清洗和浸泡。
【文檔編號】B01L3/00GK104034895SQ201410260221
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月12日 優先權日:2014年6月12日
【發明者】李長明, 劉英帥, 張嫄媛 申請人:西南大學