一種基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱及其制備方法
【專利摘要】本發明提供一種基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱及其制備方法。該方法將疊氮類單體、炔基類單體、交聯劑、致孔劑、引發劑和催化劑于一鍋內超聲溶解，再注入經乙烯基改性的石英毛細管內，經過處理制得毛細管整體柱。本發明結合了點擊化學結合產率高、選擇性高、內在簡單、靈活有效的優點和“一鍋法”的反應條件溫和、有機單體取材廣泛、制備時間短的優點，制備的基于Cu(I)點擊的聚合物基質的整體柱具有穩定的顆粒狀堆積的結構。將自由基聚合和點擊化學“一鍋法”結合起來制備毛細管整體柱，拓寬了點擊化學在整體柱中的應用。
【專利說明】一種基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于毛細管整體柱的制備領域，具體涉及一種基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱及其制備方法。
【背景技術】
[0002]生物樣品的復雜性和多樣性對現有分離技術提出了嚴峻的挑戰，用于分離技術的儀器如高效液相色譜等，在分離生物樣品時均需在硬件和軟件方面進行相應的改進。其中色譜分離的核心部分是色譜柱。傳統的填充柱在柱效與通量之間無法取得平衡，也就是提高柱效的同時柱背壓也隨之增加，無法滿足快速、高效、高通量分離的要求。在這種背景下，整體柱應運而生。整體柱柱體是具有多孔結構的整體棒狀固定相，與傳統填充柱相t匕，具有通透性好、傳質速率快、易于改性、容易制備等優點，特別適合于來源寶貴的微量生物樣品，是當前微分離分析領域的研究熱點(Sykora.D, Svec.F，Frechet.J.M, J.Chromatogr.A, 1999，852: 297)。目前整體柱已能適用于各種分離模式,如反相色譜、正相色譜、親和色譜、疏水相互作用色譜等模式。
[0003]整體柱按聚合基質的不同可以分為:硅膠(無機)基質整體柱、有機聚合物基質整體柱及有機-無機雜化整體柱。目前制備整體柱的方法多采用自由基原位聚合的方法，此方法選材廣泛、制備過程簡單、PH應用范圍寬、生物兼容性好。但是用于自由基原位聚合的功能單體容易發生自聚影響孔的尺寸，進而造成較差的滲透性和較低的柱效。為了克服這些缺點，人們將一些接枝率高的、反應條件溫和的方法逐步引入到整體柱的制備中，例如諾貝爾化學獎獲得主K.B.Sharpless教授提出的點擊化學的方法。點擊化學是利用易得的原料，通過高效、可靠而又具有選擇性的反應來實現雜原子連接(C-X-C)，點擊化學具有高選擇性、高轉化率、反應條件溫和、易于操作等優點。點擊化學自提出以來，在眾多領域如藥物化學、生物科學、高分子化學、色譜固定相合成等展示了良好的應用前景，引起了人們的重大關注，其應用范圍也越來越廣泛。點擊化學的代表反應是銅催化的疊氮-炔基的Husigen環加成反應和巰基-烯點擊反應。目前，基于巰基-烯的點擊反應已成功用于毛細管整體柱的制備(Ming-Luan Chen, Jun Zhang, Zheng Zhang, B1-FengYuan, Qiong-Wei Yuj Yu-Qi Feng, J.Chromatogr.A， 2013， 1284:118-125; YixuanLiuj Yingzhuang Chen, Huihui Yang, Lihua Niej Shouzhuo Yaoj J.Chromatogr.A,2013，1283:132-139)。基于銅催化的疊氮-炔基的點擊反應具有高選擇性、高產率、近乎量化的接枝度等優點，已經采用柱后修飾的方法將點擊化學應用到毛細管整體柱的制備(Xiangli Sun, Dong Lin, Hiwen He, Langxing Chen, Yukui Zhang, Talanta,2010,82:404-408)，但是目前將點擊化學和自由基聚合“一鍋法”結合制備毛細管整體柱的方法尚未有報道。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱及其制備方法。該方法采用自由基聚合和點擊化學“一鍋法”結合反應制備毛細管整體柱，具有選擇性高、產率高、操作條件溫和、方法簡便等優點，在分離有機小分子、復雜生物樣品方面有著良好的應用前景。
[0005]一種基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱，采用自由基聚合一點擊化學“一鍋法”結合反應制備而成的基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱。
[0006]一種制備如上所述的基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱的方法，包括以下步驟:
(1)預聚混合溶液的制備:將疊氮類單體、炔基類單體、交聯劑、致孔劑、引發劑、催化劑均勻混合后，于室溫下超聲振蕩，通氮氣去除混合溶液中溶解的氧氣；
(2)自由基聚合一點擊化學“一鍋法”結合反應:將步驟I)制得的混合溶液注入經乙烯基改性的石英毛細管內，密封后置于水浴鍋內反應；將毛細管取出，用甲醇或乙腈沖洗制得毛細管整體柱。
[0007]所述的基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱的制備方法，步驟I)所述的疊氮類單體為疊氮化羧酸或疊氮化羧酸酯；其中，疊氮類羧酸的化學式為N3(CH2)nCOOH, η為1-9，疊氮化羧酸酯的化學式為N3(CH2)nCOOR, η為1-9 ;
所述的炔基類單體為甲基丙烯酸炔丙基酯或丙烯酸炔丙基酯中的一種；
所述的交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯或聚乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一種；
所述的致孔劑為二甲基亞砜/十二醇混合物或N，N- 二甲基甲酰胺/十二醇混合物中的一種；其中，二甲基亞砜與十二醇的質量比為40-60:40-60，Ν，Ν-二甲基甲酰胺與十二醇的質量比為40-60:40-60 ；
所述的引發劑為偶氮二異丁腈；
所述的催化劑為溴化亞銅配合物、氯化亞銅、溴化亞銅、碘化亞銅中的一種；其中溴化亞銅配合物為溴化亞銅與配體五甲基二乙烯三胺或2，2’ -聯吡啶形成的配合物中的一種。
[0008]所述的基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱的制備方法，二甲基亞砜/十二醇混合物:二甲基亞砜與十二醇的質量比為55:45，N, N-二甲基甲酰胺/十二醇混合物:N，N-二甲基甲酰胺與十二醇的質量比為55:45。
[0009]所述的基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱的制備方法，步驟I)中疊氮類單體和炔基類單體的摩爾質量比為廣2:1，優選1:1 ;炔基類單體和交聯劑的質量比為廣2:1，優選1:1 ;致孔劑與疊氮類單體、炔基類單體和交聯劑三者之和的質量比為60-80:20-40，優選80:20 ;引發劑的質量為疊氮類單體、炔基類單體和交聯劑三者質量之和的f 2%，優選1% ;催化劑在混合溶液中的濃度為0.2~lmg/mL，優選0.4mg/mL。
[0010]所述的基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱的制備方法，步驟2)中，反應溫度為6(T75°C，優選為70°C ;反應時間為12~24h，優選為24h。
[0011]一種如上所述的基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱的應用為:用于有機小分子、復雜生物分子的分離。
[0012]本發明的有益效果在于:
本發明提供的基于 Cu(I)點擊的聚合物基質的毛細管整體柱的制備方法，可以在70°C水浴鍋中反應24h將自由基聚合和點擊化學“一鍋法”結合反應，大大改善了普通的自由基聚合造成的柱體結構不均一的問題，制備過程簡單、易操作、制備方法重現性好，可適用于分離有機小分子、復雜生物樣品等。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為實施例所制得的基于Cu(I)點擊的聚合物基質的毛細管整體柱截面的掃描電鏡圖；
圖2為實施例所制得的基于Cu (I)點擊的聚合物基質的毛細管整體柱柱體與管內壁連接處的掃描電鏡圖；
圖3為實施例2中甲苯、N, N- 二甲基甲酰胺、甲酰胺、硫脲4種混合樣的分離色譜圖； 圖4為實施例3中5種苯系物的分離色譜圖；
圖5為實施例4中不同pH條件下苯胺類的分離色譜圖；
圖6為實施例5中6種生物堿的分離色譜圖；
圖7為實施例6中5種核苷堿基類混合樣的分離色譜圖。
【具體實施方式】
[0014]下面通過具體實施例對本發明的技術方案做進一步說明。但本發明并不限于以下實施例。
[0015]本發明提供的制備整體柱的方法，所用的聚合物分離介質是由6-疊氮己酸和甲基丙烯酸炔丙基酯點擊并且和乙二醇二甲基丙烯酸酯聚合而成，該聚合體系還包括二甲基亞砜和十二醇的二元致孔劑、弓I發劑和催化劑。
[0016]實施例1
1.柱子預處理
將毛細管內壁依次用丙酮沖洗30min，清水沖洗lh，氫氧化鈉沖洗12h，清水沖洗2h，鹽酸沖洗3h，清水沖洗2h，甲醇沖洗30min，最后通氮氣吹干；
2.硅烷化
在預處理過的毛細管內注入無水甲醇和甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(Y-MAPS)體積比為1:1的混合液，在45°C下反應12h，然后用甲醇沖洗30min，在60°C下氮氣吹干；
3.柱內合成
準確量取6-疊氮己酸36 μ L，甲基丙烯酸炔丙基酯31 μ L，乙二醇二甲基丙烯酸酯29 μ L, 二甲基亞砜200 μ L,十二醇219 μ L,偶氮二異丁腈lmg，碘化亞銅0.2mg于離心管中，于室溫下超聲使其混合均勻，氮吹制成預聚混合溶液；將混合液注入經乙烯基改性的100 μ m內徑毛細管中，至25cm處，兩端封口放入70°C水浴鍋中反應24h。反應結束后取出冷卻至室溫，在高壓恒流泵的低流速下用甲醇沖洗除去未反應的單體和致孔劑，制得了聚合物基質的毛細管整體柱；
用掃描電子顯微鏡觀察上述制備得到的整體柱的柱體微觀形貌，可以得知材料具有微米級的微孔和連續的三維骨架，如圖1所示；
用掃描電子顯微鏡觀察上述制備得到的整體柱的柱體微觀形貌，可以得知整體柱基質與石英毛細管內壁鍵合完好，能耐受19兆帕的泵壓，具有較好的機械穩定性，如圖2所示。[0017]實施例2
在微柱液相色譜(μ HPLC)模式下，以5%乙腈水溶液為流動相Α，5%水乙腈溶液為流動相B ;色譜條件:100%Β ;泵流速為0.05 mL/min ;檢測波長為214nm ;甲苯、硫脲、甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺(各IOOppm)的混合液在上述實施示例I中制得的聚合基質的毛細管整體柱上實現高效選擇性的分離，其色譜分離圖如圖3所示，色譜圖中的峰依次為1:甲苯，2:N，N- 二甲基甲酰胺，3:甲酰胺，4:硫脲。
[0018]實施例3
在微柱液相色譜(μ HPLC)模式下，以5%乙腈水溶液為流動相A，5%水乙腈溶液為流動相B ;色譜條件:45%B ;泵流速為0.05 mL/min ;檢測波長為214nm ;硫脲、苯、甲苯、乙苯、丙苯、丁苯(各IOOppm)的混合液在上述實施示例I中制得的聚合基質的毛細管整體柱上實現高效選擇性的分離，其色譜分離圖如圖4所示，色譜圖中的峰依次為1:硫脲，2:苯，3:甲苯，4:乙苯,5:丙苯,6:丁苯。
[0019]實施例4
在微柱液相色譜(μ HPLC)模式下，以5%乙腈磷酸鹽緩沖液(50mM，pH=3、4.5、5.5)為流動相A，5%水乙腈溶液為流動相B ;色譜條件:50%B ;泵流速為0.05 mL/min ;檢測波長為214nm ;苯胺、苯甲胺、鄰硝基苯胺、甲萘胺(各IOOppm)的混合液在上述實施示例I中制得的聚合基質的毛細管整體柱上實現高效選擇性的分離，其色譜分離圖如圖5所示，色譜圖中的峰依次為1:苯胺，2:苯甲胺，3:鄰硝基苯胺，4:甲萘胺。
[0020]實施例5
在微柱液相色譜(μ HPLC)模式下，以5%乙腈磷酸鹽緩沖液(20mM，pH=3)為流動相A，5%水乙腈溶液為流動相B ;色譜條件:92%B ;泵流速為0.05 mL/min ;檢測波長為214nm ;茶堿、鹽酸甲基麻黃堿、鹽酸罌粟堿、荷葉堿、氧化槐果堿、高三尖杉酯堿(各IOOppm)的混合液在上述實施示例I中制得的聚合基質的毛細管整體柱上實現高效選擇性的分離，其色譜分離圖如圖6所示，色譜圖中的峰依次為1:茶堿，2:鹽酸甲基麻黃堿，3:鹽酸罌粟堿，4:荷葉堿，5:氧化槐果堿，6:高三尖杉酯堿。
[0021]實施例6
在微柱液相色譜(μ HPLC)模式下，以5%乙腈磷酸鹽緩沖液(20mM，pH=3)為流動相A，5%水乙腈溶液為流動相B ;色譜條件:92%B ;泵流速為0.05 mL/min ;檢測波長為254nm ;腺嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、甲氨基嘌呤、腺苷(各IOOppm)的混合液在上述實施示例I中制得的聚合基質的毛細管整體柱上實現高效選擇性的分離，其色譜分離圖如圖7所示，色譜圖中的峰依次為1:腺嘌呤，2:胞嘧啶，3:尿嘧啶，4:甲氨基嘌呤，5:腺苷。
[0022]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【權利要求】
1.一種基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱，其特征在于:采用自由基聚合一點擊化學“一鍋法”結合反應制備而成的基于Cu (I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱。
2.一種制備如權利要求1所述的基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)預聚混合溶液的制備:將疊氮類單體、炔基類單體、交聯劑、致孔劑、引發劑、催化劑均勻混合后，于室溫下超聲振蕩，通氮氣去除混合溶液中溶解的氧氣； (2)自由基聚合一點擊化學“一鍋法”結合反應:將步驟I)制得的混合溶液注入經乙烯基改性的石英毛細管內，密封后置于水浴鍋內反應；將毛細管取出，用甲醇或乙腈沖洗制得毛細管整體柱。
3.根據權利要求2所述的基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱的制備方法，其特征在于:步驟I)所述的疊氮類單體為疊氮化羧酸或疊氮化羧酸酯；其中，疊氮類羧酸的化學式為N3(CH2)nCOOH, η為1_9，疊氮化羧酸酯的化學式為N3(CH2)nCOOR, η為1_9 ; 所述的炔基類單體為甲基丙烯酸炔丙基酯或丙烯酸炔丙基酯中的一種； 所述的交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯或聚乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一種； 所述的致孔劑為二甲基 亞砜/十二醇混合物或N，N- 二甲基甲酰胺/十二醇混合物中的一種；其中，二甲基亞砜與十二醇的質量比為40-60:40-60，Ν，Ν-二甲基甲酰胺與十二醇的質量比為40-60:40-60 ； 所述的引發劑為偶氮二異丁腈； 所述的催化劑為溴化亞銅配合物、氯化亞銅、溴化亞銅、碘化亞銅中的一種；其中溴化亞銅配合物為溴化亞銅與配體五甲基二乙烯基三胺或2，2’ -聯吡啶形成的配合物中的一種。
4.根據權利要求3所述的基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱的制備方法，其特征在于:二甲基亞砜/十二醇混合物:二甲基亞砜與十二醇的質量比為55:45，N，N- 二甲基甲酰胺/十二醇混合物:N，N- 二甲基甲酰胺與十二醇的質量比為55:45。
5.根據權利要求2所述的基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱的制備方法，其特征在于:步驟I)中疊氮類單體和炔基類單體的摩爾質量比為廣2:1，炔基類單體和交聯劑的質量比為廣2:1，致孔劑與疊氮類單體、炔基類單體和交聯劑三者之和的質量比為60-80:20-40，引發劑的質量為疊氮類單體、炔基類單體和交聯劑三者質量之和的廣2%，催化劑在預聚混合溶液中的濃度為0.2"lmg/mL。
6.根據權利要求2所述的基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱的制備方法，其特征在于:步驟2)中，反應溫度為6(T75°C，反應時間為12~24h。
7.—種如權利要求1所述的基于Cu(I)點擊的聚合物基質毛細管整體柱的應用，其特征在于:用于有機小分子、復雜生物分子的分離。
【文檔編號】B01D15/22GK103920308SQ201410132570
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月3日 優先權日:2014年4月3日
【發明者】林子俺, 俞瑞芳, 鄭江南, 楊黃浩, 張蘭, 陳國南 申請人:福州大學