一種單端孢霉烯族類毒素分子印跡聚合物的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種單端孢霉烯族類毒素分子印跡聚合物的制備方法，所述單端孢霉烯族類毒素為順勢二羥基結構，該方法是以含雙鍵的取代苯硼酸作為功能單體，在堿性條件下，將指定的單端孢霉烯族類毒素作為模板分子與作為功能單體的含雙鍵的取代苯硼酸形成共價復合物，進一步和含雙烯鍵的交聯劑、引發劑及致孔劑混合，通過紫外光照射進行光引發或者熱聚進行熱引發，引發功能單體與交聯劑之間、交聯劑與交聯劑之間的聚合反應形成聚合物，然后用酸性溶液提取清除聚合物中的模板分子，得到含有與順勢二羥基可逆結合的苯硼酸位點以及與模板分子形狀相互補的空腔的分子印跡聚合物。
【專利說明】一種單端孢霉烯族類毒素分子印跡聚合物的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于毒素檢測領域，特別地涉及一種單端孢霉烯族類毒素分子印跡聚合物 的制備方法。
【背景技術】
[0002] 單端孢霉烯族類毒素（Trichothecenes)是一類由鐮刀菌屬真菌產生的代謝產 物，都含有特征性的12,13-環氧-單端孢氧-9-烯環結構，按照他們化學結構的不同而被 分為A、B、C、D四型，天然污染農作物的是A、B兩型。A、B型單端孢霉烯族類毒素廣泛存在 于糧食、飼料以及糧谷類食品中，主要來源于被真菌污染的小麥、大麥和玉米等糧食。由這 些污染原料制成的食品和飼料中往往含有單端孢霉烯族類毒素 （Lancova et al.，2008)。 人類許多急性疾病的爆發與消費鐮刀霉污染的糧谷類食品有關（Goyarts et al.，2007)。 如果飼料中含有A、B型單端孢霉烯族類毒素，不僅對飼料喂養的動物造成傷害，影響產 量和質量，還可能將這些毒素轉移到奶、肉、蛋等動物源性食品中，嚴重危害消費者的健康 (Seeling et al. ，2006 ;Valenta et al. ，2005)。
[0003] 目前，單端孢霉烯族類毒素的定量檢測方法主要有氣質聯用法（GC-MS) (Cunha et al.，2012;Yelko et al.，2012)，液相色譜（Lippolis et al.，2008)，液相色譜-串聯質 譜（HPLC-MS / MS) (Jos印 et al·，2012 ;Rasmussen et al·，2010)和酶聯免疫法（ELISA) (Mona et al·，2012 ;Klinglmayr et al·，2010)。可見，單端孢霉烯族類毒素的檢測主要 采取先富集（固相萃取、柱色譜等技術）再定量檢測（依賴質譜、液譜等高端儀器）的方 法。該方法具有檢測靈敏度高，穩定、可靠等優點。但是，該方法耗時（前處理時間長）、費 用高昂（各種柱子、填充材料的價格不菲，所需儀器昂貴）。酶聯免疫法是基于抗原抗體專 一性反應的免疫方法，具有靈敏度高，無需前處理，回收率高等優點。但是，在免疫反應中 使用的單克隆抗體存在價格昂貴、不易保存（需要低溫存儲）、且生產周期較長等諸多問 題。這些問題嚴重限制了酶聯免疫法的使用與推廣。因此，發展一種選擇性專一、穩定性 好、價格低廉的抗體替代者不僅具有重要的科學意義，還具有可觀的市場前景。分子印跡 聚合物（MIP)(參見 G.Wulff，Angew. Chem. Iht. Ed. Engl. 1995, 34,1812-1832 ;G.Vlatakis， L. I. Andersson，P. Muller, K. Mosbach，Nature 1993, 361，645-647)是重要的抗體仿生材料。
[0004] 分子印跡技術具有以下優點：一、預定性，可以根據使用目的制備不同的分子印 跡聚合物；二、專一性，能專一地識別模板分子，與模板分子間形成類似于抗體與抗原間的 相互作用（分子印跡聚合物因此被稱為"塑料抗體"或"人工抗體；三、實用性，分子印 跡聚合物可以通過化學合成大規模制備，價格低廉，而且適用于各種反應條件、穩定性高、 使用壽命長。因為這些優點，分子印跡聚合物在對光學異構體拆分、固相萃取、化學仿生傳 感、模擬酶催化和藥物分析技術等領域已展現了良好的應用前景（參見L. X. Chen，S. F. Xu， J. H. Li, Chem. Soc. Rev. 2011,40,2922-2942) 〇
[0005] 生物分子的印跡有相當的挑戰性，主要存在兩個方面的困難：第一，生物分子在通 常的聚合條件下容易發生構型變化甚至變性；其次，生物分子在聚合物網絡內的傳質慢，模 板分子的除去困難。為了解決以上困難，表面印跡（Hoshino et al. ,2011)、抗原決定基印 跡（Nishino et a.，2006)、金屬配合法（Qin et al.，2009)和納米技術（Cai et al.，2010) 等方法被發展、應用于生物大分子（蛋白）的印跡。但毒素的分子印跡文獻報道很少。Choi 等采用表面等離子共振法（surface plasmon resonance, SPR)在金表面制備了脫氧雪腐鐮 刀菌烯醇（DON)分子印跡聚合物（Choi et al. ,2011)。De Smet等采用本體聚合的方法制 備了 T-2毒素的分子印跡聚合物（De et al. dOlOhPascale等利用甲叉丁二酸（Itaconic Acid)對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON)的親和性，先識別DON再聚合制備脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 (DON)的分子印跡聚合物（Pascale et al.，2008)。
[0006] 上述印跡的方法各有優缺點，但是一種印跡方法都只能印跡一種毒素。對于結構 存在差異的單端孢霉烯族類毒素而言，發展一種適用于多種毒素的印跡方法具有及其重要 的科學意義和市場前景。
【發明內容】
[0007] 為解決上述技術問題，本發明提供了一種單端孢霉烯族類毒素分子印跡聚合物的 制備方法，所述單端孢霉烯族類毒素為順勢二羥基結構，其特征在于，該方法包括如下步 驟：
[0008] (1)配置預聚液：以含雙鍵的取代苯硼酸作為功能單體，以單端孢霉烯族類毒素 作為模板分子，在堿性條件下，使得所述模板分子與所述功能單體混合均勻并形成共價復 合物，再加入含雙烯鍵的交聯劑、致孔劑，紫外光引發劑或熱引發劑，進一步混合均勻，得到 的溶液作為預聚液；
[0009] (2)制得聚合物：針對所述預聚液，通過紫外光照射進行光引發或者通過熱聚進 行熱引發，引發功能單體與交聯劑之間、交聯劑與交聯劑之間的聚合反應從而形成聚合 物；
[0010] (3)制得分子印跡聚合物：用酸性溶液提取清除聚合物中的模板分子，得到含有 與順勢二羥基可逆結合的苯硼酸位點以及與模板分子形狀相互補的、空腔的分子印跡聚合 物。
[0011] 本發明的技術方案，適用于所有順勢二羥基結構的單端孢霉烯族類毒素。
【具體實施方式】
[0012] 具體的，在一個實施例中，本發明公開了一種單端孢霉烯族類毒素分子印跡聚合 物的制備方法，所述單端孢霉烯族類毒素為順勢二羥基結構，其特征在于，該方法包括如下 步驟：
[0013] (1)配置預聚液：以含雙鍵的取代苯硼酸作為功能單體，以單端孢霉烯族類毒素 作為模板分子，在堿性條件下，使得所述模板分子與所述功能單體混合均勻并形成共價復 合物，再加入含雙烯鍵的交聯劑、致孔劑，紫外光引發劑或熱引發劑，進一步混合均勻，得到 的溶液作為預聚液；
[0014] (2)制得聚合物：針對所述預聚液，通過紫外光照射進行光引發或者通過熱聚進 行熱引發，引發功能單體與交聯劑之間、交聯劑與交聯劑之間的聚合反應從而形成聚合 物；
[0015] (3)制得分子印跡聚合物：用酸性溶液提取清除聚合物中的模板分子，得到含有 與順勢二羥基可逆結合的苯硼酸位點以及與模板分子形狀相互補的、空腔的分子印跡聚合 物。
[0016] 就該實施例來看，其利用受pH調控的取代硼酸與順勢二羥基間可逆的共價相互 作用，以含雙鍵的取代硼酸作為功能單體，在堿性條件下將毒素分子的模板（印跡分子） 與功能單體形成復合物，加入交聯劑、引發劑和致孔劑，通過紫外光照射（或熱聚法）引發 功能單體與交聯劑間以及交聯劑與交聯劑間的共聚反應，使用酸性溶液提取清除聚合物中 的模板分子，得到含有可與順勢二羥基可逆結合的苯硼酸位點以及與模板分子形狀相互補 的空腔的分子印跡聚合物。
[0017] 進一步的，在另一實施例中，考慮到具體的配比參數的多種適宜選擇，優選的，所 述模板分子與所述功能單體的質量比為1 : 10-1 : 1000,所述堿性條件為pH值大于等于 7. 5,所述交聯劑與致孔劑的體積比為1 : 2-1 : 10,所述交聯劑與所述功能單體的質量比 為1 : 1-1 : 100。就上述比例的取值范圍而言，其中：
[0018] 當模板分子與功能單體質量比為1 :10時，模板分子堿性條件下與功能單體反應， 大部分的復合物與交聯劑聚合得到分子印跡聚合物；隨著功能單體質量的增加，幾個硼酸 配基（小分子）圍繞識別一個順勢二羥基化合物（大分子），聚合過程更穩定；功能單體質 量的增加至1 :1000時，功能單體飽和，制備的聚合物中多個硼酸配基圍繞識別一個順勢二 羥基化合物，聚合過程穩定，印跡聚合物識別模板分子時結合位點更多，識別靈敏性增加；
[0019] 當交聯劑與致孔劑體積比為1 :2時，制備的聚合物致密，孔徑小；隨著致孔劑體積 的增加，聚合物的孔徑增大，大孔、中孔、小孔相互穿插；當交聯劑與致孔劑體積比為1 :1〇 時，聚合物疏松多孔，大孔串中孔，易于粘稠介質的流動；
[0020] 當交聯劑與功能單體的質量比為1 :1時，制備的聚合物中功能基團較少，聚合物 結構相對簡單、穩定；隨著功能單體質量的增加，聚合物中功能基團增加，性能表征中出現 了功能單體的獨特性能；當交聯劑與功能單體的質量比為1 :1〇〇時，制備的聚合物中功能 基團數量穩定，印跡聚合物中的分子印跡空腔數穩定。
[0021] 進一步的，在另一實施例中，所述步驟（2)中，所述通過紫外光照射進行光引發具 體包括如下步驟：將預聚液滴入某容器中，或涂覆在襯底表面、并在其上覆蓋掩膜板，在紫 外光下曝光5-120S，透光部分因紫外光照射誘發而聚合，而被遮擋的部分則不聚合。事實 上，紫外光下5s，預聚液就已經聚合；隨著曝光時間的增加，聚合物的鏈越長；到120s時，光 引發劑反應完全，聚合物在紫外光下開始老化。
[0022] 進一步的，在另一實施例中，所述步驟（2)中，所述通過熱聚進行熱引發具體包括 如下步驟：將預聚液滴入某容器或涂覆在襯底表面，然后置于水浴中或加熱臺上，溫度為 50-120°C的條件下加熱1-24小時。
[0023] 進一步的，在另一實施例中，所述步驟（2)之后步驟（3)之前，還進一步包括如下 步驟：用清洗溶劑來清洗除去所述聚合物中的未聚合部分，所述清洗溶劑為乙腈-水溶液 或甲醇-水溶液。
[0024] 進一步的，在另一實施例中，所述步驟（3)中的酸性溶液為pH值小于等于5的乙 腈-水溶液或甲醇-水溶液。
[0025] 進一步的，在另一實施例中，所述的單端孢霉烯族類毒素為嘔吐毒素、F-2毒素或 T-2毒素；
[0026] 所述的取代苯硼酸是對乙烯基苯硼酸、間乙烯基苯硼酸或間丙烯酰胺基苯硼酸；
[0027] 所述的交聯劑可以是聚乙二醇雙丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯和甲叉雙丙烯 酰胺；
[0028] 所述紫外光引發劑是安息香二甲醚、偶氮二異丁腈、1-羥基環己基苯基酮 Irgacurel84或安息香乙醚；
[0029] 所述的熱引發劑是偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈、過氧化甲乙酮、過氧化環己酮或 偶氮二異丁酸二甲酯；
[0030] 所述的致孔劑是聚乙二醇、1，4 丁二醇或十二醇。
[0031] 進一步的，在另一實施例中，所述掩膜板為多孔、每個孔均含圓環狀結構的掩膜 板，從而使得預聚液在紫外光照射誘發而聚合后，通過該掩膜板得到多孔的、環狀、聚合物， 且聚合物沿著每個孔的外邊緣，每個孔的中心則成為空白的區域，所述空白的區域有利于 后期的檢測。
[0032] 進一步的，在另一實施例中，優選的，所述多孔選擇96孔。
[0033] 就分子印跡材料技術而言，最大的難點有如下兩個：1、模板分子不易洗脫；2模板 分子易于變形。通過上述實施例，不難發現，在不同的實施例中，本發明能夠解決上述難點 中的一個或兩個：
[0034] 對于模板分子不易洗脫的問題：1、本發明選用的功能單體是pH值調控的單體，堿 性條件識別模板，酸性條件下放出模板，因此洗脫時將洗液調整為酸性就可以將模板分子 從聚合物中洗脫；2、本發明配置的預聚液中含有大量的致孔劑，因此制備的聚合物含有大 量的孔洞結構，酸性洗液洗脫下來的模板分子可以輕松的從孔洞中傳質出來。
[0035] 對于模板分子易于變形的問題：1、本發明采用光聚法制備聚合物，時間很短，可在 2分鐘內聚合完成，因此模板分子不會出現變形；2、毒素分子本身就比較耐熱，因此選擇合 適的溫度是不會破壞毒素結構的，所以本發明也可以使用熱聚法制備印跡聚合物。另外本 發明好設計了獨特的掩膜板結構，以96孔環狀掩膜板為例，其使用效果非常好，達到了在 線識別，在線抓取的目的。光聚法制備毒素分子印跡陣列，可以得到各種形貌、結構的印跡 陣列。本發明案例中使用的掩膜板，可以在96孔內制備圓環狀聚合物，識別毒素分子后，反 應終止液為強酸性溶液，將環內識別的毒素洗脫，直接在中心空白區檢測，從而實現在線識 另IJ、在線檢測。
[0036] 此外，在另一個實施例中，公開了一種光聚法（即光引發）制備F-2毒素分子印跡 聚合物的方法：
[0037] (1)、準備預聚液，將0.005g對乙烯基苯硼酸和O.OOlg的安息香二甲醚溶解在 200μl的聚乙二醇200(PEG200，平均分子量200)、100μl的聚乙二醇雙丙烯酸酯（PEGMA)， 磷酸鹽緩沖溶液調整pH值至8. 5后加入10mg / ml的F-2毒素標準品50 μ 1，渦旋2分鐘 (本實施例中F-2毒素與功能單體對乙烯基苯硼酸的質量比為1 : 10,交聯劑TOGMA與致 孔劑PEG200的體積比為1 :2);
[0038] (2)、在96孔遮掩板的孔內滴加50 μ 1預聚液，貼附含有特定結構的掩膜板（圓環 結構），UV(365nm)曝光60s。去掉掩膜板，將聚合物浸泡于甲醇/水的混合溶液中（甲醇 體積比為65% )振蕩30min，去除未反應完全的預聚液和致孔劑，再將聚合物浸泡在甲醇/ 10M磷酸溶液（體積比3 : 7)中1小時，去除聚合物中的模板分子，最后用甲醇/水的混合 溶液（甲醇體積比為65% )震蕩10分鐘3次，得到F-2毒素分子印跡聚合物。電鏡結果表 明所得的分子印跡聚合物為多孔結構。這多孔結構有利于印跡的毒素分子在印跡聚合物中 的傳質。
[0039] 進一步的，在另一個實施例中，本發明公開了 F-2毒素分子印跡聚合物檢測F-2毒 素標準品的應用實施例：
[0040] (1)、配置不同濃度的標準品，稀釋溶液為35%的甲醇/水溶液；
[0041] (2)、取50ul不同濃度的F-2毒素標準品，加入到酶標板的微孔中，震蕩lOmin ;倒 出待測液，加入70%的甲醇/水溶液，50ul，震蕩10分鐘，重復3次該步驟；加入酶標物 50ul，震蕩孵化30min ;倒出酶標物，加入lOOul工作洗液，震蕩10分鐘，重復3次該步驟； 加入TMB顯色液A和B各50ul，避光顯色30min，加入反應終止液100ul，震蕩lOmin，直接 進行ELISA分析測試。
[0042] 就該實施例而言，有如下優勢：
[0043] (1)、引入圓環掩膜板，光聚后在96孔內得到多孔的環狀分子印跡材料。該環狀材 料沿著96孔的外邊緣，中心留下了空白的區域利于后期的ELISA檢測；
[0044] (2)、該分子印跡材料在多孔的環內識別F-2毒素，與酶標物發生抗原-抗體專一 反應，將酶標物也控制在多孔的環內，微米級的孔徑有利于TMB顯色液識別酶標物。反應終 止液是酸性溶液，將顯色后的大顆粒從多孔的環狀聚合物中洗脫至中心空白的檢測區，因 此可以在線檢測農產品中的F-2毒素。
[0045] 進一步的，在另一個實施例中，本發明公開了熱聚法制備嘔吐毒素分子印跡聚合 物的方法：
[0046] 1、準備預聚液，將0. 005g間乙烯基苯硼酸和0. 001g的偶氮二異庚腈溶解在 1000μ 1的12醇、100μ 1的乙二醇二甲基丙烯酸酯，磷酸鹽緩沖溶液調整pH值至7. 5后加 入10mg / ml的嘔吐毒素標準品5 μ 1，渦旋2分鐘（本實施例中嘔吐毒素與功能單體間乙 烯基苯硼酸的質量比為1 : 100,交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯與致孔劑12醇的體積比為 1 ：1〇)；
[0047] 2、在離心管內滴加100 μ 1預聚液，密封離心管后放入80°C的水浴中12h，得到 嘔吐毒素分子印跡聚合物。在離心管內加入200ul甲醇/水的混合溶液（甲醇體積比為 65% )振蕩lh，去除預聚液中未反應完全的溶液和致孔劑，再將聚合物浸泡在甲醇/ 10M醋 酸酸溶液（體積比2 : 8)中4小時，去除聚合物中的模板分子，最后用甲醇/水的混合溶 液（甲醇體積比為65% )震蕩30分鐘3次，得到嘔吐毒素分子印跡聚合物。同樣的，也可 以通過電鏡結果來證實所得的分子印跡聚合物為多孔結構。這多孔結構有利于印跡的毒素 分子在印跡聚合物中的傳質。
[0048] 進一步的，在另一個實施例中，本發明公開了嘔吐毒素分子印跡聚合物檢測嘔吐 毒素標準品的應用：
[0049] 1、配置不同濃度的標準品，稀釋溶液為35 %的甲醇/水溶液。
[0050] 2、取1ml不同濃度的嘔吐毒素標準品，加入含有印跡聚合物的離心管內，震蕩 24h ;吸取上層清液。ELISA試劑盒檢測上層清液中DON的濃度，得到DON分子印跡材料對 DON的吸附等溫線。實驗結果表明，每克DON分子印跡材料最多可以吸附234 μ gDON。
【權利要求】
1. 一種單端孢霉烯族類毒素分子印跡聚合物的制備方法，所述單端孢霉烯族類毒素為 順勢二羥基結構，其特征在于，該方法包括如下步驟： (1) 配置預聚液：以含雙鍵的取代苯硼酸作為功能單體，以單端孢霉烯族類毒素作為 模板分子，在堿性條件下，使得所述模板分子與所述功能單體混合均勻并形成共價復合物， 再加入含雙烯鍵的交聯劑、致孔劑，紫外光引發劑或熱引發劑，進一步混合均勻，得到的溶 液作為預聚液； (2) 制得聚合物：針對所述預聚液，通過紫外光照射進行光引發或者通過熱聚進行熱 引發，引發功能單體與交聯劑之間、交聯劑與交聯劑之間的聚合反應從而形成聚合物； (3) 制得分子印跡聚合物：用酸性溶液提取清除聚合物中的模板分子，得到含有與順 勢二羥基可逆結合的苯硼酸位點以及與模板分子形狀相互補的、空腔的分子印跡聚合物。
2. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)中：優選的，所述模板 分子與所述功能單體的質量比為1 : 10-1 : 1000,所述堿性條件為pH值大于等于7. 5， 所述交聯劑與致孔劑的體積比為1 : 2-1 : 10,所述交聯劑與所述功能單體的質量比為 1 : 1-1 : 100。
3. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（2)中，所述通過紫外光照射 進行光引發具體包括如下步驟：將預聚液滴入某容器中，或涂覆在襯底表面、并在其上覆蓋 掩膜板，在紫外光下曝光5-120S，透光部分因紫外光照射誘發而聚合，而被遮擋的部分則不 聚合。
4. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（2)中，所述通過熱聚進行熱 引發具體包括如下步驟：將預聚液滴入某容器或涂覆在襯底表面，然后置于水浴中或加熱 臺上，溫度為50-120°C的條件下加熱1-24小時。
5. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（2)之后步驟（3)之前，還進 一步包括如下步驟：用清洗溶劑來清洗除去所述聚合物中的未聚合部分，所述清洗溶劑為 乙腈-水溶液或甲醇-水溶液。
6. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述步驟（3)中的酸性溶液為pH值小 于等于5的乙腈-水溶液或甲醇-水溶液。
7. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于： 所述的單端孢霉烯族類毒素為嘔吐毒素、F-2毒素或T-2毒素； 所述的取代苯硼酸是對乙烯基苯硼酸、間乙烯基苯硼酸或間丙烯酰胺基苯硼酸； 所述的交聯劑可以是聚乙二醇雙丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯和甲叉雙丙烯酰 胺； 所述紫外光引發劑是安息香二甲醚、偶氮二異丁腈、1-羥基環己基苯基酮 Irgacurel84或安息香乙醚； 所述的熱引發劑是偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈、過氧化甲乙酮、過氧化環己酮或偶氮 二異丁酸二甲酯； 所述的致孔劑是聚乙二醇、1，4 丁二醇或十二醇。
8. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述掩膜板為多孔、每個孔均含圓環狀 結構的掩膜板，從而使得預聚液在紫外光照射誘發而聚合后，通過該掩膜板得到多孔的、環 狀、聚合物，且聚合物沿著每個孔的外邊緣，每個孔的中心則成為空白的區域，所述空白的 區域有利于后期的檢測。
9.如權利要求8所述的制備方法，其特征在于：優選的，所述多孔選擇96孔。
【文檔編號】B01J20/30GK104059195SQ201410063390
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年2月23日 優先權日:2014年2月23日
【發明者】李澧 申請人:江蘇省農業科學院