具有可拆卸載玻片的樣品處理裝置制造方法
【專利摘要】一種生物和化學樣品處理裝置，該裝置b.包括一個抗高壓的、淺的并且寬面積的微流體腔室，該微流體腔室具有由可拆卸的載玻片形成的至少一個壁，該載玻片含有諸如固定的實體、生物樣品或分子的樣品，c.包括用于將流體注射到所述腔室并且從該腔室收集流體的微流體出入孔的安排，d.與形成在該腔室外部的入口端口和微流體通道接合，e.被配置為使得該載玻片可以與該裝置接觸而形成所述腔室，f.被適配為在所述腔室的內部以快速的方式優選地在小于15秒之內、并且由于所述微流體出入孔的安排而以規則或均勻的方式遞送和轉運流體物質和試劑。
【專利說明】具有可拆卸載玻片的樣品處理裝置 發明背景
[0001] 在現代腫瘤學中，生物標志物分析是一種用于癌癥診斷和預測的不可缺少的工 具。在醫學實驗室中，免疫組織化學（IHC)已經被用作常規組織病理學檢查過程中用于癌 癥生物標志物分析的重要工具。IHC是一種由許多地方與國際當局，例如食品藥品管理局 批準的技術，其用于組織標本和的生物標志物分析。一般而言，某些生物標志物（事實上為 抗原）是用與靶標生物標志物具有親和力的特異性一級抗體進行搜索的。隨后，使用與標 記物結合且與這些一級抗體具有親和力的特異性二級抗體進行特異性標記。這種標記普 遍地是一種熒光標志物或有色標志物，并且在熒光的情況下，該技術被稱為免疫組織熒光 (IHF)。
[0002] 另一方面，IHC和IHF不能立即應用于樣品組織而需要一些預處理階段。經由固 定步驟開始預處理，此時使已經從患者取得的疑似組織學樣品首先經歷一個保存該組織內 部的蛋白質和抗原以及該組織的形態的程序。雖然存在許多固定技術，固定步驟通常是經 由涉及液氮使用的非常迅速的冷卻步驟的冷凍固定、或甲醛固定來完成的。隨后，使組織經 歷顯微切片術過程，此時它們被切成薄切片（4ym-lOym)并被固定在標準的載玻片上。為 了后續較長時間保存，將冷凍固定的（CF)組織切片保持冷凍，而將甲醛固定的組織用一層 石蠟保存。后者稱為"甲醛固定的石蠟包埋的（FFPE)"組織切片。在固定步驟后，待恢復到 環境溫度之后，可使這些冷凍固定的組織直接經歷IHC程序，而這些FFPE組織需要一些另 外的處理。這些處理包括石蠟的化學消除和稱為抗原修復1的另一個步驟。通過使用不同 的手段，包括加熱和酶促反應，該抗原修復步驟有助于恢復被甲醛交聯的抗原。
[0003] 除了在實驗室中手工處理之外，該技術的重要性和常規診斷的需1在許多資源中， 抗原修復也稱為"表位修復"。此外，如果在抗原修復過程中涉及樣品的加熱，抗原修復也可 稱為熱誘導的或熱介導的抗原修復。要觸發了用于IHC過程自動化的商用組織處理器的開 發。這些儀器能夠從抗原修復到染色處理組織切片，并且它們常規地在醫學實驗室中用于 診斷和預測。對于常規儀器而言，該過程時間在3小時到24小時之間變化，并且它們通常 能夠處理多個載玻片。 長過程持續時間
[0004] 并非為技術的先進，可以認為現有的組織處理器就能使該手工過程自動化和并行 化，以便將處理量和再現性提高而達到一定的程度。眼前的問題之一是這種處理周期的持 續時間較長。一般而言，這些過程運行過夜，且在次日之前不能獲得經處理和染色的組織。 目前，這是當前IHC的過程的較大障礙，因為所需要的時間期限不允許在手術干預過程中 完成分析。然而，如果能夠在干預過程中完成IHC，則通過即時使用來自IHC的結果可以精 確調整外科治療方案。一個非常重要的實例是癌癥的診斷及其后續的治療步驟。當患者已 經診斷患有癌癥時，慣常程序通常是實現疑似組織的組織活檢。然后，使這些樣品經歷IHC 分析，從而看出癌癥之嫌疑是否是真實的。如果答案是肯定的，那么進行第二次手術來清除 所有來自身體的腫瘤，這是一個關鍵步驟，因為即使單個的活癌細胞也能夠再次生長為腫 瘤。不幸的是，直到現在，還沒有提供一種證實腫瘤被完全清除的技術。因此，有時候，患者 可能需要再次手術或化學療法來清除這些可能已經留下的細胞。當計數時，手術的次數在1 到3次之間變化，這對于患者增加了風險、代價和焦慮，并造成重大的衛生資源例如醫師的 時間和手術室可用性的損失。
[0005] 被稱為術中的程序的正規時間少于20分鐘。直到現在，僅僅介紹了一種減少 IHC所需要的時間的IHC系統。這種技術是基于被稱為"波"機制的一種現象，并利用了 兩個鄰近載玻片（其中之一攜帶組織切片）的'波狀'鉸鏈運動（PCT/US2006/015020和 W0/2006/116037)。該技術可以將冷凍固定載玻片的染色期縮短至15分鐘，并因此可以稱 為術中技術。另一方面，這15分鐘不包括固定、觀察和成像時間，其中判斷這些事項可能還 需要至少大約15分鐘，這樣就超出了術中條件。因此，染色方案持續時間應當減少至低于 5分鐘，以便使總的IHC過程是在'術中'。而且，盡管冷凍固定的組織的處理比較容易，但 是由于許多原因，FFPE組織更受歡迎。首先，由于所需要的設備，在冷凍固定程序中，組織 保存和歸檔具有更高的成本。更突出的是，冷凍固定的組織相比于FFPE組織更頻繁地顯示 出假陰性或假陽性。因此，雖然冷凍固定可以提供更快的結果，FFPE是更合宜的。報告的 用于FFPE組織切片使用"波"機制的處理時間是70分鐘，這個時間期限接近于常規的自動 化組織處理器的時間。 在定量分析中的受限準確度
[0006] 除了術中方面之外，直到現在為止，正如在某些測定法過程中所需要的，當使用借 助于免疫組織化學獲得的信號的范圍處理需要定量性生物標志物表達分析的病例時，用任 何技術獲得的結果的準確度都受到了限制。當需要這種半定量分析時，常規技術可產生高 達20%病例的模棱兩可的結果，而僅僅使用免疫組織化學并不能實現最終的診斷結果。因 此，當前的標準是使這些病例經受后續的遺傳分析（原位雜交），以便實現最終的診斷結 果，為診斷過程增加了可觀的成本和時間（幾天）。
[0007] 定量免疫組織化學分析的不準確性來源于免疫組織化學信號的強度，由于非特異 性結合反應、以及組織變性的不可預測效應、在組織固定、石蠟包埋、和熱誘導的表位修復 方面的變化，該強度不一定與抗原表達的程度成比例。常規IHC是一種宏觀操作，其中在30 分鐘到數小時范圍之內的反應時間對于實現表面抗原對生物試劑的均勻暴露和結果的可 再現性是需要的。這源于擴散時間長、試劑控制和定量精確性的缺乏、以及受限的流體交換 率。此外，長的測定時間和抗體暴露時間可以導致顯著的抗體吸附和非特異性結合，使得生 成的免疫組織化學信號不再是組織上的靶標生物標志物濃度的線性函數。這些定量生物標 志物的表達水平的得分經常受到病理學家的判讀和經驗的影響。
[0008] 然而，如果可以保證在生物標志物表達水平與免疫組織化學信號之間的比例性， 則免疫組織化學信號將是定量的，并且可以高得多的準確度完成陽性樣品與陰性樣品之間 的區別。
[0009] 事實上，在靶標抗原與獲自免疫測定的信號之間的這種非比例性不僅僅對于診斷 性免疫組織化學或一般的免疫組織化學是特異性的。這個問題在表面上存在固定靶標的所 有情形中存在，并且一種或多種檢測試劑以受到這些檢測試劑的擴散速度限制的比率與這 種靶標結合。這些情形可以包括但不限于免疫組織化學、DNA雜交、RNA定量、適體和低聚物 探針。另外，空間位阻機制也可以影響這種非比例性并且損害最后的定量測定。 需要在基礎設施、設備和專門人才方面進行投資
[0010] 除了過程持續時間長和準確度受限制的固有問題之外，最先進的自動化設備還具 有少數其他缺點。現代商業自動化IHC是笨重的，其被提供在工作臺中或置于臺面上。因 此，它們遠非便攜式和手持式的。雖然便攜不是必需的，但是例如對于術中操作，這可以增 加在缺乏實驗室環境或電的情形的偏遠地方的可及性。
[0011] 在具有低預算以及位于偏遠地方的全科診所中，沒有能夠進行這種診斷的必需基 礎設施、設備和專門技術。事實上，對于小型診所而言，形成和維持這樣一個實驗室是極其 昂貴的，需要大約1MCHF在基礎設施和設備方面的投資以及每年對于專門人才的300KCHF 以上的投資。因此，形成可以進行免疫組織化學的實驗室所需要的投資是主要的障礙之一， 其阻止了全世界大量患者對這種診斷技術的可及性。
[0012] 由最先進的設備所要求的當前實驗室結構引起的一個另外的主要障礙是定制問 題，當在新的生物標志物發現和相關研究使用時，這顯得特別突出。與新發現的分子和生物 標志物一起使用的現有大規模診斷設備的改變是昂貴且耗時的。這源于在研究和發現中需 要的靈活性與中心診斷實驗室所需要的并行化程度及處理量之間的矛盾。此外，中心設施 抵制這樣的定制，因為它們的當前診斷工作超載或者這種定制可以影響后面的再現性。因 此，通常手工完成涉及免疫組織化學的研究任務。然而，當考慮需要確認結果的大量試驗以 及再現性的需要時，用于手工完成這樣的研究需要的總時間可能跨越數年，顯著影響了生 物標志物發現的總體研究與開發成本。
[0013] 可以在構成以下裝置的3個不同部分下對現有技術進行概述：（a)進行IHC的芯 片上實驗室裝置、（b)呈現的減少過程時間的自動化宏觀IHC處理器以及（c)具有相似微 流體設計的針對其他應用制造的芯片上實驗室裝置。在此，我們概述了這些裝置并給出了 就品質因數進行的比較。 進行IHC的芯片上實驗室裝置
[0014] 直到現在，對于IHC有少數微流控方法，用于改良常規IHC的某些方面，這些方法 可潛在地受益于減少的擴散時間和改進的流體交換控制。這些方法中的一些旨在減少總的 分析時間，并且另一些旨在利用多個平行的小通道進行多路IHC，用于搜索具有更高抗體稀 釋度的在空間上移位的位置中的不同靶標生物標志物。然而，在這些研究中沒有一個暗示 微流控方法導致在定量分析準確度方面的增加以及通過這種分析獲得的模棱兩可的診斷 結果的減少。
[0015] 我們團隊已經闡明了針對IHC設計的多種芯片上實驗室裝置，以便降低時間與輸 出量的比值。我們已經證明在PDMS中的第一代L0C，其容許相對較快的組織分析（相對于 常規的2小時，為20分鐘）[V.費爾南德斯-莫雷拉（Fernandez-Moreira)等人，分析家 (Analyst)，第135期，第42-52頁，2010]。不幸的是，這種裝置顯示出受限的分析速度和檢 測區。該系統不能保持高壓，導致最大操作體積流量大約為50nL/s。該系統組裝和拆開都 麻煩（手工整合），顯著增加了分析時間和死體積。并且，僅有組織切片的一部分可以被暴 露（不到表面的百分之十幾），由此限制了TS檢測區。
[0016] 隨后，我們證明了又在PDMS中生產的第二代裝置（A.T.塞弗蒂里克（Ciftlik)等 人，用于化學和生命科學的微型系統的第14屆國際會議會刊（Proc.of14thInt.Conf.on MiniaturizedSystemsforChemistryandLifeSciences) (microTAS'10),第 699-701 頁，2010年10月），其增加了該區域并將孵育時間減少至3. 5分鐘。在另一方面，這種裝置 受制于許多問題，這些問題在很大程度上損害了定量分析的準確度和它的低成本商品化。 低準確度源于最后的發生在腔室內的經擴散控制的抗原抗體反應，這也致使時間分辨熒光 的使用是不可缺少的。腔室和與其連接的微流體通道的截面結構形成如在圖1中展示的 結構。在該截面中，該腔室是一個寬而淺的長方形，并且該組織切片形成底寬側。這些微流 體通道為大約50ym高的多個管道，并且這些通道在左手邊和右手邊的淺邊緣上與該腔室 連接，靠近發現與組織切片相對的上部寬側。在這樣的設計中，當通過使用淺側上的界定 的并且接近上部寬側的入口和出口誘導流體流時，流體流的幅度僅僅在上部表面周圍是顯 著的，而它在組織切片周圍低得多。因此，IHC方案試劑到組織表面的轉運在很大程度上仍 然依賴于分子從上部表面的緩慢橫向流擴散。此外，該設計要求該腔室高度應當始終高于 這些微流體通道的高度，并且這種條件致使在抗體轉運方面的擴散的限制作用甚至更加顯 著。這種在先設計轉化為不能制造低于250ym的腔室，從而當與50ym高的腔室比較時， 擴散時間增加了 25倍（參見第0029段）。更突出的是，方案試劑到組織表面的緩慢的擴散 受限的轉運損害了在獲得的信號與組織表面上的抗原表達程度之間的比例性，使得不可能 成功地定量評估免疫組織化學信號。
[0017] 在這樣一個擴散受限的系統中使用短的孵育時間（如在第0016段和引證文獻中 所述）只有在使用先進的成像設備和材料時才有可能。由于如此長的擴散時間，當在該方 案中使用短的試劑孵育時間時，只有小部分一級抗體和二級抗體可以到達組織切片表面， 并且只有通過時間分辨熒光才有可能檢測到如此低的信號。時間分辨熒光是一種先進的成 像技術，其中熒光團激發和發射的記錄是通過利用特殊的時間分辨標志物結合的抗體（鑭 化合物）在非重疊時期完成的，這些抗體在激發之后很長時間能夠繼續顯著地發射。激發 和發射過程的時間多路復用在很大程度上消除了源于組織和周圍材料的自體熒光背景信 號，并且使得在組織上非常少量的結合（一級和二級）抗體易于被檢測到。使用標準的熒 光成像設備和商業熒光團，不可能檢測這種信號。盡管如此，用于時間分辨標志物（鑭化合 物）的熒光團和顯微鏡設備兩者都是非常昂貴且不標準的，并且結合的診斷抗體是不可商 購的。結果，時間分辨顯微鏡的要求構成了阻止該裝置的成功且低成本商業實施的另一個 障礙，因此，當采用像熒光團和發色團之類的標準染色試劑時，這是不能操作的。
[0018] 除了以上列出的設計相關問題（第0016-0017段和引證文獻）之外，還有許多由 于使用PDMS作為結構材料所致的缺點。PDMS的相對低的楊氏模量使得這些通道在較高流 體壓力下易于嚴重變形。也就是說，這些流動特征可能在一個方案中涉及的不同壓力和流 速下發生改變。而且，在這種先前設計中，整合的組織切片載玻片的密封是使用形成下面的 入口 /出口微通道的壁的PDMS來完成的。此外，由于PDMS的低楊氏模量，更好地密封該組 織載玻片所需要的力可能易于使這些通道變形，其程度可至這些通道被阻斷，并且該裝置 的操作變得不可能。由于這些通道易于變形所致的在設計維度和流速方面的這些改變可能 引入在生成的IHC信號方面的改變，并且，當用于診斷時，可能在很大程度上損害結果的再 現性。此外，PDMS的熱性能阻止了 70°C以上溫度的使用，并且PDMS與可能涉及IHC方案的 許多試劑例如二甲苯（lineXylene)在化學上不相容。這種裝置的另一個缺點是它僅僅接 受非標準組織切片載玻片形狀，其構成了定制以及因此所致的這種結構作為診斷裝置的商 業化發行的成本問題。
[0019] 最后，在第0016-0018段中描述的系統僅僅改進了免疫組織化學測定的方案時 間，但是這以使用時間分辨熒光為代價，就所需要的材料和基礎設施而言，這是昂貴且最不 可及的方法。而且，測定時間最小化并沒有消除試劑到組織表面的擴散控制的轉運，并且進 行可以用這個系統完成的定量分析的能力與常規設置并沒有不同：可能不能定量組織生物 標志物。最后但相當重要，由于在形成該系統的微流體結構中的可能變形，該系統的低楊氏 模量高度損害了再現性。
[0020] 在文獻中呈現的另一種方法為所謂的多路微流體IHC(MMIHC)平臺（M.S.金（Kim) 等人，生物材料（Biomaterials)，第 32 卷，Iss: 5，第 1396-1403 頁，2011，以及金（Kim)等 人，PLoS0NE，第5(5)卷：第el0441頁，2010)，其具有多個小通道，用于搜索在空間不同位 置中的不同標志物。該裝置具有90分鐘的響應時間，仍然處于自動化IHC處理器的那些時 間范圍。而且，該裝置可能使大約1. 5%的TS區染色，這對于該技術的推廣是一個缺點。盡 管作者已經表明，對于具體的乳腺癌病例，即使對于這個小的區域，與完全染色的TS有大 約85%相關，不能實現充分的相關。對于每個不同的病例實現這種相關研究也是一項麻煩 的工作。另一方面，作者已經表明，它們可以使一級抗體濃度降低10倍，這對于減少昂貴抗 體的消耗是一個重要的步驟。 減少過程時間的商業自動化宏觀IHC處理器
[0021] 如前面已經介紹的，具有低IHC過程時間的在市場上的唯一處理器是"波"系統 (PCT/US2006/015020和W0/2006/116037)。這種技術是基于稱為"波"機制的一種現象，并 利用了兩個鄰近載玻片（其中之一攜帶組織切片）的'波狀'鉸鏈運動（切萊魯斯診斷公 司（CelerusDiagnostics))。它可以將冷凍固定載玻片的染色期縮短至15分鐘，并因此可 以稱為術中技術。另一方面，這15分鐘不包括固定、觀察和成像時間，其中判斷這些事項可 能還需要至少大約15分鐘，這樣就超出了術中條件。 具有相似微流體設計的針對其他應用制造的芯片上實驗室裝置
[0022] 可以在文獻中找到基于堅向孔的裝置，該堅向孔接受具有固定化標本的載玻片。 邁克尼里（Mcneely)等人（PCT/US2002/07113 和W0/2002/072264)介紹了針對DNA微陣列 處理制造的這樣一種裝置。不同于在IHC中需要的寬面積腔室，這種DNA微陣列處理裝置具 有多個堅向孔和將試劑遞送到存在DNA微陣列元件的每個小點的微流體通道網絡。還呈現 了一種稱為"微流體探針"的相似裝置（A.克瓦爾（Queval)等人，實驗室芯片（LabChip)， 第 10 卷，第 326-334 頁，2010,以及專利文件PCT/IB2010/052018 和W0/2010/128483)，其中 堅向微流體孔安排在非常小的點（約100Um，呈對角線排列）內，以便將組織或細胞單層中 的某些點染色，其中這種探針可以在空間上移動。在另一個德拉馬什（Delamarche)等人的 專利中（PCT/IB2003/005350和W0/2004/050246)，介紹了一種使液體在一種表面上流動的 裝置，其中使用堅向孔和墊片來形成該表面上的腔室。
[0023] 還呈現了用相似的技術制成的另外的DNA雜交裝置（US/2006/0003440)和測序裝 置（PCT/US2010/047392和W02011/026136)，其中它們也包含連接至具有固定化DNA的微流 體通道的堅向孔。阿迪（Adey) (PCT/US02/24616和W0/2003/015922)已經描述了另一種裝 置，該裝置具有用于DNA和RNA處理的低體積腔室，該腔室具有柔性偏轉膜，以根據應用來 改變腔室高度。金等人（PCT/US2008/074865和W0/2009/029845)還描述了一種寬面積微 流體裝置，其具有均勻分布的半環形入口孔和三角形出口孔。
[0024] 在堅向微流體孔的研究中，未曾提供具有高壓抗性的、在非常短的時間內操作的、 寬面積的且均勻分布試劑的裝置。在以上裝置和研究中沒有一個暗示了微流控方法導致在 固定靶標的定量分析準確度方面的增加以及通過這種分析獲得的模棱兩可的結果的減少。 此外，要么正如在僅有一級抗體孵育在芯片上完成的MMIHC的情況下，半手工的芯片上實 驗室IHC處理器可以僅僅使一部分TS染色，要么具有高的試劑成本。 發明說明
[0025] 本發明涉及如權利要求書中定義的裝置和方法。
[0026] 具體而言指的是在臨床免疫組織化學中用于準確的生物標志物檢測的微流體組 織處理器（MTP)。大面積（256mm2)且淺的（〈100ym)腔室是通過夾緊標準的載有乳腺癌組 織切片的顯微鏡載玻片形成的，該載玻片具有玻璃/娃微機械加工的結構，其結合了用于 將組織切片迅速且均勻地暴露于免疫測定生物試劑的出入孔。結合有淺腔室中小的堅向擴 散長度的微流體流動模式允許使用短至2分鐘的生物試劑孵育時間。這允許通過保留在表 面靶標量與生成的信號之間的比例性的準確定量分析。 微流體裝置的設計
[0027] 作為具有固定的組織切片的簡單標準顯微鏡載玻片的組織載玻片（TS)與微流體 通道的快速組裝是相當重要的，因為總測定時間是關鍵參數。除了快速組裝之外，我們設 想了這樣一種系統，其中我們僅僅需要改變TS，而其他方面（微流體回路）保持不變。圖 2顯示了該裝置的截面圖示，該裝置具有位于以下位置的微流體出入孔：（a)沿著用于流入 和流出的組織腔室的邊緣以及（b)在用于流入的腔室的中心和在用于流出的腔室的邊緣。 該裝置具有用于引導并預處理遞送到TS的流體的橫向微流體通道，其使用頂部微流體層 和用于接近薄腔室（通過使用〇型環將TS密封到該微流體通道裝置部分上而形成）的堅 向微流體出入孔。
[0028] 不同于先前提供的其中該腔室從側面直接進入的系統（參見第0016-0019段）， 這些微流體通道通過堅向微流體出入孔與該組織腔室連接。這種安排容許調整頂層微流體 通道參數（厚度、結構、保壓能力等等），不依賴于該組織腔室的形成和結構。由于該組織 腔室的保壓能力也是測定時間的決定因素，該具有TS的微流體腔室的密封是很關鍵的。在 此，該密封是通過定制的〇型環使用聚二甲基硅氧烷（PDMS)成型而產生的。利用這種設計， 所施加的密封力僅僅影響腔室厚度和該腔本身的保壓能力，并且這種密封機制從該微流體 系統的其余部分機械地解耦。
[0029] 此外，這種設計允許該腔室高度大大低于先前的系統（參見第0016-0019段）。具 體而言，該組織腔室高度僅由相對于〇型環凹槽的該〇型環厚度的選擇以及施加于TS的密 封力決定。事實上，該腔室的厚度是一個關鍵參數，因為它直接影響在IHC過程中使用的試 劑的孵育時間，這是由較大抗體分子的緩慢擴散所要求的。當該裝置與TS整合時，形成具 有在50 y m與100 y m之間的厚度的組織腔室。對于普遍使用的抗體，像小鼠抗人IgG分子， 我們已經計算出1分鐘的孵育時間需要小于100Um的腔室高度。另一方面，降低腔室高度 至低于50 y m是可能的，但是可能潛在地導致在高壓充填與洗滌周期過程中組織從TS的脫 離，并且可能增加總流持續時間。
[0030] 形成這樣的淺流體腔室的能力對于將主要轉運機制從擴散轉換成平流是關鍵的。 改變該腔室中的試劑的主導轉運機制對于防止擴散控制的反應是關鍵的，這些反應損害了 固定靶標的成比例的染色并且致使定量分析不準確。通過將流體流如在圖2中所示導向到 該整合的TS的表面，不僅最小腔室高度，而且該微流體出入孔的設計，都對準確定量產生 影響。該流體流的這種方向使得能夠進行這些試劑向組織表面的平流介導的轉運，并且允 許免疫組織化學反應在反應控制方案下發生。
[0031] 為了將該裝置的可用的染色區增加到100%，必須實現具有16mm乘以16mm維度的 大腔室。在這種腔室內部的均勻流體分布對于每單位時間向每個組織部分遞送相等量的試 劑和洗滌溶液是關鍵的。因此，我們采用了分布的微流體通道網絡結構，該結構使得整個腔 室的流量均衡。圖3顯示了在頂層中產生的分布的網絡通道以及還有該微流體出入孔安排 的俯視圖。這些微流體出入孔的安排旨在實現該腔室內部的試劑的均勻分布。另一方面， 該分布的微流體通道網絡結構保證了試劑均等地遞送遍及該組織腔室。在原則上，人們可 以通過調整該腔室的大小、相應的微流體通道和孔安排而將該腔室面積增加到25mm乘以 50mm〇
[0032] 圖4顯示了在具有分布的網絡通道的組織腔室中的對流的有限元法（FEM)模擬， 這些通道是針對50iim腔室高度（COMSOLKMultiphysics)的lOyL/s流速的。這種 模擬表明，在緩沖液洗滌2. 5s之后，在最壞的情況下，所達到的先前試劑的濃度僅為其初 始濃度的1〇_12。因此，我們期望沒有會需要數量級更高的洗滌和充填時間的死表面位置。 如在圖4中的FEM模擬給出的，只有分布的網絡通道與足夠薄而被視為二維度的組織腔室 結合時，分布的網絡通道才有效地運作。雖然先前的運作顯示出相似的微流體通道網絡結 構（參見第0016-0019段和圖1)，它們的截面結構阻止了這些試劑經由平流直接供應到TS 表面。也就是說，這些試劑遞送到該腔室的與該組織表面的位置相對的頂側，并且這些試劑 向該組織表面的轉運完全受到擴散的支配。相比之下，具有機械脫耦的組織腔室和經由微 流體出入孔連接到該腔室的微流體通道網絡的本裝置展現了該模擬的平流轉運的所有優 點（參見第0037-0038段和圖8)。
[0033] 該整合的裝置截面顯示在圖5中，其中該系統由為了易于整合的粗機械加工的 (macro-machined)接頭和為了微流體和組織染色的微機械加工的（micromachined)芯片 組成。該微流體裝置與該接頭部分永久整合，而僅有這些TS在分析之間被組裝和拆卸。這 種構型對于接近具有標準商業流體接頭的微流體裝置是需要的。而且，這種外部管道的整 合容許利用高于200巴的流體壓力。
[0034] 能夠實施連續處理而在試劑之間沒有交叉污染的系統對于可靠地實現生物醫學 染色方案是相當重要的。在我們的例子中，具有3種試劑的IHC測定對于每個靶標是需要 的。出于這個目的，在接頭結構中制成了一種微流體入口小道（lane)，這種結構能結合可商 購的單向止回閥。這些止回閥在防止交叉污染中以及在TS的組裝和拆卸過程中阻斷外部 流體系統中是至關重要的。在操作過程中，將壓力施加到所需要的試劑的注射器上，從而打 開相應止回閥并釋放在該組織腔室內部的流體，而其他注射器保持未加壓，因此與該組織 腔室隔離。這樣的整合還提高了處理量，因為在每一置換中我們防止了外部微流體系統的 大的死體積的再充填。在另一方面，如果進行了微型止回閥到該裝置中的整合，則死體積和 流動時間可以降低更多。 微細加工
[0035] 在本發明中，通過微流體溝的多步驟深反應離子蝕刻（DRIE)以及隨后的與涂覆 有如在圖6中例示的聚一氯對二甲苯（ParyleneC)的派熱克斯（Pyrex)晶片的粘結來制 造這些微流體裝置，以便實現更高的精確度和爆破壓力。1)采用具有2.5 濕氧化物的 4英寸硅片作為開始。2)然后，旋轉5iimAZ9260光致抗蝕劑，用DNC掩模暴露，并顯影形 成這些通道。用RIE(阿爾卡特（Alcatel)601E)蝕刻在下面的氧化物。3)剝離該抗蝕劑， 并且使用5iim的AZ9260光致抗蝕劑（微量化學（MicroChemicals)GmbH公司，德國）和腔 室掩模實現另外的光刻步驟。在光刻之后，以兩個步驟對前側進行DRIE蝕刻（阿爾卡特 (Alcatel)601E)。這是為了形成不同高度的通道和腔室。首先，將該腔室蝕刻為lOOym的 深度并且將該抗蝕劑剝離。4)在抗蝕劑剝離之后，經由在第一個步驟中的圖案化的硬掩模 將這些通道蝕刻。根據設計，蝕刻的深度在50ym與200ym之間變化。5)隨后，將這個晶 片通過低應力聚一氯對二甲苯（Parylene-C)粘結程序粘結到2iim的聚對二甲苯涂覆的派 熱克斯（Pyrex)晶片上。注意的是，在這個步驟中還可以使用陽極粘結，但這可能引起更 高的應力和裂縫。6)在粘結之后，從具有8iim厚AZ9260抗蝕劑的硅側對粘結堆（bonded stack)施用另外的光刻步驟。稍后，實施一個另外的DRIE步驟，直到達到該腔室時為止， 這也用來產生用于0型環附著的凹槽。最后，剝離該抗蝕劑。通過劃切該晶片結束該加工。 圖7(a)顯示了在加工和劃切之后在該裝置的頂層中的微流體通道。圖7(b)顯示了微流體 出入孔連同放置該0型環的凹槽，這些出入孔位于該裝置的底側。
[0036] 在本發明中使用的材料和微加工技術消除了先前的由于使用PDMS所致的缺點。 Si和Si02具有比PDMS高得多的楊氏模量，使得這些微流體通道在更高的流體壓力下抵抗 變形，并允許施加高達16MPa的流體壓力（A.T.塞弗蒂里克（Ciftlik)等人，實驗室芯片 (LabChip)，第12卷，第396-400頁）。當進行比較時，PDMS制造的系統限于大約0. 7MPa 的壓力（M.A.艾丁斯（Eddings)等人，微機械微工程雜志（J.Micromech.Microeng.)， 18,pp. 067001)。因此，在我們的設計中，流動特征將是穩定的，即使在可能涉及IHC方案的 高得多的壓力和流速下也是如此。此外，由于所使用材料的高剛性以及上文解釋的機械脫 耦（參見第0028段），為了更好地密封組織載玻片所需要的力并不強加任何約束，并且這 些微流體通道保持完整。因此，由于這些通道的變形所致的在設計維度和流速方面的變化 仍然是可忽略不計的。因而，精確的方案應用是可能的，并且當用于診斷時，這種精確度保 證了再現性。此外，本裝置可以在高達200°C下運行，并且就與可能涉及IHC方案中的這些 試劑的化學相容性而言是穩固得多。而且，它接受標準的組織切片載玻片形狀，不需要任何 定制，并且作為診斷裝置的這種結構的商業化對于在臨床實踐中使用的標準是直觀的。圖 7(c)顯示了標準TS到一體化系統中的結合，并且圖7(d)顯示了具有該形成的組織腔室的 一體化系統。 裝置性能和臨床結果 濃度響應時間和均勻性表征
[0037] 通過從使用開放源ImageJ軟件獲得的圖像分析該組織腔室的強度分布圖來表征 濃度。為了分析，將具有5幀/秒的視頻轉化為灰階。首先，通過計算具有40UL/S流速的 持續長時間（100smin)的整個腔室的平均強度，以實驗方式找到最大濃度強度（MxCI)。類 似地，在流動PBS緩沖溶液之后，以實驗方式找到最小濃度強度（MnCI)。這兩個值用來將記 錄在實驗中的強度歸一化，并且歸一化的值用作試劑濃度C，其范圍在0到1之間。稍后， 我們應用了試劑和緩沖溶液，這兩者都應以方波波型的形式應用，具有16s的周期和50% 的占空比，但是具有180°的相移。根據所得視頻，研究了在組織腔室的不同區域中的濃度 變化的響應時間、以及平均化的行為。生成的響應時間曲線用來評估我們裝置的可能時間 性能。因此，我們在C和1-C的對數圖中使用了直線擬合。這些擬合用十倍數（decades)/ 秒（dec/s)給出了充填和洗滌性能，這是用于計算對給定的充填/洗滌純度所需要的洗滌 和充填時間的指標。另一方面，通過將組織染色區的像素直方圖的標準差分成在完成充填 和洗滌的瞬間的照相機像素深度，計算了整個組織腔室的濃度均勻性。
[0038] 響應時間和均勻性測量的曲線圖在圖8中給出。圖8(c)顯示了位于在如所指示 的腔室的入口、中間和出口周圍的不同組織腔室區域的濃度響應。雖然在入口和出口之間 的濃度響應存在著明顯的滯后，試劑施用的總時間是相同的。這對于結果的再現性是相當 關鍵的，因為組織的某些區域的延長暴露或短時暴露于抗體和染色可以導致假靶標表達水 平。我們還觀察到整個腔室的平均強度非常接近于在該腔室中部的測量值。因此，對于需要 組織切片的特定部分的高光學倍率的情況，人們可以使用該腔室的中部，因為它的其余部 分以任何方式都不能被監測。通過將整個組織腔室平均化計算出的C和1-C的對數圖在圖 8(a)和（b)中給出，其中最佳直線擬合斜率的平均值是針對洗滌和充填周期而示出的。觀 察到-0. 40dec/S的充填性能，這意味著需要5s的充填來實現在注射器內部的試劑濃度的 99%。類似地，洗滌性能為-0. 32dec/S，指示7s的緩沖液足以將濃度降低至初始值的1% 以下。我們認為，在這兩者之間的差異是由于分子的擴散所致，這有利于充填周期，但損害 了洗滌。圖8(d)顯示了在充填狀態下的腔室的像素直方圖，展示了遍及該腔室在5s的充 填之后2%的濃度不均勻性。 在癌組織上的生物標志物的比例檢測的孵育時間的優化
[0039] 已經展示了該微流體腔室的時間響應，我們致力于分析在人類乳腺癌組織上的診 斷性生物標志物。基于先前的分析，需要開發序貫方案，以及在陽性病例中具有再現性高的 信背（SBR)比的產生熒光圖像的最佳孵育時間。在這項優化研究中，我們使用了從相同腫 瘤切除術樣品鄰近地切割的7個具有強表達的HER2/neu陽性組織切片，由于用來建立孵育 條件和孵育時間的一級抗體和二級抗體的不同孵育時間（tin。）呈對數變化，取孵育的2"分 鐘，其中11 = -2、-1、0、1、2、3、4，從而評估孵育時間對從15秒到16分鐘所得信號的作用。 這與裝置設計結合，表明在充填之后從中心到組織切片表面的1分鐘擴散持續時間，并且 以上孵育時間的集合構成了在理論值周圍的呈對數分布的病例。
[0040] 圖9顯示了方案時間的優化。（a)針對一級抗體和二級抗體的不同孵育時間 (tin。)，從相同腫瘤切除術樣品鄰近地切割的HER2/neu陽性組織切片獲得的熒光強度。（b) 通過取（a)的信號與背景值的比率獲得的關于孵育時間的信背比（SBR)。在孵育的前2分 鐘期間，SBR的主要部分呈線性發展，表明免疫反應處于這個時間表上的動力學制度中。（c) 每額外孵育時間的SBR變化率。該變化率為在tin。= 2分鐘時的最大值，并且當組織切片 經受更長的孵育時間時開始下降。（d)在針對表達靶標抗原的相同組織切片上的不同區域 計算的信號值水平中的變異系數（CV)的研究。具有大約2%的變異系數（CV)的可再現信 號均勻性是在2分鐘和8分鐘之間的孵育時間（tin。）觀察到的。
[0041] 在組織制備和抗原修復之后，將顯示在表1中的方案應用于組織切片上，其中試 劑充填和緩沖液洗滌時間分別選擇為5s和7s。將該方案應用于MTP上之后，取出顯微鏡 載玻片，加蓋玻片，并且用掃描熒光顯微鏡完成了圖像采集。隨后，使用這些圖像通過取在 圖像像素上的熒光強度平均值來獲得信號值，這些圖像像素與位于癌細胞的細胞膜中的 HER2/neu表達區域相對應。類似地，通過將在其余像素上的熒光強度平均化獲得背景值 (圖9(a))。針對如在圖9(c)中顯示的每一孵育時間計算出的SBR圖，其中可以看出，當我 們對于HER2/neu病例增加孵育時間64倍時，即使對于n= -2的方案，該信號是可檢測的， 并且SBR僅僅從1. 2提高到1. 90。在孵育的前2分鐘期間，SBR的主要部分呈線性發展，表 明免疫反應處于這個時間表上的動力學（反應控制的）方案中，并且之后受到擴散的控制。 我們還研究了在針對表達靶標抗原的相同組織切片上的不同區域計算的信號值水平中的 變異系數（CV)。觀察到可再現的信號均勻性，并且，盡管隨著時間降低，在n= 1(圖9(d)) 之后CV保持穩定。
[0042] 我們還選擇了n= 1(2分鐘的孵育時間）的方案，作為在我們的臨床研究中使用 的最終方案。主要原因在于，對于1，免疫反應被視為處于動力學制度中，并因此在這 個時間表中的孵育將產生與組織切片上表達的抗原的量成線性比例的熒光信號。其次，SBR 增加率是最大的，直到n= 1時為止，并且當組織切片經受更長的孵育時間時，它開始下降， 因此，當使用n=l時，每孵育時間的SBR保持最大。（圖9(c))。我們可以得出結論的是， n= 1的方案是最優的，因為它是這樣一種方案，其中免疫反應處于具有最大SBR增益而且 在信號水平中的最小可實現的CV的動力學制度中。這直接轉換成4V2分鐘的總方案時間。
[0043] 為了與先前的IHC技術進行定量技術性能比較，我們設計了品質因數，其被定義 為每試劑體積、分析時間和試劑成本的染色面積。表4將這些結果列在表格中，表明在時間 上的將近100倍的提高以及相對于常規技術的1000倍的總體提高。
[0045] 在降低每靶標所花費的總時間的試圖中，我們還對多路方案的可行性提出了質 疑。使用了一級抗體與二級抗體的混合物來靶向一種以上的受體，進而減少了在IHC測定 中每靶標的總時間。表2顯示了這樣一種方案的時間設置，將其應用于我們的乳腺癌組織 切片。雖然具有相同的總時間，每靶標的時間已經減少至非多路方案的一半。圖10顯示 了使用具有我們的系統的免疫組織化學進行的乳腺癌生物標志物人類表皮生長因子受體 (HER2/neu)和雌激素受體（ER)的示例性多路熒光檢測。使用具有微流體組織處理器的免 疫組織化學進行乳腺癌生物標志物人類表皮生長因子受體（HER2/neu)和雌激素受體（ER) 的多路熒光檢測。該檢測是用優化的方案完成的，該方案具有孵育時間2分鐘（n= 1)并 且使用針對各自的抗原的一級抗體和二級抗體的混合物。（a)藍色通道代表結合有DAPI的 核復染，并有助于將細胞核可視化。（b)用單克隆兔抗人一級抗體檢測HER2/neu，并且用亞 歷克薩-熒光劑（Alexa-Fluor) 594標記的山羊抗兔多克隆IgG二級抗體將其可視化，此處 以紅色通道表示。（c)用單克隆小鼠抗人一級抗體（克隆6F11)檢測雌激素受體（ER)，并且 用亞歷克薩-熒光劑（Alexa-Fluor)647結合的山羊抗小鼠多克隆IgG二級抗體將其可視 化，此處以綠色通道表示。（d)顯示了在一起的三個通道。這些圖像的寬度相應于eooym 并且是使用掃描熒光顯微鏡通過6乘以6拼接高分辨圖像獲得的。 臨床研究
[0046] 為了在真實世界環境中測試該開發的MTP系統，我們對從病理學研究所檔案檢索 的一組76位乳腺浸潤性導管癌進行了一系列免疫組織化學反應。在已經在MTP上建立針對 HER2/neu免疫組織化學的最佳實驗條件之后，其中對于一級抗體和二級抗體的孵育時間為 2分鐘（n= 1)，我們對76位乳腺浸潤性導管癌應用了我們的方案。在常規IHC和MTP-IHC 之間的診斷結果的比較顯示在圖11中。當與常規IHC比較時，MTP-IHC產生了 90%的較少 模糊的結果，并且準確地預測了ISH擴增結果。插圖表顯示了對于所研究的76個病例的常 規IHC評分和MTP-IHC評分的交叉相關。使用MTP-IHC技術，對于評分（0)和⑴的病例 以及評分（+++)的病例，我們未曾產生單個假陽性或假陰性結果。更重要的是，評分（++) 的模糊病例的數量顯著減少，從27例減少到3例（幾乎減少了 90% )。通過MTP-IHC將借 助于經典IHC診斷的24例評分（++)的模糊病例評分為（0) /+或（+++)，并且在這些24位 病例中的每一位中，其賦值都與基因擴增狀態相對應。最初被診斷為（+++)病例的一個病 例被重新賦值為評分（++)。因此，當使用呈現的MTP-IHC而不是常規的IHC時，最終的診斷 性HER2/neu結果的預測準確性要高得多。 用途的替代領域和拓展領域
[0047] 本發明的流體操作并不僅限于壓力驅動流的產生。當該流體流由其他致動機制 (包括但不限于，電動流或熱誘導流）誘導時，本裝置的創造性（孵育時間的同時減少、在動 力學制度中維持方案反應、導致在所得讀出信號與靶標抗原量之間經證實的比例性、以及 由于快速且均勻的流體交換所致的高均勻性）同樣適用。例如，存在著采用電動或熱誘導 流的其他發明（W0/2011/102801和EP1 974 814)，然而，在這些文獻中，創造性在于誘導 流本身的特定電極的某些安排（或設計、形狀等）。因此，當與其他技術組合來誘導所述微 通道和所述組織腔室內部的流體流時，這樣的在先要求不能限制本發明的用途。
[0048] 類似地，當溫度控制系統（不限于但優選通過一體化（金屬或聚合物）電極和傳 感器和/或通過使其與預熱的元件接觸來完成）結合在本發明中描述的微流體裝置和一體 化系統內時，本裝置的創造性同樣適用。例如，存在著在微流體系統中采用一體化和/或附 加的溫度控制系統的其他發明（US/2005/009101)，然而，在這些文獻中，創造性在于構成該 溫度控制系統的加熱元件和傳感元件的某些特征、設計和/或形狀。因此，當與在所述微通 道和所述組織腔室內部實現溫度控制的技術組合時，這樣的在先要求不能限制本發明的用 途。
[0049] 需要溫度控制的示例性應用為甲醛固定的石蠟包埋的（FFPE)組織切片的直接處 理。FFPE組織切片的處理需要在芯片上完成去除石蠟（脫蠟）、再水合和抗原修復步驟。事 實上，如果可以在該裝置上形成微加熱器（電極），這是可能的，因為抗原修復程序通常需 要在大約95°C加熱組織。基于染色方案所需要的已知時間，我們可以估計實現這種芯片上 樣品預處理所需要的時間。表3總結了芯片上脫蠟和抗原修復方案，表明這樣的預處理在 另外的5分鐘時期內是可行的。因此，加上染色所需要的2. 5分鐘，該裝置具有在7. 5分鐘 內實現完全處理FFPE組織切片的潛力，而直到現在為止報道的最快的完全處理是"波"機 制（PCT/US2006/015020 和W0/2006/116037)，其具有 70 分鐘的方案時間。
[0050] 類似地，當用于固定在腔室內的實體成像的成像系統（不限于但優選地包括光檢 測器或光源、或光檢測器陣列，可以使用硅微電子技術加工）與本發明中描述的微流體裝 置和一體化系統組合時，本裝置的創造性同樣適用。例如，存在著在微流體背景下采用這樣 的成像系統（W0/2010/148252)的其他發明，然而，在這些文獻中，創造性在于構成這些成 像系統的這些元件和/或結構的某些特征、設計和/或形狀。因此，當與在這些微通道和該 組織腔室內部整合一種成像系統的技術組合時，這樣的在先要求不能限制本發明的用途。
[0051] 類似地，當光學部件（不限于但優選地包括透鏡、物鏡、微透鏡陣列、偏振和/或熒 光濾光器，位于光檢測器和光源或這些光檢測器和光源陣列的前面）與本發明中描述的微 流體裝置和一體化系統組合時，本裝置的創造性同樣適用。例如，存在著在微流體背景下采 用這樣的光學元件（W0/2010/148252)的許多其他發明，然而，在這些文獻中，創造性在于 構成這些光學系統的這些元件和/或結構的某些特征、設計和/或形狀。因此，當與在這些 微通道和該組織腔室內部整合光學元件的技術組合時，這樣的在先要求不能限制本發明的 用途。
[0052] 證明了在本發明中描述的裝置對于癌癥生物標志物的免疫組織化學檢測是有用 的，當與常規免疫組織化學比較時，就診斷結果而言具有大大提高的辨別力（正如通過基 因擴增所證實的）（圖11)。這通過顯著縮短的孵育時間得以解釋，其允許獲益于控制初始 的第一次孵育分鐘數的比例性，其中抗體以高度成比例的方式結合至抗原，具有作為抗體 和抗原濃度的直接函數的恒定結合率。因此，本發明的應用并不限于IHC，而且可以用于可 以致力于在比例性動力學制度下運作的任何表面反應，以便實現與固定在固體載體上的靶 標的范圍成線性比例的反應。
[0053] 在本發明中描述的裝置利用了堅向出入孔和分布在腔室外周附近的微流體通道 網絡的智能構造安排（圖3)以及用以保證在低體積的覆蓋組織切片的大（16_乘以16_) 而非常淺（小于lOOum)的孵育腔室內的快速、完全、和均勻的生物試劑交換的高壓（圖 2-8)。以這種方式，由于獲得的對流流動，在組織切片上的生物試劑的洗滌和充填時期保持 在5-7秒的絕對極小值，同時在實際孵育期間保證了無流動條件。此外，我們觀察到作為孵 育時間的函數的SBR比的增加在初始反應限制的線性制度期間更為突出（圖9 (c))，表明在 本裝置中的短孵育時間通常足以獲得足夠強的讀出信號，而不必增加檢測抗體的濃度。
[0054] FFPE組織的10分鐘完全處理時間也與該技術的術中利用的時間表、以及獨立的 微型化且自動化的診斷性IHC系統的使用良好擬合。減少死體積、增加系統壓力以及實現 均勻的在組織樣品上的試劑和緩沖液流有助于減少測定時間，其短至足以被視為在手術過 程中的即時反饋。將固定在標準載玻片上的組織切片機械地夾固到微流體結構上并且可以 在一分鐘之內將其置放，這樣，僅僅在組裝步驟需要改變TS。品質因數比較（表4)揭示，當 與現有技術比較時，本發明可以展現出1000倍的提高。
[0055] 該呈現的技術可通過整合微型顯微鏡而容易地轉化成獨立的、完全的免疫組織化 學診斷解決方案。因此，可以完成診斷而不需要另外的基礎設施、專門人才，并且幾乎不需 要維護。
[0056] 然而本發明并不限于前面論述的實例。 引用的參考文獻 瓦妮莎?費爾南德斯（VanesaFernandez)-莫雷拉（Moreira)、泊松（BoSong)、VenkataragavaluSivagnanam、安妮-索菲肖萬（Anne-SophieChauvin)、凱若琳 (Caroline)D.B.范德維夫（Vandevyver)、馬丁 ?吉斯（MartinGijs)、伊爾卡?海米拉 (IlkkaHemmi丨5)、漢斯-安東?萊爾（Hans-AntonLehr)、和珍-克勞德（Jean-Claude) G.班茲利（Biinzli)，作為用于癌癥生物標志物的芯片上實驗室檢測的多標記的生物結 合的鑭系發光螺旋配合物（Bioconjugatedlanthanideluminescenthelicatesas multilabelsforlab-on-a-chipdetectionofcancerbiomarkers) ?分析家（Analyst), 第 135 期，第 42-52 頁，2010.B。 安塔?圖納?塞弗蒂里克（AtaTunaCiftlik)、泊松（BoSong)、凱若琳?范德維夫 (CarolineVandevyver)、珍-克勞德?班茲利（Jean-ClaudeBtinzli)、漢斯-安東?萊 爾（Hans-AntonLehr)、和馬丁努斯?吉斯（MartinusGijs)，用于癌癥組織切片的快速 免疫組織化學生物標志物檢測裝置（Fastimmunohistochemicalbiomarkerdetection deviceforcancertissueslices)，用于化學和生命科學的微型系統的第14屆國際會議 會干丨J(Proceedingsof14thInternationalConferenceonMiniaturizedSystemsfor ChemistryandLifeSciences)，格羅寧根，荷蘭，10 月 3 日至 10 月 7 日，2010 年，2010。 金瑕碩S(MinseokS.Kim)、權世容（SeyongKwon)、金泰民（TaeminKim)、李恩淑（Eun SookLee)、樸在均（Je-KyimPark)，使用用于免疫組織化學和免疫細胞化學的多路微流體 平臺進行的乳腺癌的定量蛋白質組學圖譜（Quantitativeproteomicprofilingofbreast cancersusingamultiplexedmicrofluidicplatformforimmunohistochemistryand immunocytochemistry)，生物材料（Biomaterials)，第 32 卷，第 5 次發行，2011 年 2 月，第 1396-1403 頁。 金MS(KimMS)、金T(KimT)、孔S-Y(KongS-Y)、權S(KwonS)、衰CY(BaeCY)等人， 使用微流體多路免疫組織化學平臺進行乳腺癌診斷（Breastcancerdiagnosisusinga microfluidicmultiplexedimmunohistochemistryplatform)，PLoSONE5 (5):el0441. doi:10.1371/journal.pone. 0010441，2010。 佩奇?埃里克森（PageErickson)、邁克爾?艾弗曼（MichaelEverman)、邁克爾?貝 爾（MichaelBell)、凱文?埃德伯格（KevinEdberg)、馬修?波特克（MatthewBotke)， 用于自動化的快速免疫組織化學的增強流體方法和設備（Enhancedfluidicmethod andapparatusforautomatedrapidimmunohistochemistry)，PCT/US2006/015020， W0/2006/116037,2011。 米歇爾?麥克內利（MichealMcneely)、利斯?阿迪（NisAdey)、馬克?施普特（Mark Spute)、愛德華?艾利夫（EdwardAyliffe)等人，用于微流體分界面分類的方法和系 統（Methodandsystemformicrofluidicinterfacingtoarray)，PCT/US02/07113， W0/2002/072264?2002〇 亞瑟?克瓦爾（ArthurQueval)、納格斯瓦拉R.吉哈塔曼埃尼（Nageswara R.Ghattamaneni)、塞西爾M?佩羅（C6cileM.Perrault)、拉明德爾?吉爾（Raminder Gill)、瑪 _亞姆?米薩耶（MaryamMirzaei)、R.安妮?麥金尼（R.AnneMcKinney)和大 衛?容克（DavidJuncker)，用于器官型腦切片的微量灌注的腔室和微流體探頭（Chamber andmicrofluidicprobeformicroperfusionoforganotypicbrainslices)，實驗室 芯片（LabChip)，2010, 10, 326-334。 伊曼紐爾?德拉馬什（EmmanuelDelamarche)、烏特?德雷克斯勒（UteDreschsler)、 和羅伯特?諾齊克（RobertLovchik)，多層微流體探頭及其加工方法（Multilayer microfluidicprobeheadandmethodoffabricationthereof)，PCT/IB2010/052018， W0/2010/128483,2010。 伊曼紐爾?德拉馬什（EmmanuelDelamarche)、大衛?容克（DavidJuncker)、布魯 諾?米切爾（BrunoMichel)、和海因茨?施密德（HeinzSchmid)，用于在一種表面上流 動液體的方法和裝置（Methodanddeviceforflowingaliquidonasurface)，PCT/ IB2003/005350,W0/2004/050246, 2004。 蘭普雷克特?瓦爾特勞德（LamprechtWaltraud)、麥西斯?安東（MathesAnton)、文 策爾?喬治（WenczelGyoergy)、和施特賴特?沃爾夫岡（StreitWolfgang)，用于提供雜交 室的裝置和方法（Deviceandprocessunitforprovidingahybridizationchamber)， US/2006/0003440,2006。 喬恩?星崎（JonHoshizaki)、楊沫俊（JoonMoYang)、瑪麗亞姆?沙里亞蒂（Maryam Shariati)、大衛?科克斯（DavidCox)、克爾科?希拉諾（KirkHirano)等人，低體積 測序系統及其使用方法（Low-volumesequencingsystemandmethodofuse)，PCT/ US2010/047392，W0 2011/026136,2011。尼爾斯?阿迪（NilsAdey)，分層的微陣列界面裝 置（Laminatedmicroarrayinterfacedevice)，PCT/US02/24616，W0/2003/015922,2003。 金基范（GibumKim)、托德?施沃雷爾（ToddSchwoerer)，用于寬面積微流體的微流 體設備（Microfluidicapparatusforwideareamicrofluidics)，PCT/US2008/074865， W0/2009/029845?2009〇 安塔?圖納?塞弗蒂里克（AtaTunaCiftlik)和馬丁A.M?吉斯（MartinA.M.Gijs)， 用于高壓微流體與CMOS裝置整合之后的聚對二甲苯與氮化娃的粘結（Paryleneto siliconnitridebondingforpost-integrationofhighpressuremicrofluidics toCMOSdevices)，芯片上實驗室（LabonaChip)，2012, 12 (2) ,396-400.doi:10. 1039/ cllc20727j。 馬克A艾丁斯（MarkAEddings)、米切爾A約翰（MichaelAJohnson)和布魯斯K蓋 爾（BruceKGale)，用于微流體裝置的最佳PDMS-PDMS粘結技術的確定（Determiningthe optimalPDMS-PDMSbondingtechniqueformicrofluidicdevices)，微機械學和微工 程學雜志（JournalofMicromechanicsandMicroengineering)，2008, 18, 067001。 納撒尼爾?羅賓遜（NathanielRobinson)和佩爾?埃蘭德松（PerErlandsson)，一種 電動流體系統（Anelectrokineticfluidicsystem)，W0/2011/102801，2011。 荷蘭皇家飛利浦電子公司（KoninklijkePhilipsElectronicsNV)，一種基于 活性基質原理的微流體裝置（Amicrofluidicdevicebaseduponactivematrix principles)，EP1974814, 2008。 蓋理?布萊克本（GaryBlackburn)，包含生物通道的微流體裝置（Microfluidic devicescomprisingbiochannels),US/2005/009101,2005〇 喬迪?維考卡爾（JodyVykoukal)、戴恩尼M.維考卡爾（DayneneM.Vykoukal)、格雷戈 里P.斯通（GregoryP.Stone)、埃克哈德U.阿爾特（EckhardU.Alt)，用于定量顯微成像的 方法和設備（methodandapparatusforquantitativemicroimaging)，W0/2010/148252， 2010〇
【權利要求】
1. 一種生物和化學樣品處理裝置，該裝置 a. 包括一個抗高壓的、淺的并且寬面積的微流體腔室，該微流體腔室具有由可拆卸的 載玻片形成的至少一個壁，該載玻片含有諸如固定的實體、生物樣品或分子的樣品， b. 包括用于將流體注射到所述腔室并且從該腔室收集流體的微流體出入孔的安排， c. 與形成在該腔室外部的入口端口和微流體通道接合， d. 被配置為使得該載玻片可以與該裝置接觸而形成所述腔室， e. 被適配為在所述腔室的內部以快速的方式優選地在小于15秒之內、并且由于所述 微流體出入孔的安排而以規則或均勻的方式遞送和轉運流體物質和試劑。
2. 根據權利要求1所述的裝置，該裝置包括用于在該腔室內部產生流體流，即，誘導入 口與出口之間的壓差的壓力驅動流發生工具。
3. 根據權利要求1所述的裝置，該裝置包括用于通過在所述微流體腔室、所述微流體 通道和所述微流體出入孔的任何兩個或更多個點之間施加電位差而在該腔室內部產生流 體流的電動流發生工具。
4. 根據權利要求1所述的裝置，該裝置包括用于在該腔室內部產生流體流，即，通過在 所述微流體腔室、所述微流體通道和所述微流體出入孔的任何兩個或更多個點之間經由發 生溫差而誘導流體流的熱誘導流發生工具。
5. 根據以上權利要求中任一項所述的裝置，該裝置包括調整和控制局限在所述腔室、 所述微流體通道和所述微流體出入孔中的流體的溫度的一個加熱元件和一個溫度傳感器。
6. 根據以上權利要求中任一項所述的裝置，該裝置結合用硅微電子技術加工的光檢測 器和光源或光檢測器和光源的陣列，用于固定在載玻片上的實體的數字成像而用于明視野 或熒光檢測。
7. 根據以上權利要求中任一項所述的裝置，該裝置包括位于光檢測器和光源或這些光 檢測器和光源陣列的前面的微透鏡陣列、偏振和/或熒光濾光器。
8. -種使用如在關于以上權利要求的任一項中定義的裝置進行的生物和化學樣品處 理的方法，該方法包括以下步驟： a. 手工或自動地獲得在一側或多側上具有實體的所述載玻片 b. 通過手工或自動地將所述載玻片結合到所述微流體裝置上建立所述形成的腔室 c. 使在所述載玻片上的實體在預定時期期間并且以預定溫度依次經受合適的流體或 反應物質 d. 使在所述載玻片上的實體在預定時期期間并且以預定溫度依次經受合適的用于指 示檢測的流體或反應物質。
9. 根據權利要求8所述的方法，該方法包括以下之一： a. 提供少于10分鐘的總組織化學檢測 b. 提供少于5分鐘的組織化學檢測 c. 提供少于2. 5分鐘的組織化學檢測 d. 提供少于10分鐘的細胞化學檢測 e. 提供少于5分鐘的細胞化學檢測 f. 提供少于2. 5分鐘的細胞化學檢測 g. 提供少于2分鐘的染色過程 h. 提供少于2分鐘的石蠟溶解或蝕刻過程 i. 少于5分鐘的抗原修復過程 j. 少于5分鐘的表位修復過程 k. 少于5分鐘的熱誘導抗原修復過程 l. 少于5分鐘的熱誘導表位修復過程。
10. 根據權利要求8或9所述的方法，其特征在于相對短的處理和流體交換時間，以此 方式來減少非特異性指示、假陽性和模糊結果。
11. 如在權利要求1到7的任一項中定義的裝置的用途，用于使在該載玻片的表面上的 實體在預定時期期間經受合適的流體或反應物質或任何合適的流體反應物質的序列，所述 用途包括以下操作的至少一個： i. 一個組織化學過程 ii. 一個細胞化學過程 iii. 一個免疫組織化學過程 iv. -個免疫細胞化學過程 v. -個免疫組織熒光過程 vi. -個免疫細胞熒光過程 vii. -個原位雜交過程 viii. -個熒光原位雜交過程 ix. -個抗原修復過程 X. 一個表位修復過程 Xi. -個熱誘導抗原修復過程 xii. -個熱誘導表位修復過程 xiii. -個石蠟溶解或蝕刻過程 xiv. -個染色過程。
【文檔編號】B01L3/00GK104284725SQ201380022147
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年2月15日 優先權日:2012年2月27日
【發明者】阿塔·圖納·奇夫特里克, M·吉斯 申請人:洛桑聯邦理工學院