一種提高蛋白純化純度的預處理方法
【專利摘要】本發明屬于生物醫藥【技術領域】。本發明提供一種蛋白純化過程的優化步驟，以及該步驟涉及的蛋白吸附材料。本發明所述的蛋白純化的優化步驟，主要是預處理后、粗分級前，或粗分離過程中，采用本發明提出的非定向蛋白吸附載體，去除雜質蛋白，有利于下一步的分離純化，提高蛋白純化產品的純度。本發明所述的非定向蛋白吸附載體，可以為石墨烯單質，也可以為石墨烯與納米材料的復合物；其形態可以是粉末狀，可以是二維平面狀，也可以是三維海綿狀；其存在狀態可以為固態，也可以為溶液態或分散液。本發明可用于蛋白純化領域。
【專利說明】一種提高蛋白純化純度的預處理方法
【技術領域】
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[0001]本發明涉及蛋白質分離純化領域，確切的講，涉及一種蛋白提取液的處理方法以及該方法涉及的蛋白吸附材料。
【背景技術】
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[0002]蛋白質的分離純化在生物化學研究應用中使用廣泛，是一項重要的操作技術。一個典型的真核細胞可以包含數以千計的不同蛋白質，一些含量十分豐富，一些僅含有幾個拷貝。為了研究某一個蛋白質，必須首先將該蛋白質從其他蛋白質和非蛋白質分子中純化出來。
[0003]分離純化某一特定蛋白質的一般程序可以分為預處理、粗分級分離和細分級分離三步。
[0004]預處理，也稱前處理:
[0005]分離純化某種蛋白質，首先要把蛋白質從原來的組織或細胞中以溶解的狀態釋放出來并保持原來的天然狀態，不丟失生物活性。然后根據不同的情況，選擇適當的方法，將組織和細胞破碎。組織和細胞破碎后，選擇適當的緩沖液把所要的蛋白提取出來。細胞碎片等不溶物用離心或過濾的方法除去。如果所要的蛋白主要集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體或可溶性細胞質等，則可利用差速離心的方法將它們分開，收集該細胞組分作為下步純化的材料。如果碰上所要蛋白是與細胞膜或膜質細胞器結合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結構解聚，然后用適當介質提取獲得蛋白質提取液。
[0006]粗分級分離:
[0007]當蛋白質提取液(有時還雜有核酸、多糖之類)獲得后，選用一套適當的方法，將所要的蛋白與其他雜蛋白分離開來。一般這一步的分離用鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點是簡便、處理量大，既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白溶液。有些蛋白提取液體積較大，又不適于用沉淀或鹽析法濃縮，則可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法進行濃縮。
[0008]細分級分離:
[0009]樣品經粗分級分離以后，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進一步純化，一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時還可選擇電泳法，包括區帶電泳、等電點聚焦等作為最后的純化步驟。用于細分級分離的方法一般規模較小，但分辨率很高。
[0010]在實際工作中，即使在上述三個步驟中都采用最適合的分離純化方法，也很難得到高純度的蛋白質。尤其是性質未知的雜質蛋白或者污染蛋白，現有的技術是很難將其一步去除的，只能采取一系列的步驟；而且這些雜質蛋白、污染蛋白的少量存在也會對目標蛋白的性質研究產生極大的影響。因此，科研工作者和工藝師也在積極地改進現有的純化方法、或開發新的純化工藝，以此不斷的促進對蛋白質性質的研究；同時蛋白質的性質研究也反過來推動者蛋白分離純化技術的進步。
【發明內容】
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[0011]本發明的主體思想:
[0012]與上述的蛋白分離步驟中，主要是預處理后、粗分級前，采用本發明提出的非定向蛋白吸附載體，去除雜質蛋白，有利于下一步的分離純化，提高蛋白純化產品的純度。
[0013]本發明涉及的技術方案:
[0014]石墨烯是近幾年剛剛發現的新型納米材料，具有極高的比表面積，理論比表面積高達2630m2 / g。而且具有很好的吸附性能和良好的機械性能，作為吸附材料也得到了很好的開發應用。此外，石墨烯與納米材料之間的協同效應使這種含有大比表面積的復合材料比單一的納米材料具有更大的優越性，以石墨烯為載體制備納米吸附材料也成為當前研究熱點。
[0015]發明人長時間進行石墨烯功能化修飾與應用領域。在實驗研究中，發現石墨烯或石墨烯與其它納米材料的復合物對蛋白質具有很好的非定向吸附作用，可以快速、大量的吸附各類雜質蛋白質。在此發現的基礎上，發明人經過多次試驗，優化了蛋白純化的步驟，預處理后、粗分級前，或者粗分離之中使用上述石墨烯吸附材料對細胞裂解液或者細胞培養上清液進行處理，有效提高蛋白純化產品的純度。
[0016]亦即:本發明提供一種蛋白純化過程的優化步驟，以及該步驟涉及的蛋白吸附材料。
[0017]1、本發明所述的蛋白純化的優化步驟，主要是預處理后、粗分級前，或粗分離過程中，采用本發明提出的非定向蛋白吸附載體，去除雜質蛋白，有利于下一步的分離純化，提高蛋白純化產品的純度。
[0018]2、本發明所述的非定向蛋白吸附載體，其特征是，可以為石墨烯單質，也可以為石墨烯與納米材料的復合物；其形態可以是粉末狀，可以是二維平面狀，也可以是三維海綿狀；其存在狀態可以為固態，也可以為溶液態或分散液。
[0019]3、上述2所述的非定向蛋白吸附載體，其特性為:單顆載體的尺寸為1nm至100微米。
[0020]4、上述2所述的石墨烯與納米材料的復合物,其特征在于:所述的納米材料包含以下材料中的一種或任意兩種及兩種以上的混合物:金屬納米粒子，如金、銀、氧化鋁、氧化鐵；半導體納米晶，如CdTe ;碳納米管；納米非金屬粉末或溶液；高分子材料。
[0021]5、本發明所述的優化的蛋白純化步驟為:
[0022](I)準備石墨烯或石墨烯/納米材料復合材，作為非定向吸附載體；
[0023](2)進行蛋白質純化的預處理程序，得到細胞裂解液，或者細胞培養上清液；
[0024](3)將上述步驟I得到的載體與步驟2的細胞裂解液中或者細胞培養上清液混合均勻，其中石墨烯質量為細胞裂解液或細胞培養上清液溶液質量的1%——20% ；
[0025](4)將上述混合液攪拌15min-1h,使石墨烯充分吸附雜志蛋白質；
[0026](5)將吸附雜質后的混合液使用濾紙或濾膜過濾；
[0027](6)繼續進行蛋白質的后續分離步驟。
[0028]本發明優勢:
[0029]本發明利用石墨烯巨大的比表面積，且吸附性能好的特點，將其單獨使用或與納米材料合理復合組裝，可起到蛋白非定向吸附的作用。將該材料運用在蛋白分離過程中，主要是預處理后、粗分級前，一步去除多種雜質蛋白，有利于下一步的分離純化，提高蛋白純化產品的純度。該材料具有制備簡單，性質穩定的優點；且對環境友好，成本低廉；可以大量快速吸附蛋白；且使用操作簡單，不需要操作者具備很高的科技水平都可以進行操作。
【具體實施方式】
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[0030]下面通過具體實施例，對本發明做進一步的說明。
[0031]采用石墨烯/金納米粒子復合材料進行非定向吸附的蛋白純化方法:
[0032](I)準備石墨烯/金納米材料復合材，作為非定向吸附載體:使用氨基環氧加成反應制備超小尺寸氧化石墨烯(<500nm)，試用該方法制備的石墨烯尺寸小，毒性小，便于修飾；用此石墨烯用做基本載體進行金納米粒子復合；
[0033](2)進行蛋白質純化的預處理程序:將組織和細胞破碎，選擇適當的緩沖液把所要的蛋白提取出來。細胞碎片等不溶物用離心或過濾的方法除去。如果所要的蛋白主要集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體或可溶性細胞質等，則可利用差速離心的方法將它們分開，收集該細胞裂解液作為下步純化的材料；
[0034](3)將上述步驟I得到的載體與步驟2的細胞裂解液混合均勻，其中石墨烯質量為細胞裂解液或細胞培養上清液溶液質量的1% 20% ;
[0035](4)將上述混合液攪拌15minlh,使石墨烯充分吸附雜志蛋白質；
[0036](5)將及附雜質后的混合液使用濾紙或濾膜過濾；
[0037](6)繼續進行蛋白質的后續分離步驟，最終得到純化的目標蛋白。
【權利要求】
1.一種蛋白純化過程的優化步驟，以及該步驟涉及的蛋白吸附材料，其特點在于:主要是預處理后、粗分級前，或粗分離過程中，采用本發明提出的非定向蛋白吸附載體，去除雜質蛋白，有利于下一步的分離純化，提高蛋白純化產品的純度。
2.根據權利要求1所述的非定向蛋白吸附載體，其特征是，可以為石墨烯、氧化石墨烯、還原石墨烯，也可以為石墨烯與納米材料的復合物；其形態可以是粉術狀，可以是二維平面狀，也可以是三維海綿狀；其存在狀態可以為固態，也可以為溶液態或分散液。
3.根據權利要求1所述的非定向蛋白吸附載體，其特性在于:單顆載體的尺寸為1nm至100微米。
4.根據權利要求2所述的石墨烯與納米材料的復合物,其特征在于:所述的納米材料包含以下材料中的一種或任意兩種及兩種以上的混合物:金屬納米粒子，如金、銀、氧化鋁、氧化鐵；半導體納米晶，如CdTe ;碳納米管；納米非金屬粉末或溶液；高分子材料。
5.根據權利要求1所述的優化的蛋白純化步驟為: (1)準備石墨烯或石墨烯/納米材料復合材，作為非定向吸附載體； (2)進行蛋白質純化的預處理程序，得到細胞裂解液，或者細胞培養上清液； (3)將上述步驟I得到的載體與步驟2的細胞裂解液中或者細胞培養上清液混合均勻，其中石墨烯質量為細胞裂解液或細胞培養上清液溶液質量的1%——20% ； (4)將上述混合液攪拌15min-1h,使石墨烯充分吸附雜志蛋白質； (5)將使用石墨烯進行雜質吸附后的混合液用膜過濾，得到處理后的細胞裂解液或上清液； (6)繼續進行蛋白質的后續分離步驟。
【文檔編號】B01J20/20GK104130309SQ201310756622
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年12月25日 優先權日:2013年12月25日
【發明者】劉遵峰, 賈鳳美, 劉倩 申請人:常州碳宇納米科技有限公司