一種水性膠層析介質及用于檢測的方法

一種水性膠層析介質及用于檢測的方法
【專利摘要】本發明公開了一種水性膠層析介質，所述水性膠層析介質的組成為聚蔗糖、明膠和水，其中聚蔗糖的濃度為5-100g/L，明膠的濃度為1-10g/L，水性膠層析介質能分離紅細胞與游離免疫球蛋白用于不完全抗體的檢測以及分離顆粒性抗原抗體用于抗原抗體的檢測。通過上述方式，本發明的水性膠層析介質及用于檢測的方法，該方法可應用于紅細胞、血小板、白細胞等血液細胞的檢測中，也可用于免疫標記技術中其它顆粒性抗原與游離的可溶性蛋白的分離，如ELISA、免疫熒光、流式細胞法等，避免了免疫學方法操作過程中繁瑣的洗滌過程，極大地簡化了操作步驟，提高了檢測效率，能用于大量樣本檢測，水性膠層析介質原材料價格便宜，生產技術要求低。
【專利說明】一種水性膠層析介質及用于檢測的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學檢測領域，特別是涉及一種水性膠層析介質及用于檢測的方法。【背景技術】
[0002]不完全抗體(主要為IgG類抗體)與紅細胞相應抗原結合后(致敏紅細胞)在鹽水介質中不出現肉眼可見的凝集反應，但在加入抗-1gG的抗體(二抗)后，該二抗與致敏紅細胞上不完全抗體的Fe段結合，得以搭橋，出現凝集反應，該試驗稱為抗人球蛋白試驗(ant1-human globulin test or Coombs test),在臨床常規的抗體篩檢、鑒定以及交叉配血中，要求對具有輸血史、妊娠史及輸用過血液制品的受血者和供血者都應進行不完全抗體檢測。臨床上保障安全輸血，診斷新生兒溶血病、自身免疫性溶血病、藥物免疫溶血性疾病等以及血型學研究工作中，對不完全抗體的檢測是最重要內容之一。對此，傳統的試管抗人球蛋白試驗1945年發明，沿用至今只能應用于少量標本的確證實驗，由于其繁瑣的操作使其始終未成為臨床常規檢測手段；目前應用最多的微柱凝膠抗人球蛋白實驗，這不需要洗滌過程，但存在著試劑價格高，血液標本中纖維蛋白原容易產生假陽性的缺點；此外，各種“增強實驗”，包括蛋白酶、白蛋白、聚凝胺等，都因為各自缺點也沒能成為檢測血型不完全抗體的可靠方法。
[0003]1945年科學家Coombs RRA等根據一些病人的病癥，確信他們的血液中應該有抗患者紅細胞的凝集素，但將這些血清與紅細胞混合后并未出現凝集反應，而當加入人血清抗體(抗人球)后，以其搭橋則出現凝集反應，最初此方法只用于檢測血清中不完全抗體，經過發展同樣用于檢測病人體內已經結合了抗體和/或補體的紅細胞，即經典的Coombstest,前者為間接抗人球蛋白實驗,后者為直接抗人球蛋白實驗,經典的Coombs test理應是現在和將來對不完全抗體檢測的確定性、標準性試驗，發明之初也被希望能應用于臨床常規不完全抗體檢測以及出紅細胞以外的其他小分子抗原抗體檢測，但由于抗人球與血清中致敏紅細胞的抗體及血清中游離的免疫球蛋白都能結合，因此在常規的試管Coombstest時首先要洗滌去除未與紅細胞結合的游離免疫球蛋白，再加入抗人球，這樣避免抗人球被反應液中非特異性的免疫球蛋白中和而出現的假陰性反應，這需要生理鹽水離心洗滌至少三次以上，使反應液中非特異性的免疫球蛋白殘余要少于原量的1/5000，由此導致其操作繁瑣費時，且一些弱反應抗體不能檢出等缺點，不能滿足臨床進行血型相容性試驗時間性要求，故此方法始終未能成為臨床常規檢測項目。為解決這一難題人們發展出了一些增強介質如聚凝胺(polybrene)、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)、低離子強度溶液(low ionic strength saline,LISS)以及酶液等,利用這些介質的技術都可以減少或避免洗滌程序、減少孵育時間并增強抗原抗體反應，但同樣存在一些缺點:如聚凝胺法易引起假陰性，操作過程不易規范化；以PEG為介質的試驗中，抗人球蛋白試劑中的抗補體成分會導致假陽性反應；有些抗體(抗-K)在低離子溶液中與紅細胞結合量要比在正常鹽水中要少的多，所以在低離子溶液中進行試驗時會導致該抗體的漏檢；酶處理紅細胞，因為對某些血型抗原的破壞而出現假陰性反應，也可能因為蛋白酶對紅細胞膜多肽分子的消化，使其暴露出隱蔽抗原，進而與抗人球蛋白試劑中異種抗體，或血清反應液中的多凝集抗體作用出現假陽性反應。
[0004]90年代發展起來的微柱凝膠試驗(microcolumn gel-coombs test)和固相紅細胞吸附試驗(solid-phase red cell adherence test, SPRCA),同樣都用于不完全抗體檢測。其中微柱凝膠技術，正在取代應用多年的血凝試驗，應用在紅細胞血型血清學臨床常規檢驗工作中，其生命力在于克服了傳統試管法的繁瑣洗滌程序，使對不完全抗體的檢測和確定試驗同時進行，也省去了確認陰性結果是否正確的步驟，該試驗具有敏感性高、結果更易判斷又能較長時間保存、樣本用量少、能同時檢測多份標本等優點，但此方法的缺點是，由于樣本采集的不規范，特別是其中未完全去除纖維蛋白原的血清標本，會在凝膠中形成纖維蛋白從而阻礙紅細胞沉降而浮于膠中或膠表面形成假陽性。陳舊的紅細胞標本中的細胞碎片也會浮于膠中或膠面上呈假陽性。同時凝膠顆粒的活動性易受溫度影響，溫度低時，凝膠顆粒的活動性減少，紅細胞較難穿過凝膠，也易出現假陽性結果，此外凝膠卡中的原材料凝膠顆粒多為進口，受國外市場的壟斷，近年來價格越來越高，間接導致臨床檢測成本的提高，上述諸多不利因素限制了微柱凝膠試驗在臨床的進一步廣泛應用。SPRCA是在96孔反應板的底部包被抗原，反應液中血清抗體與之反應，應用抗人球蛋白包被的紅細胞作為指示細胞，顯示反應結果，指示細胞效期短有成為影響本方法臨床廣泛應用的關鍵因素。微柱凝膠抗人球蛋白試驗和固相紅細胞吸附實驗能夠成為臨床常規應用的實驗技術，但是仍不可能完全取代試管法Coombs test。目前，尚無任何一種方法能100%地測出所有血型抗體，有些抗體較為復雜，如唯酶抗體等，所以在遇到復雜標本時應用多種方法協同處理，以提高不完全抗體的檢出率，確保臨床用血安全。
[0005]在抗體檢測技術發展過程中，從凝集試驗到今天的各種免疫標記技術，如檢測顆粒性抗原的ELISA、免疫熒光、流式細胞法等，始終沒有脫離洗滌過程，反應過程中涉及2-3次反應程序，每個反應程序都要進行3次以上的洗滌過程，操作繁瑣費時，臨床應用時受到一定限制。

【發明內容】

[0006]本發明主要解決的技術問題是提供一種水性膠層析介質及用于檢測的方法，該方法可以將反應液中包括非特異性免疫球蛋白等可溶性蛋白分子與沉降到試管底部的細胞型抗原抗體復合物隔絕，從而能夠取代傳統的需要多次洗滌細胞型抗原抗體復合物，去除反應液中可溶性蛋白分子的繁瑣實驗程序，操作簡單，結果準確。
[0007]為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是:提供一種水性膠層析介質，所述水性膠層析介質的組成為聚蔗糖、明膠和水，其中所述聚蔗糖的濃度為5-100g/L，所述明膠的濃度為l-10g/L。
[0008]提供一種水性膠層析介質用于不完全抗體檢測的方法，包括步驟為:將待檢血液細胞或待檢血液細胞和血清的混合液加入到水性膠層析介質上，第一次離心分層，棄去包括水性膠層析介質的上層，再加入抗人球蛋白試劑，第二次離心后判讀凝集結果。
[0009]提供一種水性膠層析介質用于不完全抗體檢測的方法，包括步驟為:將抗人球蛋白試劑包被在試管底部或96空酶標板底部，在管中或者孔中加入水性膠層析介質，將待檢血液細胞或待檢血液細胞和血清的混合液加入到水性膠層析介質上，第一次離心分層，棄去包括水性膠層析介質的上層，第二次離心后判讀凝集結果。
[0010]在本發明一個較佳實施例中，所述第一次離心的轉速為300-800g，時間為3-5分鐘，第二次離心的轉速為100-300g，時間為1-3分鐘。
[0011]提供一種水性膠層析介質用于分離顆粒性抗原檢測抗體的方法，包括步驟為:將顆粒性抗原與血樣混合反應后，轉移到水性膠層析介質上，通過低速離心分層，棄去包括水性膠層析介質的上層，加入標記二抗，再次通過低速離心將水性膠層析介質層分離，檢測結
果O
[0012]在本發明一個較佳實施例中，所述顆粒性抗原為細菌、病毒或人工顆粒性抗原。
[0013]在本發明一個較佳實施例中，所述低速離心的轉速為300_1000g，時間為3-5分鐘。
[0014]本發明的有益效果是:本發明的水性膠層析分離血液細胞及其他顆粒性抗原的檢測方法，該方法可應用于紅細胞、血小板、白細胞等血液細胞的檢測中，也可用于免疫標記技術中其它顆粒性抗原與游離的可溶性蛋白的分離，如ELISA、免疫熒光、流式細胞法等，避免了免疫學方法操作過程中繁瑣的洗滌過程，極大地簡化了操作步驟，提高了檢測效率，能用于大量樣本檢測， 水性膠層析介質原材料價格便宜，生產技術要求低。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其它的附圖，其中:
圖1是本發明的水性膠層析介質用于不完全抗體檢測的方法一較佳實施例的結構示意圖。
【具體實施方式】
[0016]下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0017]所用的試劑與儀器:抗-D、抗-A、抗-B，羊抗人IgG、BSA、AP-AHG、PNPP，MGIA抗人球蛋白卡，2M NaOH、生理鹽水、水性膠層析介質，離心機，酶標儀，其中所述水性膠層析介質是將5g聚蔗糖和0.1g明膠溶于IOOmL的水中得到。
[0018]血樣:A、B、O、AB全血各3人份，O型RhD (+)和RhD㈠紅細胞各1份。
[0019]實施例一:
請參閱圖1，提供一種紅細胞-水性膠層析抗人球蛋白檢測不完全抗體的方法，包括步驟為:(I)紅細胞致敏:將全血O型RhD (+)和RhD (-)紅細胞用生理鹽水稀釋至體積百分比為5%，取用人血清稀釋的效價為64的抗-D，兩者等體積混合，37°C下孵育30min ；
(2)在2個試管中分別加ImL水性膠體，再分別加入IOOPL RhD (+)和ΙΟΟμ? RhD (-)紅細胞，轉速為3000rpm下離心lmin，棄去水性膠體，再加100μ? AHG，轉速為1000rpm下離心lmin，觀察凝集結果。在陰性結果試管中加入I滴致敏紅細胞,1000rpm離心lmin，由此驗證AHG的有效性。
[0020]同時用試管抗人球蛋白試驗做平行對照試驗，并比較兩種方法檢測結果的一致性。
[0021]紅細胞-水性膠層析抗人球蛋白試驗和試管抗人球蛋白試驗的檢測結果一致，RhD(+)紅細胞出現凝集，RhD(-)紅細胞沒有凝集現象出現，且兩種試驗方法凝集效果相當，說明本檢測方法是成立的，通過水性膠的分離，絕大部分非特異性蛋白被去除。
[0022]實施例二:
提供一種紅細胞-水性膠層析直接抗人球蛋白試驗:
將體積比為5%的O型紅細胞與用人血清稀釋的效價為64的抗-D等體積混合，37°C下孵育30min。在I個試管中加ImL水性膠體，再滴加ΙΟΟμ?實施例一得到的致敏紅細胞，轉速為3000rpm下離心lmin，棄去水性膠體，再滴加ΙΟΟμ? AHG后混勻，轉速為1000rp下離心lmin,觀察凝集現象。
[0023]提供一種紅細胞-水性膠層析間接抗人球蛋白試驗:
在I個試管中加ImL水性膠體，體積比為5%的O型紅細胞與用人血清稀釋的效價64的抗-D等體積混 合，取IOOPL混合液置于水性膠體上層，37°C下孵育30min后轉速為3000rpm離心lmin,棄去水性膠體,滴加IOOPL AHG后混勻,轉速為1000rpm離心lmin,觀察凝集現象。
[0024]IAT和DAT對應的試管都出現了凝集，對照沒有凝集，說明血漿中的非特異性蛋白被分離并去除干凈，即使殘留也不足以中和AHG。
[0025]實施例三:
提供一種抗人球蛋白法、MGIA法和紅細胞-水性膠層析抗人球蛋白法檢測不完全抗體敏感性比較:
紅細胞致敏:用質量體積百分比1% (w/v) BSA鹽水溶液將抗-D倍比稀釋至1:512，O型紅細胞用生理鹽水洗滌4次后稀釋至體積比為6%，兩者等體積混合，37°C下孵育30min，中間混勻兩次。
[0026]試管抗人球蛋白法:將所有致敏的紅細胞用生理鹽水洗滌4次，配成體積比為3%備用，標記好試管，每管滴加50μ?紅細胞，再分別滴加IOOPL效價64的AHG，轉速為1000rpm下離心lmin，觀察不同稀釋度的凝集強度。
[0027]MGIA法:取商品化的MGIA抗人球蛋白卡，做好標記，每管滴加50μ?體積比為3%的致敏未洗紅細胞，轉速為900rpm離心2min,轉速為1500rpm離心5min,觀察不同抗-D稀
釋度的凝集強度。
[0028]紅細胞-水性膠層析抗人球蛋白法:標記好試管，每管加ImL水性膠體，靜置備用，每管滴加50μ?體積比為3%的致敏未洗紅細胞，轉速為3000rpm離心lmin，棄去水性膠體，再分別滴加IOOPL效價64的AHG，轉速為1000rp離心lmin，觀察不同抗-D稀釋度的凝集強度。
[0029]比較結果:抗人球蛋白法與紅細胞-水性膠層析抗人球蛋白法敏感性一致，低于MGIA法，操作流程要比抗人球蛋白法簡單很多。下表為三種方法檢測不完全抗體的敏感性的測評:
【權利要求】
1.一種水性膠層析介質，其特征在于，所述水性膠層析介質的組成為聚蔗糖、明膠和水，其中所述聚蔗糖的濃度為5-100g/L，所述明膠的濃度為l-10g/L。
2.根據權利要求1所述的水性膠層析介質用于不完全抗體檢測的方法，其特征在于，包括步驟為:將待檢血液細胞或待檢血液細胞和血清的混合液加入到水性膠層析介質上，第一次離心分層，棄去包括水性膠層析介質的上層，再加入抗人球蛋白試劑，第二次離心后判讀凝集結果。
3.根據權利要求1所述的水性膠層析介質用于不完全抗體檢測的方法，其特征在于，包括步驟為:將抗人球蛋白試劑包被在試管底部或96空酶標板底部，在管中或者孔中加入水性膠層析介質,將待檢血液細胞或待檢血液細胞和血清的混合液加入到水性膠層析介質上，第一次離心分層，棄去包括水性膠層析介質的上層，第二次離心后判讀凝集結果。
4.根據權利要求2或3任一所述的水性膠層析介質用于不完全抗體檢測的方法，其特征在于，所述第一次離心的轉速為300-800g，時間為3-5分鐘，第二次離心的轉速為100-300g,時間為1-3分鐘。
5.根據權利要求1所述的水性膠層析介質用于分離顆粒性抗原檢測抗體的方法，其特征在于，包括步驟為:將顆粒性抗原與血樣混合反應后，轉移到水性膠層析介質上，通過低速離心分層，棄去包括水性膠層析介質的上層，加入標記二抗，再次通過低速離心將水性膠層析介質層分離，檢測結果。
6.根據權利要求5所述的水性膠層析介質用于分離顆粒性抗原檢測抗體的方法，其特征在于，所述顆粒性抗原為細菌、病毒或人工顆粒性抗原。
7.根據權利要求5所述的水性膠層析介質用于分離顆粒性抗原檢測抗體的方法，其特征在于，所述低速離心的轉速為300-1000g，時間為3-5分鐘。
【文檔編號】B01J20/281GK103706340SQ201310710675
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】李勇, 王紅梅, 段生寶, 田晶晶, 丁少華, 陳曄洲, 李 東 申請人:中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所