一種稀有細胞多級分選微流控器件的制作方法
【專利摘要】本發明提供的一種稀有細胞多級分選微流控器件，包括鍵合封裝的流道結構和電極基底；所述流道結構包括螺旋流道、二級流道、下分支流道、上分岔流道、下分岔流道，所述螺旋流道一端為樣品入口、另一端通過縮擴結構分別與二級流道、下分支流道連接，所述二級流道分別與上分岔流道和下分岔流道連接，所述上分岔流道和下分支流道與血細胞出口連接，所述下分岔流道與稀有細胞出口連接；所述電極基底包括基底本體和兩組電極組；所述電極組位于二級流道底部。該器件成本低、操作簡單、易集成微型化，能夠實現對稀有癌細胞的高通量、高純度分選。
【專利說明】一種稀有細胞多級分選微流控器件
【技術領域】
[0001]本發明屬于分析檢測設備領域，涉及一種稀有細胞粒子多級分選微流控器件，特別涉及一種整合微流體慣性效應及介電泳技術的高通量、高純度稀有細胞粒子多級分選微流控器件。
【背景技術】
[0002]細胞的精確檢測在疾病的預防、診斷、治療及細胞生物學研究等生物醫學應用方面具有十分重要的意義。但通常在臨床上，研究的對象是一個非齊性總體，其中包含了大量的細胞信息，使得檢測其中的稀有細胞將變得十分困難；例如，檢測進入循環血液中的稀有癌細胞，其對人體正常血細胞的個數比例約為1:1O9,即在ImL血液中僅有數個稀有癌細胞，因此檢測非常困難。
[0003]微流控技術作為一種高效流體或粒子操控的新方法，可實現樣品制備、反應、聚焦、分選及檢測等功能，是生物醫學、分析化學等多學科領域的重要研究內容。目前，采用微流控的細胞分選一般基于單一技術，按其機理可簡要概括為以下幾類:第一類是基于復雜微結構的操控技術；第二類是基于流體的被動方法，如采用慣性流、擠壓流、水力分選、場流分離等操控技術；第三類是采用重力及沉降方法進行分選的操控技術；第四類是采用仿生物學方法的操控技術；第五類是依據水液兩相性的分選技術；第六類是借助磁、聲、光、電等外場的分選技術。上述各方法雖均已取得了一定的研究成效，但應用于稀有細胞分選仍存在各自的不足:如薄膜分選、擠壓流分選、水力分選、場流分選、重力及沉降分選、水液兩相性分選、磁分選、光電分選都存在操作通量過低的問題，從而限制其進一步商業應用；而柱狀陣列分選、慣性流分選、水力分選、水液兩相性分選等方法存在分選純度不高的問題。此外，上述分選方法還存在一些其他的缺陷，如薄膜分選、聲分選易對細胞活性造成損傷；擠壓流分選只在兩種粒子尺寸相差較大的時候才能取得較好的分選效果；磁、聲、光、電分選由于引入了耗能外場而致使設備昂貴、操作復雜。
[0004]為克服單級分選的不足，近年來出現了一些多級分選的研究，這些研究的思路是將一級操作作為二級分選的預處理，以優化二級分選的效果；或是采用二級精分選，對一級粗分選的結果進行進一步提純。然而，現有多級分選研究仍是基于單一的技術，僅僅是將單一分選技術的簡單組合，增加了操作工序及成本，很難同時滿足對稀有細胞分選的高通量、高純度的要求。
【發明內容】
[0005]發明目的:為了克服上述缺陷，本發明的目的是提供一種整合微流體慣性效應及介電泳技術的高通量、高純度稀有細胞粒子多級分選微流控器件，實現稀有細胞/粒子的高通量、高純度分選。
[0006]技術方案:本發明提供的一種稀有細胞多級分選微流控器件，包括鍵合封裝的流道結構和電極基底；所述流道結構包括螺旋流道、二級流道、下分支流道、上分岔流道、下分岔流道，所述螺旋流道一端為樣品入口、另一端通過縮擴結構分別與二級流道、下分支流道連接，所述二級流道分別與上分岔流道和下分岔流道連接，所述上分岔流道和下分支流道與血細胞出口連接，所述下分岔流道與稀有細胞出口連接；所述電極基底包括基底本體和兩組電極組；所述電極組位于二級流道底部。
[0007]作為改進，所述電極組為斜插齒形，呈鏡像布置；通過設置兩組鏡像布置的斜插齒形電極組，前一電極組施加低頻負介電泳信號，將所有細胞偏轉至靠近流道壁的一側；后一組施加高頻負介電泳信號，將稀有細胞粒子沿著電極方向偏轉，而血細胞仍沿著主流動方向移動，從而使稀有細胞粒子和血細胞有效分離。
[0008]作為另一種改進，所述螺旋流道的垂直截面為矩形或外側高、內側低的梯形；當螺旋流道的垂直截面為矩形時，其深寬比在I以下，優選0.1-1 ;螺旋流道截面為低深寬比矩形，可以使較大的稀有細胞粒子與較小的血細胞粒子平衡位置相距更遠，以利于分離。
[0009]作為另一種改進，所述縮擴結構與螺旋流道連接端垂直截面尺寸比與二級流道、下分支流道連接端垂直截面尺寸小。所述縮擴結構上游縮聚處與螺旋流道聯通，下游突擴處形成一較短的直流道，并分成兩支，分別將稀有細胞粒子流導入上分支流道即介電泳流道，將血細胞粒子流導入至下分支流道。
[0010]作為另一種改進，所述二級流道通過上分支流道與縮擴結構連接，上分支流道的垂直截面尺寸比下分支流道垂直截面尺寸小；下分支流道即血細胞粒子流分支寬度大于上分支流道即稀有細胞粒子流分支寬度，從而減小上分支流道分選所需處理的流體體積，進而達到降低流速的目的。
[0011]作為另一種改進，所述二級流道的垂直截面為矩形，其深寬比為0.05-0.01 ;上分支流道即介電泳流道截面為超低深寬比矩形，以進一步降低流道中的流速，保證介電泳力在粒子上具有足夠的響應時間。
[0012]作為另一種改進，所述流道結構的材質選自聚二甲基硅氧烷、環氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、玻璃、硅和石英中的一種。
[0013]作為另一種改進，所述電極基底由ITO玻璃刻蝕而成，或通過在玻璃或硅材料上濺射并圖形化出金屬電極的方法制成。
[0014]有益效果:本發明提供的稀有細胞多級分選微流控器件成本低、操作簡單、易集成微型化，通過集成慣性分選及介電泳分選兩級流道，充分利用慣性分選的高通量優勢及介電泳分選的高精度優勢，克服了現有分選芯片只基于某種單一技術，難以同時實現高通量與高純度分選的不足，兩種方式組合互相配合協同，實現對稀有癌細胞的高通量、高純度分選。
[0015]具體而言，該器件的一級流道即螺旋流道充分利用慣性技術的高通量優勢，通過彎流道中的Dean流和慣性遷移，將稀有癌細胞粒子和血細胞粒子聚焦至不同的平衡位置，并通過縮擴結構分別導入二級流道和血細胞出口，且分選后稀有癌細胞粒子流的樣品體積遠小于血細胞粒子流的樣品體積。通過一級流道的粗分選，可以在高通量的條件下排除大部分血細胞，只使小部分含有稀有癌細胞及殘余血細胞的樣品進入二級流道，從而減輕介電泳分選的通量壓力。二級流道通過鋪設在流道底部的兩組斜插齒電極，對進入其中的稀有癌細胞及殘余血細胞施加負介電泳力，其中前一組電極施加低頻信號，使稀有癌細胞及殘余血細胞均沿電極方向偏轉，在流道壁一側處排成一條線，以優化分選效果；后一組電極施加高頻信號，只使稀有癌細胞沿電極方向偏轉而殘余血細胞仍沿原方向流動，從而實現兩者的精確分離。介電泳分選作為一種主動分選技術，具有精度高的優勢。
[0016]該稀有細胞多級分選微流控器件可廣泛用于臨床診斷、生物學研究、生化分析等領域，尤其適用于體液中稀有細胞的早期檢測、細胞學水平上的化療藥物敏感性測試等方面。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1是本發明稀有細胞多級分選微流控器件的結構示意圖。
[0018]圖2是本發明稀有細胞多級分選微流控器件的爆炸圖。
[0019]圖3是流道結構的結構示意圖。
[0020]圖4是電極基底的結構示意圖。
[0021]圖5是螺旋流道慣性分選的原理圖。
[0022]圖6是突擴結構處細胞粒子分選的原理圖。
[0023]圖7是二級流道中電極組介電泳分選的原理圖。
【具體實施方式】
[0024]下面對本發明專利的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明專利技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明專利的保護范圍不限于下述的實施例。
[0025]本實施例中流道結構I的材質為聚二甲基硅氧烷(PDMS)，也可選用玻璃、環氧樹月旨、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、硅和石英等光學性能良好的材料制作。不同材料對應的芯片加工工藝、鍵合技術可能存在差異，可根據加工條件及應用需求來選擇相應材料。本實施例中的流道結構I借助軟光刻技術制作，澆鑄所用陽模采用SU-8無掩模光刻加工，該技術具有柔性高、制作成本低及加工周期短等優點。也可借助基于鉻掩模/打印膠片掩模的光刻技術、硅的濕法/深反應離子刻蝕、超精密機加工、金屬電鍍及感光電路板的刻蝕加工等技術來制作陽模。
[0026]本實施例中的電極基底2采用無掩膜光刻加工技術，對ITO玻璃進行圖形化并化學刻蝕而成，也可通過在玻璃或硅材料基底上沉積金屬電極并光刻圖形化來制作。上述各種加工方法中，不同技術所能達到的加工精度和橫截面形狀等特性也不相同，應根據分選對象及實際設備條件進行選擇。
[0027]本實施例所述的器件用于血液中稀有癌細胞的高通量、高純度分選，也可用于其它體液(如尿液、唾液、胸水、腹水、痰等)中稀有細胞的分選或提純，亦可拓展應用于兩種大小不同、導電性不同或介電屬性不同的其他粒子分選。
[0028]稀有細胞多級分選微流控器件，見圖1和2，包括流道結構I和電極基底2，通過將流道結構I與電極基底2鍵合封裝而成。
[0029]流道結構1，見圖2，包括螺旋流道11、二級流道12、下分支流道13、上分岔流道14、下分岔流道15 ;螺旋流道11近端與樣品入口 16相連，螺旋流道11遠端延伸成平直流道與縮擴結構17近端相連，縮擴結構17遠端分成兩支，分為二級流道12和下分支流道13，下分支流道13直接與血細胞出口 18相連；二級流道12遠端同樣分為上分岔流道14及下分岔流道15兩支，其中上分岔流道14與血細胞出口 18相連，下分岔流道15與稀有細胞出口 19相連。
[0030]為使細胞粒子能夠在螺旋流道11內實現聚焦，螺旋流道11的高度h應滿足
0.07〈ap/h〈0.3，其中ap為粒子直徑；同時，螺旋流道11的垂直截面形狀應設計成低深寬比矩形(深寬比AR=h/w〈l)，以便對經過螺旋流道11的粒子沿流道寬度方向進行分選，盡量減少粒子間相互作用的影響；在其它實施例中，流道截面也可以設計成外側高、內側低的梯形。此外，螺旋流道11的流道間間距應大于流道寬度，以避免流道壁過薄而產生變形。縮擴結構17近端兩側流道壁互成120°的角度，而后形成一較寬的平直流道，也就是說，縮擴結構17與螺旋流道11連接端垂直截面尺寸比與二級流道12、下分支流道13連接端垂直截面尺寸小。二級流道12通過上分支流道10與縮擴結構17連接，上分支流道10的垂直截面尺寸比下分支流道13垂直截面尺寸小，以使只有少量的稀有細胞樣品流進入二級流道12。二級流道12的的垂直截面為超低深寬比矩形(深寬比AR=h/w為0.01-0.05)，在保證PDMS微結構不坍塌的條件下應使流道盡量寬，以充分降低二級流道12中的樣品流速，滿足介電泳分選的要求，優化二級分選效果；二級流道12近端與上分支流道10相連處兩側流道壁亦呈對稱的120°角，以逐漸放寬流道至所需的寬度。
[0031]電極基底2，見圖4，包括基底本體21和刻蝕形成的兩組電極組22 ;兩組電極組22均位于二級流道12底部。其中，第一電極組23和第二電極組24呈鏡像關系，其中第一電極組23包含第一電極25和第二電極26,第二電極組24包含第三電極27和第四電極28。第一電極25由三條上端相連的等寬平行電極構成，第二電極26由三條下端相連的等寬平行電極構成，且第一電極25和第二電極26呈斜插齒狀交叉排列，排列后構成第一電極25和第二電極26的六條平行電極等寬、等間隙的均勻排列，電極方向與二級流道12中的樣品主流動方向呈15°角。同樣，第三電極27由三條上端相連的等寬平行電極構成，第四電極28由三條下端相連的等寬平行電極構成，第三電極27和第四電極28呈斜插齒狀交叉排列，排列后構成第三電極27和第四電極28的六條平行電極等寬、等間隙的均勻排列，電極方向與二級流道12中的樣品主流動方向呈165°角。在其它實施例中，第一電極25、第二電極26、第三電極27和第四電極28包含的平行電極條數以及平行電極與主流動方向的角度均可按需求重新設計。電極組22的整體高度大于二級流道12的寬度、整體寬度小于二級流道12的長度。此外，第一電極25、第二電極26、第三電極27和第四電極28分別與不同的引出電極相連，采用信號發生器，可通過引出電極對第一電極組23施加較低頻負介電泳信號、對第二電極組24施加較高頻負介電泳信號。
[0032]該器件的封裝過程如下:將流道結構I及電極基底2微結構表面清洗干凈后，本實施例利用紫外/臭氧對流道結構I及電極基底2表面進行表面改性處理，實現流道結構I及電極基底2的不可逆鍵合。其它實施例中也可以用氧等離子體處理等手段進行表面改性來實現流道結構I和電極基底2的不可逆鍵合。鍵合后，第一電極組23和第二電極組24將鋪設在二級流道12的底端，構成二級介電泳分選芯片。此外，在其他實施例中，亦可在流道結構I和電極基底2的邊緣對稱分布一些對準標記，對準標記可通過軟光刻技術/金屬薄膜圖形化工藝與流道結構I和電極基底2的微結構一起加工，借助體視顯微鏡及的對準標記，實現流道結構I與電極基底2在位置上的精確鍵合。
[0033]待整體器件封裝完畢后，在樣品入口 16中插入微管連接注射泵等外部流體驅動設備，用于特定流速樣品的引入，在血細胞出口 18及稀有細胞出口 19處插入微管用于分選后樣品液的收集和導出。
[0034]下面以血液中稀有癌細胞的分選為例闡述該多級分選器件的工作步驟和原理。
[0035]螺旋流道11即一級慣性流道的分選原理，見圖5，以特定流速從樣品入口 16往流道內注入粒子懸浮液后，螺旋流道11入口部分隨機分布有紅細胞，白細胞及稀有癌細胞，其中紅細胞直徑約6-9 μ m,白細胞直徑約6-15 μ m,而稀有癌細胞種類不同，大小不同，但一般都比血細胞尺寸大很多，本實施例中以人體乳腺癌細胞MCF-7為例，取其直徑為16-24 μ mo在直流道的情況下，由于泊肅葉流(Poiseuille flow)的拋物線形速度剖面,其中的粒子將受到指向壁面的剪切誘導慣性升力Fu的作用朝壁面運動，而當粒子靠近壁面時，因粒子自轉而旋轉產生的對稱尾跡被壁面影響而產生一個指向流道中心線的壁面誘導慣性升力F?，Fls與Fm共同構成了慣性升力Fy致使粒子發生特定慣性遷移。而在彎流道中除了慣性遷移，由于流道中心線附近流體較壁面附近流體具有更高的流速，導致流經流道的流體離心力和徑向壓力梯度的不平衡，致使流道中心線處的流體向外流動。封閉流道為滿足質量守恒，靠近外壁面112處的流體將沿著流道上下底面回流，于是在垂直主流動方向上產生兩個旋轉方向相反的潤，稱為Dean流或二次流，由于粒子受到Dean拽力Fdd的作用，Dean流大小與粒子的直徑呈正比。粒子在慣性升力F1及Dean拽力Fdd的共同作用下遷移至靠近流道內壁面111的平衡位置，圖5中，粒子a所在處即為穩定的平衡位置；粒子d雖也受力平衡，但不穩定，很小的擾動就會使其離開該位置；其余各位置b、C、e、f、g處粒子受力均不平衡。
[0036]突擴結構7處細胞粒子分選的原理，見圖6，在螺旋流道11的出口處，稀有癌細胞5因較紅細胞3、白細胞4尺寸更大，受到更大的Dean拽力Fdd作用，因而其平衡位置更靠近內壁面111，但由于細胞粒子的柔性及尺寸的分散性，仍有少量參與血細胞分散在稀有癌細胞5粒子流中。當細胞粒子運動至突擴結構17中時，因壁面誘導慣性升力Fm的變化，所有細胞將向靠近壁面的方向移動至新的平衡位置，且此時稀有癌細胞5的平衡位置與血細胞平衡位置間間距變大，利于分選。在突擴結構17遠端，稀有癌細胞5及少量的殘余紅細胞
3、白細胞4進入上分岔流道，導 入至二級流道12中；而絕大部分的紅細胞3、白細胞4進入下分支流道13，被直接導入至血細胞出口 18。另外，上分支流道10的寬度遠小于下分支流道13寬度的設計，使只有小部分樣品進入二級流道12中，從而減小二級流道12的通量壓力。
[0037]二級流道12中電極組介電泳分選的原理，見圖7，二級流道12與鋪設在其底部的第一電極組23和第二電極組24共同構成了二級介電泳分選芯片。通過對第一電極組23和第二電極組24施加特定頻率的交流電信號，將在二級流道12中形成非均勻電場，而流經二級流道12的細胞將在非均勻電場作用下誘導產生非對稱偶極矩，從而產生介電泳力Fdep。介電泳力Fdep的指向及大小與電場強度、電場頻率、電場梯度、粒子及周圍介質的介電常數和導電性、粒子的大小等有關，本實施例中，對通過二級流道12的細胞粒子施加負介電泳作用，使其向電場強度弱，即遠離電極的方向運動。本實施例中由于二級流道12截面為超低深寬比矩形，有較大的橫截面積，且進入二級流道12中的樣品體積較小，致使樣品在二級流道12中流速極緩，從而細胞粒子有足夠的時間響應非均勻電場的驅動。對第一電極組23和第二電極組24施加不同頻率的交流電信號，二級流道12中的細胞受到流體拖拽力(Fd)和負向介電泳力(nFDEP)的共同作用，且血細胞和稀有癌細胞5因介電屬性及大小不同而受到不同的介電泳作用力，表現出不同的運動特性。在第一電極組23處施加較低頻交流電信號，紅細胞3、白細胞4、稀有癌細胞5將均受到負介電泳力nFDEP1和流體拖拽力Fdi的作用，并在兩者的合力F1的作用下沿著電極的方向移動，并最終遷移至二級流道12的上側壁面處，近似地排成一條線，以增加第二電極組24的分選精度。在第二電極組24處施加較高頻交流電信號，只有稀有癌細胞5受到負介電泳力nFDEP2的作用，并在nFDEP2與流體拖拽力Fd2的合力F2作用下沿電極方向移動，最終遷移至二級流道12的下壁面處，并流入下分岔流道15，最終從稀有細胞出口 19導出；而紅細胞3、白細胞4將只在流體拖拽力Fd2的作用下仍沿主流動方向移動，并流入上分岔流道14，最終從血細胞出口 18導出，實現紅細胞3、白細胞4與稀有癌細胞5的精確分選。
[0038]本實施例中提出的稀有細胞多級分選器件，集成慣性技術與介電泳技術，可同時滿足稀有細胞分選高通量、高精度的分選要求，同時具有成本低、操作簡單等優點，可廣泛用于臨床診斷、生物學研究、生化分析等領域，尤其適用于體液中稀有細胞的早期檢測、細胞學水平的化療藥物敏感性測試等方面。
【權利要求】
1.一種稀有細胞多級分選微流控器件，其特征在于:包括鍵合封裝的流道結構(I)和電極基底(2);所述流道結構(I)包括螺旋流道(11)、二級流道(12)、下分支流道(13)、上分岔流道(14)、下分岔流道(15)，所述螺旋流道(11) 一端為樣品入口(16)、另一端通過縮擴結構(17)分別與二級流道(12)、下分支流道(13)連接，所述二級流道(12)分別與上分岔流道(14)和下分岔流道(15)連接，所述上分岔流道(14)和下分支流道(15)與血細胞出口(18 )連接，所述下分岔流道(15 )與稀有細胞出口( 19 )連接；所述電極基底(2 )包括基底本體(21)和兩組電極組(22);所述電極組(22)位于二級流道(12)底部。
2.根據權利要求1所述的一種稀有細胞多級分選微流控器件，其特征在于:所述電極組(22)為斜插齒形,呈鏡像布置。
3.根據權利要求1所述的一種稀有細胞多級分選微流控器件，其特征在于:所述螺旋流道(11)的垂直截面為矩形或外側高、內側低的梯形；當螺旋流道(11)的垂直截面為矩形時，其深寬比在I以下。
4.根據權利要求1所述的一種稀有細胞多級分選微流控器件，其特征在于:所述縮擴結構(17)與螺旋流道(11)連接端垂直截面尺寸比與二級流道(12)、下分支流道(13)連接端垂直截面尺寸小。
5.根據權利要求1所述的一種稀有細胞多級分選微流控器件，其特征在于:所述二級流道(12)通過上分支流道(10)與縮擴結構(17)連接，上分支流道(10)的垂直截面尺寸比下分支流道(13)垂直截面尺寸小。
6.根據權利要求1所述的一種稀有細胞多級分選微流控器件，其特征在于:所述二級流道(12)的垂直截面為矩形，其深寬比為0.05-0.01。
7.根據權利要求1所述的一種稀有細胞多級分選微流控器件，其特征在于:所述流道結構(I)的材質選自聚二甲基硅氧烷、環氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、玻璃、硅和石英中的一種。
8.根據權利要求1所述的一種稀有細胞多級分選微流控器件，其特征在于:所述電極基底(2)由ITO玻璃刻蝕而成，或通過在玻璃或硅材料上濺射并圖形化出金屬電極的方法制成。
【文檔編號】B01L3/00GK103464229SQ201310410606
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月10日 優先權日:2013年9月10日
【發明者】易紅, 倪中華, 黃笛, 項楠, 陳科, 唐文來 申請人:東南大學