通過使用不混溶中間流體進行分子反應的方法
【專利摘要】本發明涉及用于在裝置中進行分子反應的方法，包括如下步驟:(a)將一或多種試劑溶液和不混溶中間流體引入所述裝置中，其中所述裝置包含其上固定有化學或生化可識別實體的基材；(b)在所述固定的化學或生化可識別實體與所述試劑溶液之間進行分子反應；或者在存在所述試劑溶液時在所述固定的化學或生化可識別實體上進行分子反應；(c)用所述不混溶中間流體替換存在于所述基材上的試劑溶液；(d)分離所述不混溶中間流體和所述試劑溶液；和重利用所述試劑溶液和/或不混溶中間流體進行一或多次步驟(a)至(e)的重復。本發明還涉及用于進行分子反應的裝置，包含反應區，儲存器和液體連接件，以及其中所述不混溶中間流體和所述試劑溶液可由重力分離來分離的收集和再生區、或者其中將不混溶中間流體和試劑溶液分離的重導向和分配模塊。本發明還涉及不混溶中間流體用于替換微觀流體裝置的反應區中存在的試劑溶液的用途，以及相應的裝置用于進行測序反應或核酸合成反應的用途。
【專利說明】通過使用不混溶中間流體進行分子反應的方法
發明領域
[0001]本發明涉及用于在裝置中進行分子反應的方法，包括如下步驟:(a)將一或多種試劑溶液和不混溶中間流體引入所述裝置中，其中所述裝置包含其上固定有化學或生化可識別實體的基材；(b)在所述固定的化學或生化可識別實體與所述試劑溶液之間進行分子反應；或者在存在所述試劑溶液時在所述固定的化學或生化可識別實體上進行分子反應；(C)用所述不混溶中間流體替換存在于所述基材上的試劑溶液；(d)分離所述不混溶中間流體和所述試劑溶液；和重利用所述試劑溶液和/或不混溶中間流體進行一或多次步驟(a)至(e)的重復。本發明還涉及用于進行分子反應的裝置，包含反應區，儲存器和液體連接件，以及其中所述不混溶中間流體和所述試劑溶液可由重力分離來分離的收集和再生區、或者其中將不混溶中間流體和試劑溶液分離的重導向(redirection)和分配模塊。本發明還涉及不混溶中間流體用于替換微觀流體裝置的反應區中存在的試劑溶液的用途，以及相應的裝置用于進行測序反應或核酸合成反應的用途。
[0002]發明背景
[0003]現代分子反應裝置往往是基于離散的液體小滴或單位大小的液體包(packet)的微操控。這些包可以用一組基本指令以離散的方式進行轉移、儲存、混合、反應、和/或分析。為建立所述液體的包裝特性并防止相鄰小滴的聚結，可使用不混溶載體液(Chen等，2007，Langmuir, 23, 2255-2260)。此類不混溶載體液通常是穩定的具有高沸點、高密度、高粘度和顯著降低的水溶性的基于碳氟化合物的流體。根據Chen等，2007，包括FC-3283和FC-40在內的基于碳氟化合物的流體可用作間隔液以用于在分離的試劑栓(plug)中的蛋白結晶反應。然而，此方法的施行僅被顯示用于少量的情況，包括微粒的合成(Xu等，2005, Angew.Chem.1nt.Ed., 44, 724-728)或雙重乳化(double emulsion) (Utada 等，2005，Science,308，537-541)。
[0004]在其它分子【技術領域】，例如DNA測序領域，目前的方法是基于在大陣列中以相對短的讀取長度進行的高度并行的分子反應。這是因為向DNA鏈添加堿基需要大約少于I小時每堿基對。因而，添加大約100個堿基對需要大約3.5至4天的運行時間，構成了目前測序機器中通常I周測序運行時間的大部分。測序速度低的一個原因是并入核苷酸時受限的反應速率，其由于成本原因而受限于酶或者反應混合物中其它反應物的濃度。更重要的是，由于在每步并入核苷酸之后需要洗滌整個表面，通常會浪費所有的試劑。因而，總的試劑消耗主要與讀取長度成比例并且構成了主要的成本因素。這繼而導致傾向于盡可能地降低試劑濃度而具有反應時間較長的缺點。
[0005]因而需要新的方法學，其使得能在裝置中進行分子反應而不浪費試劑溶液，并且同時有助于總成本的降低和反應速率的提高。
[0006]發明概述
[0007]本發明解決了此種需求并提供了手段和方法，其使得能以降低的總成本和潛在提高的速率來進行分子反應。具體而言，該目標是通過提供試劑溶液的重利用而實現的，更具體地是通過在裝置中進行分子反應的方法來實現的，所述方法包括如下步驟:[0008](a)將一或多種試劑溶液和不混溶中間流體引入所述裝置中，其中所述裝置包含其上固定有化學或生化可識別實體的基材；
[0009](b)在所述固定的化學或生化可識別實體與所述試劑溶液之間進行分子反應；或者在存在所述試劑溶液時在所述固定的化學或生化可識別實體上進行分子反應；
[0010](c)用所述不混溶中間流體替換存在于所述基材上的試劑溶液；
[0011](d)分離所述不混溶中間流體和所述試劑溶液，優選在收集和再生區進行；和
[0012](e)重利用所述試劑溶液和/或不混溶中間流體進行一或多次步驟(a)至(e)的重復。
[0013]此方法提供了若干優勢:利用不混溶中間流體使得能防止分子反應中通常使用的試劑的污染和/或稀釋，并從而為有效重利用這些試劑鋪平了道路。另外，由于重利用所述試劑的可能性，可以提高反應物的濃度，特別是限速化合物如酶或標記的核苷酸的濃度。這繼而可以在某些情形中使反應以數量級加速，且由于重復循環反應而仍受益于降低的總試劑成本。在測序反應的范圍，這意味著測序反應運行地更便宜和更快并使得整個測序過程(包括樣品制備和生物信息學分析)能在一天內完成。類似的改善在其它分子反應情形中也是可能的，例如在核酸或蛋白合成方法中。
[0014]在本發明另外的優選實施方案中，上文所述的方法另外包括用洗滌緩沖液洗滌所述基材的步驟，其中通過所述不混溶中間流體使所述洗滌緩沖液與所述試劑溶液分開。
[0015]在另一個優選實施方案中，上文所述的方法另外包括測量所述分子反應的狀態或結果的步驟。在特別優選的實施方案中，可以通過光學和/或電子手段進行所述測量。
[0016]在本發明另一個優選的實施方案中，上文所述方法的所述替換步驟(C)是通過氣動流體驅動(pneumatic fluid driving)、螺動傳動(peristaltic actuation)、活塞和傳動膜驅動、或應用定向真空(vectored vacuum)來進行的。
[0017]在本發明另一個優選的實施方案中，上文所述方法的所述分離步驟(d)是通過用重力分離將所述試劑溶液與所述不混溶中間流體分離來進行的。
[0018]在另一方面，本發明涉及用于進行分子反應的裝置，包括:
[0019](a)反應區，包含其上固定有化學或生化可識別實體的基材；
[0020](b)儲存器和液體連接件，其使得試劑溶液、不混溶中間流體以及任選存在的洗滌緩沖液能通過所述反應區，其中所述不混溶中間流體能夠從所述反應區替換所述試劑溶液；和
[0021](C)收集和再生區，其中所述不混溶中間流體和所述試劑溶液可由重力分離來分離，使得能通過將所分離的液體引導回所述反應區而再利用所述不混溶中間流體和所述試劑溶液。在一特別優選的實施方案中，所述收集和再生區包含一個與反應區連接的入口，且在一進一步優選的實施方案中，額外地包含兩個分別與試劑溶液的儲存器和不混溶中間流體的儲存器連接的出口。
[0022]在另一方面，本發明涉及用于進行分子反應的裝置，包括:
[0023](a)反應區，包含其上固定有化學或生化可識別實體的基材；
[0024](b)儲存器和液體連接件，其使得試劑溶液、不混溶中間流體以及任選存在的洗滌緩沖液能通過所述反應區，其中所述不混溶中間流體能夠從所述反應區替換所述試劑溶液；和[0025](c)重導向和分配模塊，其中檢測從所述不混溶中間流體至所述試劑溶液的轉換并分離所述流體和溶液，使得能通過將所分離的液體引導回所述反應區而再利用所述不混溶中間流體和所述試劑溶液。在一特別優選的實施方案中，所述重導向和分配模塊任選包含一個與反應區連接的入口，且在一進一步優選的實施方案中，額外地包含兩個分別與試劑溶液的儲存器和不混溶中間流體的儲存器連接的出口。
[0026]在本發明優選的實施方案中，上文所述的裝置是微觀流體裝置。在特別優選的實施方案中，所述裝置是集成微觀流體盒(integrated microfluidic cartridge)。
[0027]在另外的優選實施方案中，上文所述的分子反應是測序反應或者核酸合成反應。
[0028]在另一方面，本發明涉及不混溶中間流體的用途，其用于從微觀流體裝置的反應區基材替換所述反應區中存在的試劑溶液，其中所述反應區包含具有化學或生化可識別實體的基材，并用于使得所述化學或生化可識別單元活化或具有反應性((re_)active)。
[0029]在本發明優選的實施方案中，所述化學或生化可識別實體是核酸、肽、多肽、碳水化合物、其修飾的形式，核酸、肽、多肽、碳水化合物、其修飾的形式的陣列，或者其任意組
入
口 ο
[0030]在本發明另一個實施方案中，上文所述的不混溶中間流體包含或由(全)氟化烴和/或(全)氟化硅酮(silicone)組成。在特別優選的實施方案中，所述不混溶中間流體包含或由(全)氟化飽和烴組成。
[0031]在本發明另外的優選實施方案中，上文所述不混溶中間流體具有所述不混溶中間流體具有低于大約0.1Pa.S的粘度，高于大約1100kg/l的密度，高于大約50°C的沸點和低于大約1%的水溶性。
[0032]在本發明另外的特別優選的實施方案中，上文所述的不混溶中間流體是Fluorinert Electronic Liquid FC_40o
[0033]在另一方面，本發明涉及上文定義的裝置用于進行測序反應或用于進行核酸合成反應的用途。
[0034]附圖簡述
[0035]圖1顯示實施本發明方法的流控方案的側視圖，其中1=洗滌緩沖液(WB)儲存器，2=試劑溶液(RS)和不混溶中間流體(IF)儲存器，3=反應室，4=試劑溶液(RS)和不混溶中間流體(IF)收集和再生室，5=廢物室以及X=閥。
[0036]圖2顯示實施本發明方法的流控方案的俯視圖，其中1=洗滌緩沖液(WB)儲存器，2=試劑溶液(RS)和不混溶中間流體(IF)儲存器，3=反應室，4=試劑溶液(RS)和不混溶中間流體(IF)收集和再生室，5=廢物室以及X=閥。
[0037]圖3顯示FC40的化學結構。
[0038]圖4顯示FC-40對雜交信號的作用。
[0039]圖5顯示FC-40對末端修復(end_repair) PRC反應的作用。
[0040]實施方案詳述
[0041]本發明人開發了手段和方法，其使得能夠基于試劑溶液的重利用而以提高的速率和降低的總成本來進行分子反應。
[0042]雖然本發明將以特定的實施方案來進行描述，本說明書不應理解為限定意義。
[0043]在具體描述本發明的示例性實施方案之前，提供了對于理解本發明而言重要的定義。
[0044]如本說明書中以及所附的權利要求書中所用的單數形式的〃 一個(a和an) 〃也包括相應的復數，除非上下文清楚地給出另外的指示。
[0045]在本發明的背景中，術語〃大約〃和〃約〃表明本領域技術人員會理解的準確度的區間以確保所涉及的特征的技術效果。該術語通常表示從所表示的數量值偏差±20%，優選±15%，更優選±10%，且更優選±5%。
[0046]應理解術語〃包含〃是非限制性的。對于本發明的目的，術語〃由……組成〃被認為是術語"包含"的優選實施方案。如果下文中的組被定義為包含至少某數目的實施方案，這也意味著涵蓋了優選僅由這些實施方案組成的組。
[0047]此外，說明書和權利要求書中的術語〃第一 〃，〃第二 〃，〃第三〃或〃 (a) 〃，〃 (b) 〃，〃(c)〃，"(d) 〃以及類似的等，是用于區別類似的要素且并不必然用于描述次序或時間先后順序。應理解如此使用的術語在適當情況下是可互換的，并且本文所描述的本發明的實施方案能以本文所描述或演示的之外的其它次序操作。
[0048]如果術語〃第一 〃，〃第二 〃，〃第三〃或〃 (a) 〃，〃 (b) 〃，〃 (C) 〃，〃 (d) 〃等涉及方法或用途的步驟，則在步驟之間沒有時間或時間間隔的相干性(coherence)，也即步驟可以同時進行或者此類步驟之間可以有秒、分鐘、小時、天、周、月或者甚至年的時間間隔，除非在上文或下午所述的本申請中另有指明。
[0049]應理解本發明并不局限于本文所描述的特定的方法學、方案、試劑等，因為這些可以變化。還應理解本文所用的措辭僅僅是用于描述特定的實施方案的目的，而并不是要限制本發明的范圍，該范圍將僅有所附的權利要求來限定。除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語都具有本領域技術人員通常所理解的相同含義。
[0050]如上文所述，本發明一方面涉及用于在裝置中進行分子反應的方法，包括如下步驟:
[0051](a)將一或多種試劑溶液和不混溶中間流體引入所述裝置中，其中所述裝置包含其上固定有化學或生化可識別實體的基材；
[0052](b)在所述固定的化學或生化可識別實體與所述試劑溶液之間進行分子反應；或者在存在所述試劑溶液時在所述固定的化學或生化可識別實體上進行分子反應；
[0053](c)用所述不混溶中間流體替換存在于所述基材上的試劑溶液；
[0054](d)分離所述不混溶中間流體和所述試劑溶液，優選在收集和再生區進行；和
[0055](e)重利用所述試劑溶液和/或不混溶中間流體進行一或多次步驟(a)至(e)的重復。
[0056]如本文所用，術語"裝置"是指允許或適宜于分子反應進行的構件，例如盛器(receptacle)、室或容器、或者儀器。所述裝置可相應地裝配有一或多個入口和/或出口元件，其可以包含一或多個表面，例如反應表面或者具有具體功能性的表面，其可以包含反應區、洗滌區、混合區、等待區、測量區、廢物區、儲存器區、再收集和再生區、或者再收集或再生區等，或者其任意的子部分或組合。其還可以包含這些元件之間的連接件，例如管或接頭(joint);和/或其可包含要在裝置中使用的液體、流體、化合物、成分、樣品或任意其它實體的儲存器和存放處。
[0057]優選地，其可包含反應區。此〃反應區〃可以是封閉的實體，其僅包含與該區的尺寸相比尺寸較小的入口和/或出口構件并且被理解為〃反應室〃；或者其可以是開放的構件，與裝置中存在的其它實體自由連接。反應區可以適宜于使所述的分子反應進行，或者在某實施方案中可以裝配有或包含元件使反應在所述實體中發生。為了適宜于使反應進行，可以在反應區中設定或調節一或多個參數。例如，可將反應區中的溫度調節為本領域技術人員已知的適宜值。該值可主要取決于要選擇的靶分子和發生的反應或相互作用的類型，并且可以根據反應物類型、反應類別、所設想的速率、反應終止點考量及本領域技術人員已知的其它參數而有不同。
[0058]使反應發生的元件可以是基材，化學、生化、生物或其它實體的陣列，催化劑等。另夕卜，反應區可以由適宜于測量或移動活動的區域所組成，例如其可包含可移動的表面使所封閉的空間縮小，和/或其可包含導電區或電容區等和/或其可包含一或多個允許光學檢測的透明表面。在某些實施方案中，反應的尺度和/或形式可以適于一種上述的功能。在另外的實施方案中，所述裝置可另外地或者可選地包含一或多個檢測區。此區可以等同于其它區，或者可以與其它區例如反應區或混合區等分開。在本發明含義之內的檢測區可包含傳感器或檢測器元件，例如用于通過電子、光學、嗅覺、或聽覺來檢測反應產物、反應結果或者用于檢查反應步驟是否已經完結。這些區可以包括，例如導電區或電容區等，或者其可以包含一或多個透明表面以允許對例如反應結果進行光學檢測，如標記反應的進行或者強
/又寸。
[0059]在本發明另外的實施方案中，所述裝置可另外地或者可選地包含加熱模塊或調節單元以用于控制和/或調節溫度，例如其中可將溫度保持恒定在期望值或者可以依據反應類型或反應循環等而設定為期望值的加熱區。在另外的實施方案中所述裝置可另外地或可選地包含冷卻模塊，例如其中可將溫度保持恒定在期望值或者可以依據反應類型或反應循環等而設定為期望值的冷卻區。這些區還可進一步裝配有適宜的傳感器元件使得能測量溫度改變或溫度梯度。
[0060]所述裝置可另外地或可選地含有單元、元件或裝備，使得能進一步改變參數，如帶電實體的存在、離子的存在，或者可以傳遞機械或剪切力等。例如，所述元件可適宜于建立電流或電泳電流，所述元件可適宜于提供具體的PH或者化學或物理實體的具體存在，例如某些酸、鹽、溶劑等的存在，和/或所述元件可適宜于提供強烈的介質移動。任意上述的另外的設備可用于裝置的任何部分，例如在反應區或反應室中。
[0061]在另外的具體實施方案中，所述裝置可另外地或可選地含有使得可以對流速、粘度或密度值、一種狀態至另一狀態的轉換、試劑的存在或不存在、中間不混溶流體的存在或不存在等進行檢測的模塊。
[0062]如本文所用的術語"分子反應"是指在分子基礎上(在某些實施方案中時在大分子的基礎上)的化學、生化、生物學、或物理相互作用，或者其任意組合，優選是指化學或生化反應。在某些實施方案中還慮及了亞分子相互作用(sub-molecular interaction),例如涉及分子的部分、或單個原子或離子的相互作用。所述反應可在所述裝置的表面發生，其可在所述裝置內的實體中發生而不與其表面有聯系，或者其可在裝置的兩個部分(sector)都發生。例如，分子反應優選地，所述分子反應可在上文所述的反應區或反應室中發生。
[0063]在步驟(a)中，將一或多種試劑溶液和不混溶中間流體引入所述裝置中，其中所述裝置包含其上固定有化學或生化可識別實體的基材。如本文所用，術語"試劑溶液"是指包含一或多種反應物的液體或流體，所述反應物對于溶液本身的組分之間的反應、或者對于溶液的組分與裝置的構件、元件或形式(例如反應區或反應室的構件、元件或形式)之間的相互作用是必需的或者使其可進行。所述試劑溶液可以例如是，包含化學、生化或生物學實體的水性溶液，如核酸或其片段，肽，多肽，如抗體、酶等，核苷酸，化學標記，特定濃度的鹽或離子，一或多種緩沖液或緩沖組分等，或者大分子結構元件如可移動珠，聚合結構等。另外，所述試劑溶液可任選包含可檢測的染料，其可以例如用于檢測試劑溶液和不混溶中間流體之間的轉換，或者檢測兩種或更多種類型的試劑溶液之間的轉換。根據本發明，可使用單一的試劑溶液。或者，可以使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同的試劑溶液。如本文所用，術語"不同的試劑溶液"是指上述成分的任何差異，例如核酸、肽、多肽、離子、鹽、緩沖組分、染料等的存在或不存在、或者濃度的差異。濃度的差異可以例如是大約5%、10%、20%、50%、100%、500%、1000%或更多或者其間的任意值的提高或者降低。另外，差異也可以是所述試劑溶液溫度的差異，其粘度、密度、電傳導、或本領域技術人員知道的流動參數的差異。不同的試劑溶液可以例如包含退火溶液、變性溶液、封閉溶液、去封閉溶液等或其任意組合。
[0064]如本文所用，術語〃不混溶中間流體〃是指與上文所述試劑溶液基本上不混溶或完全不混溶的流體。〃基本上不混溶〃的中間流體可包含高達大約0.01,0.02,0.05,0.07、0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8或高達1%的不同流體，特別是試劑溶液，例如如本文所述的水性試劑溶液。優選地，不混溶中間流體包含比例為少于1%、更優選少于0.5%、更優選少于0.1%的水或水性溶液。通常，所述不混溶中間流體在與試劑溶液(例如本文所定義的水性溶液)形成接觸時形成分離的相。不混溶中間流體和試劑溶液之間的分離優選可以是基本完全的或者是完全的，例如導致所述不混溶中間流體與至少99%、99.5%、99.9%,99.99%,99.999%,99.9999%或100%的所述試劑溶液分離。具體而言，本發明優選的實施方案中所述不混溶中間流體顯示出所述試劑溶液組分在所述中間流體中的不可溶性、或所述試劑溶液組分在所述中間流體中的基本不可溶性。如本文所用，術語"試劑溶液組分的不可溶性"是指所述試劑溶液的組成在與所述中間流體接觸時不改變。如本文所用，術語"試劑溶液組分在所述中間流體中的基本不可溶性"是指所述中間流體可含有至多大約 0.01,0.02,0.05,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8% 或至多 1% 的所述試劑溶液的一或多種組分。在另外的實施方案中，所述不可溶性特別是指表面區域，其中試劑溶液的組成可基本不變，由此使得可以重利用。在本發明特別優選的實施方案中，基材上反應位點的比率，例如化學或生化可識別實體的比率，可以是在溶液中大量過量的。
[0065]不混溶中間流體可包含單一化學特征(例如單一結構或構象)的分子，和/或單一物理性質(例如單一的沸點、單一的粘度、單一的密度、單一的導電性)的分子，或者其可包含兩種或更多種分子類型或類別，例如不同化學特征的分子類型。優選地，此類不同分子類型具有類似的或相當的物理性質，例如類似的沸點、類似的粘度、類似的密度、或類似的導電性。還優選的是其化學和/或物理性質以這樣的方式類似的分子類型，所述方式使得兩種分子能夠組合以提供組合的不混溶中間流體，具有平均的沸點、粘度或密度。
[0066]如本文所用，在〃不混溶中間流體〃的背景中的術語〃中間〃是指該流體的功能是讓所述一或多種試劑溶液或其它流體實體彼此互相分離或不接觸。例如，如果提供了兩種不同的試劑溶液或流體實體，例如以小滴、流體單元或栓(Plug)的形式，根據本發明的所述中間不混溶流體可以在這些試劑溶液單元或流體單元之間，例如填充兩個小滴或栓之間的空間。因而，所述不混溶流體可以使根據本發明的所述一或多種試劑溶液不接觸，其因此構成了所述試劑溶液之間的中間流體、或裝置中不與所述不混溶中間流體混溶的任意其它類型流體成分之間的中間流體。通過進行此操作，不混溶中間流體以流體單元、小滴、或栓本身的形式分離。在本發明具體的實施方案中，由不混溶流體所分開或分離的相同試劑溶液的單元可以穿過或穿越反應區。優選地，所述分開導致第一種試劑溶液與所述不混溶流體完全不混溶或完全不混合和/或導致第一種試劑溶液與第二種或隨后的試劑溶液完全不混溶或完全不混合。在另外的具體實施方案中，此類試劑溶液單元可包含不同的成分、不同濃度的成分，可具有不同的溫度、不同的粘度、不同的導電性，顏色不同，具有不同的pH、不同的酶濃度，顯示封閉材料、去污劑、離子、鹽的存在或不存在，或者具有任意適宜的參數差異。此類另外的參數會是本領域技術人員知曉的，或者可以得自適宜的教科書。
[0067]在本發明另外的具體實施方案中，引入所述裝置的第一種試劑溶液可引起裝置的部分的分子修飾，例如基材區域，特別是如本文所述的反應區或反應室的區域。或者，此種修飾還可以由隨后引入的試劑溶液所引起。相應的分子修飾可以例如是，結合位點、相互作用結構域、活性位點或結構域的占據，或者基材表面區域的濕潤，優選是由薄膜或液體濕潤，更優選由薄水膜濕潤。以上述的方式修飾，則所述不混溶中間流體的存在可能不會完全地提供試劑溶液第一和第二單元的部分的不相混溶性，例如，由于結合至結合位點的因子或實體，或者由于薄流體膜可保留在原位并因而會與第二種或隨后的試劑溶液混合。
[0068]在另外的具體實施方案中，不混溶中間流體可包含另外的成分，即包含超過一種分子類型或類別，而包含化合物如表面活性劑、去污劑、染料或適宜的穩定劑。
[0069]術語〃引入〃如本文所用是指將試劑溶液和/或不混溶中間流體提供給上述的裝置。可以通過將所述試劑溶液和/或不混溶中間流體注射至所述裝置中來進行此提供。例如，在裝置的混合物或T-型區，可從外部或內部的儲存器、或者從注射器或其它適宜的盛器注射試劑溶液。類似地，在裝置的此種混合物或T-型區，可從外部或內部的儲存器、或者從注射器或其它適宜的盛器注射不混溶流體。優選地，這些實體的引入輪流發生或交替發生。
[0070]術語〃基材〃如本文所用是指本領域技術人員已知的任意適宜的基材。所述基材可具有任意適宜的形式或樣式，例如其可以是平的、弧形的，例如朝向發生相互作用的區中凸地或中凹地呈弧形，其可以是卷曲的或者包含波狀的樣式。其還可以被組織為環狀結構，或者其可以被組織為珠樣元件或珠的形式(可例如安排至陣列中)。所述珠可布滿基材平面或者通過鏈接元件如桿、接頭等固定在反應區域，或者可以包含含有捕獲分子的磁顆粒，被特定的封閉試劑覆蓋等。
[0071]在另外的具體實施方案中，可使用本領域技術人員已知的包被的珠。在另外的實施方案中，所述基材可包含或由微結構表面、包被、或移動載體(其可優選被保持在反應區或反應室內)、或珠樣元件所組成，但卻有不同的形狀。
[0072]通常，所述基材是固體支持物，即包含主要有非液體堅固性的支持材料并由此使得能精確且可追蹤地對所述支持材料上的實體進行定位。基材的實例有固體材料或者包含功能性化學基團的基材，例如胺基或胺官能化的基團。本發明所慮及的另外的基材實例有多孔支持材料或多孔基材如尼龍，例如Nytran N或Nytran SPC*"* Biodyne G?。另外的典型支持材料或基材有非多孔基材。在非多孔基材中優選的有玻璃、硅酮(silicone)、融合硅石(包被有具有官能化基團的硅烷層如聚乙二醇、胺、環氧化物、異硫氰酸酯等)、聚-L-賴氨酸包被的材料、硝化纖維、聚苯乙烯、環烯烴共聚物(COC)、環烯烴聚合物物(COP)、聚丙烯、聚乙烯和和聚碳酸酯。對于肽/多肽實體的固定特別有用的另外的基材實例包括藻酸鈣或其修飾的形式。通常，核酸可偶聯至聚合的或無機的表面基材，例如上文所述的，其中有共價偶聯；而肽、多肽或蛋白質實體偶聯至聚合的或無機的表面基材，例如上文所述的，其中有或無共價偶聯。
[0073]術語"可識別實體"如本文所用是指實體，特別是分子或大分子，其能夠與其它分子、緩沖液、離子、鹽或其它化合物相互作用并由此導致其與起始情形或與先前狀態的區另O，例如共價鍵的建立、活性中心的占據、對適宜的區域或結構域的結合、構象或表面結構的變化、化學實體的并入(例如核苷酸、染料)、或本領域技術人員已知的任何其它區別。
[0074]如本文所用，"化學可識別實體"是指化學基團，例如有機分子、或者無機元件或分子、或者生化或生物分子的反應性基團，其適宜于化學相互作用、反應、結合相互作用、或任何其它類型的相互作用(提供了在化學上與起始情形、或先前狀態不同的情形)。例如，此類實體可以對特定的化學反應而言是反應性的，或者其可以能使得化學結合相互作用、催化、轉換、或化學產物的產生得以進行。如本文所用，術語"生化可識別實體"是指實質上大分子的相互作用，例如配體和相應受體之間的結合相互作用，或者酶及其底物之間的相互作用，或者封閉試劑等。這些相互作用主要涉及生化或生物學相關實體，如核酸、肽、多肽、蛋白質、抗體、酶及其底物、輔因子、結合因子等。在某些實施方案中，化學和生化可識別實體可以是相似的或基本相同的，或者生化相互作用可以是基于化學可識別實體或者反之。
[0075]術語〃固定的〃如本文所用是指化學或生化可識別實體通過分子相互作用而結合至支持性基材，所述分子相互作用將所述實體定位在所示基材的特定區域并同時阻止該實體的脫離(例如在洗滌、漂洗替換或相互作用步驟等期間)。通常，此類分子相互作用是基于所述支持材料和所要固定的化學或生化可識別實體的結構元件或官能團之間的共價化學鍵，例如核酸、肽/多肽、碳水化合物、或其經修飾形式的相應官能團，或者其組合。此類官能團以及使用適宜的化學來將其用于固定過程將會是本領域技術人員所熟知的。
[0076]在一個具體的實施方案中，可以通過由熱或光交聯化學或生化可識別實體來實現所述固定，即通過在由能量源如熱或光提供的能量的影響和推動下，形成連接兩者結構元件的分子相互作用或鍵，或者是通過化學固定。通常，經熱交聯的固定是通過在某溫度干燥并隨后烘烤基材上的化學或生化可識別實體來進行的。此方法優選用核酸的固定。據認為干燥和烘烤會導致分子通過疏水相互作用而附著至所述基材。此過程可被分類為物理吸附的亞形式。術語〃物理吸附〃涉及一種方法，其包括初始的分離和吸引步驟，由此所述化學或生化可識別實體接近反應性基團，這是基于物理吸附的方法。生物分子(例如核酸)被吸附至固體支持物上實際上可以用任何支持材料來進行，因為已觀察到任何此類支持材料都會與幾乎任何表面相互作用。
[0077]通常，支持材料和待固定化學或生化可識別實體之間的相互作用水平，會根據所述支持材料的性質和形式以及所述化學或生化可識別實體的大小和化學/物理/生物學性質而改。所述相互作用通常是五個階段的過程，包括如下步驟:(i)將所述化學或生化可識別實體轉移至所述基材的表面，(ii)吸附至所述表面，(iii)重排所吸附的化學或生化可識別實體，(iv)對所吸附的化學或生化可識別實體進行潛在的脫附，和(V)將脫附的化學或生化可識別實體從表面轉移走。雖然該過程在某種程度上意味著脫附的潛力是固有的，但是基于所述化學或生化可識別實體的大小而言所述結合通常是不可逆的。脫附相互作用背景中的術語"化學或生化可識別實體的大小"，與存在的結合位點的數目有關。雖然原則上任意一個結合位點可以在任何時候從基材的表面解離，但是大量結合位點的作用是，包含化學或生化可識別實體的分子作為整體將保持結合。通過應用熱形式的能量，例如在大約40至150°C的溫度，優選50至120°C，更優選60至110°C，更優選70至100°C及最優選80至90°C，可增強所述化學或生化可識別實體物理吸附至支持物材料，并且有效固定所需的時間則可被縮短。可以將熱交聯進行任意本領域技術人員已知的適宜時間段，例如2min中12小時，優選1-3小時。可以通過本領域技術人員已知的任意適宜的手段來進行加熱或烘烤交聯，例如使用干燥箱或烤箱。在溫度之外，還可以將其它參數調節至本領域技術人員已知的適宜值，如濕度、通風或換氣。加熱或烘烤交聯還可以與其它形式的固定組合，如光交聯或化學交聯。
[0078]為誘導化學或生化可識別實體和支持物材料之間的相互作用，通常通過對所述化學或生化可識別實體應用典型波長的光來進行光交聯，例如在150至550nm的范圍內，優選在200至500nm的范圍內。通常，所述化學或生化可識別實體和支持物材料之間所誘導的相互作用是所述化學或生化可識別實體的共價結合，例如結合至核酸，結合至所述材料。可以例如通過使用UV光來進行光交聯。對于核酸的情況，鍵接經核酸分子的堿基進行，例如胸腺嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶殘基，其與支持物材料上相應的和適宜的化學官能團反應，如本領域技術人員所知的那樣。可以通過適宜的化學活化方法來控制和調整支持物材料之上或內部的化學官能團的存在和數目。此類活化方法可以例如在支持物材料之上或之內提供具體定位的官能團并促進所述化學或生化可識別實體和所述材料之間就這些定位的官能團而言的特定相互作用。所述支持物材料之上或內部的化學官能團的存在和數目還可以影響所固定的化學或生化可識別實體的朝向和自由度。
[0079]如本文所述的"化學固定"可以是所述支持物材料和所述化學或生化可識別實體之間基于化學反應的相互作用。此種化學反應通常不依賴于經熱或光的能量輸入，但是卻可以被加熱(例如化學反應的某最適佳溫度)、或某波長的光所增強。例如，支持物材料上的官能團和所述化學或生化可識別實體的相應功能性元件之間可以發生化學固定。所述化學或生化可識別實體中的此類相應功能性元件可以是所述分子化學清單(inventory)的一部分，或者可以是額外引入的。此種官能團的實例有胺基。通常，所要固定的化學或生化可識別實體，例如核酸或肽/多肽，包含胺官能團或者是經化學修飾的以便包含胺官能團。此種化學修飾的手段和方法是本領域技術人員已知的。
[0080]或者，可直接在所示基材上合成所述化學或生化可識別實體。用于此過程的方法是本領域技術人員熟知的。核酸方面的實例有Agilent Inc.、Affymetrix Inc.、NimblegenInc.或Flexgen BV所開發的制備技術,其中例如Affymetrix Inc.使用經光網(reticle)的照射(illumination),而 Nimblegen Inc.使用像素化鏡(pixilated mirror)以及Agilent Inc.提供了在適當位置印壓四種不同核苷酸的技術。Flexgen BV使用掃描激光束。通常，使用對要發生核苷酸添加的點進行特異性活化的激光和鏡組。此方法可提供，例如，大小在5和100 μ m之間的點，例如大約30 μ m或更大。化學或生化可識別實體，例如核酸，因而可具有高達約80個核苷酸的長度。在不同的也經慮及的技術中，可以使用非接觸性噴墨(inkjet)打印方法來沉積所述化學或生化可識別實體沉積。在本發明具體的實施方案中，可將核酸(優選聚合物)均勻地沉積在特制的載玻片上。此原位合成技術通常可以產生60-聚體長的寡核苷酸探針，這是通過在合成方法中一個堿基接一個堿基合成，或者是通過打印預合成的寡聚物并將其共價偶合至表面。
[0081]對于肽、多肽或蛋白質的固定，例如對于酶的固定，優選通過共價結合至基材，例如以通過化學反應的基質的形式。可以通過使用適宜的間隔分子來對此技術進行補充或支持。此間隔分子的實例為聚乙二醇，其通常降低基材元件的空間位阻。
[0082]在步驟(b)中，在所述固定的化學或生化可識別實體與所述試劑溶液之間進行分子反應；或者在存在所述試劑溶液時在所述固定的化學或生化可識別實體上進行分子反應。術語"進行"如本文所用是指，在裝置中所述固定的化學或生化可識別實體所在的區或區域(優選在反應區或反應室中)，將一或多種試劑溶液與經固定的上文所定義的化學或生化可識別實體接觸。所述接觸可以進行任意適宜的時間段，例如lsecjsecUOsec、30sec、lmin、2、min、5min、30min、lh、或幾小時、甚至幾天、或者這些值之間的任意時間。所述時間段可取決于所要進行的分子反應的類型，試劑溶液中成分的量和/或濃度，例如酶底物、核苷酸、標記、染料等的濃度，所使用的溫度，封閉試劑的存在或缺失，反應的動力學，以及本領域技術人員已知的任意其它參數。所述接觸還可以在其它適宜的條件下進行，例如在特別設定的PH或特定的pH范圍，在特定的溫度或特定的溫度范圍，以特定的成分濃度，例如反應液中特定的離子濃度、特定的多肽/肽濃度，優選特定的酶濃度等。此類條件會是本領域技術人員已知的并且可以根據反應類型和/或所設想的反應結果而進行調適。在本發明具體的實施方案中，可以將酶的濃度、更優選DNA聚合酶的濃度設定為大大高于目前測序反應中所使用的DNA聚合酶的量的值，例如高達目前所使用的1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、或50倍。在具體的實施方案中，也可使用其它成分濃度的類似提高，例如核苷酸、底物等。
[0083]在本發明的某些實施方案中，可以通過外部活動來控制所述分子反應的進行。例如，可以通過使用如上文所述的適宜的加熱或冷卻模塊來設定、提高或者降低溫度。另外，可測量pH、和/或通過所述裝置中(優選反應區或反應室中)存在的適宜的pH設備來改變pH。
[0084]分子反應(優選完整的分子反應)的進行，可以依賴于一種試劑溶液的存在或者可以基于兩種或更多種試劑溶液的使用。例如，第一試劑溶液可提供第一反應步驟、或準備步驟(例如去封閉步驟或封閉步驟等)所需的成分。第二或隨后的試劑溶液可提供第二或隨后的步驟中所需的成分，例如用于相互作用的成分如特定的酶、或酶底物、或特定的標簽或染料等。
[0085]所述分子反應可以在所述固定的化學或生化可識別實體(例如核酸、肽/多肽、碳水化合物)和所述試劑溶液之間進行，其通常可導致所述固定的實體的化學或生化修飾，例如將化學基團添加至所述固定的實體，和/或所述試劑溶液的化學或生化修飾。或者，在存在所述試劑溶液時在所述固定的化學或生化可識別實體上進行所述分子反應。例如，所述試劑溶液可以提供催化成分，例如在所固定的化學或生化可識別實體上進行反應所需的酶活性，但卻不會改變或基本上不會改變所述試劑溶液。所述分子反應優選通過移動動作而起始和/或終止，所述移動動作導致所述化學或生化可識別實體與所述試劑溶液的接觸和/或導致所述化學或生化可識別實體與所述試劑溶液的所述接觸的終止。此種起始或終止可以基于所述試劑溶液的經過反應區或反應室的移動，特別是上文所述的試劑溶液單元或栓。優選通過使用本發明的不混溶中間流體來進行所述移動。由此，通過控制所述移動，例如流速，或者通過在所述裝置的特定區或區域開始、加速、減慢、暫停或停止所述移動，可以控制分子反應，其速度可以被改變，反應產物的量可以被改變等。在本發明具體的實施方案中，所述分子反應的起始以及特別是終止可以基于對反應產物的測量結果來進行。例如，此種基于測量的終止方法可以通過微電流來施行，例如計算機化模塊，其與反應狀態、反應階段或反應過程的適宜參數的存在或缺乏相關聯。在步驟(C)中用本發明的不混溶中間流體替換存在于所述基材上的試劑溶液。術語"替換"如本文所用是指試劑溶液單元或栓從所述裝置的特定區或區域的排出，例如引入到上文所述的裝置中。優選地，所述替換可導致所述試劑溶液從裝置的反應區的基材排出。另外或者可選地，反應溶液、或任何其它與所述不混溶中間流體不同且不混溶的溶液單元的替換，不僅可以在反應區/在反應室內發生，還可以在該裝置的任意其它位點或區域發生，例如在管中，在連接件處，在等待或儲存區等。
[0086]在本發明具體的實施方案中，所述替換可以是完全的或基本完全的替換，例如導致99%、99.9%,99.99%或100%的所述試劑溶液或任何其它溶液從所述基材(例如反應區的基材)去除，或者是從該裝置的任意其它位點被完全或基本完全替換。在另外的可選的實施方案中，所述替換可以不是完全的或者基本完全的。可以將一定量的先前存在的溶液特別是先前存在的試劑溶液保留在所述基材上，而不進行替換動作。在優選的實施方案中，可以將液體的薄膜，例如試劑溶液的薄膜，或者水薄膜保留在所述基材上，而并不由所述不混溶中間流體替換。在所述替換動作期間，同時，可以將所述試劑溶液或者任意其它溶液或流體的另外的成分保留在所述基材上。
[0087]在本發明另外的優選實施方案中，不混溶中間流體殘余或薄膜可不被保留在基材表面或該裝置的任意其它區域或位點。因而可通過跟隨穿過該裝置的某區或區域的試劑溶液單元而實現不混溶中間流體殘余的替換。
[0088]本發明所述方法的替換步驟可導致所述試劑溶液以及所述替換不混溶中間流體移動至裝置中遠離其先前所在區域或部分的區域或部分。可通過本領域技術人員已知的任意適宜手段來進行此種移動，其可使試劑溶液單位或栓以及所述不混溶中間流體轉移至裝置的不同區，例如等待區、測量區、廢物區、儲存區、回收和再生區或者回收和再生室等。所述移動可以由適宜的手段來控制和影響，例如閥、門、鎖、節點、合流等。可通過機械手段、電子手段或其它任意適宜的手段來進行控制。
[0089]在步驟(d)中，分離所述不混溶中間流體和所述試劑溶液。術語“分離”如本文所用是指對不混溶中間流體單位和試劑溶液單位的混合物所進行的動作。在另外的實施方案中，所述分離還在任何該裝置中存在的其它液體或流體單位之間進行。因此，所述分離可導致裝置中存在的液體或流體單元的次序或順序的瓦解，其中本發明所述的不混溶中間流體在試劑溶液或其它溶液之前和/或之后。此分離優選導致相同的或類似的液體或流體單元的收集，例如不混溶中間流體的收集、試劑溶液的收集、特定類型試劑溶液的收集、或者裝置中存在的任意其它類型的流體單元的收集。
[0090]在本發明優選的實施方案中，可在收集和再生區進行所述分離。術語“收集和再生區”如本文所用是指對試劑溶液和不混溶中間流體進行捕集或收集的裝置的部分、或位于裝置之外的元件。通常，此收集和再生區可具有收集和再生室的形式、或者收集和再生容器或盛器的形式。在收集所述試劑溶液和不混溶中間流體之后，可進行分離，例如通過任意適宜的手段，如使用重力、使用離心、電分離措施、電泳分離技術、密度梯度分離等。
[0091]經分離后，可將所述試劑溶液和不混溶中間流體轉移回裝置中發生上文所述分子反應的區，例如通過收集和再生區經適當定位的出口而引流回反應區，或者通過任意其它適宜的循環技術。
[0092]如本文所述的分離可以使兩種或超過兩種液體或流體分離，例如兩種或更多種不同的不混溶中間流體與試劑溶液之間，或者兩種或更多種試劑溶液和其它溶液與不混溶中間流體之間。超過兩種的這些流體分離的前提是在上文所述的任意分離手段之后產生不同的相。
[0093]在優選的實施方案中，所述分離是完全的或基本完全的分離。例如，兩種或更多種流體之間的分離，特別是本發明的反應溶液和不混溶中間流體之間的分離可以是90%、95%、99%,99.9%,99.99%,99.999%或100%。如果進行了上文所述的分離過程并且在兩種或更多種流體相之間留下了不可分離的區，則此不可分離的區可被廢棄，或者其可進行其它不同的分離過程，例如，在首先進行重力過程之后通過離心來增強分離等。
[0094]在本發明另外的具體實施方案中，所述試劑溶液和所述不混溶中間體經分離之后，可再生所述試劑溶液和/或所述不混溶中間流體，例如通過調節pH、調節速率、調節成分的濃度等，這是在其被轉移回裝置中發生上文所述分子反應的區之前，例如例如通過收集和再生區經適當定位的出口而引流回反應區，或者通過任意其它適宜的循環技術。
[0095]在本發明具體的實施方案中，所述分離可跳過收集或回收的步驟而導致所述不混溶中間流體(特別是所述不混溶中間流體單元或栓)與所述試劑溶液(特別是所述試劑溶液單元或栓)、或其它任何溶液或流體栓直接空間分離，使得其可以通過適宜的手段如引流動作等而直接被再利用。例如，可在本發明的裝置中，將不混溶中間流體單元或栓、和/或試劑溶液單元或栓的改向、分流或偏轉至分離的通道、管或區。
[0096]在步驟(e)中，重利用試劑溶液和/或所述不混溶中間流體。由此，在一個實施方案中，在裝置中不混溶中間流體和試劑溶液單元或栓的次序或順序瓦解之后，例如在裝置的通道部分，根據步驟(d)，如上文所述，所述分離的流體單元在本發明要求保護的方法中可被用于第二次或者隨后的應用。可以在重利用所述流體單元之前將其再集合起來，或者可以以其現在的形式作為單元進行應用。由于所述不混溶中間流體和所述試劑溶液的不可混溶性，本發明的所述試劑溶液或試劑溶液單元將不會被裝置中存在的任何其它流體或液體(例如不同的試劑溶液、或者洗滌或漂洗緩沖液等)所稀釋也不會被其弄臟或污染。通常，包含一定量成分的試劑溶液可重利用若干次，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40,50或更多次，例如通過將其引流回裝置中發生分子反應的區(例如上文所述的反應區或反應室)。在一些實施方案中，試劑溶液的重利用可取決于一或多種成分的濃度，其可以例如通過裝置中特定部分的適當手段來確定。或者，重利用可取決于本發明分子反應的質量和/或速率，例如，如上文所述根據反應產物等的測量所確定的。在另外的實施方案中，可以向反應溶液提供缺乏的成分，例如，可以提高離子、蛋白質例如酶、核苷酸、染料或任何其它化合物的濃度，這是在一定量的時間或一定次數的重利用后、或者在測量了所述成分的濃度后或者測量了反應結果后(如上文所述)。隨著適宜性的下降，即成分的濃度下降、分子反應的質量和/或速率的下降，可以廢棄所述試劑溶液，例如某試劑溶液單元。此類廢棄的單元優選被重新引入的試劑溶液(例如試劑溶液單元)所替代。
[0097]上文所述的不混溶中間流體可以重利用若干次，例如5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、100、150、200或更多次，例如通過將其引流回裝置中發生分子反應的區，例如上文所述的反應區或反應室、或者如上文所述在裝置中引入所述流體的區。不混溶中間流體的重利用可取決于所述流體的不混溶性質量、其粘度、其密度和其它本領域技術人員已知的適宜參數。可以在反應區中或者裝置中其它任何適宜的測量區測量這些參數。隨著適宜性的下降，即不混溶性質量的下降、粘度和密度的改變，可以廢棄所述不混溶中間流體，例如某些不發揮作用的或者質量降低的不混溶中間流體單元。此類廢棄的單元優選被重新引入的不混溶中間流體所替代。
[0098]在本發明具體的實施方案中，可跳過上文所述的步驟(d)并將不混溶中間流體單元之前和/或之后的試劑溶液單元的序列(在其已經穿過反應區或反應室后)以其原次序或以改變的次序(例如通過引入另外的溶液和/或不混溶中間流體的單元)直接引流回所述反應區或反應室。試劑溶液和/或不混溶中間流體可優選如上文所述通過重復方法步驟(a)至(d)而重利用。在本發明可選的實施方案中，重利用可基于這些步驟的亞集的重復，例如可以跳過分離步驟并將流體單元的序列可以直接引流至反應區、或者該裝置的任何其它區。
[0099]如上文所述的步驟重復可以進行任意適宜的次數。這可以取決于所要進行的反應的類型和數目、反應溶液中成分的質量和濃度、反應步驟的速率、裝置中的流動參數或者本領域技術人員已知的任何其它適宜的參數。例如，所述方法步驟可以重復1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、15、20、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、170、180、190、200 或更多次。
[0100]在另外的實施方案中，可將試劑溶液和/或不混溶中間流體收集并儲存在裝置中、裝置的區或室中或者外部的盛器中，而其上固定有化學或生化實體的基材則被替換或修飾。由此，本發明還慮及了重利用所述試劑溶液和不混溶中間流體以用于在超過一種基材或基材類型上進行反應。
[0101]在本發明另一個優選的實施方案中，上文所述的方法還可以包括用洗滌緩沖液洗滌所述基材的步驟。所述基材的洗滌可以用適宜的洗滌緩沖液來進行，例如包含一或多種去污劑、和/或緩沖組分、和/或鹽，和/或穩定劑的水性液。例如，洗滌緩沖液可包含TRIS-堿、Tween、甲酰胺、NaCl和穩定劑，具有大約7.0的pH。適宜洗滌緩沖液的另外的實例包括 IOX PBS (0.1M PBS，pH7.4), 20X PBS, (0.2M PBS，pH7.4)，IOX PBS-Tween 20(0.1MPBS,0.5%Tween 20，ρΗ7.4)或 20X PBS-Tween 20 (0.2Μ PBS, l%Tween 20，ρΗ7.4)。另外的洗滌緩沖液及其在特定反應和情形中的應用是本領域技術人員已知的，或者可以得自適當的教科書。[0102]所述洗滌緩沖液優選通過上文所述不混溶中間流體而與上述試劑溶液脫離。由此，在用不混溶中間流體替換試劑溶液單元或者兩種或更多種試劑溶液單元(例如上文所述的不同成分或功能的單元)之后，可將洗滌緩沖液引入到裝置中并使其穿過或移過所述裝置中包含上述基材的區。在本發明特別優選的實施方案中，所述洗滌緩沖液單元之后可跟隨有不混溶中間流體，例如另外的不混溶中間流單元。這種跟隨的不混溶中間流體單元可繼而從所述基材替換所述洗滌緩沖液，例如從位于反應區或反應室的基材替換。所述替換優選可以是完全的或者基本完全的替換。
[0103]在本發明另外的優選實施方案中，可通過上文所述的分離過程而重利用所述洗滌緩沖液。或者，可以廢棄所述洗滌緩沖液，例如在上文所述的分離方法或重導向方法之后將其去除。
[0104]在本發明另外的具體實施方案中，可以通過反轉(revert)移動方向(即流體單元的移動方向)來增強洗滌緩沖液的活性，反應區中的此種流向的反轉可以改善洗滌活性。在本發明另外的具體實施方案中，可以調節洗滌緩沖液的流速(例如為了實現適宜的嚴格性)，優選與設定一定的溫度組合進行。
[0105]在本發明另一個優選的實施方案中，上文所述的方法還可包括測量所述分子反應的狀態和結果的步驟。如本文所用，術語“測量所述分子反應的狀態和結果”是指測定來自上文所述分子反應的終產物和/或中間產物。例如，可以測量標記的或未標記的分子的存在，溶液中顏色或染料的存在或缺失，PH的改變，核酸、肽、多肽等的濃度，電導或任何其它適宜的參數。此測量可以在上文所述的反應區或室內進行，和/或在本發明裝置的特地測量或檢測區中進行。測量的位點可以例如取決于反應類型，例如反應是否在基材上固定的實體之內或之上發生導致其可檢測的修飾，或者其是否在試劑溶液中發生導致其可檢測的修飾。如果所述固定的實體被修飾，可以在原位進行測量，而對于試劑溶液中的分子反應的狀態或結果的測量，則可以在反應區或反應室內發生，或者在該裝置的任何位點發生，例如在與反應區分離的特定的測量或檢測區中。
[0106]可以通過光學手段進行相應的測量。例如，為了檢測溶液中或基材處的光學變化、和/或為了確定此種光學變化的質量，可使用CCD照相機或其它適宜的光學設備。可選或者另外地，可使用電氣手段來進行相應的測量，例如基于在本發明裝置的位點處或區中對導電性、電容(capacity)或離子強度、pH、和/或電泳參數的測定。可以將相應的測量模塊連接至集成平臺，例如可以對分子反應的階段、速率或施行進行評估的計算機、計算機化模塊或微電子裝置。此種集成平臺還可裝配有適宜的軟件或程序，使得可以進行控制活動和評估。此種評估還可用于施行校正步驟，例如速率或流動參數的提高或降低、另外的試劑溶液組分的引入、反應溫度的提高或降低、分配給反應步驟的時間段的增加或減少等。
[0107]在本發明特別優選的實施方案中，相應的光學測量可用于在測序反應的情況中檢測序列，例如通過發光的顏色或者在某個點反應的存在或缺失。
[0108]在本發明另外的優選實施方案中，上文所述方法中的替換步驟(C)是通過氣動流體驅動、螺動傳動、活塞和傳動膜驅動或者應用定向真空來進行的。
[0109]可以施行氣動流體驅動，例如，通過在裝置的不同部分使用空氣流或氣流模塊。所述模塊可以將空氣或氣體泵壓至裝置中。可以在裝置的小管或鏈接部分提供相應的模塊和裝置區塊。優選使用基本上與所述試劑溶液和/或所述不混溶中間流體不混溶的、和/或可以容易地從其中去除的氣體化合物。此技術另外的細節和變化是本領域技術人員熟知的或者可以得自適當的教科書。在本發明具體的實施方案中，所述氣體化合物可以是或者具有不混溶流體的形式。此處可使用的可選不混溶流體的另外實例包括鐵磁流體(ferrofIuid)。
[0110]可以施行蠕動傳動，例如，通過在裝置中提供柔性的連接件或管道，或者通過將裝置設定為具有一或多個柔性的或可移動的側面或隔片，使得可進行蠕動性移動。可通過任意適宜的手段來進行所述蠕動活動，例如，在所述柔性的管道或隔片上的滾動裝置或傳動裝置，通過以方向相反的方式(contradirectional fashion)組合兩種此類管道或隔片,通過在所述管道或隔片上應用液體介導的壓力，例如提供直接與本發明的所述管道或隔片接觸的充滿水的管道，和/或通過使用蠕動泵。此技術另外的細節和變化是本領域技術人員熟知的或者可以得自適當的教科書。
[0111]可以施行活塞和傳動膜驅動，例如，通過在裝置使用至少一個可移動表面，或者在所述裝置的特定區使用至少一個可移動表面，例如反應區或反應室，或者上文所述的混合或儲存區。此可移動表面因而可以是柔性膜的形式并且可以用作活塞以降低所述裝置內、或所述裝置的區內的體積，從而導致所述區或區域外的相鄰材料的轉移。可移動表面或活塞構件可以與適宜的擴充(expansion)儲存器或區組合，使得裝置內的流體可以移動。此技術另外的細節和變化是本領域技術人員熟知的或者可以得自適當的教科書。
[0112]可以施行定向真空，例如，通過使用適宜的定向真空泵將空氣或液體吸入本發明裝置的特定區中，例如吸入擴充儲存器或目標儲存器，或者吸入特定的方向，從而導致試劑溶液和/或不混溶中間流體單元或栓在裝置中的移動。例如，壓縮的空氣或真空可用于移動與內部的流體接觸的膜。此技術另外的細節和變化是本領域技術人員熟知的或者可以得自適當的教科書。
[0113]根據本發明具體的實施方案，可以根據適宜性來調節替換活動的方向、流速以及速率。具體而言，裝置可以在所述裝置內的不同位置裝配有兩個或更多個上文所述的移動或驅動模塊，使得能夠(i)對替換進行良好的調整、和(ii)將替換方向反轉。
[0114]在本發明另一個優選的實施方案中，通過使上文所述試劑溶液、或多種試劑溶液、或任意其它溶液例如洗滌緩沖液、和所述不混溶中間流體經重力分離來進行所述分離步驟
(d)。術語“重力分離”如本文所用是指將當前的、未增強的重力應用于試劑溶液、或多種試劑溶液、或任意其它溶液例如洗滌緩沖液，與所述不混溶中間流體的混合物達一定的時間。由于中間流體的特性特別是其不混溶性的特性，重力會導致在特定的區、室或管內產生兩個或更多個相。對于一種試劑溶液和一種不混溶中間流體的情況，應用重力可產生兩個相的液體或流體，一個相是所述試劑溶液而另一個相是所述不混溶中間流體。如果使用了水性試劑溶液，則上層相可以是試劑溶液相，而下層相可以是不混溶中間流體。
[0115]在優選的實施方案中，可以通過在填充適宜的區、管或盛器后避免擾動來增強所述重力分離。這可以例如通過從任何入口構件移除(例如通過旋轉器或移送構件)所述區、管或盛器來施行。通過機械分離不同試劑溶液和不混溶中間流體的組合或其它此類試劑溶液和不混溶中間流體組合的混合物，可實現不同試劑溶液之間的簡單區分。相應移除的區、管或盛器隨后可再與裝置連接，例如在引入端口處或經過入口構件，使得可以有效重利用所分離的流體。[0116]對于重力分離超過兩種不同溶液/流體的情況，可以提供或使用超過兩個出口構件，例如位于接近相應的相處，使得可以有效重利用所分離的流體。
[0117]難以分離的流體可另外通過增強的重力分離來進行分離，如使用離心力、加熱或冷卻所述流體、搖動動作或任意其它的適宜動作。
[0118]在本發明另外的具體實施方案中，通過重導向和/或分配上文所述試劑溶液、或多種試劑溶液、或任意其它溶液例如洗滌緩沖液、或所述不混溶中間流體來進行所述分離步驟(d)。術語“重導向和/或分配”如本文所用是指上文所述的流體單元改向至不同的方向例如裝置的分支管或區，以及此類單元的相應分配，例如在裝置的此類管或通道的網絡內分配。可以通過在裝置中于特定測量點確定從不混溶中間流體到試劑溶液或其它溶液的轉換來施行此動作。隨后，在檢測了例如不混溶中間流體之后，可使相應的流體單元向分支的管、通道或盛器移動或改向、或者移動或改向至分支的管、通道或盛器內。類似地，在檢測了試劑溶液之后，可將相應的流體單元移動或改向至不同的方向，例如向著分支的管、通道或盛器或者進入其內。所述分支的管、通道或盛器中的類似流體單元可重新集結或保持分離，并進一步被轉移或弓I導回本發明裝置的反應區。
[0119]可以通過顏色、粘度、pH、電特性或其它適宜參數來檢測上文所述的流體單元之間的轉換。可將傳感器或測定模塊加至所述裝置，例如在分支的管附近。
[0120]在另一方面，本發明涉及用于進行分子反應的裝置，包括:(a)反應區，包含其上固定有化學或生化可識別實體的基材；(b)儲存器和液體連接件，使試劑溶液、不混溶中間流體以及任選存在的洗滌緩沖液能通過所述反應區，其中所述不混溶中間流體能夠從所述反應區替換所述試劑溶液；和(C)收集和再生區，其中所述不混溶中間流體和所述試劑溶液可由重力分離來分離，使得能通過將所分離的液體引導回所述反應區而再利用所述不混溶中間流體和所述試劑溶液。
[0121]所述裝置可優選包含如上文所述的反應區，其包含如上文所述的化學或生化可識別實體(根據本文所述的技術固定)。
[0122]所述裝置還可包含儲存器，例如擴充區或導管或者引入導管或區，其使得流體單元在裝置內移動，例如通過上述的轉移技術之一。所述儲存器可以具有任意適宜的形式或大小，以及可以包含至少一個入口和一個出口、或者超過一個入口和一個出口、或者超過一個出口和一個出口。所述儲存器可以是開放的或者是用所述裝置封閉。裝置中可以存在一個或多個儲存器，例如置于不同的位置使得流體可以移動等。
[0123]如本文所用，液體連接件可以是任意適宜的的大小、直徑、或形式。例如，液體連接件可以是毛細管。或者，其可以具有更大的大小。液體連接件并不必然需要持久地充滿液體，還可以載入氣體容納物，例如如果要進行氣動替換措施。
[0124]可以存在如上文所述的收集和再生區。此區優選以收集和再生容器、導管、室或盛器的形式提供。所述收集和再生區可適宜于容納來自液體連接件、或者來自本發明裝置的不同區的一或多個流體單元，例如是由上文所述的移動技術所驅動。本發明此方面的收集和再生區被設計為使得如上文所述的一或多種試劑溶液和不混溶中間流體的流體單元可以經重力分離。因此，在具體的實施方案中，所述收集和再生區可經設計以避免填充之后的擾動，例如是通過提供轉動機制以將所述區從裝置或者從入口移除、通過提供入口連接的移除機制(例如移至另外的收集和再生區)、和/或通過提供停止或暫停機制以使收集和再生區的填充停住直至重力分離和/或重利用步驟已發生(例如使填充過程停住lOsec、30sec、lmin、2min、5min、10min、20min 等。
[0125]所述收集和再生區可以可選地或者另外地裝配有使得上文所述經增強的分離可以進行的元件，例如使得可以應用離心力的元件、冷卻或加熱元件、搖動或混合模塊等。這些另外的模塊可依據收集和再生區中液體的分離狀態而啟動。
[0126]在本發明另外的優選實施方案中，所述收集和再生區包含與上文所述反應區連接的一個入口以及分別與用于試劑溶液的儲存器和用于不混溶中間流體的儲存器相連的兩個出口。術語“與反應區相連的入口”如本文所用是指如上文所述的反應區與收集和再生區之間的直接或間接液體連接件。此連接件可以通過管、通道、毛細通道、橋聯、或其它任何適宜的連接元件來實現。其也可以是反應區與收集和再生區之間可以關閉的直接連接件，例如是通過門或鎖來關閉。術語“與用于試劑溶液的儲存器相連的出口”如本文所用是指如上文所述的收集和再生區與僅含有試劑溶液(優選僅含有一種類型的試劑溶液或者給定的組分)的儲存器之間的直接或間接液體連接件。此連接件可以通過管、通道、毛細通道、橋聯、或其它任何適宜的連接元件來實現。在一些實施方案中，收集和再生區可以與超過一個用于試劑溶液的儲存器連接，或者可以與裝置中使用的每種試劑溶液的一個儲存器連接。術語“與用于不混溶中間流體的儲存器連接的出口”如本文所用是指上文所述的收集和再生區，與僅含有本發明不混溶中間流體的另外的儲存器之間的直接或間接液體連接件。此連接件可以通過管、通道、毛細通道、橋聯、或其它任何適宜的連接元件來實現。
[0127]用于試劑溶液的和用于不混溶中間流體的儲存器可以與裝置的反應區連接而使得可以重引導和重利用各自的流體，或者與裝置的任何其它區或區域連接，例如與如上文所述的引入區。
[0128]在本發明另一個實施方案中，用于試劑溶液的和用于不混溶中間流體的所述儲存器或多個儲存器是可以從所述裝置移除的，例如使得可以在外部的位置儲存如冰箱或冷卻設施。此種可移除性可以通過在入口和/或出口區塊存在的門控(gating)和鎖控(locking)元件來實現。從本發明的裝置移除儲存器的可能性進一步提高了反應溶液(例如含有貴重的酶或其它組分)的重利用性，這是通過在不同的裝置中或在不同的時間點(例如在儲存期之后)提供進一步的使用。或者，可移除儲存器還可以用于在使用前儲存反應溶液(例如含有貴重的酶或其它組分)。在具體的實施方案中，鎖控也可以是持久性的。如上文所述的入口構件可以這樣的方式設計，其使得可以有效引入流體單元，這例如是通過使其位于收集和再生區的頂端。出口構件因而可可以這樣的方式設計，其使得試劑溶液和不混溶中間流體可以有效撤離。例如，出口可以位于收集和再生區的下半部和上半部、三分之一處(third)或四分之一(quarter)處。或者，入口可以是根據收集和再生區中液體的量而可移動的重定位的。或者，收集和再生區可包括超過一個出口構件，其優選是可以關閉的，并且可以根據液體的量以及試劑溶液相和不混溶中間流體相的位置來使用。
[0129]入口和出口構件可以進一步裝配有適宜的驅動元件例如泵，或者裝配有適宜的封閉實體如門、鎖，或者裝配有分支小管等。
[0130]在本發明另外的具體實施方案中，收集和再生區可以與裝置的所述反應區或引入區直接連接，例如使所述試劑溶液和所述不混溶中間流體可以直接循環(例如通過直接的液體連接件)。[0131]在本發明另外的實施方案中，還可以將洗滌緩沖液與所述不混溶中間流體和/或試劑溶液分離，只要所述洗滌緩沖液不與所述試劑混溶。如果在裝置中使用洗滌緩沖液，則可提供收集和再生區使得所述洗滌緩沖液和本文所述的不混溶中間流體可以經重力分離。相應的收集和再生區因而可以裝配有與裝置的反應區或其它區相連的入口，以及用于經使用的洗滌緩沖液的出口(導向廢棄物模塊)和用于不混溶中間流體的出口(導向儲存器或直接引導回其它裝置區例如本文所述的反應區)。或者，所述洗滌緩沖液還可以被再利用并因而可以被轉移至儲存器和/或直接轉移回裝置的其它區，特別是如上文所述的反應區。對于重利用洗滌緩沖液，所述裝置可以提供過濾或消毒模塊。
[0132]在另一方面，本發明涉及用于進行分子反應的另外的裝置，包括:(a)反應區，包含其上固定有化學或生化可識別實體的基材；(b)儲存器和液體連接件，使試劑溶液、不混溶中間流體以及任選存在的洗滌緩沖液能通過所述反應區，其中所述不混溶中間流體能夠從所述反應區替換所述試劑溶液；和(C)重導向和分配模塊，其中檢測從所述不混溶中間流體至所述試劑溶液的轉換并分離所述流體和溶液，使得能通過將所分離的液體引導回所述反應區而再利用所述不混溶中間流體和所述試劑溶液。反應區(a)以及儲存器和液體連接件(b)已在上文有描述。
[0133]本文所述的“重導向和分配模塊”是指將上文所述流體單元改向或重導向至不同方向的技術實體，如改向或重導向至裝置的分支管或區(例如連接至本文所述的裝置的反應區)，其中反應溶液單元被改向至一個特定方向，而不混溶中間流體單元被改向至另一個特定方向(不同于所述反應溶液單元所改向的方向)。類似地，可以對不同類型的試劑溶液進行差異性改向。可以通過上文所述的移動或驅動技術來進行相應的改向，例如氣動驅動、活塞驅動、或應用定向真空、使用一或多個閥。有效改向的前提是檢測不相同的流體單元之間的轉換。流體單元之間的轉換可以如上文所述進行檢測，例如通過用適宜的傳感器、照相機或其它本領域已知的技術實體來確定顏色、pH、電性質或其它適宜參數中的差異。此類技術實體優選與所述改向模塊連接，例如通過微電子流或者計算機化的評估模塊，其上的例如可以在裝置中自動或半自動地分配流體單元。也可在裝置的其它區域(例如在分支管附近)提供另外的傳感器或測定模塊。
[0134]在本發明具體的實施方案中，所述重導向和分配模塊可包含包含與反應區連接的一個入口以及分別與用于試劑溶液的儲存器和用于不混溶中間流體的儲存器相連的兩個出口。術語“與反應區相連的入口 ”如本文所用是指如上文所述的反應區與重導向和分配模塊之間的直接或間接液體連接件。此連接件可以通過管、通道、毛細通道、橋聯、或其它任何適宜的連接元件來實現。其也可以是反應區與重導向和分配模塊之間可以關閉的直接連接件，例如是通過門或鎖來關閉。術語“與用于試劑溶液的儲存器相連的出口”如本文所用是指如上文所述的重導向和分配模塊與僅含有試劑溶液(優選僅含有一種類型的試劑溶液或者給定的組分)的儲存器之間的直接或間接液體連接件。此連接件可以通過管、通道、毛細通道、橋聯、或其它任何適宜的連接元件來實現。在一些實施方案中，重導向和分配模塊可以與超過一個用于試劑溶液的儲存器連接，或者可以與裝置中使用的每種試劑溶液的一個儲存器連接。術語“與用于不混溶中間流體的儲存器連接的出口 ”如本文所用是指上文所述的重導向和分配模塊與僅含有本發明不混溶中間流體的另外的儲存器之間的直接或間接液體連接件。此連接件可以通過管、通道、毛細通道、橋聯、或其它任何適宜的連接元件來實現。用于試劑溶液的和用于不混溶中間流體的儲存器可以與裝置的反應區連接而使得可以重引導和重利用各自的流體，或者與裝置的任何其它區或區域連接，例如與如上文所述的引入區。在本發明另一個實施方案中，用于試劑溶液的和用于不混溶中間流體的所述儲存器或多個儲存器是可以如上文所述從裝置移除的。
[0135]在本發明另外的具體實施方案中，重導向和分配模塊可以與裝置的所述反應區或引入區直接連接，例如使所述試劑溶液和所述不混溶中間流體可以直接循環(例如通過直接的液體連接件)。
[0136]在本發明另外的實施方案中，還可以將洗滌緩沖液與所述不混溶中間流體和/或試劑溶液分離，只要所述洗滌緩沖液不與所述試劑混溶。如果在裝置中使用洗滌緩沖液，則可提供重導向和分配模塊使得本文所述的洗滌緩沖液和不混溶中間流體可以重導向。因而相應的重導向和分配模塊可裝配有與裝置的反應區或其它區相連的入口，以及用于經使用的洗滌緩沖液的出口(導向廢棄物模塊)和用于不混溶中間流體的出口(導向儲存器或直接引導回其它裝置區例如本文所述的反應區)。或者，所述洗滌緩沖液還可以被再利用并因而可以被轉移至儲存器和/或直接轉移回裝置的其它區，特別是如上文所述的反應區。對于重利用洗滌緩沖液，所述裝置可以提供過濾或消毒模塊。
[0137]在本發明另外的實施方案中，可以在重復使用之后進行試劑溶液中組分的再生。另外，可以測定所述試劑溶液中試劑的質量，例如在原位、或者在裝置的外部測定區塊中進行。
[0138]在本發明另外的優選實施方案中，上文所述的、或者在本發明方法的背景中所提到的裝置是微觀流體裝置。術語“微觀流體裝置”如本文所用是指可以對約束在小尺度、優選亞毫米尺度的流體進行精確控制和操作的裝置。通常，微觀流體裝置執行小的體積，例如在nl、pi或fl的范圍，和/或其可執行小的總大小。另外，本發明的微觀流體裝置可消耗較低量的能量。在微觀流體裝置中，可以實現如下效果，諸如層流、比表面張力、電濕潤(electrowetting)、快速熱弛豫、存在電表面電荷(electrical surface charge)以及擴散作用，和/或可以將所述效果用于進行本發明的方法。在一些實施方案中，微觀流體裝置可以與外部來源或外部元件連接，例如對于重利用目的的分離或儲存或導管是可能的。另外，所述微觀流體裝置可包含電子或計算機界面，使得可以控制和操作裝置中的活動、和/或可以檢測或測定反應結果或產物。
[0139]在本發明另外的具體實施方案中，所述微觀流體裝置可以是集成微觀流體盒(integrated microfluidic cartridge)。術語“集成微觀流體盒”如本文所用是指使微觀流體緊湊和調整其大小，例如用室或容器樣的形式包含所有必須的連接件、區、及任選存在的組分。所述盒可以例如是完全封閉的，或者是部分封閉的使得可以通過可再密封的入口引入樣品、組分等。所述盒還可以裝配有用于掃描或者檢測裝置的比對構件(alignmentstructure),例如掃描儀的識別部分、指示所提供的組分的條形碼或矩陣碼(matrixcode)、生產日期等；或者裝配有檢測單元的界面使得可以對如上文所述的反應結果進行電子或光學測定。在另外的優選實施方案中，所述盒可包含已裝載的試劑溶液和/或不混溶中間流體，例如用于臨床應用的一次性使用的目的，使得可以避免交污染。
[0140]在本發明另外的特別優選的實施方案中，以本發明的方法和裝置為背景的如上文所述的分子反應是測序反應或核酸合成反應。[0141]術語“測序反應”如本文所用是指在確定序列的方法中使用的一或多種反應。此類確定序列的方法是本領域技術人員已知的。這些方法包括下一代測序方法或高通量測序方法，例如，焦磷酸測序，其基于Roche提供的用于454 Genome Sequencer的技術。此方法在位于油溶液中的小水滴內部擴增DNA，其中每個小水滴含有附著至單一引物包被的珠的單個DNA模板，其繼而形成克隆群落。焦磷酸測序使用熒光素酶以產生光用于檢測加至初始DNA的個體核苷酸,而經組合的數據則用于產生序列讀出結果。另一個實例是Illumina或Solexa測序的方法學，其基于可逆染料_終止劑。DNA分子通常附著至載玻片上的引物并被擴增，從而形成局部的克隆群落。隨后，一次可添加一種類型的核苷酸，而未并入的核苷酸則被洗掉。隨后，可以獲得經熒光標記的核苷酸的圖像并將染料從DNA化學去除，使得可以進行下個循環。另外的實例是Applied Biosystems的SOLiD技術,其利用連接測序。此方法是基于使用所有可能的給定長度寡核苷酸的匯集，所述寡核苷酸根據所測序的位置進行標記。將這些寡核苷酸復性并連接。隨后，由DNA連接酶對匹配的序列進行的優先連接通常得到信號，所述信號提供在該位置的核苷酸的信息。由于DNA通常是由乳化PCR所擴增，則所得的珠(每個僅含有相同DNA分子的拷貝)可以被沉積在載玻片上而得到了具有與Illumina測序相當的質量和長度的序列。還有另外的實例是Helicos的Heliscope技術，其中通過拴定至陣列的PolyT寡聚物來捕獲片段。在每個測序循環，添加聚合酶和單一熒光標記的核苷酸并對陣列成像。熒光標簽隨后被去除并重復該循環。本發明所涵蓋的測序技術的另外的實例有微觀流體Sanger測序，和基于微芯片的測序方法。本發明還慮及了這些技術的進一步開發，例如序列測定準確性、或者測定生物體基因組序列所需的時間等的進一步改善。這些測序方法可以在目前提供的方法學內進行調整，以使得由于可在反應進行期間提高酶和/或寡聚物和/或核苷酸的量，從而可以高度提高讀取長度和降低成本。所述方法的進一步改變以及細節是本領域技術人員熟知的，并且可以得自適宜的出版物例如 Metzger, 2010, Nature Reviews, Genetics, Vol 11。
[0142]術語“核酸合成反應”如本文所用是指在基材上直接產生寡核苷酸序列的方法，例如以陣列的形式。典型的方法可以例如包括，在硅石基材上的光刻法合成(photolithographic synthesis),其中使用光以及光敏感遮蔽劑以便一次一個核苷酸地生成序列。在提供單一核苷酸的溶液前，將每個可應用的探針選擇性地去遮蔽(unmask)，繼而發生遮蔽反應并將下一組探針去遮蔽以為了不同的核苷酸暴露作準備。若干次重復后，完整構建所涉及的探針的序列。因而，所構建的寡核苷酸依據所期望的目的可以更長(例如60-聚體)或更短(例如25-聚體)。所述方法的進一步改變以及細節是本領域技術人員熟知的，并且可以得自適宜的出版物例如Pease等，1994，PNAS 91:5022 - 5026。
[0143]在另一方面，本發明涉及本文所定義的不混溶中間流體的用途，其用于用于從上文所述的微觀流體裝置中的反應區基材替換所述反應區中存在的試劑溶液、或者洗滌溶液或緩沖液。優選所述試劑溶液或洗滌溶液或緩沖液的替換可以是完全的或基本完全的替換，例如導致99%、99.9%,99.99%或100%的試劑溶液或任意其它容易從反應區基材去除。
[0144]在本發明優選的實施方案中，本文所定義的所述不混溶中間流體可以用于從反應區替換試劑溶液、或者洗滌溶液或緩沖液，其中所述反應區包含具有化學或生化可識別實體的基材。
[0145]在本發明更優選的實施方案中，如本文所定義的所述不混溶中間流體可以用于通過從所述反應區基材替換試劑溶液、或者洗滌溶液或緩沖液，從而使所述化學或生化可識別單元具有活性或反應性。術語“使……具有活性或反應性”如本文所用是指去除所述基材之中或之上的化學或生化實體上任何結合的或濕潤的實體。所述基材因而可以經清潔去除廢棄產物、結合的實體、緩沖成分、酶底物等。
[0146]在本發明另一特別優選的實施方案中，所述化學或生化可識別實體是核酸，肽，多肽，碳水化合物，或其修飾的形式，或者是核酸，肽，多肽，碳水化合物，或其修飾的形式的陣列，或者其任意組合。
[0147]術語“核酸”如本文所用是指任意本領域技術人員已知的核酸，優選是指DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA。DNA可以是例如A_DNA、B_DNA或Z-DNA的形式。RNA可以例如是P-RNA即批喃糖基-RNA(pyranosysl-RNA)、或者經結構修飾的形式如發夾RNA或頸環RNA的形式。術語“PNA”涉及肽核酸，即人工合成的類似于DNA或RNA的聚合物，其用于生物學研究和醫學治療，但是其未知是可自然發生的。PNA骨架通常由重復的N-(2-氨乙基)-甘氨酸單元(由肽鍵連接)所組成。各種嘌呤和嘧啶堿基通過亞甲基羰基鍵連接至所述骨架。PNA—般像肽一樣進行描述，N-端在前面(左邊)的位置而C-端在右邊。術語“CNA”涉及氨基環己基乙烷酸核酸。另外，該術語涉及環戊烷核酸，即包含例如2'-脫氧氨基甲酸鳥苷酸的核酸分子。
[0148]術語“HNA”涉及己糖醇核酸，即由標準的核堿基和磷酸化的1，5-脫水己糖醇骨架所構建的DNA類似物。術語“LNA”涉及鎖定的核酸。通常，鎖定的核酸是經修飾并因而不可接近的RNA分子。可以用連接2'和4'碳的額外橋聯來修飾核苷酸的核糖部分。此橋聯將核糖鎖定在3'-內結構構象。所述鎖定的核糖構象增強堿基堆積和骨架預組織。這可顯著地提高熱穩定性，也即寡核苷酸的解鏈溫度。術語“AM”涉及阿拉伯糖核酸或其衍生物。本發明北京中，優選的ANA衍生物是2，-脫氧-2'-氟-β -D-拉伯糖核苷(2，F-ANA)。在另外的實施方案中，核酸分子可以包含任意的DNA、RNA、PNA、CAN、HNA、LNA和ANA的組合。在另外的實施方案中，上文所定義的核酸分子可以是短寡核苷酸、長寡核苷酸或多核苷酸的形式。
[0149]以本發明為背景的術語“肽”是指包含超過一個氨基酸的任意類型的氨基酸序列，特別是長達40或50個氨基酸的短序列。在一些實施方案中，該術語還指蛋白結構或其功能性衍生物。另外，肽可以與另外的化學部分或官能性組合。
[0150]如本文所用，術語“多肽”是指中等或長的氨基酸序列，優選包含40或50個氨基酸。在一些實施方案中，該術語還指蛋白結構或其功能性衍生物。另外，多肽可以與另外的化學部分或官能性組合。
[0151]如本文所用，術語“碳水化合物”是指具有經驗式Cm(H2O)n的有機化合物，也即僅由碳、氫和癢所組成，具有2:1的碳:氫原子比`。該類包括單糖、二糖、寡糖、和多糖。優選提到的是糖，即單糖和二糖。
[0152]本發明的多肽、蛋白質或肽的“修飾”可以是乙酰化，聚乙二醇化，羥乙基淀粉化，甲酰化，磷酸化，酰胺化，用已知的保護/封閉基團衍生化，特定的化學切割，蛋白水解切害I]，連至細胞配體或其它已知蛋白或者高氨基酸聚合物化(即融合至富含甘氨酸的高氨基酸聚合物(HAP))等。可以用本領域技術人員已知的適宜技術來進行此類修飾。另外，所述多肽、肽或變體可含有一或多種非典型氨基酸。[0153]“陣列”如本文所用是指用于陣列中捕獲分子和周圍環境中潛在作用物(例如如上文所述的介質)之間相互作用的有序排列。陣列可以包括任意二維和三維排列的可接近區域，優選是二維排列。陣列可以包括核酸，例如寡核苷酸、肽/多肽實體、碳水化合物、或者這些的混合物或組合。
[0154]在本發明優選的實施方案中，所述不混溶中間流體包含氟化烴。在本發明另外的優選實施方案中，所述不混溶中間流體由氟化烴組成。在本發明另一個優選的實施方案中，所述不混溶中間流體包含全氟化烴。在本發明另一個優選的實施方案中所述不混溶中，間流體由全氟化烴組成。在本發明另一個優選的實施方案中，所述不混溶中間流體包含氟化硅酮。在本發明另一個優選的實施方案中，所述不混溶中間流體由氟化硅酮組成。在本發明另一個優選的實施方案中，所述不混溶中間流體包含全氟化硅酮。在本發明另一個優選的實施方案中，所述不混溶中間流體由全氟化硅酮組成。在本發明另一個優選的實施方案中，所述不混溶中間流體包含氟化的飽和烴。在本發明另一個優選的實施方案中，所述不混溶中間流體由氟化的飽和烴組成。在本發明另一個優選的實施方案中，所述不混溶中間流體包含全氟化的飽和烴。在本發明另一個優選的實施方案中，不混溶中間流體由全氟化的飽和烴組成。
[0155]在本發明的一些實施方案中，所述不混溶中間流體包含上述烴的組合或者由上述烴的組合組成。
[0156]術語“烴”如本文所用是指主要由氫和碳所組成的分子。該類包括烴基、芳香族烴(芳烴)、烷、烯、環烷和基于炔的化合物。優選該術語涉及烷如丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷等，或者涉及烯如戊烯、己烯、庚烯、辛烯、壬烯、癸烯等。在本發明的一些實施方案中，烴類還包括雜原子特別是氮，或者烴類可以另外含有官能團特別是胺基。
[0157]術語“硅酮(silicone) ”如本文所用是指聚合的硅氧烷(siloxane)或聚硅氧烷，即混合的無機-有機聚合物，具有通式[R2SiO]n，其中R是有機基團如甲基、乙基或苯基。
[0158]本發明的“氟化烴”或“氟化硅酮”是其中一個或多個但卻不是全部的氫被氟原子取代的烴或者硅。優選取得或使用具有高氟化度的烴和/或硅酮，以提供親水性和疏水性物質的低溶解。
[0159]本發明的“全氟化烴”或“全氟化硅酮”是其中所有氫原子都被氟原子取代的烴或硅酮分子。
[0160]在本發明另外的優選實施方案中，所述不混溶中間流體具有低于大約0.1Pa.s的粘度，高于大約1100kg/l的密度，高于大約50°C的沸點和低于大約1%的水溶性。
[0161]在本發明的一些實施方案中，疏水不混溶中間流體可以例如具有大約0.09Pa.S、
0.08Pa.s、0.07Pa.s、0.06Pa.s、0.05Pa.s、0.04Pa.s、0.03Pa.s、0.02Pa.s、0.0lPa.s 等的粘度和超過大約1100kg/l的密度，高于大約50°C的沸點和低于大約1%的水溶性。
[0162]在本發明另外的實施方案中，所述不混溶中間流體可以，例如，具有大約1200kg/
1、1300kg/l、1400kg/l、1500kg/l、1750kg/l、2000kg/l、2500kg/l等的密度以及低于大約0.1Pa.s的粘度，高于大約50°C的沸點和低于大約1%的水溶性.[0163]在本發明另外的實施方案中，所述不混溶中間流體可以，例如，具有大約60°C、7o°c、8o°c、9o°c、io(rc、ii(rc、i2(rc、i3(rc、i4(rc、i5(rc 或更高的沸點，以及低于大約0.1Pa.s的粘度，高于大約1100kg/l的密度，和低于大約1%的水溶性。[0164]在本發明另外的實施方案中，疏水不混溶中間流體可以例如，具有大約0.9%、
0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1% 或更低的水溶性或低于大約 0.1Pa.s 的粘度，超過大約1100kg/l的密度，和高于大約50°C的沸點。
[0165]在本發明另外的實施方案中，疏水不混溶中間流體可以例如具有，大約0.09Pa.S、
0.08Pa.s、0.07Pa.s、0.06Pa.s、0.05Pa.s、0.04Pa.s、0.03Pa.s、0.02Pa.s、或 0.0lPa.s 等的粘度；和大約 1200kg/l、1300kg/l、1400kg/l、1500kg/l、1750kg/l、2000kg/l、或 2500kg/
I等的密度；和大約 6o°c、7o°c、8o°c、9(rc、io(rc、ii(rc、i2(rc、i3(rc、i4(rc、i5(rc 或更高的沸點；和大約 0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1% 或更低的水溶性。
[0166]可以根據本領域技術人員已知的適宜的測定法和過程來測試和測定上述參數和/或流體的不混溶性。本發明因此慮及了落入上文所提供的參數組之內并且不混溶的流體，例如提供適宜的測試或測定法測定。
[0167]在本發明另一個優選的實施方案中，所述不混溶中間流體是FluorinertElectronic Liquid FC-40。該術語特別是指圖3所示的化合物,并且還進一步具有如下特性:⑴表觀:清晰、無色，(ii)平均分子量:650沸點(Iatm):165°C ； (iv)流動點:_57V ; (V)計算的臨界溫度:543K ； (vi)估算的臨界壓:1.18x10?帕斯卡；(vii)蒸汽壓:287帕斯卡；(vii)汽化潛熱(正常沸點):69J/g ； (vii)液態密度:1855kg/m3 ； (viii)運動粘度:2.2厘沱；(ix)絕對粘度:4.1厘泊；(X)液態比熱:1100J kg-1℃ ―1 ； (xi)液態導熱性:0.065---1。。-S(xii)膨脹系數:0.0012。。-S(Xiii)折射指數:1.290 ； (xiii)水溶性 <7ppmw ； (xiv)水中溶解度:〈5 ；ppmw ； (xv)電介質強度:46kV,0.1〃 間隔(gap) ； (xvi)電介質常數:1.9 ;和(xvii)電阻率(ASTM D-257):4.0xl015ohm cm
[0168]在本發明另外的具體實施方案中，FC-40可以與一或多種其它不混溶中間流體組合，例如上文所述的一或多種不混溶中間流體。
[0169]在另外的優選實施方案中，本發明涉及上文所述裝置用于進行測序反應或核酸合成反應的用途。以本發明用途權利要求為背景的測序反應應當被理解為上文所定義的測序反應、或者本領域技術人員所知道的測序反應。以本發明用途權利要求為背景的核酸合成反應應當被理解為上文所定義的核酸合成反應、或者本領域技術人員所知道的核酸合成反應。還慮及了上文所定義的裝置用于進行上文所述分子反應、或本領域技術人員所知的分子反應的用途。
[0170]提供如下的實施例和附圖用于說明目的。因而，應理解實施例和附圖不應被認為是限定。本領域技術人員顯然能夠設想出本文所述原理的另外的修改。
實施例
[0171]實施例1 - FC-40對雜交信號的作用
[0172]為測試FC-40對雜交信號的作用，以InM的濃度對兩個不同的探針即PCR12和PCR5進行雜交。
[0173]PCR產物12包含114堿基對并且是人類染色體的部分，2011年3月15號的登錄號是N0.NCBI36:12:111399702:111400602:1 ;序列報道如下(SEQ ID NO:1)，對捕獲探針的特異性結合區域加有下劃線:
[0174]AGTTACATTGCCACACAAGGCTGCCTGCMAACACGGTGAATGACTTTTGGCGGATGGTGTTCCAAGAAAACTCCCGAGTGATTGTCATGACAACGAAAGAAGTGGAGAGAGGA(SEQ ID NO:1)
[0175]PCR產物5包含108堿基對并且是人類染色體的部分，2011年3月15號的登錄號是 N0.NCBI36:5:127637813:127638713:1 ;序列報道如下(SEQID NO: 2)，對捕獲探針的特異性結合區域加有下劃線:
[0176]ACCAGGTGGACATTTACAGGTAAACCCCCCCAGGGTGTTGACACAGAGGAACTGGCAGTTATGCTGCTTTGTTTGACATTCATCAAGGTCTGAAATTAGAGAGAAGCC(SEQ ID NO:2)
[0177]合成PCR產物并用Atto770 (Biolegio)熒光標記。長度均為76個核苷酸(Biolegio)的兩種類型的合成寡核苷酸分別被用作PCR12和PCR5的捕獲探針:
[0178]捕獲探針12:
[0179]GGAGTTTTCTTGGAACACCATCCGCCAAAAGTCATTCAC CGTGTTTTGCAGGCAGCCTT(SEQ IDNO:3).[0180]捕獲探針5:
[0181]CTTGATGAATGTCAAACAAAGCAGCATAACTGCCAGTTCCTCTGTGTCAACACCCTGGGG(SEQ IDNO:4).[0182]將寡核苷酸以6 μ M的濃度溶解至含1.5Μ甜菜堿的PBS中，在潔凈間設施內按排噴墨印壓至氨基硅烷載玻片(Genorama SA載玻片)上，并UV光交聯；每個點由300pL的溶液所產生。
[0183]將由Atto700熒光標記的參照點溶解至含有以2 μ M的濃度溶解至含1.5Μ甜菜堿的PBS中，并按平行的排壓印。
[0184]為了流過用PCR 12和PCR 5進行的雜交測試，在壓印區上構建具有入口、出口、和U型微通道的微觀流體構件(寬1.2mm,總長50mm，高100 μ m)。通過注射泵的手段經入口將雜交溶液注射至微通道中。
[0185]將PCR 12和PCR 5以InM的濃度溶解在雜交緩沖液中(3x SSC w0.11%SDS)，于95°C變性10分鐘，在冰上冷卻并通過注射泵的手段以6 μ 1/min注射至微觀流體構件中。將該流保持恒定30分鐘。
[0186]將該體系保持在熱盤上以確保雜交期間微通道內部54°C的溫度。
[0187]在54°C流過雜交30分鐘后，將流體從微通道移除，并用共焦掃描儀分析該區域，以檢測經標記PCR產物的結合。
[0188]為評估FC-40對雜交過程的惰性，以如下條件進行三個平行試驗措施:
[0189]l)FC-40流過進行5分鐘，室溫，以6 μ 1/min流過+PCR12和PCR5的雜交如前所述；
[0190]2) FC-40流過進行5分鐘，以6 μ 1/min流過+洗滌緩沖液(lx SSC w0.2%SDS)進行5分鐘，室溫，以6 μ 1/min流過+PCR12和PCR5的雜交如前所述；和
[0191]3)PCR12和PCR5的雜交如前所述，未接觸FC-40。
[0192]由圖4，部分1、2和3(相應于試驗部分1)、2)和3)，如前)可知，與FC-40的接觸對雜交信號無影響。
[0193]由圖4，部分1、2和3(相應于試驗部分1)、2)和3)，如前)可知，與FC-40的接觸對雜交信號無影響。
[0194]實施例2 - FC-40對酶末端修復PRC反應的作用[0195]為測試FC-40對酶末端修復PRC反應的作用，用Cp40am(具有氨基官能性的合成寡核苷酸，58個核苷酸長(Biolegio))進行雜交。Cp40am的序列報道如下(SEQ ID NO: 5):
[0196]Cp40am:
[0197]AGTCCTCACCCAAGCGCACGTTTTCGATTAGCTGCCCAAGTCTTCAATGCATCTTACC(SEQ IDNO:5)
[0198]將Cp40am溶解至具有1.5M甜菜堿的PBS中，并作為捕獲探針壓印至Nexterion載玻片P(Schott),如數據表所推薦那樣。將16-孔上層構件(superstructure) (Schott)應用于所壓印的載玻片。
[0199]將As40+4(具有4個突出核苷酸的互補探針(GCTA-))溶解于雜交緩沖液(3x SSCw0.1%SDS)至IOnM ;將50 μ I的雜交溶液引入孔中。于50°C進行雜交30分鐘。
[0200]在洗滌緩沖液(lx SSC w0.2%SDS)中洗滌之后，以Klenow聚合酶在NEB緩沖液中(w0.1%BSA)用核苷酸mic dNTP-C*來進行末端修復反應，其中C核苷酸經Cy5標記；將dNTP-C*混合物稀釋至300nM的濃度。此溶液作為參照溶液(參見圖5 ;〃Ref〃)。
[0201]為了測試FC-40對末端修復反應的影響，根據如下比例將漸增量的FC-40加至聚合酶溶液:1:1000、1:100、1:10、1:5。
[0202]將50 μ I的每種溶液應用于不同的孔并在37°C進行末端修復反應30分鐘。
[0203]由圖5，第3欄可知，達到1:100 (v/v)的微量的FC-40在末端修復步驟期間不影響Klenow聚合酶的活性。令人吃驚的是，更高濃度的FC-40 (第I和第2欄)表現出提高聚合酶反應的產率。
【權利要求】
1.用于在裝置中進行分子反應的方法，包括如下步驟: (a)將一或多種試劑溶液和不混溶中間流體引入所述裝置中，其中所述裝置包含基材，所述基材上固定有化學或生化可識別實體； (b)在所述固定的化學或生化可識別實體與所述試劑溶液之間進行分子反應；或者在存在所述試劑溶液時在所述固定的化學或生化可識別實體上進行分子反應； (c)用所述不混溶中間流體替換存在于所述基材上的試劑溶液； (d)分離所述不混溶中間流體和所述試劑溶液，優選在收集和再生區進行；和 (e)重利用所述試劑溶液和/或不混溶中間流體進行一或多次步驟(a)至(e)的重復。
2.權利要求1的方法，還包括用洗滌緩沖液洗滌所述基材的步驟，其中通過所述不混溶中間流體將所述洗滌緩沖液與所述試劑溶液分開。
3.權利要求1或2的方法，還包括測量所述分子反應的狀態或結果的步驟，優選通過光學和/或電手段進行。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述替換步驟(c)通過氣動流體驅動、蠕動傳動、活塞和傳動膜驅動、或應用定向真空來進行。
5.權利要求1-4任一項的方法，其中所述分離步驟(d)通過使所述試劑溶液和所述不混溶中間流體經重力分離進行。
6.用于進行分子反應的裝置，包括: (a)包含基材的反應區，所述基`材上固定有化學或生化可識別實體； (b)儲存器和液體連接件，其使得試劑溶液、不混溶中間流體以及任選地存在的洗滌緩沖液能通過所述反應區，其中所述不混溶中間流體能夠從所述反應區替換所述試劑溶液；和 (C)收集和再生區，其中所述不混溶中間流體和所述試劑溶液可由重力分離來分離，使得能通過將所分離的液體引導回所述反應區而再利用所述不混溶中間流體和所述試劑溶液，其中所述收集和再生區任選地包含一個與反應區連接的入口和兩個分別與試劑溶液的儲存器和不混溶中間流體的儲存器連接的出口。
7.用于進行分子反應的裝置，包括: (a)反應區，包含其上固定有化學或生化可識別實體的基材； (b)儲存器和液體連接件，其使得試劑溶液、不混溶中間流體以及任選地存在的洗滌緩沖液能通過所述反應區，其中所述不混溶中間流體能夠從所述反應區替換所述試劑溶液；和 (C)重導向和分配模塊，其中檢測從所述不混溶中間流體至所述試劑溶液的轉換并分離所述流體和溶液，使得能通過將所分離的液體引導回所述反應區而再利用所述不混溶中間流體和所述試劑溶液，其中所述重導向和分配模塊任選地包含一個與反應區連接的入口和兩個分別與試劑溶液的儲存器和不混溶中間流體的儲存器連接的出口。
8.權利要求1-5任一項的方法或者權利要求6或7的裝置，其中所述裝置是微觀流體裝置，優選集成微觀流體盒。
9.權利要求1-5或8任一項的方法或者權利要求6-8任一項的裝置，其中所述分子反應是測序反應或者核酸合成反應。
10.不混溶中間流體的用途，其用于從微觀流體裝置的反應區基材替換所述反應區中存在的試劑溶液，其中所述反應區包含具有化學或生化可識別實體的基材，以及用于使得所述化學或生化可識別單元活化或具有反應性。
11.權利要求1_5、8或9任一項的方法、權利要求6-9任一項的裝置或者權利要求10的用途，其中所述化學或生化可識別實體是核酸、肽、多肽、碳水化合物、其修飾的形式，核酸、肽、多肽、碳水化合物、其修飾的形式的陣列，或者其任意組合。
12.權利要求1-5、8、9或11任一項的方法、權利要求6-9或11任一項的裝置或者權利要求10或11的用途，其中所述不混溶中間流體包含或由(全)氟化烴和/或(全)氟化硅酮組成，優選包含或由(全)氟化飽和烴組成。
13.權利要求1-5、8、9或11任一項的方法、權利要求6-9或11任一項的裝置或者權利要求10或11的用途，其中所述不混溶中間流體具有低于大約0.1Pa.s的粘度，高于大約1100kg/l的密度，高于大約50°C的沸點和低于大約1%的水溶性。
14.權利要求1-5 、8、9、11、12或13任一項的方法、權利要求6_9、11、12或13任一項的裝置或者權利要求10、11、12或13任一項的用途,其中所述不混溶中間流體是FluorinertElectronic Liquid FC-40.
15.權利要求6-9、11、12、13或14任一項的裝置用于進行測序反應或者核酸合成反應的用途。
【文檔編號】B01L3/00GK103459035SQ201280014380
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年3月20日 優先權日:2011年3月22日
【發明者】R·溫貝格爾-弗里德爾, P·J·范德扎格, E·塞爾沃利 申請人:皇家飛利浦有限公司