專利名稱：一種用于分離水溶性聚合物和蛋白用色譜填料及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種色譜填料，特別涉及一種用于分離水溶性聚合物和蛋白用色譜填料及其制備方法。
背景技術：
隨著色譜技術的迅速發展，色譜填料也在不斷的更新和發展，人們已經制備出各種不同種類的新型色譜填料來解決分離科學中存在的各種問題。目前，分離化學中面臨的主要問題是復雜生物樣品的分離比較困難。由于生物樣品的組成極其復雜，許多生物大分子在生物樣品中的含量極低，因而分離干擾大、分離純化步驟繁多、流程長；并且，許多生物大分子在使用有機溶劑作為流動相分離純化時極易失去活性；因此，生物大分子的分離純化技術需要以此為依據，而選擇合適的色譜分離填料是克服生物大分子在分離純化過程中存在上述問題、獲得對其進行高效分離純化的關鍵。體積排阻色譜技術是20世紀60年代初發展的一種快速而又簡單的分離技術，又稱尺寸排阻色譜或凝膠色譜。所用的固定相是具有一定孔徑范圍的多孔性凝膠，是一種按目標物分子大小進行分離的色譜技術。它的分離并不依賴于流動相和固定相間的作用力，按流動相類型不同分為凝膠滲透色譜和凝膠過濾色譜。其常用的填料主要有硅膠或多聚體兩大類，由于硅膠的內水體積更大，且孔徑更均一，硅膠比聚合物凝膠有更好的分辨力，常被用于分子量范圍在數千至近百萬的蛋白質、多肽和生物酶等生物樣品的分離。但傳統工藝制備分離蛋白、多肽和生物酶等生物大分子的體積排阻色譜填料存在親水性不夠，穩定性較差等問題。因此，提供一種具有較大孔隙容積、較低的疏水性、較高的理論塔板數和較大的峰容量的色譜填料，正成為國內外研究的熱點。
發明內容
針對現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種制備分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料的方法，該方法制備的色譜填料能用作多種分離保留模式，能分別作為HILIC模式和體積排阻模式用于液相色譜的分離分析，特別適用于水溶性聚合物和蛋白、多肽、生物酶等生物樣品。為實現上述目的，本發明提供一種用于分離水溶性聚合物和蛋白的親水性硅膠色譜填料的制備方法，包括如下步驟A硅膠活化，制得活化硅膠；B將所述活化硅膠進行環氧基改性，制得環氧基改性硅膠；C在所述環氧基改性硅膠上引入親水性聚合物，制得親水性聚合物改性硅膠 '及D將所述親水性聚合物改性硅膠水解，制得所述用于分離水溶性聚合物和蛋白的親水性硅膠色譜填料。
根據本發明的構思，所述A步驟包括將硅膠用蒸餾水清洗，然后用氫氟酸水溶液浸泡，隨后用蒸餾水洗滌至中性，最后用丙酮洗滌并干燥。根據本發明的構思，所述B步驟包括以硼酸緩沖液作為溶劑，將所述活化硅膠與環氧基硅烷化試劑在攪拌和回流下進行改性反應，其中所述環氧基硅烷化試劑有選為Y-(2，3-環氧丙氧)丙基二甲氧基娃燒。根據本發明的構思，所述C步驟包括將所述環氧基改性硅膠與親水性聚合物在攪拌和回流下進行改性反應，反應結束后，抽濾，并依次用蒸餾水、四氫呋喃、乙腈進行洗滌。根據本發明的構思，所述D步驟包括將所述親水性聚合物改性硅膠與檸檬酸緩沖液進行水解反應，反應結束后，抽濾，依次用蒸餾水和甲醇洗滌，真空干燥。根據本發明的構思，所述氫氟酸水溶液的質量濃度為O. 08%，且所述硅膠與氫氟酸水溶液的料液比為1:8-1:10。根據本發明的構思，所述硅膠與環氧基硅烷化試劑的質量比為1:2-1: 4，所述活化硅膠進行環氧基改性的反應時間為O. 5-2小時；反應溫度為70-100° C。根據本發明的構思，所述硼酸緩沖液的pH值為7. 0-9. 0，所述活化硅膠與硼酸緩沖液的料液比為1:8-1:10。根據本發明的構思，所述親水性聚合物為可溶性粉、纖維素或葡聚糖。根據本發明的構思，所述硅膠與可溶性淀粉的質量比為1: 2-1: 4，所述環氧基改性硅膠進行親水性聚合物改性的反應時間為20-24小時；反應溫度為70-100° C。根據本發明的構思，所述檸檬酸鹽緩沖液的pH值為2. 0-4. 0，所述硅膠與檸檬酸鹽緩沖液的料液比為1:8-1:10，所述親水性聚合物改性硅膠進行水解的反應時間為1-3小時，反應溫度為70-90° C。為實現上述目的，本發明同時還提供了一種用于分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料，通過上述任一項所述的制備方法制得。在本發明中，各反應步驟中所述的料液比為質量與體積之比。本發明通過如下的措施來實現首先，通過硅膠表面活性硅羥基與Y-(2，3-環氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷的反應將環氧基團鍵合到粒徑均一的多孔硅膠表面，形成環氧基改性硅膠，然后通過硅膠表面硅羥基與親水性聚合物(可溶性淀粉、纖維素以及葡聚糖等)的作用在其表面包覆一層聚合物，最后在酸性條件下使硅膠表面環氧基團水解形成二醇基，獲得二醇基改性的分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料。該填料具有較大的孔體積，較低的疏水性，較高的理論塔板數和較大的峰容量。本發明采用分子自組裝方式將親水性聚合物包覆在硅膠微球表面，通過合成聚合物包覆的二醇基色譜填料，大大增強其穩定性。使得水溶性聚合物、蛋白、生物酶、多肽等生物大分子的非特異性吸附極小；具有優良的分辨能力。并且，優越的鍵合相表面消除了其它的吸附作用，保持了樣品的生物活性，因而廣泛應用于生物大分子的分離。本發明制備的色譜填料與常規的色譜填料相比具有以下優點1.多孔硅膠表面包覆的親水性聚合物克服了填料存在親水性不夠理想的問題，并且增強了其穩定性。2.該填料對目標物具有多重保留機理，可以用作HILIC和體積排阻兩種色譜分離模式，對水溶性聚合物以及蛋白、多肽、生物酶等生物樣品具有極為優異的分離能力；3.該填料所用的流動相幾乎為純水相，分離條件極為溫和，因而極大程度地保證了樣品在分離過程中具有高生物活性；4.相比常規聚合物基質的色譜填料，硅膠基質的分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料具有較大的孔體積、較低的疏水性、較高的理論塔板數和較大的峰容量。
圖1為本發明用于分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料的合成示意圖。圖2為本發明實施例1所制備色譜填料分離頭孢米諾鈉及其相關物質的效果示意圖。圖3為本發明實施例1所制備色譜填料分離頭孢西丁鈉及其相關物質的效果示意圖。圖4為本發明實施例1所制備色譜填料分離頭孢地嗪鈉及其相關物質的效果示意圖。圖5為本發明實施例2所制備色譜填料分離門冬酰胺酶的效果示意圖。圖6為本發明實施例3所制備色譜填料分離分析胰島素的效果示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。但本發明并不限于以下的實施例。本發明提供一種用于分離水溶性聚合物和蛋白的親水性硅膠色譜填料的制備方法，包括如下步驟A硅膠活化，制得活化硅膠；B將所述活化硅膠進行環氧基改性，制得環氧基改性硅膠；C在所述環氧基改性硅膠上引入親水性聚合物，制得親水性聚合物改性硅膠；及D將所述親水性聚合物改性硅膠水解，制得所述用于分離水溶性聚合物和蛋白的親水性硅膠色譜填料。其中A步驟包括將硅膠用蒸餾水清洗,然后用氫氟酸水溶液浸泡，隨后用蒸餾水洗滌至中性，最后用丙酮洗滌并干燥。其中B步驟包括以硼酸緩沖液作為溶劑，將所述活化硅膠與環氧基硅烷化試劑在攪拌和回流下進行改性反應，其中所述環氧基硅烷化試劑有選為Y-(2，3-環氧丙氧)丙
基二甲氧基娃燒。其中C步驟包括將所述環氧基改性硅膠與親水性聚合物在攪拌和回流下進行改性反應，反應結束后，抽濾，并依次用蒸餾水、四氫呋喃、乙腈進行洗滌。其中D步驟包括將所述親水性聚合物改性硅膠與檸檬酸緩沖液進行水解反應，反應結束后，抽濾，依次用蒸餾水和甲醇洗滌，真空干燥。具體合成步驟過程，如圖1所示。圖1為本發明用于分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料的合成示意圖。以下為本發明制備用于分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料的實施例，但本發明的構思及其應用原料/儀器并不限于。實施例1 :分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料的制備(I)往500mL反應容器中加入50g硅膠，并加入200mL蒸餾水攪拌30分鐘、過濾，重復該步驟兩次。然后加入400mL質量比為O. 08%氫氟酸水溶液,攪拌24小時后用蒸懼水清洗至中性，最后加入200mL丙酮洗滌、過濾，110° C干燥12小時，得到經活化的硅膠；(2)往500mL反應容器中(裝有冷凝器、機械攪拌器、溫度計)中加入400mLpH=9. O的硼酸緩沖溶液(Tiidsol 緩沖液，購于廣州華粵行儀器有限公司)、50g經活化的娃月父和IOOmL Y -(2，3_環氧丙氧)丙基二甲氧基娃燒，80° C攬祥反應30分鐘；得到環氧基團改性硅膠；(3)向反應容器中加入IOOg可溶性淀粉，于97° C下回流攪拌反應20_22小時；反應結束后冷卻回流一夜(12小時左右)；依次用200mL熱的蒸餾水、200mL熱的四氫呋喃和200mL熱的乙腈清洗制備好的填料，過濾，得到可溶性淀粉改性硅膠；(4)將該可溶性淀粉改性硅膠重新置于反應容器中，加入500mL pH3. O檸檬酸緩
沖液(HydrionR緩沖液，購于廣州和為有限公司)，于70° C下回流攪拌反應I小時；反應結束后用400mL蒸餾水、400mL甲醇清洗制備好的填料，過濾、并重復該步驟一次；將清洗好的填料自然晾干，然后在110° C真空干燥2小時，得到分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料。實施例2 :分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料的制備(I)往500mL反應容器中加入50g硅膠，并加入200mL蒸餾水攪拌30分鐘、過濾，重復該步驟兩次。然后加入 400mL質量比為O. 08%氫氟酸水溶液,攪拌24小時后用蒸懼水清洗至中性，最后加入200mL丙酮洗滌、過濾，110° C干燥12小時，得到經活化的硅膠；(2)往500mL反應容器中(裝有冷凝器、機械攪拌器、溫度計)中加入450mLpH=9. O的硼酸緩沖溶液、50g活化的硅膠和150mL Y-(2, 3-環氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，80° C攪拌反應30分鐘；得到環氧基團改性硅膠；(3)向反應容器中加入150g葡聚糖，于97° C下回流攪拌反應20-22小時；反應結束后冷卻回流一夜(12小時左右)；依次用200mL熱的蒸餾水、200mL熱的四氫呋喃和200mL熱的乙腈清洗制備好的填料，過濾；得到葡聚糖改性硅膠；(4)將所得的葡聚糖改性硅膠重新置于反應容器中中，加入400mL pH3. O檸檬酸緩沖液(HydHonk^沖溶液，購于廣州和為有限公司)，于70° C下回流攪拌反應I小時；反應結束后用200mL蒸餾水、200mL甲醇清洗制備好的填料，過濾、并重復該步驟一次；將清洗好的填料自然晾干，然后110° C真空干燥2小時，得到分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料。實施例3 :分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料的制備(I)往500mL反應容器中加入50g硅膠，并加入200mL蒸餾水攪拌30分鐘、過濾，重復該步驟兩次。然后加入400mL質量比為O. 08%氫氟酸水溶液,攪拌24小時后用蒸懼水清洗至中性，最后加入200mL丙酮洗滌、過濾，110° C干燥12小時，得到經活化的硅膠；(2)往500mL反應容器中(裝有冷凝器、機械攪拌器、溫度計)中加入450mLpH=9. O的硼酸緩沖溶液、50g活化的硅膠和150mL Y-(2, 3-環氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，80° C攪拌反應30分鐘；得到環氧基團改性硅膠；(3)向反應容器中加入150g纖維素，于97° C下回流攪拌反應20_22小時；反應結束后冷卻回流一夜(12小時左右)；依次用200mL熱的蒸餾水、200mL熱的四氫呋喃和200mL熱的乙腈清洗制備好的填料，過濾，得到纖維素改性硅膠；(4)將所得的維素改性硅膠重新置于反應容器中中，加入400mL pH3. O檸檬酸緩沖液(Hydrionk緩沖溶液，購于廣州和為有限公司)，于70° C下回流攪拌反應I小時；反應結束后用200mL蒸餾水、200mL甲醇清洗制備好的填料，過濾、并重復該步驟一次；將清洗好的填料自然晾干，然后110° C真空干燥2小時，得到分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料。實施例4 :分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料色譜柱體積排阻分離將實施例1中的分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料進行裝柱，柱長300mm,柱內徑 7. 8_。以磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· O) [O. 005mol/L磷酸氫二鈉溶液-O. 005mol/L磷酸二氫鈉溶液(61:39)]-乙腈(95:5)為流動相，流速為每分鐘O. 8mL，檢測波長為254nm，檢測頭孢米諾鈉及其相關物質。如圖2所示，圖2為本發明實施例1所制備色譜填料分離頭孢米諾鈉及其相關物質的效果示意圖。頭孢米諾鈉為頭孢類抗生素，分子量為667. 67，其色譜圖橫坐標是保留時間，單位為min (分鐘)，縱坐標是檢測信號的響應值，單位為mV(毫伏)。由圖可以看出頭孢米諾鈉色譜峰與其雜質色譜峰獲得了極大程度的分離，克服了采用常規的C18柱難于分離頭孢米諾鈉及其雜質等眾多問題，說明了該填料具有優異的分離性能。以磷酸鹽緩沖液[O. 01mol/L磷酸氫二鈉溶液-O. 01mol/L磷酸二氫鈉溶液(66:34)]-乙腈(95:5)為流動相，流速為流速為每分鐘O. 8mL，檢測波長為232nm，測定頭孢西丁鈉及其相關物質。如圖3所示，圖3為本發明實施例1所制備色譜填料分離頭孢西丁鈉及其相關物質的效果 示意圖。頭孢西丁鈉為頭孢類抗生素，分子量為449. 43，其色譜圖橫坐標是保留時間，單位為min (分鐘)，縱坐標是檢測信號的響應值，單位為10_3mV(毫伏)。根據色譜圖可以看出頭孢西丁鈉與其雜質能夠獲得較好的分離，并且分離雜質峰的靈敏度較高，充分證明了該填料具有優異的色譜分離性能。以磷酸緩沖溶液(pH=7. O) [O. 005mol/L磷酸氫二鈉溶液-O. 005mol/L磷酸二氫鈉溶液(61:39)]-乙腈(95:5)作為流動相，流速為每分鐘O. 8mL，檢測波長為231nm，測定頭孢地嗪鈉及其相關物質。如圖4所示，圖4為本發明實施例1所制備色譜填料分離頭孢地嗪鈉及其相關物質的效果示意圖。橫坐標是保留時間，單位為min (分鐘)，縱坐標是檢測信號的響應值，單位為10_3mV(毫伏)。根據色譜圖可以看出頭孢地嗪鈉與其雜質能夠獲得較好的分離，并且分離雜質峰的靈敏度較高，完全滿足藥典所規定的分離參數。實施例5 :分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料色譜柱體積排阻分離將實施例2中的分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料進行裝柱，柱長300mm，柱內徑7. 8mm。以O. lmol/L磷酸鹽緩沖液(ρΗ6· 7)(磷酸二氫鈉6. Og,磷酸氫二鈉20. 2g，加水900mL，用磷酸或氫氧化鈉溶液調節pH值至6. 7，加水至IOOOmL)為流動相，流速為每分鐘0. 6mL，檢測波長為280nm，測定門冬酰胺酶。如圖5所示，圖5為本發明實施例2所制備色譜填料分離門冬酰胺酶的效果示意圖。橫坐標是保留時間，單位為min (分鐘)，縱坐標是檢測信號的響應值，單位為10_3mV(毫伏)。由圖可以明顯看出該色譜柱能夠將門冬酰胺酶的雜質峰分離，完全符合藥典的規定。實施例6 :分離球狀蛋白色譜用親水硅膠色譜填料色譜柱體積排阻分離將實施例3中的分離球狀蛋白色譜用親水硅膠色譜填料進行裝柱，柱長300_，柱內徑7. 8mm。以乙腈三氟乙酸水=40:0. 1:60為流動相，流速為每分鐘1. OmL，檢測波長為210nm，測定胰島素及其相關高分子物質。如圖6所示，圖6為本發明實施例3所制備色譜填料分離分析胰島素的效果示意圖。橫坐標是保留時間，單位為min (分鐘)，縱坐標是檢測信號的響應值，單位為10_3mV(毫伏)。由圖可以看出使用該色譜柱能夠得到較好的胰島素峰型，并獲得較高的柱效。對比實施例分離球狀蛋白色譜用親水硅膠色譜填料色譜柱與其他類型的色譜柱對比效果。將實施例3中的分離球狀蛋白色譜用親水硅膠色譜填料進行裝柱，柱長300_，柱內徑7. 8mm。以磷酸緩沖溶液(pH=7. O) [O. 005mol/L磷酸氫二鈉溶液-O. 005mol/L磷酸二氫鈉溶液(61:39)]-乙腈(95:5)作為流動相，流速為每分鐘O. 8mL，檢測波長為231nm，測定頭孢地嗪鈉及其相關物質。并將測定的結果與常規的C18柱、其他公司類似的色譜柱(例如賽分科技的SRT SEC-150)對比，發現使用常規的C18柱無法將頭孢地嗪鈉和其相關雜質分離開來，其分離度不超過1. 0，而使用賽分公司SRT SEC-150分離頭孢地嗪鈉和其相關雜質時，其分離度仍然不夠理想，目標物頭孢地嗪鈉與其雜質不能達到基線分離，并且雜質峰的響應也不夠理想；而使用本方法制備的分離球狀蛋白色譜用親水硅膠色譜填料色譜柱最大的優勢在于目標物頭孢地嗪鈉與其相關雜質的分離度均能達到基線分離，證明了該色譜填料相比常規的C18色譜柱和其它公司類似的色譜柱具有更為優異的分離效果。全多孔硅膠基質的體積排阻色譜填料具有較大孔隙容積、較低的疏水性、較高的理論塔板數和較大的峰容量。通過合成親水性聚合物涂層的二醇基色譜填料，可以大大增強了其穩定性(B. Anspach, et al. J. Chromatogr. , 1988, 443, 45)。并且,分離中既不涉及太多的作用力，分離一般在水相條件下，極為溫和。另外，硅膠上包覆的親水性聚合物具有多種保留機理，其表面受二醇基官能團保護而不與蛋白相互作用，色譜柱不會累積強烈吸附的目標物，目標物的回收率較高，不容易發生副反應，使用壽命長，多數蛋白在洗脫過程中的質量回收率接近100%。另外，硅膠表面包覆的親水性聚合物保證了填料與目標物充分的作用，具有更高的分辨率，能夠在更高的溫度下操作。以上所述的，僅為本發明的較佳實施例，并非用以限定本發明的范圍，即凡是依據本發明申請的權利要求書及說明書內容所作的簡單、等效變化與修飾，皆落入本發明專利的權利要求保護范圍。
權利要求
1.一種用于分離水溶性聚合物和蛋白的親水性硅膠色譜填料的制備方法，包括如下步驟 A硅膠活化，制得活化硅膠； B將所述活化硅膠進行環氧基改性，制得環氧基改性硅膠； C在所述環氧基改性硅膠上引入親水性聚合物,制得親水性聚合物改性硅膠；及 D將所述親水性聚合物改性硅膠水解，制得所述用于分離水溶性聚合物和蛋白的親水性硅膠色譜填料。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于， 所述A步驟包括 將硅膠用蒸餾水清洗，然后用氫氟酸水溶液浸泡，隨后用蒸餾水洗滌至中性，最后用丙酮洗滌并干燥； 所述B步驟包括 以硼酸緩沖液作為溶劑，將所述活化硅膠與環氧基硅烷化試劑在攪拌和回流下進行改性反應； 所述C步驟包括 將所述環氧基改性硅膠與親水性聚合物在攪拌和回流下進行改性反應，反應結束后，抽濾，并依次用蒸餾水、四氫呋喃、乙腈進行洗滌； 所述D步驟包括 將所述親水性聚合物改性硅膠與檸檬酸緩沖液進行水解反應，反應結束后，抽濾，依次用蒸餾水和甲醇洗滌，真空干燥。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述氫氟酸水溶液的質量濃度為O.08%,且所述娃膠與氫氟酸水溶液的料液比為1:8-1:10。
4.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述環氧基硅烷化試劑為Y-(2，3-環氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷。
5.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述硅膠與環氧基硅烷化試劑的質量比為1:2-1:4，所述活化硅膠進行環氧基改性的反應時間為O. 5-2小時；反應溫度為70-100。 Co
6.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述硼酸緩沖液的pH值為7.0-9. 0，所述活化硅膠與硼酸緩沖液的料液比為1:8-1:10。
7.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述親水性聚合物為可溶性粉、纖維素或葡聚糖。
8.如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述硅膠與可溶性淀粉的質量比為1:2-1:4，所述環氧基改性硅膠進行親水性聚合物改性的反應時間為20-24小時；反應溫度為 70-100° C。
9.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述檸檬酸鹽緩沖液的pH值為2.0-4. 0，所述硅膠與檸檬酸鹽緩沖液的料液比為1:8-1:10，所述親水性聚合物改性硅膠進行水解的反應時間為1-3小時，反應溫度為70-90° C。
10.一種用于分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料，通過如權利要求1-9中任一項所述的制備方法制得。
全文摘要
本發明提供了一種用于分離水溶性聚合物和蛋白的親水性硅膠色譜填料及其制備方法。其制備方法包括A硅膠活化，制得活化硅膠；B將所述活化硅膠進行環氧基改性，制得環氧基改性硅膠；C在所述環氧基改性硅膠上引入親水性聚合物，制得親水性聚合物改性硅膠；D將所述親水性聚合物改性硅膠水解，制得分離水溶性聚合物和蛋白的親水性硅膠色譜填料。該色譜填料具有較大孔隙容積、較低的疏水性、較高的理論塔板數和較大的峰容量。
文檔編號B01J20/30GK103055832SQ20121059450
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者趙岳星, 薛昆鵬, 姚立新 申請人:浙江月旭材料科技有限公司