專利名稱：微型高效沙丁胺醇免疫親和純化富集柱制備及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物分離、純化富集裝置，尤其是一種微型高效沙丁胺醇免疫親和層析柱的制備方法及其應用。
背景技術：
沙丁胺醇(Sal)屬于興奮劑，可以提高瘦肉率、促進動物生長。因其經濟效益明顯，利益驅使養殖戶或養殖企業大量使用，導致畜產品中沙丁胺醇大量殘留，人食用這類畜產品后，可引發肌肉震顫、心悸、神經過敏、頭痛、目眩、惡心等中毒癥狀，特別是對血壓、心臟病患者危害更大，長期使用可能導致染色體畸變，誘發惡性腫瘤。沙丁胺醇在許多國家，特別是歐盟和中國，被禁止用做家畜促生長劑。所以，對動物來源的食品中沙丁胺醇殘留進行嚴格地檢測是非常重要。由于生物樣本成分復雜，待測物濃度低，大多數取樣量少，而我國明確規定禁止沙丁胺醇及其衍生物在動物的飼養過程中使用。這就對分析方法的靈敏度、準確度有更高的要求。采用免疫親和色譜柱提取樣品中沙丁胺醇，再與高效液相色譜法(HPLC-UV)、氣-質聯機法(GC-UV)、膠體金快速試紙條檢測法確證是必然的趨勢。但是，現有的提取沙丁胺醇免疫親和色譜柱的技術與工藝存在活化后填料不穩定、非親和法提純的抗體特異性差、抗體和填料偶聯不穩定，造成偶聯在填料上的抗體脫落、裝柱體積偏大(裝柱體積I毫升以上)，提取沙丁胺醇時造成洗脫體積大、富集效率低，減低了確證的準確度和靈敏度。
發明內容
本發明的目的是提供一種高效、準確純化富集沙丁胺醇的免疫親和純化富集柱及其制備方法和用途。發明釆取的技術方案:
為達上述目的，本發明2次采用抗原抗體的特異性反應和可離解的特性Ag + Ab (固相) Ag-Ab (固相)原理,具體如下:
首先利用這一原理將沙丁胺醇乙酰酯偶聯到活化瓊脂糖(Agarose)上制得Sal -Agarose親和柱，用于提取沙丁胺醇特異性多克隆抗體。再利用這一原理將提取所得的抗沙丁胺醇特異性抗體(Ant1-Sal)偶聯到Agarose上制得Ant1-Sal- Agarose免疫親和純化富集柱,用于分離純化、富集待檢樣品中的沙丁胺醇。根據上述機理，本發明采用如下技術步驟:
一種沙丁胺醇免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于:
O將經免疫親和純化的沙 丁胺醇特異性多克隆抗體和過碘酸活化的瓊脂糖Agarose混勻，在搖床上室溫反應30分鐘，然后在4°C冰箱靜置30分鐘后加入硼氫化鈉還原，用蒸餾水清洗未結合的抗體，用磷酸緩沖液(PBS)清洗填料，10倍填料體積/次，洗4次，滴干PBS后加入等體積甘油，混勻，得到沙丁胺醇免疫親和填料；
2)在特制的塑料柱內下端裝上過濾膜，將沙丁胺醇免疫親和填料裝入柱中，25 μ L/柱，填料上層蓋上過濾膜，即得所述的沙丁胺醇免疫親和純化富集柱。所述的沙丁胺醇免疫親和純化富集柱，包括偶聯有免疫親和純化的沙丁胺醇特異性多克隆抗體的瓊脂糖填料及裝載該填料的特制塑料柱。所述的免疫親和純化的沙丁胺醇特異性多克隆抗體是用沙丁胺醇與溴乙酰氯反應得到衍生物沙丁胺醇溴乙酰酯溶液，用反向高效液相色譜HPLC純化該溶液，得到純化后的沙丁胺醇溴乙酰酯，將純化后的沙丁胺醇溴乙酰酯與載體蛋白偶聯，得到該偶聯物作為免疫原免疫動物，得到抗血清，同時用該純化后的沙丁胺醇溴乙酰酯與經活化的瓊脂糖珠反應制備純化抗體用的免疫親和柱，用該親和柱一步提取抗血清得到沙丁胺醇特異性多克隆抗體。所述的沙丁胺醇溴乙酰酯制備方法是將沙丁胺醇標準品在三乙胺催化下與溴乙酰氯反應得到衍生物沙丁胺醇溴乙酰酯溶液。將此沙丁胺醇溴乙酰氯酯溶液用制備型高效液相色譜儀反向柱色譜分離純化出相對于沙丁胺醇標準品峰后移，且具有沙丁胺醇紫外光吸收光譜特征的單一主峰組分，收集該主峰組分得到純化的沙丁胺醇溴乙酰酯。所述的沙丁胺醇溴乙酰酯與載體蛋白偶聯制備免疫原，是用十二烷基硫酸鈉SDS變性牛血清蛋白BSA或卵清蛋白OVA等常用載體蛋白，再與碘乙酸-羥基琥珀酰亞胺酯即NHS-碘乙酸反應，再用二硫蘇糖醇DTT還原，得到巰基化的BSA或OVA ;通過葡聚糖凝膠G25S印hadex脫鹽去掉多余的二硫蘇糖醇后，將沙丁胺醇溴乙酰酯與巰基化的BSA或OVA混合，調pH=8.5，在室溫搖動反應60分鐘，經G25 Sephadex脫鹽后得到的為免疫原。所述的用純化后的沙丁胺醇溴乙酰酯與經活化的瓊脂糖反應制備純化抗體用的免疫親和柱，是將經活化的瓊脂糖與賴氨酸反應得到氨基花的瓊脂糖，再將氨基化的瓊脂糖與NHS-碘乙酸反應后，再用DTT還原，得到巰基化的瓊脂糖，將巰基化的瓊脂糖和沙丁胺醇溴乙酰酯快速混勻，室溫反應60分鐘，得到化學共價鍵復合體沙丁胺醇溴乙酰-瓊脂糖填料，將填料裝柱，洗去多余的DTT，得到提純沙丁胺醇特異性抗體用的免疫親和柱。所述的沙丁胺醇免疫親和純化富集柱和沙丁胺醇膠體金試紙條聯用的技術。本發明的優點:
I)本親和純化富集柱所用偶聯的抗體為經過免疫親和一步法提純的，抗體特異性高；采用高密度、大容量將特異性抗體偶聯于活化的瓊脂糖填料，使得本發明親和純化富集柱抗體和填料結合穩定，柱容量、回收率明顯優于當前同類產品，達到排除雜質干擾、提高檢測準確性和可靠性。2)本親和純化富集柱裝載填料的微型化，填料裝柱體積僅需25 μ L/柱，能使洗脫體積縮小，非常明顯地提高檢測的靈敏度。3)本發明轉載填料的塑料柱為特制的，能達到靈活掌握上樣體積、提高過柱效率的效果。
圖1為經制備型高效液相色譜分離純化的沙丁胺醇色譜圖及主要衍生組分收集峰圖。圖2為沙丁胺醇多克隆抗體間接競爭ELISA的IC50圖。圖3為沙丁胺醇免疫親和純化富集柱和沙丁胺醇膠體金試紙條聯用效果圖，圖中的1、2為用膠體金試紙條測試沙丁胺醇豬陰性尿液；2、3為用膠體金試紙條檢測在沙丁胺醇陰性尿液中加入沙丁胺醇標準品使濃度是0.01ng/mL ;5、6為用膠體金試紙條檢測在沙丁胺醇陰性尿液中加入沙丁胺醇標準品使濃度為0.01ng/mL經過沙丁胺醇免疫親和純化H集柱集后的洗脫液。
具體實施例方式提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發明，而決不對本發明的內容和保護范圍構成任何限制。實施例1沙丁胺醇特異性多 克隆抗體的制備。1.1沙丁胺醇溴乙酰脂的制備:1.1.1取50 mg的沙丁胺醇溶于500 μ L的富馬酸二甲酯(DMF)溶液中，充分溶解冰凍10分鐘，再與40 PL的溴乙酰氯搖勻冰凍2分鐘后加入25 PL三乙胺搖勻，在60°C反應30分鐘；加入500 μ 的50%甲醇。1.1.2離心，取上清用制備型高效液相色譜儀(C-18 HPLC)反向柱色譜分離純化。分別收集相對于沙丁胺醇標準品峰后移的峰，且有沙丁胺醇紫外光(UV)吸收光譜特征的主要組分(大約20 mg)，凍干。1.1.3收集凍干后的衍生物立即用I mL甲醇復溶，用0.1 mo I/L Na2CO3調PH>8。1.2沙丁胺醇免疫原、配對檢測抗原制備1.2.1沙丁胺醇免疫原
取 250 mg BSA,加入 5 mL 0.1 mol/L Na2C03、0.5 mL 10% 的 SDS 混勻后煮沸 5 分鐘變性后冷卻至室溫，加入100 mg現制的NHS-碘乙酸活性酯(碘乙酸-NHS)，4°C避光反應30分鐘，立即脫鹽，收集10 mL，然后加入50 mg的DTT保持pH>8.5下室溫避光反應60分鐘，再加入50 mg DTT煮沸5分鐘還原。冷卻至室溫，還原后的BSA經過脫鹽柱G25 Sephadex去掉多余的DTT后加入上述1.1.3的經HPLC純化的沙丁胺醇溴乙酰酯400 μ L，用0.1mol/L Na2COjfpH=S.5，室溫避光反應60分鐘后生成沙丁胺醇溴乙酰-BSA共價鍵復合體，經G25 Sephadex脫鹽、分裝保存待用。1.2.2配對檢測抗原
取 10 mg 卵清蛋白 0VA，溶解于 400 μ 含 0.1 mol/L EDTA 的 0.1 mol/L Na2CO3 溶液，充分溶解后，加入40 μ 10%的SDS混勻后煮沸5分鐘變性，然后加入6 mg的DTT煮沸10分鐘還原。冷卻至室溫，還原后的OVA經脫鹽柱G25 Sephadex去掉多余的DTT后加入上述經HPLC純化的沙丁胺醇溴乙酰酯200 μ L，用0.1 mol/L Na2CO3調ρΗ=8.5，室溫避光反應60分鐘后，生成沙丁胺醇溴乙酰-OV共價鍵復合體，經G25 S印hadex脫鹽后得到的為配對檢測抗原。1.3沙丁胺醇多克隆抗血清制備
用新西蘭大白兔為免疫動物，疫苗濃度為I mg/mL，首次免疫用0.5 mL疫苗加0.5 mLPBS加I mL完全佐劑混勻多點注射，加強免疫用0.25 mL疫苗加0.75 mLPBS加I mL不完全佐劑混勻分2點注射，首次免疫后，每間隔2周加強免疫一次，35-40天采集0.5 mL血清檢測滴度，用配對檢測抗原包被做血清的間接ELISA檢測，血清滴度達到1:6400后進行大量血清制備。
權利要求
1.一種微型高效沙丁胺醇免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于: 1)將經免疫親和純化的沙丁胺醇特異性多克隆抗體和過碘酸活化的瓊脂糖混勻，在搖床上室溫反應30分鐘，然后在4°C冰箱靜置30分鐘后加入硼氫化鈉還原，用蒸餾水清洗未結合的抗體，用磷酸緩沖液清洗填料，10倍填料體積/次，洗4次，滴干磷酸緩沖液后加入等體積甘油，混勻，得到沙丁胺醇免疫親和填料； 2)在特制的塑料柱內下端裝上過濾膜，將沙丁胺醇免疫親和填料裝入柱中，25μ L/柱，填料上層蓋上過濾膜，即得所述的沙丁胺醇免疫親和純化富集柱。
2.根據權利要求1所述的方法制備的沙丁胺醇免疫親和純化富集柱，包括偶聯有免疫親和純化的沙丁胺醇特異性多克隆抗體的瓊脂糖填料及裝載該填料的特制塑料柱。
3.根據權利要求1或2所述的沙丁胺醇免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于:所述的免疫親和純化的沙丁胺醇特異性多克隆抗體是用沙丁胺醇與溴乙酰氯反應得到衍生物沙丁胺醇溴乙酰酯溶液，用反向高效液相色譜HPLC純化該溶液得到純化后的沙丁胺醇溴乙酰酯，將純化后的沙丁胺醇溴乙酰酯與載體蛋白偶聯，得到的偶聯物作為免疫原免疫動物，得到抗血清，同時用該純化后的沙丁胺醇溴乙酰酯與經活化的瓊脂糖反應制備純化抗體用的免疫親和柱，用該親和柱一步提取抗血清得到沙丁胺醇特異性多克隆抗體。
4.根據權利要求3所述的沙丁胺醇免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于:所述的沙丁胺醇溴乙酰酯是將沙丁胺醇標準品在三乙胺催化下與溴乙酰氯反應得到衍生物沙丁胺醇溴乙酰酯溶液。
5.將此沙丁胺醇溴乙酰氯酯溶液用制備型高效液相色譜儀反向柱色譜分離純化出相對于沙丁胺醇標準品峰后移，且具有沙丁胺醇紫外光吸收光譜特征的單一主峰組分，收集該主峰組分得到純化的沙丁胺醇溴乙酰酯。
6.根據權利要求3所述的沙丁胺醇免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于:所述的沙丁胺醇溴乙酰酯與載體蛋白偶聯制備免疫原，是用十二烷基硫酸鈉SDS變性牛血清蛋白BSA或卵清蛋白OVA等常用載體蛋白，再與碘乙酸-羥基琥珀酰亞胺酯即NHS-碘乙酸反應，再用二硫蘇糖醇DTT還原，得到巰基化的BSA或OVA ;通過葡聚糖凝膠G25 Sephadex脫鹽去掉多余的二硫蘇糖醇后，將沙丁胺醇溴乙酰酯與巰基化的BSA或OVA混合，調ρΗ=8.5，在室溫搖動反應60分鐘，經G25 Sephadex脫鹽后得到的為免疫原。
7.根據權利要求3所述的沙丁胺醇免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于:所述的用純化后的沙丁胺醇溴乙酰酯與經活化的瓊脂糖反應制備純化抗體用的免疫親和柱，是將經活化的瓊脂糖與賴氨酸反應得到氨基化的瓊脂糖，再將氨基化的瓊脂糖與NHS-碘乙酸反應后，再用DTT還原，得到巰基化的瓊脂糖，將巰基化的瓊脂糖和沙丁胺醇溴乙酰酯快速混勻，室溫反應60分鐘，得到化學共價鍵復合體沙丁胺醇溴乙酰-瓊脂糖填料，將填料裝柱，洗去多余的DTT，得到提純沙丁胺醇特異性抗體用的免疫親和柱。
8.根據權利要求1或2所述的沙丁胺醇免疫親和純化富集柱和沙丁胺醇膠體金試紙條聯用。
全文摘要
本發明公開了一種微型高效沙丁胺醇免疫親和純化富集柱制備及應用，本發明所提供的免疫親和純化富集柱包括偶聯有沙丁胺醇特異性抗體的活化瓊脂糖填料和裝載該親和填料的塑料柱。所述的親和填料偶聯的沙丁胺醇特異性抗體是用免疫親和法提取得到的，所述的免疫親和純化富集柱是將免疫親和填料裝載入特制的塑料柱得到的。該免疫親和純化富集柱裝載填料體積小、富集沙丁胺醇能力強，與色譜法、膠體金試紙條聯合使用，可高效、準確檢測沙丁胺醇的含量。
文檔編號B01D15/38GK103071315SQ20121058929
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者潘麗金, 寧歡歡, 劉曉松, 謝體三, 呂春秋, 張蘭, 葉開福, 蕭浩 申請人:南寧市藍光生物技術有限公司, 廣西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心, 廣西壯族自治區分析測試研究中心