專利名稱：一種大型凝膠層析柱純化有機大分子物質的工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及凝膠層析技術領域，特別是一種大型凝膠層析柱純化有機大分子物質的工藝。
背景技術：
凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等。它的突出優點是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，不需要有機溶劑，并且對分離成分理化性質的保持有獨到之處。對于高分子物質有很好的分離效果。凝膠層析是按照蛋白質分子量大小進行分離的技術，又稱之凝膠過濾，分子篩層析或排阻層析。
凝膠是一類多孔性高分子聚合物，每個顆粒猶如一個篩子。當樣品溶液通過凝膠柱時，相對分子質量較大的物質由于直徑大于凝膠網孔而只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨著溶劑流動，因此流程較短，向前移動速度快而首先流出層析柱；反之，相對分子質量較小的物質由于直徑小于凝膠網孔，可自由地進出凝膠顆粒的網孔，在向下移動過程中，它們從凝膠內擴散到膠粒孔隙后再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入與逸出，使流量增長，移動速率慢而最后流出層析柱。而中等大小的分子，它們也能在凝膠顆粒內外分布，部分進入顆粒，從而在大分子物質與小分子物質之間被洗脫。這樣，經過層析柱，使混合物中的各物質按其分子大小不同而被分離。Vo簡稱為外水體積，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脫體積。可以用一個已知相對分子質量遠超過凝膠排阻極限的有色分子，如常用的藍色葡聚糖-2000溶液通過柱床，即可測出柱床的外水體積Vo。Vi簡稱內水體積，可由g Wr求得(g為干凝膠質量，單位為g，Wr為凝膠吸水量，以mL/g表示)。Vi也可以從洗脫一種完全不受凝膠微孔排阻的小分子溶質(如重鉻酸鉀)的洗脫體積Ve計算，即Ve = Vo + Vi對某物質在凝膠柱內洗脫體積Ne、Vo和Vi之間的關系可用下式表示Ve = Vo + Kd Vi式中Ve為脫體積，它包括自加入樣品時算起，到組分最大濃度出現時所流出的體積。Kd為每個溶質分子在流動相和固定相之間的一個特定的分配系數，它只與被分離物質分子大小和凝膠顆粒內孔隙大小分布有關。Kd可通過實驗由Ve、Vo和Vi求得。Ve = Vo + Kd Vi可改寫為Kd= (Ve-Vo) /Vi當Kd = 0時，Ve=Vo,說明這種溶質相對分子質量大，完全不能進入凝膠顆粒微孔內，被排阻于凝膠顆粒之外而最先洗脫下來；當Kd = I時，即Ve小分子=Vo + Kd Vi,說明這種溶質的相對分子質量小,完全向凝膠顆粒內擴散，在洗脫過程中將最后流出柱外。但實際上，約有1/5的內水因溶劑化作用而呈水合狀態，妨礙小分子的自由擴散。故實際上Ve小分子=Vo + 0. SVi ;當0 < Kd < I時，意味著溶質分子只有部分向凝膠顆粒內擴散，Kd愈大，進入凝膠 顆粒內的程度愈大；Kd = 0. 5時，其洗脫體積Ve = Vo+0. 5Vi。凝膠層析技術的優點凝膠層析操作簡便，所需設備簡單。有時只要有一根層析柱便可進行工作。分離介質一凝膠完全不需要像離子交換劑那樣復雜的再生過程便可重復使用。凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開。利用凝膠的分子篩特性，可對這些物質的溶液進行脫鹽、濃縮、去熱源和脫色。凝膠層析技術的缺點在大生產中，由于需要較高的分離效率，通常需要設計直徑達20cm的大型層析柱，但由于技術原因，大型層析柱不能達到Im的有效分離柱長，通行做法是將兩根50cm的層析柱串聯起來使用，達到理想的分離效果。串聯式大型凝膠層析柱雖然解決了工業化生產上的純化效率需求，但一套串聯式大型凝膠層析系統的價格十分昂貴，而其中主要的成本集中在凝膠層析柱上。因此，提高層析柱的使用效率是十分必要的。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種提高純化效率，降低設備成本的大型凝膠層析柱純化有機大分子物質的工藝。本發明的目的通過以下技術方案來實現一種大型凝膠層析柱純化有機大分子物質的工藝，它包括以下步驟(I)將凝膠裝入A段層析柱和B段層析柱，用管道連接A段層析柱和B段層析柱后，用洗脫液平衡2個柱體積，然后測柱效，柱效合格后，標定層析柱測出Vtl和Vt ；(II)a泵連接A段柱上端，按I 10%的上樣體積上樣，然后將a泵進液管道放入洗脫液中，開啟a泵洗脫0. 2 0. 3個柱體積；(III)斷開A、B兩段層析柱，將b泵連接B段層析柱的上端；同時開啟a泵、b泵分別對A、B兩段層析柱洗脫0. 4 0. 5個柱體積，收集B段層析柱洗出液起峰至Kd值小于X(0 0.4)的部分；(IV) A、B兩段層析柱各自洗脫0. 4 0. 5個柱體積后，停止洗脫。上述工藝所需要的設備器材為需要進行分離純化的樣品，樣品洗脫液，適合分離純化樣品的凝膠，一根由A、B兩段凝膠層析柱串聯的層析柱M，兩組獨立洗脫液運行泵a泵、b泵和紫外檢測器。本發明具有以下優點改進后的新工藝，在不增加層析柱的負荷的條件下，用更少的時間完成了純化過程，并且保持了純化樣品的回收率。改進后的工藝提高了串聯式凝膠層析柱的純化效率55 75%。另外，純化洗脫時，A、B段分離后，存在于A段層析柱中的小分子物質，直接被洗出，未進入B段層析柱，減小了 B段層析柱的洗脫載荷，有效的保護了層析柱中的凝膠。因此，本發明提高了串聯式凝膠層析柱的純化效率，降低了大生產時純化工藝中的設備成本，擴大了凝膠層析純化技術的應用領域；有效的保護了層析柱中的凝膠。經過多次試驗證明本發明適用于所有利用凝膠層析分離純化大分子物質的工藝；但須滿足待分離物質的收集段在\起始至K d < 0. 4的洗脫段內。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的描述實施例I :本實施例是對b型流感嗜血桿菌結合疫苗的純化，所使用的設備器材有Hib多糖-TT結合物原液(Hib — b型流感嗜血桿菌，TT一破傷風類毒素)，0. 2mol/LNaCl溶液，Sepharose4FF凝膠，一根由A、B兩段(每段有效柱長50cm，切面積20cm2)凝膠層析柱串聯的層析柱M，兩組獨立洗脫液運行泵a泵、b泵，紫外檢測器。一種大型凝膠層析柱純化有機大分子物質的工藝，其包括以下步驟 (I)將S^harose 4FF凝膠裝入A段層析柱和B段層析柱，用管道連接A段層析柱和B段層析柱后，用0. 2mol/L NaCl溶液平衡2個柱體積(柱體積2000ml)，然后測柱效，柱效=3500，標定層析柱測出VQ=535ml和Vt=1660ml ；(II)a泵連接A段柱上端，上樣100ml，然后將a泵進液管道放入洗脫液中，開啟a泵洗脫400ml ；(III)斷開A、B兩段層析柱，將b泵連接B段層析柱的上端；同時開啟a泵、b泵分別對A、B兩段層析柱洗脫1000ml，收集B段層析柱洗出液Vtl至Kd值小于0. 2的部分；(IV) A、B兩段層析柱各自洗脫0. 5個柱體積后，停止洗脫。改進后的純化結果與改進前的結果對比如下表所示
權利要求
1.一種大型凝膠層析柱純化有機大分子物質的工藝，其特征在于它包括以下步驟(I)將凝膠裝入A段層析柱和B段層析柱，用管道連接A段層析柱和B段層析柱后，用洗脫液平衡2個柱體積，然后測柱效，柱效合格后，標定層析柱測出\和Vt ； (n ) a泵連接A段柱上端，按I 10%的上樣體積上樣，然后將a泵進液管道放入洗脫液中，開啟a泵洗脫0. 2 0. 3個柱體積； (III)斷開A、B兩段層析柱，將b泵連接B段層析柱的上端；同時開啟a泵、b泵分別對A、B兩段層析柱洗脫0. 4 0. 5個柱體積，收集B段層析柱洗出液起峰至Kd值小于X ((TO. 4)的部分； (IV ) A、B兩段層析柱各自洗脫0. 4 0. 5個柱體積后，停止洗脫。
全文摘要
本發明公開了一種大型凝膠層析柱純化有機大分子物質的工藝，它包括以下步驟(I)將凝膠裝入A段層析柱和B段層析柱，用洗脫液平衡2個柱體積；(II)a泵連接A段柱上端，上樣，然后洗脫0.2～0.3個柱體積；(III)斷開A、B兩段層析柱，將b泵連接B段層析柱的上端；同時對A、B兩段層析柱洗脫，收集B段層析柱洗出液起峰至KD值小于X(0~0.4)的部分；(IV)停止洗脫。本發明的有益效果是提高了串聯式凝膠層析柱的純化效率，降低了大生產時純化工藝中的設備成本，擴大了凝膠層析純化技術的應用領域；有效的保護了層析柱中的凝膠；且適用于所有利用凝膠層析分離純化大分子物質的工藝。
文檔編號B01D15/22GK102728102SQ201210249240
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月18日 優先權日2012年7月18日
發明者伍長華, 關曉峰, 吳強, 樊釩 申請人:成都歐林生物科技股份有限公司