專利名稱：內毒素協同吸附劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種醫用內毒素協同吸附劑及其制備方法，特別是血液灌流用內毒素協同吸附劑及其制備方法。
背景技術：
內毒素是革蘭氏陰性菌生長時釋放或死亡時由細胞壁裂解產生的一類脂多糖類物質，極微量(納克級)內毒素進入人體就會引起高熱，血管擴張，甚至昏厥或死亡。內毒素血癥是由于革蘭氏陰性菌外細胞壁上的內毒素釋放到血液中引起的，可出現于多種疾病過程中，如大面積燒傷、重癥肝炎、肝硬化等疾病。內毒素血癥是臨床最常見的致死疾病之一，其使機體免疫功能嚴重受損，并能引起休克、彌漫性血管內凝血、多器官功能衰竭等一系列嚴重的病理變化，最終導致器官壞死、不可逆休克和死亡。死亡率可達40% -90%。臨床上尚無有效治療內毒素血癥的方法，已有的方法之一是通過鍵合有多粘菌素 B的吸附劑進行血液灌流。多粘菌素B是由10個氨基酸組成的多肽類抗生素，可以滅活ET 并具有抗革蘭氏陰性菌的作用。如，200510046452. 4號中國發明專利申請公開一種用于血液灌流的內毒素吸附劑的制備方法，通過生物相容性好的球形瓊脂糖凝膠為基質，采用環氧氯丙烷、己二胺、1，I’ -羰基二咪唑活化后，鍵合多粘菌素B配基后，經NaBH4還原，即得到內毒素協同吸附劑。通過該方法制備的吸附劑多粘菌素B固載量6. 12毫克/克吸附劑， 內毒素吸附量達22納克/克吸附劑。還有使用其它帶正電荷的季銨鹽、氨基酸或聚合物做配基的研究。賈凌云等在瓊脂糖上接枝季銨鹽，對血液中內毒素清除率可達50% (CN200710012501. I)。以固定賴氨酸的瓊脂糖載體為吸附劑，吸附蛋白質溶液中的內毒素，對蛋白無明顯吸附。采用大孔纖維素球載體，固定聚乙烯亞胺，血液灌流吸附內毒素，亦可使內毒素顯著下降。但是，上述不論是固載多粘菌素B的吸附劑，還是使用其它帶正電荷的季銨鹽、氨基酸或聚合物做配基的吸附劑，它們通常只對低濃度下游離的內毒素具有良好的吸附能力。但由于血液中的內毒素形態復雜，大多數情況以聚集狀態存在，上述吸附劑對高濃度下處于聚集態的內毒素分子吸附效果并不理想，因此不能有效去除血液中的內毒素。Johoson等人曾用脫氧膽酸配基進行研究。如在聚乙烯載體上，用二胺做手臂，接枝脫氧膽酸，雖然可以吸附除去血液中的內毒素，但吸附量極其有限。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種對內毒素吸附能力更大，去除更徹底的內毒素吸附劑。為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案為內毒素協同吸附劑，包括多孔的載體和固載在所述載體上的配基，其中，所述配基至少包括脫氧膽酸配基和氨基化合物配基。優選的方案是所固載的脫氧膽酸和氨基化合物的摩爾比為O. 05 1-20 I。
更優選的方案是脫氧膽酸的固載量為O. lumol-50umol/g吸附劑。上述技術方案在多孔載體上同時固載脫氧膽酸和氨基化合物兩種配基，利用脫氧膽酸使內毒素解離，同時利用氨基化合物對解離后的內毒素進行吸附除掉。上述吸附劑通過載體上兩種配基的協同作用，使其對內毒素的吸附能力遠高于帶有單一配基的內毒素吸附劑。本發明要解決的另一技術問題是提供一種制備內毒素協同吸附劑的方法，該內毒素協同吸附劑的載體上同時固載有脫氧膽酸和氨基化合物兩種配基。為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案為制備內毒素協同吸附劑的方法， 包括多孔的載體和固載在所述載體上的配基，其中所述配基至少包括脫氧膽酸配基和氨基化合物配基，所述方法包括以下步驟步驟一準備多孔載體；步驟二 在多孔載體上固載脫氧膽酸；步驟三在已固載了脫氧膽酸的多孔載體上再固載氨基化合物。優選的方案為步驟二包括以下步驟步驟2. I :對載體的進行環氧活化；步驟2. 2 :對己環氧活化的載體進行氨化；步驟2. 3 :在已經氨化的載體上固載脫氧膽酸。另一優選的方案為步驟二包括以下步驟步驟2. I對載體的進行環氧活化按體積份，在5-15份載體中加入5-10份濃度為1_3M的氫氧化鈉溶液和10_20份一端帶活性基團，一端帶環氧基的環氧化合物，在30-60°C攪拌反應l_5h，然后依次用水和 50% -95%的乙醇溶液洗滌載體5-10次，獲得環氧活化的載體； 步驟2. 2對己環氧活化的載體進行氨化向步驟2. I所獲得的已經過環氧活化的載體中加入10_20mL氨水，在30_60°C攪拌反l_5h，將氨基接在載體上；步驟2. 3在已經氨化的載體上固載脫氧膽酸將脫氧膽酸鈉溶于40%的二甲亞砜水溶液，配制成濃度為l-5mmol/L的脫氧膽酸鈉溶液；按體積份，取200-400份所述脫氧膽酸鈉溶液，加入氨化后的載體5-15份，攪拌， 用O. 2-0. 4M的HCl調節體系pH值至4_6，向體系中緩慢加入5_10mM I-環己基_2_(嗎啉乙基)碳二亞胺甲基對甲苯磺酸鹽的二甲亞砜水溶液，其中所述載體的體積與所述I-環己基-2-(嗎啉乙基)碳二亞胺甲基對甲苯磺酸鹽的二甲亞砜水溶液的體積比為I : 2，攪拌反應l_5h，反應過程中滴加O. 2-0. 4M的HCl，使體系pH值保持在4_6 ;反應完成反后用95 % 乙醇溶液洗滌，除去未反應的脫氧膽酸鈉。更優選的方案為步驟三包括如下步驟步驟3. I對步驟二所獲得的已固載有脫氧膽酸的載體進行二次活化；步驟3. 2向步驟3. I所獲得的已固載有脫氧膽酸的載體上固載氨基化合物。通過上述方法制備的內毒素協同吸附劑，載體上同時固載有脫氧膽酸和氨基化合物兩種配基，對內毒素的吸附能力遠遠大于單一配基的內毒素協同吸附劑。本發明內毒素協同吸附劑的載體的平均粒徑為50um_1500um，更好的為 300um-800um，籍此，本發明內毒素協同吸附劑不但可具有良好的吸附率，且可以用于全血吸附。本發明載體的孔徑范圍可以為2nm-300nm,優選IOnm-IOOnm, —方面可保證具有較大的比表面積，另一方面又較適合內毒素的吸附。本發明內毒素協同吸附劑的載體可以是纖維素、瓊脂糖、聚乙烯醇、苯乙烯-二乙烯苯共聚物或者聚甲基丙烯酸甲酯，優選纖維素、聚甲基丙烯酸，更優選的載體為纖維素載體。因為纖維素載體具有以下優點(I)相對高的機械強度和韌性，可以滿足全血灌流的要求。(2)具有良好的生物相容性，安全性好。(3)來源豐富，成本低廉。(4)環境友好，使用后可以自然降解。本發明內毒素的載體可以是商業途徑購買，也可以是自己制備。例如，可通過將添加一定比例的致孔劑的醋酸纖維素溶液分散在聚乙烯醇(PVA)水溶液中，待分散到合適粒徑后，加熱固化成球，制備出粒徑孔徑符合要求的二醋酸纖維素載體。關于載體的制備，現有技術中已有很多方法，為節省起見，此處不再贅述。在本發明中，考慮到脫氧膽酸在化學性質上更穩定，不宜受后續化學過程的影響， 因此采用首先固載脫氧膽酸，然后再固載陽離子化合物的方法。綜合考慮到成本及吸附效果等因素，本發明內毒素協同吸附劑上固載的脫氧膽酸的量優選為O. lumol-50umol/g吸附劑,更優選O. 5umol-20umol/g吸附劑。脫氧膽酸配基的量太少，吸附劑對聚集內毒素的解離能力有限。在一定量氨基化合物配基的量下，脫氧膽酸配基的量達到某一平臺值之后，再增加脫氧膽酸量，內毒素的吸附能力也不會有太大的提高，而成本將會更高。本發明中，可以采用肽偶聯共價結合脫氧膽酸的方法固定脫氧膽酸，如將帶有羥基的載體與一端帶有活性基團，另一端帶有環氧基團的化合物進行環氧活化反應，再用氨水氨化，引入氨基，然后通過肽偶聯的方法接枝脫氧膽酸。其中，一端帶有活性基團，另一端帶有環氧基團的化合物可以是環氧氯丙烷或帶雙環氧基團的化合物等。在本發明內毒素協同吸附劑上的氨基化合物是含有氨基的化合物，可以是氨基酸或者聚氨基酸，如多粘菌素B(PMX-B)、賴氨酸、精氨酸、組氨酸或者聚賴氨酸等，優選 PMX-B。氨基化合物的正電荷可以相對特異性地吸附表面帶有磷酸根基團的內毒素分子。 本發明中內毒素協同吸附劑上的氨基化合物可以采用環氧基或醛基和氨基反應的方法固載，優選環氧基反應。綜合考慮成本及吸附效果等因素，本發明內毒素協同吸附劑上固載的氨基化合物的量優選為O. lumol-100umol/g吸附劑,更優選的為lumol-10umol/g吸附劑。 考慮到在通過肽偶聯的方法接枝脫氧膽酸后載體上可能還殘留大量的氨基，可選擇使用二醛或者雙環氧化合物，通過醛基和氨基之間的反應，去除氨基，完成陽離子化合物的接枝。 其中二醛可以是戊二醛或己二醛，優選戊二醛。雙環氧可以是1，3_丙二醇縮水甘油醚、1， 4-丁二醇縮水甘油醚或1，5_戊二醇縮水甘油醚，優選1，4_ 丁二醇縮水甘油醚。本發明內毒素協同吸附劑上所固載的兩種配基的比例對吸附的效果和成本有一定的影響，優選的，脫氧膽酸和氨基化合物摩爾比在0.05 1-20 I之間，優選 0.1 1-10 I之間，更優選0.5 1-1 3之間。其中脫氧膽酸的量不能太少，否則吸附劑對聚集內毒素的解離能力有限，影響吸附能力。脫氧膽酸配基量過多也沒有積極的作用， 在一定量PMX-B配基量下，在某一平臺值之后，再增加脫氧膽酸量，不會增加對內毒素的吸附能力。過量的氨基化合物，如PMX-B具有神經毒性和腎毒性。因此，氨基化合物的固載量也不能太高，最好控制在20mg/mL吸附劑以下。
具體實施例方式實施例I
本實施例內毒素協同吸附劑的制備方法如下步驟一制備大孔纖維素載體將12g 二醋酸纖維素溶解在由SOmL 二氯甲烷和20mL乙醇組成的混合溶劑中，纖維素溶液的質量分數為9%。向上述溶液中加入乙酸乙酯IOOmL,作為致孔劑，混合均勻。配制400mL5%的PVA 水溶液作為分散相。將纖維素溶液緩慢傾入裝有分散相中，控制攪拌速度為100-160r. p. m, 使纖維素溶液充分分散成均勻的小液滴，然后保持攪拌速度，加熱至35°C,使二氯甲烷完全揮發，纖維素顆粒徹底固化。用水和75%乙醇洗滌徹底除去PVA和致孔劑，得到孔徑范圍為 50-200nm的纖維素載體。步驟二 在步驟一所制備的多孔載體上固載脫氧膽酸步驟2. I載體的環氧活化向IOmL載體中加入6mL 3M的氫氧化鈉溶液和15mL環氧氯丙烷，在50°C攪拌反 2h。依次用水和乙醇洗滌載體,獲得環氧活化的載體。步驟2. 2載體的氨化向步驟2. I所獲得的己環氧活化的載體中加入20mL氨水，在50°C攪拌反2h，將氨基接在載體上。步驟2. 3在載體上固載脫氧膽酸(DOC)將Immol脫氧膽酸鈉溶液溶于300mL 40%的二甲亞砜水溶液。加入氨化后的載體 10mL，攪拌，用O. 3M的HCl調節體系pH值至4. 8。向體系中緩慢加入6mM I-環己基_2_(嗎啉乙基)碳二亞胺甲基對甲苯磺酸鹽(WCCM)的二甲亞砜水溶液(載體和二甲亞砜水溶液的體積比為1:2)。攪拌反應3h，過程中滴加O. 3M的HC1，使體系pH值保持在4. 8。反應完成后用乙醇洗滌，除去未反應的脫氧膽酸鈉。步驟三在已固載了脫氧膽酸的多孔載體上再固載氨基化合物步驟3. I對步驟二所獲得的已固載有脫氧膽酸的載體進行二次活化固載DOC后的載體上仍有很多殘留的氨基。向IOmL該載體中加入IOmL的1，4_ 丁二醇-二縮水甘油醚和O. IM的氫氧化鈉溶液15mL在室溫下攪拌反應18h。反應后用水沖洗干凈。步驟3. 2向步驟3. I所獲得的已固載有脫氧膽酸的載體上固載多粘菌素B將O. Ig多粘菌素B溶于IOmL水中，用氫氧化鈉溶液將pH值調至11，加入由步驟 3. I所獲得的載體5mL，室溫反應2h，然后用IM的氯化鈉沖洗，獲得以大孔纖維素為載體，含有脫氧膽酸和多粘菌素B配基的內毒素協同吸附劑。實施例2本實施例內毒素協同吸附劑的制備過程如下步驟一制備大孔纖維素載體該步驟與實施例I相同，不再贅述。步驟二 在步驟一所制備的多孔載體上固載脫氧膽酸步驟2. I載體的環氧活化向IOmL載體中加入6mL 3M的氫氧化鈉溶液和15mL環氧氯丙烷，在50°C攪拌反 2h。依次用水和乙醇洗滌載體,獲得環氧活化的載體。
步驟2. 2載體的氨化向步驟2. I所獲得的己環氧活化的載體中加入20mL氨水，在50°C攪拌反2h，將氨基接在載體上。步驟2. 3在載體上固載脫氧膽酸(DOC)將Immol脫氧膽酸鈉溶于300mL 40%的二甲亞砜水溶液。加入氨化后的載體 10mL，攪拌，用O. 3M的HCl調節體系pH值至4. 8。向體系中緩慢加入6mM I-環己基_2_(嗎啉乙基)碳二亞胺甲基對甲苯磺酸鹽(WCCM)的二甲亞砜水溶液(體積比為1:2)。攪拌反應3h，過程中滴加O. 3M的HC1，使體系pH值保持在4. 8。反應完成后用乙醇洗滌，除去未反應的脫氧膽酸鈉。步驟三在已固載了脫氧膽酸的多孔載體上再固載氨基化合物步驟3. I對步驟二所獲得的已固載有脫氧膽酸的載體進行二次活化固載DOC后的載體上仍有很多殘留的氨基。向IOmL該載體中加入25mL O. 05M pH 為7. 4的磷酸緩沖溶液，在攪拌條件下滴加8mL 25%的戊二醛，在室溫下攪拌反應2h。(醛基含量約為74umol/g)。反應后用O. IM的磷酸緩沖液和水沖洗。步驟3. 2向步驟3. I所獲得的已固載有脫氧膽酸的載體上固載多粘菌素B將O. Ig多粘菌素B溶于IOmL水中，用氫氧化鈉溶液將pH值調至11，加入二次活化后的載體5mL，室溫反應2h，然后用IM的氯化鈉沖洗。用硼氫化鈉還原雙鍵，水洗至中性。 獲得以大孔纖維素為載體，含有脫氧膽酸和多粘菌素B配基的內毒素協同吸附劑。實施例3本實施例內毒素協同吸附劑的制備過程如下步驟一制備大孔纖維素載體該步驟與實施例I相同，不再贅述。步驟二 在步驟一所制備的多孔載體上固載脫氧膽酸步驟2. I載體的環氧活化向IOmL載體中加入6mL 3M的氫氧化鈉溶液和15mL環氧氯丙烷，在50°C攪拌反 2h。依次用水和乙醇洗滌載體,獲得環氧活化的載體。步驟I. 2載體的氨化向步驟2. I所獲得的己環氧活化的載體中加入20mL氨水，在50°C攪拌反2h，將氨基接在載體上。步驟2. 3在載體上固載脫氧膽酸(DOC)將Immol脫氧膽酸鈉溶于300mL 40%的二甲亞砜水溶液。加入氨化后的載體 10mL，攪拌，用O. 3M的HCl調節體系pH值至4. 8。向體系中緩慢加入6mM I-環己基_2_(嗎啉乙基)碳二亞胺甲基對甲苯磺酸鹽(WCCM)的二甲亞砜水溶液(體積比為1:2)。攪拌反應3h，過程中滴加O. 3M的HC1，使體系pH值保持在4. 8。反應完成后用乙醇洗滌，除去未反應的脫氧膽酸鈉。步驟三在已固載了脫氧膽酸的多孔載體上再固載氨基化合物步驟3. I對步驟二所獲得的已固載有脫氧膽酸的載體進行二次活化固載DOC后的載體上仍有很多殘留的氨基。向IOmL該載體中加入25mL O. 05M pH 為7. 4的磷酸緩沖溶液，在攪拌條件下滴加8mL 25%的戊二醛，在室溫下攪拌反應2h。(醛基含量約為74umol/g)。反應后用O. IM的磷酸緩沖液和水沖洗。步驟3. 2向步驟3. I所獲得的已固載有脫氧膽酸的載體上固載賴氨酸將O. 2g賴氨酸溶于IOmL水中,用氫氧化鈉將溶液溶液調至堿性,加入二次活化后的載體5mL，室溫反應2h，然后用IM的氯化鈉沖洗。用硼氫化鈉還原雙鍵，水洗至中性。獲得以大孔纖維素為載體，含有脫氧膽酸和賴氨酸的內毒素協同吸附劑。實施例4本實施例內毒素協同吸附劑的制備過程如下步驟一制備大孔纖維素載體該步驟與實施例I相同，不再贅述。步驟二 在步驟一所制備的多孔載體上固載脫氧膽酸步驟2. I載體的環氧活化向IOmL載體中加入6mL 3M的氫氧化鈉溶液和15mL環氧氯丙烷，在50°C攪拌反 2h。依次用水和乙醇洗滌載體,獲得環氧活化的載體。步驟2. 2載體的氨化向步驟2. I所獲得的己環氧活化的載體中加入20mL氨水，在50°C攪拌反此，將氨基接在載體上。步驟2. 3在載體上固載脫氧膽酸(DOC)將Immol脫氧膽酸鈉溶于300mL 40%的二甲亞砜水溶液。加入氨化后的載體 10mL，攪拌，用O. 3M的HCl調節體系pH值至4. 8。向體系中緩慢加入6mM I-環己基_2_(嗎啉乙基)碳二亞胺甲基對甲苯磺酸鹽(WCCM)的二甲亞砜水溶液(體積比為1:2)。攪拌反應3h，過程中滴加O. 3M的HC1，使體系pH值保持在4. 8。反應完成后用乙醇洗滌，除去未反應的脫氧膽酸鈉。步驟三在已固載了脫氧膽酸的多孔載體上再固載氨基化合物步驟3. I對步驟二所獲得的已固載有脫氧膽酸的載體進行二次活化固載DOC后的載體上仍有很多殘留的氨基。向IOmL該載體中加入25mL O. 05M pH 為7. 4的磷酸緩沖溶液，在攪拌條件下滴加8mL 25%的戊二醛，在室溫下攪拌反應2h。(醛基含量約為74umol/g)。反應后用O. IM的磷酸緩沖液和水沖洗。步驟3. 2向步驟3. I所獲得的已固載有脫氧膽酸的載體上固載精氨酸將O. 2g精氨酸溶于IOmL水中，用氫氧化鈉將溶液溶液調至堿性，加入二次活化后的載體5mL，室溫反應2h，然后用IM的氯化鈉沖洗。用硼氫化鈉還原雙鍵，水洗至中性。獲得以大孔纖維素為載體，含有脫氧膽酸和精氨酸的內毒素協同吸附劑。實施例5 本實施例內毒素協同吸附劑的制備過程如下步驟一制備大孔纖維素載體該步驟與實施例I相同，不再贅述。步驟二 在步驟一所制備的多孔載體上固載脫氧膽酸步驟2. I載體的環氧活化向IOmL載體中加入6mL 3M的氫氧化鈉溶液和15mL環氧氯丙烷，在50°C攪拌反 2h。依次用水和乙醇洗滌載體,獲得環氧活化的載體。
步驟2. 2載體的氨化向環氧活化的載體中加入20mL氨水，在50°C攪拌反2h，將氨基接在載體上。步驟2. 3在載體上固載脫氧膽酸(DOC)將O. 5mmol脫氧膽酸鈉溶于300mL 40%的二甲亞砜水溶液。加入氨化后的載體 10mL，攪拌，用O. 3M的HCl調節體系pH值至4. 8。向體系中緩慢加入6mM I-環己基_2_(嗎啉乙基)碳二亞胺甲基對甲苯磺酸鹽(WCCM)的二甲亞砜水溶液(體積比為1:2)。攪拌反應3h，過程中滴加O. 3M的HC1，使體系pH值保持在4. 8。反應完成后用乙醇洗滌，除去未反應的脫氧膽酸鈉。步驟三在已固載了脫氧膽酸的多孔載體上再固載氨基化合物步驟3. I對步驟二所獲得的已固載有脫氧膽酸的載體進行去氨基固載DOC后的載體上仍有很多殘留的氨基。向IOmL該載體中加入25mL O. 05M pH 為7. 4的磷酸緩沖溶液，在攪拌條件下滴加8mL 25%的戊二醛，在室溫下攪拌反應2h。(醛基含量約為74umol/g)。反應后用O. IM的磷酸緩沖液和水沖洗。步驟3. 2向步驟3. I所獲得的已固載有脫氧膽酸的載體上固載多粘菌素B將O. Ig多粘菌素B溶于IOmL水中，用氫氧化鈉溶液將pH值調至11，加入二次活化后的載體5mL，室溫反應2h，然后用IM的氯化鈉沖洗。比較例I按以下步驟制備吸附劑步驟一制備載體，方法同實施例I。步驟二 固載多粘菌素B步驟2. I載體的環氧活化向IOmL載體中加入6mL 3M的氫氧化鈉溶液和15mL環氧氯丙烷，在50°C攪拌反應 2h。依次用水和乙醇洗滌載體三次以上，獲得環氧活化的載體。步驟2· 2PMX-B的固載將O. Ig多粘菌素B溶于IOmL水中，用氫氧化鈉溶液將pH值調至11，加入環氧活化后的載體5mL，室溫反應2h，然后用IM的氯化鈉沖洗，獲得固載有多粘菌素B的吸附劑。比較例2:按以下步驟制備吸附劑步驟一制備載體，方法同實施例I。步驟二 固載多粘菌素B步驟2. I載體的環氧活化向IOmL載體中加入6mL 3M的氫氧化鈉溶液和15mL環氧氯丙烷，在50°C攪拌反應 2h。依次用水和乙醇洗滌載體三次以上，獲得環氧活化的載體。步驟2· 2PMX-B的固載將O. 3g多粘菌素B溶于IOmL水中，用氫氧化鈉溶液將pH值調至11，加入一次活化后的載體5mL，室溫反應2h，然后用IM的氯化鈉沖洗。獲得固載有多粘菌素B的吸附劑。比較例3:按以下步驟制備吸附劑步驟一制備載體，方法同實施例I。
步驟二 固載多粘菌素B步驟2. I載體的環氧活化向IOmL載體中加入6mL 3M的氫氧化鈉溶液和15mL環氧氯丙烷，在50°C攪拌反應 2h。依次用水和乙醇洗滌載體三次以上，獲得環氧活化的載體。步驟2· 2PMX-B的固載將O. 2g多粘菌素B溶于IOmL水中，用氫氧化鈉溶液將pH值調至11，加入一次活化后的載體5mL，室溫反應2h，然后用IM的氯化鈉沖洗。獲得固載有多粘菌素B的吸附劑。比較例4:按以下步驟制備吸附劑步驟一制備載體，方法同實施例I。步驟二 固載多粘菌素B步驟2. I載體的環氧活化向IOmL載體中加入6mL 3M的氫氧化鈉溶液和15mL環氧氯丙烷，在50°C攪拌反 2h。依次用水和乙醇洗滌載體,獲得環氧活化的載體。步驟2. 2載體的氨化向環氧活化的載體中加入20mL氨水，在50°C攪拌反2h，將氨基接在載體上，完成一次活化步驟2. 3在載體上固載脫氧膽酸(DOC)將Immo I脫氧膽酸鈉溶于300mL 40%的二甲亞砜水溶液。加入氨化后的載體 10mL，攪拌，用O. 3M的HCl調節體系pH值至4. 8。向體系中緩慢加入6mM I-環己基_2_(嗎啉乙基)碳二亞胺甲基對甲苯磺酸鹽(WCCM)的二甲亞砜水溶液(體積比為1:2)。攪拌反應3h，過程中滴加O. 3M的HC1，使體系pH值保持在4. 8。反應完成后用乙醇洗滌，除去未反應的脫氧膽酸鈉，獲得固載有脫氧膽酸的吸附劑。比較例5:按以下步驟制備吸附劑步驟一制備載體，方法同實施例I。步驟二 固載多粘菌素B步驟2. I載體的環氧活化向IOmL載體中加入6mL 3M的氫氧化鈉溶液和15mL環氧氯丙烷，在50°C攪拌反 2h。依次用水和乙醇洗滌載體,獲得環氧活化的載體。步驟2. 2載體的氨化向環氧活化的載體中加入20mL氨水，在50°C攪拌反2h，將氨基接在載體上，完成一次活化步驟2. 3在載體上固載脫氧膽酸(DOC)將2mmol脫氧膽酸鈉溶于300mL 40%的二甲亞砜水溶液。加入氨化后的載體 10mL，攪拌，用O. 3M的HCl調節體系pH值至4. 8。向體系中緩慢加入6mM I-環己基_2_(嗎啉乙基)碳二亞胺甲基對甲苯磺酸鹽(WCCM)的二甲亞砜水溶液(體積比為1:2)。攪拌反應6h，過程中滴加O. 3M的HC1，使體系pH值保持在4. 8。反應完成后用乙醇洗滌，除去未反應的脫氧膽酸鈉。獲得固載有脫氧膽酸的吸附劑。
性能評價I、配基固載量的檢測吸附劑上DOC的含量可通過脫氧膽酸試劑盒(sigma)檢測。對實施例I至3,對比例1-5的吸附劑固載脫氧膽酸的量的檢測結果具體見表一。氨基化合物為氨基酸或者氨基酸組成的多肽，可以通過茚三酮法檢測。茚三酮和 a氨基反應生成藍紫色的化合物，不同濃度下該化合物在570nm處的吸光度值不同，可據此繪制成標準曲線。檢測特定吸附劑在570nm處的紫外吸光度值，便可根據標準曲線計算
出氨基酸的固載量。稱量0. 02g吸附劑，置于25mL比色管中，加水4. OmL，再向各管中加入2%茚三酮溶液和Na2HP04-KH2P04 (pH = 8)緩沖溶液個I. 0毫升，混勻，于80°C反應30分鐘，冷卻至室溫，加水至25mL，混勻，靜置lOmin，檢測樣品管中570nm處的OD.值。按以上方法，分別對實施例I至3，對比例1-5的吸附劑固載多粘菌素B的量進行檢測，檢測結果見表一。2、吸附能力的檢測檢測方法如下標準溶液為小牛血清(BSA)溶液外添加內毒素標準品。配制lOmg/mL濃度的BSA 水溶液，添加內毒素標準品至約500Eu/mL。準確稱取ImL吸附劑于50mL錐形瓶中，用滅菌注射用水沖洗三次，吸干表面水分， 加入5mL 500Eu/mL的內毒素BSA溶液。將該樣品和空白樣放入恒溫水浴振蕩器中，在37°C 吸附2小時。用動態濁度法檢測內毒素的水平，計算吸附劑的吸附率。通過以上方法，分別對實施例I至3，對比例1-5的吸附劑對內毒素的吸附能力進行檢測，檢測結果見表一。表一實施例I至3，對比例1-5吸附劑的配基固載量及吸附能力
樣品DOC固載量 (umol/g)PMX-B固載量 (umol/g)內毒素吸附率(％)實施例I3.695.1791實施例23.183.9486實施例33.274.89 (此處配基是賴氨酸)6權利要求
1.內毒素協同吸附劑，包括多孔的載體和固載在所述載體上的配基，其特征在于 所述配基至少包括脫氧膽酸配基和氨基化合物配基。
2.根據權利要求I所述的內毒素協同吸附劑，其特征在于所述脫氧膽酸和所述氨基化合物的摩爾比為O. 05 1-20 I。
3.根據權利要求I或2任一項所述的內毒素協同吸附劑，其特征在于所述脫氧膽酸的固載量為O. lumol-50umol/g吸附劑。
4.根據權利要求3所述的內毒素協同吸附劑，其特征在于所述氨基化合物選自氨基酸或聚氨基酸。
5.根據權利要求3所述的內毒素協同吸附劑，其特征在于所述氨基化合物選自多粘菌素B、賴氨酸、精氨酸、組氨酸或者聚賴氨酸。
6.制備內毒素協同吸附劑的方法，包括多孔的載體和固載在所述載體上的配基，所述配基至少包括脫氧膽酸配基和氨基化合物配基，其特征在于所述方法包括以下步驟步驟一準備多孔載體；步驟二 在多孔載體上固載脫氧膽酸；步驟三在已固載了脫氧膽酸的多孔載體上再固載氨基化合物。
7.根據權利要求6所述制備內毒素協同吸附劑的方法，其特征在于所述步驟二包括以下步驟步驟2. I :對載體的進行環氧活化；步驟2. 2 :對己環氧活化的載體進行氨化；步驟2. 3 :在已經氨化的載體上固載脫氧膽酸。
8.根據權利要求6所述制備內毒素協同吸附劑的方法，其特征在于所述步驟二包括以下步驟步驟2. I對載體的進行環氧活化按體積份，在5-15份載體中加入5-10份濃度為1-3M的氫氧化鈉溶液和10-20份一端帶活性基團，一端帶環氧基的環氧化合物，在30-60°C攪拌反應l_5h，然后依次用水和 50% -95%的乙醇溶液洗滌載體5-10次，獲得環氧活化的載體；步驟2. 2對己環氧活化的載體進行氨化向步驟2. I所獲得的已經過環氧活化的載體中加入10-20mL氨水，在30_60°C攪拌反 l_5h，將氨基接在載體上；步驟2. 3在已經氨化的載體上固載脫氧膽酸將脫氧膽酸鈉溶于40%的二甲亞砜水溶液，配制成濃度為l-5mmol/L的脫氧膽酸鈉溶液；按體積份，取200-400份所述脫氧膽酸鈉溶液，加入氨化后的載體5-15份，攪拌，用O.2-0. 4M的HCl調節體系pH值至4_6，向體系中緩慢加入5_10mM I-環己基_2_(嗎啉乙基)碳二亞胺甲基對甲苯磺酸鹽的二甲亞砜水溶液，其中所述載體的體積與所述I-環己基-2-(嗎啉乙基)碳二亞胺甲基對甲苯磺酸鹽的二甲亞砜水溶液的體積比為I : 2，攪拌反應l_5h，反應過程中滴加O. 2-0. 4M的HCl，使體系pH值保持在4_6 ;反應完成反后用95 % 乙醇溶液洗滌，除去未反應的脫氧膽酸鈉。
9.根據權利要求6所述制備內毒素協同吸附劑的方法，其特征在于所述步驟三包括如下步驟步驟3. I對步驟二所獲得的已固載有脫氧膽酸的載體進行二次活化；步驟3. 2向步驟3. I所獲得的已固載有脫氧膽酸的載體上固載氨基化合物。
10.根據權利要求6至9任一項所述的制備內毒素協同吸附劑的方法，其特征在于所述氨基化合物選自多粘菌素B、賴氨酸、精氨酸、組氨酸或者聚賴氨酸。
全文摘要
本發明公開一種內毒素協同吸附劑及其制備方法。其中，內毒素協同吸附劑包括多孔的載體和固載在所述載體上的配基，其中，所述配基至少包括脫氧膽酸配基和氨基化合物配基。通過載體上兩種配基的協同作用，使吸附劑對內毒素的吸附能力顯著增強。
文檔編號B01J20/22GK102580683SQ20121002393
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月3日 優先權日2012年2月3日
發明者董凡 申請人:珠海健帆生物科技股份有限公司