專利名稱：一種天然產物的分離方法
技術領域：
本發明涉及一種天然產物的分離方法。
背景技術：
天然來源成分的分離與制備一直是中藥及天然藥物研究過程中的一大瓶頸。由于天然產物是復雜體系，通常一個樣品中包含了幾十甚至幾百種組分，而各組分之間量的差別通常又很大。因此，為了達到成分分離的目的，往往要結合多種色譜填料，進行反復的柱色譜分離操作。這一過程是繁瑣、漫長而枯燥的首先用柱色譜對天然產物提取物進行分離并對分離的流份進行分段收集，通過TLC檢測確定所需合并的流份，濃縮后再根據情況進行進一步的色譜柱分離(有時可能需要多次重復上述過程)。在這一過程中，涉及到溶劑濃縮和樣品轉移的操作，溶劑的濃縮不但耗時耗能，而且往往由于加熱而使不穩定的結構發生變化；樣品的轉移過程也伴隨樣品的損失。最終，難以分離的樣品用制備型高效液相進行分離，該工藝首先要將固體樣品以合適的溶劑溶解，但對固體樣品有較好溶解度的溶劑具往往有較強的溶劑效應，會大大降低制備型高效液相的分離效果；而溶劑效應弱的溶劑往往難以溶解固體樣品。綜上，采用傳統的方法對天然產物分離制備，天然產物往往在冗長、 繁多的柱色譜分離、溶劑濃縮、樣品轉移和樣品溶解操作中受到損失或者結構發生變化，研究者不得不加大投料量以求獲得理想的結果。因此，如何最大限度減少人工操作、實現自動化分離，以提高效率、突破傳統方法所形成的瓶頸，顯得迫在眉睫。二維液相色譜是在高效液相色譜基礎上發展起來的一項技術，它通過在技術上及設備上的改進，組合不同的分離模式構建二維系統。與一維液相色譜系統相比，二維液相色譜主要的優勢在于提供了更大的峰容量，從而能夠較有效地解決復雜體系樣品的分析問題 (吳劍威，等.多維液相色譜及其在中藥研究中的應用.中草藥，2010，41 (6) :1020-1023)。現有的二維液相色譜技術雖然能夠滿足分析的需求，卻無法直接應用于成分的分離制備。這是由于分離制備操作過程中需要處理的更大樣品量，需要經過體積更大的流動相。分析操作時，樣品進樣量較低，一般為20 μ I ( μ g級別)，因此一般選擇較小規模的分析液相色譜柱；而在制備操作中，一般要選擇能處理更大樣品量的中低壓色譜柱。另外，分析過程中，由流動相所帶來的溶劑效應，通過降低一維色譜流速、減少二維色譜的進樣量的處理，基本可以忽略。但在制備色譜中，溶劑效應問題是必須要解決的，現有的二維液相色譜技術無法解決上述問題。
發明內容
本發明的目的在于提供一種天然產物的分離方法，以解決現有技術中存在的上述問題。本發明包括以下步驟I)上樣工段將待分離的天然產物提取物溶液直接進樣至第一維液相色譜柱，或將待分離的天然產物提取物溶液加入拌樣填料中，攪拌均勻，干燥后加至所述第一維液相色譜柱的頂端;2)第一維液相色譜分離工段以第一維洗脫液對已上樣的第一維液相色譜柱進行洗脫，所述第一維洗脫液通過第一維輸液泵泵入第一維液相色譜柱中；3)第一維液相色譜柱洗脫液的稀釋流經第一維液相色譜柱的洗脫液，在設于第一維液相色譜柱后的混合器內與稀釋液進行混合，所述稀釋液為對第一維液相色譜柱具有弱流脫能力的溶劑，通過稀釋液加注泵泵入所述混合器中；4)稀釋液的分段富集第一維液相色譜柱的洗脫液，經步驟3)稀釋后，在切換閥的控制下，分段送入至少I個富集柱進行富集，每一次流過富集柱的第一維液相色譜柱洗脫液的體積為所述富集柱柱體積的O. 5 5倍；5)富集柱上富集物的洗脫分段富集在富集柱中的富集物，在所述切換閥的控制下，分段被第二維洗脫液洗脫，送入第二維液相色譜柱進行進一步的分離；6)第二維液相色譜分離工段以第二維洗脫液，對送入的第二維液相色譜柱的樣品進行洗脫，所述第二維洗脫液通過第二維輸液泵泵入該第二維液相色譜柱中，流出液通過檢測器進行圖譜檢測，根據圖譜收集相應色譜峰的流份。在步驟I)中，所述第一維液相色譜柱可采用中低壓液相色譜柱；所述第一維液相色譜柱優選使用含水體系流動相的色譜填料，進一步優選為反相碳-18填料(ODS)。在步驟2)中，所述第一維輸液泵可采用中低壓泵。在步驟3)中，所述第一維液相色譜柱優選使用含水體系流動相的色譜填料，進一步優選為反相碳-18填料(ODS);所述稀釋液可采用水；所述洗脫液與稀釋液的體積比可為 I (O. 3 3)。在步驟4)中，所述切換閥可采用至少I個二位多通閥或多位閥；所述富集柱優選使用含水體系流動相的色譜填料，進一步優選為反相碳-18填料(ODS);所述富集柱的柱體積可為第一維液相色譜柱柱體積的O. I O. 5倍。在步驟5)中，所述第二維液相色譜柱可采用制備高效液相色譜柱。在步驟6)中，所述第二維輸液泵可采用高壓泵。在天然產物的分離方法中，樣品首先經第一維液相色譜(優選中低壓色譜)單元分離，分離流份與稀釋液加注泵泵出的稀釋液混合后，分段送入由切換閥控制的富集柱富集，富集柱中保留的樣品，在切換閥的控制下，分段由第二維液相色譜(制備液相)泵送入制備液相色譜柱進行進一步的分離。通過該天然產物的分離方法，可實現復雜樣品的自動化分離操作，具有分離效率高、峰容量大、操作簡便等優點，能夠極大節省人力和時間。本發明的分離過程采用中低壓液相X制備型高效液相的全二維液相色譜方法， 可以很好地解決現有技術所存在的缺點，既保留了中低壓液相的大容量樣品制備能力，又保證了制備高效液相色譜的高效分離能力，減少了大量的中間處理環節。
圖I為本發明實施例采用的分離裝置結構組成示意圖。在圖I中，各標記為1、第一維輸液泵；2、第一維液相色譜柱；3、稀釋液加注泵；4、混合器；51、切換閥；6、富集柱；7、 第二維輸液泵；8、第二維液相色譜柱；9、檢測器。圖2為實施例I采用的分離裝置結構組成示意圖。在圖2中，各標記為1、第一維輸液泵(高壓)；2、第一維液相色譜柱(高壓)；3、稀釋液加注泵(高壓)；4、混合器；52、二位六通閥；6、富集柱；7、第二維輸液泵(高壓)；8、第一維液相色譜柱(制備高效液相色譜柱)；9、檢測器；11、第一維洗脫液；12、稀釋液；13、第二維洗脫液。圖3為實施例I的液相圖譜。在圖3中，橫坐標為時間(min)，縱坐標為譜峰強度。圖4為實施例2采用的分離裝置結構組成示意圖。在圖4中，各標記為1、第一維輸液泵(中低壓)；2、第一維液相色譜柱(中低壓)；3、稀釋液加注泵(中低壓)；4、混合器；53、二位十通閥；61、第一富集柱；62、第二富集柱；7、第二維輸液泵(高壓)；8、第一維液相色譜柱(制備高效液相色譜柱)；9、檢測器；11、第一維洗脫液；12、稀釋液；13、第二維洗脫液。圖5為實施例2的液相圖譜。在圖5中，橫坐標為時間(min)，縱坐標為譜峰強度。圖6為實施例3采用的分離裝置結構組成示意圖。在圖6中，各標記為1、第一維輸液泵(中低壓)；2、第一維液相色譜柱(中低壓)；3、稀釋液加注泵(中低壓)；4、混合器；54、多位閥；6、富集柱；7、第二維輸液泵(高壓)；8、第一維液相色譜柱(制備高效液相色譜柱)；9、檢測器；11、第一維洗脫液；12、稀釋液；13、第二維洗脫液。圖7為實施例3的液相圖譜。在圖7中，橫坐標為時間(min)，縱坐標為譜峰強度。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的描述，但不構成對本發明的任何限制。圖I給出本發明實施例采用的分離裝置結構組成示意圖。在圖I中，各標記為1、 第一維輸液泵；2、第一維液相色譜柱；3、稀釋液加注泵；4、混合器；51、切換閥；6、富集柱； 7、第二維輸液泵；8、第二維液相色譜柱；9、檢測器。實施例I一種天然產物的分離制備方法，分離過程采用高壓液相X制備型高效液相的全二維液相色譜方法，所述第一維液相色譜和第二維液相色譜間的切換閥為手動二位六通閥，其連接方式如圖2所示，在圖2中，各標記為1、第一維輸液泵(高壓)；2、第一維液相色譜柱(高壓)；3、稀釋液加注泵(高壓)；4、混合器；52、二位六通閥；6、富集柱；7、第二維輸液泵(高壓)；8、第一維液相色譜柱(制備高效液相色譜柱)；9、檢測器；11、第一維洗脫液；12、稀釋液；13、第二維洗脫液。樣品溶液大黃水提取物500mg，溶解于Iml水中。(I)上樣工段取上述大黃水提取物的水溶液，直接進樣至第一維液相色譜柱。(2)第一維液相色譜分離工段■第一維輸液泵高壓泵。
■色譜柱制備高效液相色譜柱，Φ2αιιΧ25αιι(柱體積78. 5ml)，填料為粒徑 5 μ m 的 ODS。■流動相30%— 60%的甲醇/水梯度洗脫，共洗脫800ml，流速，O. 5ml/min。(3)第一維液相色譜柱洗脫液的稀釋。■稀釋液水。■混合比例1 : 2 (稀釋液加注泵流速lml/min)。(4)稀釋液的分段富集■切換閥手控二位六通閥■富集柱 個數1個 柱體積第二維液相色譜柱體積O. 14倍(Φ 3cmX I. 5cm, 10. 6ml) 填料5 μ m 的 ODS■分段富集周期第一維液相色譜柱的洗脫液每30ml (約富集柱柱體積的3倍) 通過富集柱分段富集。(5)富集柱上富集物的洗脫富集在富集柱中的富集物，通過手動切換二位六通閥的通路，關閉第一維輸液泵， 開啟第二維輸液泵，被第二維洗脫液洗脫，送入第二維液相色譜柱進行進一步的分離。(6)第二維液相色譜分離工段■第二維輸液泵高壓泵■色譜柱制備高效液相色譜柱，Φ2αιιΧ15αιι(柱體積78. 5ml)，填料為粒徑 5 μ m 的 ODS■流動相20%— 40%的乙腈/水梯度洗脫，60min/次,流速，8ml/min■檢測器DAD檢測器完成I個富集樣品的分離后，手動切換二位六通閥的通路，開啟第一維輸液泵，關閉第二維輸液泵，重復工段2 6的操作，直到樣品被洗脫完全，所得到的液相圖譜(第I 7次分離)如圖3所示。實施例2一種天然產物的分離制備方法，分離過程采用中低壓液相X制備型高效液相的全二維液相色譜方法，所述一維液相色譜和第二維液相色譜間的切換閥為電控二位十通閥，其連接方式如圖4所示，在圖4中，各標記為1、第一維輸液泵(中低壓)；2、第一維液相色譜柱(中低壓)；3、稀釋液加注泵(中低壓)；4、混合器；53、二位十通閥；61、第一富集柱；62、第二富集柱；7、第二維輸液泵(高壓)；8、第一維液相色譜柱(制備高效液相色譜柱)；9、檢測器；11、第一維洗脫液；12、稀釋液；13、第二維洗脫液。樣品溶液大黃水提取物500mg，溶解于Iml水中。(I)上樣工段取上述大黃水提取物的水溶液，拌于I. Og的聚酰胺填料中，攪拌均勻，蒸干溶劑， 上樣至第一維液相色譜柱的頂端。(2)第一維液相色譜分離工段■第一維輸液泵中低壓輸液泵
■色譜柱Φ2. 2cmX20cm的中低壓柱，以粒徑100目的聚酰胺填充■流動相水％— 100%的甲醇/水梯度洗脫，共洗脫1000ml，流速，O. 3ml/min(3)第一維液相色譜柱洗脫液的稀釋■稀釋液冰■混合比例1 : O. 3 (稀釋液加注泵流速0. lml/min)。(4)稀釋液的分段切割與富集■切換閥電控二位十通閥■富集柱 個數2個 柱體積約第二維液相色譜柱體積的O. 5倍(Φ 3cmX 5cm, 35. 3ml) 填料5 μ M 的 ODS■分段富集周期第一維液相色譜柱的洗脫液每18ml (約富集柱柱體積的O. 5 倍)通過富集柱分段富集。(5)富集柱上富集物的洗脫富集在富集柱中的富集物，通過切換二位十通閥的通路，被第二維洗脫液洗脫，送入第二維液相色譜柱進行進一步的分離。(6)第二維液相色譜分離工段■第二維輸液泵高壓泵。■色譜柱制備高效液相色譜柱，Φ2αιιΧ25αιι(柱體積78. 5ml)，填料為粒徑 5 μ m 的 ODS。■流動相30%— 70%的甲醇/水梯度洗脫，60min/次,流速,8ml/min。■檢測器DAD檢測器。該工段段進行的同時，另一支富集柱同時對由第一維液相色譜洗脫下來的樣品進行富集。完成I個富集樣品的分離后，切換二位十通閥的通路，重復工段2 6的操作，直到樣品被洗脫完全，所得到的液相圖譜(第I 7次分離)如圖5所示。實施例3一種天然產物的分離制備方法，分離過程采用中低壓液相X制備型高效液相的全二維液相色譜方法，所述一維液相色譜和第二維液相色譜間的切換閥為一對同步切換的六位閥，其連接方式如圖6所示，在圖6中，各標記為1、第一維輸液泵(中低壓)；2、第一維液相色譜柱(中低壓)；3、稀釋液加注泵(中低壓)；4、混合器；54、多位閥；6、富集柱；7、 第二維輸液泵(高壓)；8、第一維液相色譜柱(制備高效液相色譜柱)；9、檢測器；11、第一維洗脫液；12、稀釋液；13、第二維洗脫液。樣品溶液蟾酥甲醇提取物200mg，溶解于Iml甲醇中。(I)上樣工段取上述蟾酥甲醇提取物的甲醇溶液，拌于I. Og的ODS填料中，攪拌均勻，蒸干溶劑，上樣至第一維液相色譜柱的頂端。(2)第一維液相色譜分離工段■第一維輸液泵中低壓輸液泵。
■色譜柱Φ IcmX 20cm的中低壓柱，以粒徑75 μ M的ODS填充。■流動相50%— 100%的甲醇/水梯度洗脫，共洗脫400ml，流速，O. lml/min。(3)第一維液相色譜柱洗脫液的稀釋■稀釋液水。■混合比例1 : 3 (稀釋液加注泵流速0. 3 ml/min)。(4)稀釋液的分段切割與富集■切換閥一對電控六位閥，同步切換。■富集柱。 個數6 個。 柱體積第二維液相色譜柱體積O. I倍(Φ IcmX I. 5cm, I. 18ml)。 填料5μπι 的 0DS。■分段富集周期第一維液相色譜柱的洗脫液每6ml (約富集柱柱體積的5倍)通過富集柱分段富集。完成一次富集后切換一次流路，繼續下一次富集直到完成6次富集，或進行洗脫。(5)富集柱上富集物的洗脫完成6次富集后，關閉第一維輸液泵，開啟第二維輸液泵，以第二維洗脫液洗脫， 分次送入第二維液相色譜柱進行進一步的分離。(6)第二維液相色譜分離工段■第二維輸液泵高壓泵。■色譜柱制備高效液相色譜柱，Φ IcmX 15cm(柱體積11. 8ml)，填料為粒徑
5μ m 的 ODS。■流動相0 —30min 28 % — 54 % 乙腈，30min — 60min 54% 乙腈洗脫，流速， 2ml/min。■檢測器DAD檢測器。完成6個富集樣品的分離后，切換多位閥的通路，重復工段6的操作，完成6次富集樣品的分離后，重復工段2 6的操作，直到樣品被洗脫完全，所得到的液相圖譜(第I 7次分離)如圖7所示。本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種天然產物的分離方法，其特征在于包括以下步驟1)上樣工段將待分離的天然產物提取物溶液直接進樣至第一維液相色譜柱，或將待分離的天然產物提取物溶液加入拌樣填料中，攪拌均勻，干燥后加至所述第一維液相色譜柱的頂端；2)第一維液相色譜分離工段以第一維洗脫液對已上樣的第一維液相色譜柱進行洗脫，所述第一維洗脫液通過第一維輸液泵泵入第一維液相色譜柱中；3)第一維液相色譜柱洗脫液的稀釋流經第一維液相色譜柱的洗脫液，在設于第一維液相色譜柱后的混合器內與稀釋液進行混合，所述稀釋液為對第一維液相色譜柱具有弱流脫能力的溶劑，通過稀釋液加注泵泵入所述混合器中；4)稀釋液的分段富集第一維液相色譜柱的洗脫液，經步驟3)稀釋后，在切換閥的控制下，分段送入至少I個富集柱進行富集，每一次流過富集柱的第一維液相色譜柱洗脫液的體積為所述富集柱柱體積的O. 5 5倍；5)富集柱上富集物的洗脫分段富集在富集柱中的富集物，在所述切換閥的控制下，分段被第二維洗脫液洗脫，送入第二維液相色譜柱進行進一步的分離；6)第二維液相色譜分離工段以第二維洗脫液，對送入的第二維液相色譜柱的樣品進行洗脫，所述第二維洗脫液通過第二維輸液泵泵入該第二維液相色譜柱中，流出液通過檢測器進行圖譜檢測，根據圖譜收集相應色譜峰的流份。
2.如權利要求I所述的一種天然產物的分離方法，其特征在于在步驟I)中，所述第一維液相色譜柱采用中低壓液相色譜柱；所述第一維液相色譜柱使用含水體系流動相的色譜填料，優選反相碳-18填料。
3.如權利要求I所述的一種天然產物的分離方法，其特征在于在步驟2)中，所述第一維輸液泵采用中低壓泵。
4.如權利要求I所述的一種天然產物的分離方法，其特征在于在步驟3)中，所述第一維液相色譜柱使用含水體系流動相的色譜填料，優選反相碳-18填料。
5.如權利要求I所述的一種天然產物的分離方法，其特征在于在步驟3)中，所述稀釋液采用水；所述洗脫液與稀釋液的體積比為I : O. 3 3。
6.如權利要求I所述的一種天然產物的分離方法，其特征在于在步驟4)中，所述切換閥采用至少I個二位多通閥或多位閥。
7.如權利要求I所述的一種天然產物的分離方法，其特征在于在步驟4)中，所述富集柱使用含水體系流動相的色譜填料，優選反相碳-18填料。
8.如權利要求I所述的一種天然產物的分離方法，其特征在于在步驟4)中，所述富集柱的柱體積為第一維液相色譜柱柱體積的O. I O. 5倍。
9.如權利要求I所述的一種天然產物的分離方法，其特征在于在步驟5)中，所述第二維液相色譜柱采用制備高效液相色譜柱。
10.如權利要求I所述的一種天然產物的分離方法，其特征在于在步驟6)中，所述第二維輸液泵采用高壓泵。
全文摘要
一種天然產物的分離方法，涉及一種天然產物的分離方法。上樣工段，第一維液相色譜分離工段，第一維液相色譜柱洗脫液的稀釋，稀釋液的分段富集，富集柱上富集物的洗脫，第二維液相色譜分離工段。分離過程采用中低壓液相×制備型高效液相的全二維液相色譜方法，可以很好地解決現有技術所存在的缺點，既保留了中低壓液相的大容量樣品制備能力，又保證了制備高效液相色譜的高效分離能力，減少了大量的中間處理環節。
文檔編號B01D15/10GK102580352SQ20121002209
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月31日 優先權日2012年1月31日
發明者丘鷹昆, 吳振, 莊萍, 陳琳 申請人:廈門大學