專利名稱：一種柵藻藻株及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物和生物能源領域，涉及一種柵藻藻株及其用途。
背景技術：
隨著石油、天然氣、煤炭等化石燃料的大量使用，全球二氧化碳濃度急劇升高，導致氣候變暖、酸雨區域面積增大、極端天氣現象頻發。環境污染等問題日益嚴重。并且隨著化石燃料的持續消耗，能源儲備也急劇減少。因此尋求一種綠色的可持續發展的新能源成為各國科學家研究的熱點。在清潔可再生能源中，以能源微藻生產生物柴油的研究受到人們廣泛的關注。生物柴油性質與化石柴油接近，是最具發展潛力的大宗液體生物燃料之一。微藻光合作用效率高，生長過程中吸收大 量的CO2,能有效地減少CO2的排放。有些微藻能夠利用廢棄物流中的組成成分，將其轉化成自身的生物物質，故能有效地用于工業廢水、廢棄物質的處理。柵藻是淡水中常見的浮游藻類，極喜在營養豐富的靜水中繁殖。其中許多種類對有機污染物具有較強的耐性。柵藻在水體自凈和污水凈化中有一定作用，是有機污水氧化塘生物相中的優勢種類。它可與細菌同時附著在水中有機物碎片和其他水生植物體上，形成膠質層，吸附有機物。柵藻進行光合作用時，一方面產生氧氣供細菌分解有機質的需要，另一方面還可直接利用有機質作為碳源和氮源，使水中有機物迅速降解，從而凈化水體。柵藻細胞內含有豐富的蛋白質和維生素，柵藻繁殖快，營養價值高，可作為人工大量培養的材料。部分柵藻細胞內能夠積累大量脂肪酸，通過人工操作，可轉化為生物柴油。申請號為200780020794.6的專利中分離到一株新的小球藻，并能應用領域到多個領域,包括環境或工業生產中廢棄二氧化碳的處理、生物能源的生產和廢水處理。申請號為201010111834的專利中利用自分離柵藻在處理城市污水，并且耦合生產生產柴油的裝置能用于生產生物柴油的微藻原料。盡管如此，尚需要新的藻株，其溫度適應范圍廣，在冬季、夏季均能夠進行室外養殖；生長速度快且易于收集；并且含有一定量的高附加值產物，可以應用到飼料或食品行業，應用范圍更加廣泛。
發明內容
本發明人經過深入的研究和創造性的勞動，得到了一種柵藻藻株，并且本發明人驚奇地發現，該柵藻藻株能夠在較寬的溫度范圍(例如9-43°C)內生長，生長速度快且易于收集，并且能夠有效產生脂肪酸、類胡蘿卜素等物質，具有在污水處理、生物柴油生產、以及飼料或食品行業等應用的潛力。由此提供了下述發明:本發明的一個方面涉及一種柵藻藻株ENN2201A (Desmodesmus sp.),其保藏編號為CGMCC N0.5150，保藏日期為2011年8月17日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。所述的柵藻藻株ENN220IA(Desmodesmus sp.),其核苷酸序列包括SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。TTAGCCATGCATGTCTAAGTATAAACTGCTTATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGGTGGTACCTTCTTACTCGGAATAACCGTAAGAAATTTAGAGCTAATACGTGCGTAAATCCCGACTTCTGGAAGGGACGTATATATTAGATAAAAGGCCGACCGGGCTCTGCCCGACCCGCGGTGAATCATGATATCTTCACGAAGCGCATGGCCTTGTGCCGGCGCTGTTCCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTGGTAACGGGTGACGGAGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACCGGGCATTTCATGTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTA ATTCCAGCTCCA ATAGCGTATATTTA AGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCGGGTGGGTTTCAGCGGTCCGCCTATGGTGAGTACTGCTGTGGCCTTCCTTACTGTCGGGGACCTGCTTCTGGGCTTCATTGTCCGGGACAGGGATTCGGCATGGTTACTTTGAGTAAATTGGAGTGTTCAAAGCAGGCTTACGCCGTGAACATTTTAGCATGGAATAACATGATAGGACTCTGCCCTATTCTGTTGGCCTGTAGGAGTGGAGTAATGATTAAGAGGAACAGTCGGGGGCATTCGTATTTCATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATGAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTGGGGGCTCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTCAACCATAAACGATGCCGACTAGGGATTGGCGGACGTTTTTGCATGACTCCGTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGGAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGGTTGTCTTGTCAGGTTGATTCCGGTAACGAACGAGACCTCAGCCTTTAAATAGTCACTGTCGCTTTTTGCGGCTGGCTTTTGACTTCTTAGAGGGACAGTTGGCGTTTAGTCAACGGAAGTATGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGATGCATTCAACAAGCCTATCCCTAGCCGAAAGGCTCGGGTAATCTTTGAAACTGCATCGTGATGGGGATAGATTATTGCAATTATTAGTCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAAGCGCAATTCATCAGATTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGGGTGTGCTGGTGAAGTGTTCGGATTGGCAATTATCGGTGGCAACACCGTCGATTGCCGAGAAGTTCATTAAACCCTCCCACCTAGAGAAGGAGAAGTCG (SEQ ID NO:3)所述的柵藻藻株ENN220IA (Desmodesmus sp.),其核苷酸序列包括SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
TGGGTTGGAAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGAATATGCAAACCACAACACGCACTCTTTATTTGTGTTCGACGTTAGGTCAACACGCGCAAGCGTGTGGCCTACTAACCTACACACCATTGACCAACCATTTATCAAACCAAACTCTGAAGCTTTGGCTGCCGTTAACCGGCAGTTCTAACAAAGAACAACTCTCAACAACGGATATCTTGGCTCTCGCAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAACCATCGAATCTTTGAACGCATATTGCGCTCGACTCCTCGGAGAA
GAGCATGTCTGCCTCAGCGTCGGTTTACACCCTCACCCCTCTTCCTTAACAGGAGGCGCCTGTCGTGCTTGCTTAAGCCGGCAGCAGGGGTGGATCTGGCTCTCCCAATCGGATTCACTCTGGTTGGGTTGGCTGAAGCACAGAGGCTTAAACTGGGACCCAATTCGGGCTCAACTGGATAGGTAGCAACACCCTCGGGTGCCTACACGAAGTTGTGTCTGAGGACCTGGTTAGGAGCCAAGCAGGAAACGCGTCTCTGGCGCGTACTCTGTATTCGACCTGAGCTCAGGCAAGGCTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGGAGGAACCCCTTTT (SEQ ID NO:6) 本發明人在德陽市中江縣凱江河取水樣，加入1/3體積的BGll培養基，在25°C、光照強度為40ymOl/m2.s的條件下培養5天左右，取該水樣于顯微鏡下觀察，判斷水樣中存在的主要物種。調整細胞濃度約為1000個/ml，取100 μ I水樣涂布于BGll培養基的固體瓊脂板上，在25°C、光照強度為40 μ mol/m2.s左右的條件下培養10天左右，即可看到單藻落長出，用接種環或無菌牙簽挑取單藻落接種于BGll培養基中培養。重復此過程，直到獲得純培養的藻株，本發明中對其編號稱為“ENN2201A”。實施例1中給出了具體的分離篩選過程。實施例2中從形態水平和分子水平上對得到的藻株進行了分類鑒定，并進行了分析和比對。根據形態鑒定和分子鑒定的結果，確定ENN2201A為柵藻科(Scenedesmaceae),鏈帶藻屬(Desmodesmus)。本發明的另一方面涉及所述的柵藻藻株的培養方法，其包括如下的(1)-(4)中的任一項或多項:(I) 所述培養基為淡水藻培養基，例如BG11、BBM、CT、SE、HB111、HB 119、或MA;(2)培養溫度為9_43°C ;優選為15_40°C ;更優選為25_30°C ；(3) pH 為 7-9 ；(4)光照為 200-1500 μ mol/m2/s。關于培養溫度，最佳的培養溫度為25_30°C，在等于高于9°C，但是小于15°C時也能生長，生長速度會受一定的影響。高于40°C并小于43°C，持續2-4h下能生長，見實施例8，但是生長速度會受影響。本發明的柵藻藻株(ENN2201A)應用范圍廣泛，包括但不限于污水處理、生物柴油生產、以及飼料或食品行業等等。本發明的另一方面涉及所述的柵藻藻株在處理或凈化污水中的用途；具體地，所述污水為工業廢水或城市生活污水,所述廢氣為工業廢氣。實施例8的數據顯示，本發明的柵藻藻株能夠有效地凈化污水特別是工業廢水，例如化工廢水。本發明的再一方面涉及所述的柵藻藻株在制備生物柴油和/或油脂中的用途。術語“生物柴油”包括但不限于:由動植物油脂或其廢油或者由藻類油脂制備的脂肪酸甲酯和/或脂肪酸乙酯；或者由動植物油脂或其廢油或者由藻類油脂制備的脂肪酸單燒基酷。實施例4的數據顯示，本發明的柵藻藻株能夠有效地生成脂肪酸。本發明的再一方面涉及所述的柵藻藻株在制備飼料中的用途；具體地，所述飼料為水產品飼料、畜禽飼料、或寵物飼料所述飼料可以全部或部分由本發明的柵藻藻株構成。本發明的柵藻藻株可以單獨作為飼料，也可以作為添加劑制備飼料。可以直接使用藻體，即藻粉，添加到飼料中，也可以破壁后加入。飼料的制備方法可以參考，例如:周安國主編，飼料手冊，農業出版社，.2002;齊廣海等編著，飼料配制技術手冊，中國農業出版社，2000;韓長日、吳偉雄，飼料添加劑制造技術，科學技術文獻出版社2011-02，等等。本發明的再一方面涉及所述的柵藻藻株在制備類胡蘿卜素中的用途；具體地，所述類胡蘿卜素選自玉米黃質、角黃素、以及胡蘿卜素中的任一種或多種。實施例7的數據顯示，本發明的柵藻藻株能夠有效地生成類胡蘿卜素。本發明還提供了如下的方法。本發明的再一方面涉及一種處理或凈化污水或廢氣的方法，包括使用本發明的柵藻藻株的步驟；具體地，所述污水為工業廢水或城市生活污水，所述廢氣為工業廢氣。本發明的再一方面涉及一種制備生物柴油和/或油脂的方法，包括使用本發明的柵藻藻株的步驟。本發明的再一方面涉及一種制備飼料的方法，包括使用本發明所述的柵藻藻株的步驟。本發明的再一方面涉及一種制備類胡蘿卜素的方法，包括使用本發明的柵藻藻株的步驟；具體地，所述類胡蘿卜素選自玉米黃質、角黃素、以及β_胡蘿卜素中的任一種或多種。發明的有益效果I)本藻種適溫范圍廣，在低溫下養殖也有較好的性能，能有效增加全年養殖天數。2)本藻種沉降性 能良好，能有效降低藻體收集的成本，具有較高的產業化應用前
旦
-5^ O3)本藻種生長速度快，含油及類胡蘿卜素，具有多方面的產業化應用效果。
圖1:ΕΝΝ2201Α顯微鏡下形態。圖A和B中的線段代表10微米。圖2:ΕΝΝ2201Α 藻 18S 序列 Blast 結果。圖3:ENN2201A 進化樹分析(18S)。圖4:ENN2201A 藻 ITS 序列 Blast 結果。圖5:ENN2201A 進化樹分析(ITS)。圖6:ENN2201A在三角瓶中生長結果。圖7:ENN2201A、1號藻株、2號藻株的脂肪酸含量和干重的評價結果。圖8:ENN2201A在低溫環境下生長結果。生長速率計算公式:v = (ml_m2) /
藻液干重，t:培養時間。注:接種時，三個藻株初始濃度分別為1: 0.914、2: 0.812、1.288，差距不是很大，不會對后續生長有特別重大的影響。圖9:將處在對數生長期的ENN2201A藻種接種于50X3X50cm的板式反應器中，以BGll培養基培養。并且，以相同條件接種兩株生長較快的柵藻藻株進行比較。圖10:ENN2201A生長16天時類胡蘿卜素中各物質含量。占干重比例:左為玉米黃質、中為角黃素、右為胡蘿卜素。圖11:ΕΝΝ2201Α在自來水及廢水中的生長情況。生物材料保藏說明:
柵藻藻株ENN2201A(建議的分類命名為Desmodesmus sp.)，其于2011年8月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCN0.5150，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。
具體實施例方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例1:篩選產油柵藻藻株在德陽市中江縣凱江河取水樣，加入1/3體積的BGlI培養基，在25°C、光照強度為40 μ mol/m2.s的條件下培養5天左右，取該水樣于顯微鏡下觀察，判斷水樣中存在的主要物種。調整細胞濃度約為1000個/ml，取100 μ I水樣涂布于BGll培養基的固體瓊脂板上，在25°C、光照強度為40 μ mol/m2.s左右的條件下培養10天左右，即可看到單藻落長出，用接種環或無菌牙簽挑取單藻落接種于BGll培養基中培養。重復此過程，直到獲得純培養的藻株。將生長出的純系藻液分別在三角瓶、柱式反應器中培養，定期測定干重和油脂含量，從中挑選生長速度快、油脂含量高的藻株。通過此方法，獲得一藻株命名為ENN2201A。本發明所用的BGll培養基均如下面的表I所示。表1:BG11培養基配方
權利要求
1.一種柵藻藻株ENN2201A(Desmodesmus sp.)，其保藏編號為CGMCC N0.5150，保藏日期為2011年8月17日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.根據權利要求1所述的柵藻藻株ENN220IA(Desmodesmus sp.),其核苷酸序列包括SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
3.根據權利要求1或2所述的柵藻藻株ENN220IA(Desmodesmus sp.),其核苷酸序列包括SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
4.權利要求1所述的柵藻藻株的培養方法，其包括如下的(1)-(4)中的至少一項: (1)所述培養基為淡水藻培養基，例如BG11、BBM、CT、SE、HB111、HB 119、或MA; (2)培養溫度為9-43°C;優選為15-40°C ;更優選為25_30°C ； (3)pH 為 7-9 ；(4)光照為200-1500 μ mol/m2/s。
5.權利要求1所述的柵藻藻株在處理或凈化污水和/或廢氣中的用途；具體地，所述污水為工業廢水或城市生活污水,所述廢氣為工業廢氣。
6.權利要求1所述的柵藻藻株在制備生物柴油和/或油脂中的用途。
7.權利要求1所述的柵藻藻株在制備飼料中的用途；具體地，所述飼料為水產品飼料、畜禽飼料、或寵物飼料。
8.權利要求1所述的柵藻藻株在制備類胡蘿卜素中的用途；具體地，所述類胡蘿卜素選自玉米黃質、角黃素、以及胡蘿卜素中的至少一種。
9.一種處理或凈化污水或廢氣的方法，包括使用權利要求1所述的柵藻藻株的步驟；具體地，所述污水為工業廢水或城市生活污水，所述廢氣為工業廢氣。
10.一種制備生物柴油和/或油脂的方法，包括使用權利要求1所述的柵藻藻株的步驟。
11.一種制備飼料的方法，包括使用權利要求1所述的柵藻藻株的步驟。
12.—種制備類胡蘿卜素的方法，包括使用權利要求1所述的柵藻藻株的步驟；具體地，所述類胡蘿卜素選自玉米黃質、角黃素、以及胡蘿卜素中的任一種或多種。
全文摘要
本發明屬于微生物和生物能源領域，涉及一種柵藻藻株及其用途。具體地，本發明涉及一種柵藻藻株ENN2201A(Desmodesmus sp.)，其保藏編號為CGMCC No.5150，保藏日期為2011年8月17日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發明的柵藻藻株能夠在較大的溫度范圍內生長，生長速度快且易于收集，并且能夠有效產生脂肪酸、類胡蘿卜素等物質，具有在污水處理、生物柴油生產、以及飼料或食品行業等應用的潛力。
文檔編號B01D53/84GK103184156SQ201110448718
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者鄧平, 羅少敬, 陳傳紅, 吳洪, 馬建源 申請人:新奧科技發展有限公司