專利名稱：親水性金屬離子固定化親和磁球及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于在線或離線磷酸化肽段選擇性富集分離的親水性磁球，具體地說是一種親水性金屬離子固定化親和磁球及其制備和應用。
背景技術：
蛋白質磷酸化是最普遍的翻譯后修飾之一，在生命過程中扮演著信號傳導、代謝調節、細胞功能調控等重要作用。然而，磷酸化蛋白/肽段通常含量較低，在質譜分析中常受到大量非磷酸化蛋白/肽段的干擾。因此，發展針對磷酸化肽段的選擇性富集技術對于深入開展磷酸化蛋白質組研究至關重要。基于固載金屬離子與磷酸根間的特異相互作用的固定化金屬親和色譜是目前最 常用的磷酸化富集技術之一(Chaga GS.^ Biochem. Biophys. Methods. 2001, 49,313-334)。氨甲基磷酸等以磷酸根為配體的固定化金屬親和材料已成功用于磷酸化肽段的選擇性富集，因其與磷酸肽的結合能力遠大于次氨基三乙酸等以羧基為配體的固定化金屬親和色譜材料，故對磷酸化肽段的選擇性得到了很大的提高(Hou C Y; Ma J F，Tao D Y,Shan Y C， Liang Z, Zhang L H, Zhang Y K, J proteome Res, 2010, 9, 4093-4101;DunnJD, WatsonJT, Bruening M L, Anal. Chem, 2006，78，1574-1580)。但因氨甲基磷酸等試劑往往只含有一個磷酸根以和金屬離子進行螯合，螯合作用較弱，且含有其他甲基等疏水性基團，導致了疏水性肽段的競爭性吸附，故以其為配體制備的固定化金屬親和材料親水性差，對磷酸化肽的選擇性還有待進一步提高。另外這些試劑均有劇毒且易水解，故以這些試劑為配體的固定化金屬親和材料的制備過程對操作人員具有極大的危害性，而且材料的制備過程因該試劑的極易水解導致難于控制，重現性差。磁性材料(或稱磁性微球)因其具有較好的磁性響應，極大的方便了材料的制備及應用過程，故其在生物醫藥方面的應用發展較快，取得了很多成功的應用成果。在磷酸化蛋白組學研究中，磷酸化肽段富集的高選擇性、高重現性和富集過程的方便快捷是獲得可靠分析結果的必需條件。因此，發展具有高親水性的固定化金屬離子親和納米磁球對于實現磷酸化肽段分離鑒定具有重要意義。
發明內容
本發明的目的在于提供一種親水性金屬離子固定化親和磁球及其制備和應用，以期解決金屬離子固定化親和材料的親水性差、選擇性差、制備過程重現性差、所得親和材料性能不穩定、操作不安全、操作過程繁瑣、制備的材料使用時往往需要液相泵或離心機等其他輔助儀器，使用不方便快捷等缺點。該親水性金屬離子固定化親和磁球主要用于在線或離線選擇性富集磷酸肽。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為
將表面帶有氨基的磁球通過表面活化及修飾反應，使其表面鍵合上含多個磷酸基和羥基的親水性功能化分子，以用于后續的金屬離子固定。最后通入含金屬離子的溶液，實現金屬離子的固定化。具體為
O磁球表面活化反應過程將表面帶有氨基的磁球和質量濃度為1-50%的戊二醛溶液，溶液的pH值為3-9,在室溫下反應O. 15-6 h,進行氨基磁球表面的活化反應；磁球表面的氨基通過戊二醛的活化反應，使其表面鍵合上含羰基的基團，以用于后續的功能化修飾。在磁球表面活化反應后，用pH值為3-9的溶液清洗3-6次。2)磁球表面修飾反應過程將活化后的氨基磁球加入質量濃度為1-200 mg/mL的三磷酸腺苷二鈉溶液中，溶液的pH值為3-9，在室溫下反應O. 5-6 h，進行磁球表面的化學修飾反應，使磁球表面鍵合上含多個磷酸基和羥基的親水性功能分子，以用于后續的金屬離子固定。
在氨基磁球完成表面功能團修飾反應后，用pH值為3-9的溶液清洗3-6次。3)金屬離子的固定化過程將表面功能化修飾的磁球加入含有O. 05-2 mol/L的可溶性金屬離子溶液中，實現金屬離子的固定化；在室溫下，反應時間O. 5-6 h。金屬離子溶液為可溶性金屬無機鹽溶液中的一種或多種(如氯化鹽、硫酸鹽、硝酸鹽或其他可溶于水的金屬鹽)，其中金屬元素包括過渡金屬(IB、IIB、IIIB、IVB、VB、VIB、VIIB、VIII)以及主族金屬(IIIA、IVA)中的一種或多種。制備好的金屬離子固定化親和磁球用甲酸體積分數為O. 05-0. 2 %的溶液沖洗，去除游離的金屬離子。制備得到的親水性金屬離子固定化親和磁球可用于在線或離線的磷酸化肽段選擇性富集快速分離，使用后的親水性金屬離子固定化親和磁球可通過重復步驟3)的親水性金屬離子的固定化過程實現再生。本發明的優點為(1)制備的磁性材料親水性好，對磷酸化肽段具有很好的選擇性和較高的富集容量；(2)本制備方法無毒無害；(3)本制備方法簡便，步驟少，重現性好；(4)制備的磁性顆粒性能穩定，使用方便快捷，無需液相泵、離心機等輔助儀器設備。
圖I是實施例I所得的親水性鈦離子固定化親和納米磁球的傅里葉紅外表征圖(a,氨基磁球；b,親水性鈦離子固定化親和納米磁球)；
圖2是實施例I所得的親水性鈦離子固定化親和納米磁球的磁性響應圖片(a，親水性鈦離子固定化親和納米磁球的懸浮液；b，親水性鈦離子固定化親和納米磁球對外加磁場的磁性響應);
圖3是將磷酸化蛋白(β -酪蛋白)與非磷酸化蛋白(牛血清蛋白)的胰蛋白酶酶解產物按照物質的量比1:100混合，所得混合物富集前后質譜對比圖(a，未富集；b，用實施例I所得親水性鈦離子固定化親和納米磁球富集后)(磷酸肽用*標示，發生中性丟失的磷酸肽用#標示，無標示的均為非磷酸肽)。
具體實施例方式本發明所涉及的表面帶有氨基的磁球(氨基磁球)粒徑可為納米級也可為微米級，可參照文獻(Y. Li, X. Xu, C. Deng, P. Yang and X. Zhang, J Proteome Res, 2007,6，3849-3855.)合成，亦可從深 圳市納微科技有限公司購得。實施例I :一種親水性鈦離子固定化親和納米磁球的制備
將O. I克氨基磁球(粒徑為200納米)和5毫升質量濃度為20%的戊二醛溶液在室溫下反應2 h，溶液的pH值為5，進行氨基磁球表面的活化反應。待磁球表面活化反應完成后，用PH值為5的溶液清洗磁球3次。將活化后的氨基磁球加入3毫升質量濃度為200 mg/mL的三磷酸腺苷二鈉溶液中，溶液的PH值為5，在室溫下反應2 h，進行磁球表面的化學修飾反應，使磁球表面鍵合上含多個磷酸基和羥基的親水性功能分子，以用于后續的鈦離子固定。待磁球完成表面功能團修飾反應后，用PH值為5的溶液清洗3次。最后將表面功能化修飾的磁球加入10毫升含有O. I mol/L的硫酸鈦溶液中，在室溫下，反應時間2 h，實現鈦離子的固定化。制備好的親水性鈦離子固定化親和納米磁球用2毫升甲酸體積分數為O. I %的溶液沖洗，去除游離的鈦離子后保存于4°C甲酸體積分數為O. I %的溶液中。實施例2 :—種親水性鎵離子固定化親和納米磁球的制備
金屬離子溶液為硝酸鎵溶液，其他同實例1，可得親水性鎵離子固定化親和納米磁球。實施例3 :—種親水性鐵離子固定化親和納米磁球的制備
金屬離子溶液為三氯化鐵溶液，其他同實例1，可得親水性鐵離子固定化親和納米磁球。應用例I
以本發明的親水性鈦離子固定化親和納米磁球為離線磷酸化肽段捕集材料，以含三氟乙酸體積分數為5%，乙腈體積分數為80%的水溶液為上樣緩沖溶液，可在30 min內實現對蛋白樣品中磷酸化肽段的選擇性捕集。本發明的優點為制備方法簡便，步驟少，制備過程無毒無害，安全性高且重現性好；與其他金屬離子固定化親和材料的制備方法相比，本方法所得金屬離子固定化親和磁球親水性強，對磷酸化肽段有很高的特異性富集能力，性能穩定；制備的磁性顆粒使用方便快捷，無需液相泵、離心機等輔助儀器設備。
權利要求
1.一種親水性金屬離子固定化親和磁球，其特征在于是以三磷酸腺苷二鈉為磁球表面功能化修飾試劑的親水性金屬離子固定化親和磁球。
2.—種權利要求I所述親水性金屬離子固定化親和磁球的制備方法，其特征在于是以三磷酸腺苷二鈉為磁球表面功能化修飾試劑的親水性金屬離子固定化親和磁球的制備方法，包括有如下步驟 (1)將表面帶有氨基的磁球表面的氨基通過戊二醛進行活化反應，以利于后續的表面修飾反應； (2)活化的磁球通過鍵合三磷酸腺苷二鈉分子，使其表面鍵合上含有一個以上的磷酸基和羥基親水性基團的功能分子，以用于后續的金屬離子固定； (3)最后在含金屬離子的溶液中，實現金屬離子的固定化，完成親水性金屬離子固定化親和磁球的制備。
3.按照權利要求2所述的制備方法，其特征在于 步驟(I)是以戊二醛為磁球表面氨基的活化劑實現的，即將氨基磁球和質量濃度為1-50%的戊二醛溶液在室溫下反應O. 15-6 h，溶液的pH值為3-9，完成磁球表面的活化反應。
4.按照權利要求2或3所述的制備方法，其特征在于 在磁球完成表面活化反應后，用PH值為3-9的溶液清洗3-6次。
5.按照權利要求2所述的制備方法，其特征在于 步驟(2)是以三磷酸腺苷二鈉為磁球表面的功能化修飾分子實現的，即將活化后的磁球與質量濃度為1-200 mg/mL的三磷酸腺苷二鈉溶液在室溫下反應O. 5-6 h,進行磁球表面的化學修飾反應，使磁球表面鍵合上含一個磷酸基和羥基親水性基團的功能分子，以用于后續的金屬離子固定，溶液的PH值為3-9。
6.按照權利要求2或5所述的制備方法，其特征在于 在磁球完成表面功能化分子修飾反應后，用PH值為3-9的溶液清洗3-6次。
7.按照權利要求2所述的制備方法，其特征在于 步驟(3)是以含金屬離子的溶液實現金屬離子的固定化過程，即將表面功能化修飾的磁球加入含有O. 05-2 mol/L的可溶性金屬鹽溶液中，實現金屬離子的固定化；在室溫下，反應時間O. 5-6 h0
8.按照權利要求2或7所述的制備方法，其特征在于制備好的親水性金屬離子固定化親和磁球用甲酸體積分數為O. 05-0. 2 %的溶液沖洗，去除游離的金屬離子。
9.按照權利要求2或7所述的制備方法，其特征在于金屬離子溶液為可溶性金屬無機鹽溶液中的一種或多種，其中金屬元素包括過渡金屬B、IIB、IIIB、IVB、VB、VIB、VIIB、VIII以及主族金屬IIIA、IVA中的一種或多種。
10.一種權利要求I所述的制備方法，其特征在于制備得到的親水性金屬離子固定化親和磁球可用于在線或離線的磷酸化肽段選擇性富集快速分離，使用后的親水性金屬離子固定化親和磁球可通過重復權利要求7的金屬離子的固定化過程實現再生。
全文摘要
本發明涉及一種親水性金屬離子固定化親和磁球的制備方法，包括有以下步驟氨基磁球表面通過戊二醛進行氨基的活化；活化后的磁球通過表面修飾反應連接上三磷酸腺苷二鈉分子，使其表面鍵合上含有多個磷酸根和羥基的親水性功能分子，以利于后續金屬離子的固定；最后在含金屬離子的溶液中，實現金屬離子的固定化，完成親水性金屬離子固定化親和磁球的制備。本發明的優點為制備方法簡便，與其他金屬離子固定化親和色譜柱或磁球的制備方法相比，本方法所得親水性金屬離子固定化親和磁球親水性強，選擇性好，對磷酸化肽段有很好的特異性富集能力，制備重現性好，性能穩定，操作簡單，可避免復雜的離心操作，在蛋白組學，特別是磷酸化蛋白組學領域有著廣泛的應用前景。
文檔編號B01J13/02GK102760543SQ20111010366
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月25日 優先權日2011年4月25日
發明者張麗華, 張麗媛, 張玉奎, 楊開廣, 梁振 申請人:中國科學院大連化學物理研究所