專利名稱：結合蛋白質和肽的特異性吸附劑及使用所述吸附劑的分離方法
技術領域：
本專利申請涉及生物分子的分離技術領域，尤其涉及生物色譜。
背景技術：
用于生物分子的色譜介質傳統地已按照一種或多種下列與樣品相互作用的可能模式歸類-疏水性相互作用(反相)-親水性相互作用(正相)-陽離子交換 -陰離子交換-尺寸排阻-金屬離子螯合。技術發酵工藝在效價方面的持續改進導致對簡單、成本有效和高選擇性的下游純化技術需求的增長，該純化技術能夠處理大的蛋白容量而不會提高同樣因素下所需的液體體積。由此對給定分離問題傳統地逐步應用以上色譜類別，這反映在產物純度的逐步穩定提高中，但也反映在每個階段產物損失(最終嚴重累積)中，更別提操作時間和商品成本。向下游工藝早期引入親合色譜是該需求的解決方案，因為多次證實將一系列連續的順序色譜步驟由此減少到僅一步。親合色譜有時被視為單獨一類，但從化學角度看，它是基于如上同樣的相互作用模式，并且通常基于兩種或更多種模式的組合。親合色譜的原理特性在于其對預定分析物的高度特異性，所述分析物通常基于已知的具有生物學意義的分子識別對如抗原-抗體、碳水化合物-凝集素、荷爾蒙-受體，或在互補核酸鏈之間。因此大多數親合吸附劑由終端使用者根據它的特定分離任務進行定制。為生產全功能吸附劑，通過選擇僅有的幾種對本身可商購的支承材料的標準生物綴合技術將生物親合殘基直接或經由任選的在該殘基轉錄和旋轉運動中允許更多自由度的鏈(tether)偶聯。這種吸附劑的保質期通常較短，往往不得不根據需要制備。此外，已發現合成親合配體如短鏈或環狀合成肽或類肽，以及某些反應性染料(主要是三嗪染料)與生物分子基團特異性地相互作用。后者是廉價并且容易制備的低分子量的殘基，所述殘基沒有在生物聚合物的三級結構中不穩定和變化的缺點。而且，由于它們小的分子尺寸和可調、強的活化化學性質，即使沒有長的栓鏈(tethering)，它們仍可以高效地定向固定到固體載體上，然而生物聚合物在相同條件下往往在固定化之后會因未折疊、空間位阻或隨機取向而缺少活性。任一種情況下，主動參與識別過程的吸附劑組分通常僅存在于支承固體的表面上(往往作為表面結合的單層)。除了均相固體支承材料以外，現有技術熟知根據其表面覆有交聯聚合物薄膜的本體固體支承材料的通用設計由2層截面形態組成的吸附劑。過去已主要使用如重度(輻射)交聯的聚丁二烯、聚苯乙烯、聚硅氧烷、聚(甲基)丙烯酸酯和聚酰胺之類的聚合物。它們已主要用于形成保護周圍介質以免與固體支承材料的基本部分(“載體”)發生不需要的相互作用的致密界面。這種相互作用可能導致生物分子非特異性地或甚至不可逆地結合吸附齊U，而另一方面，固體支承材料的成分或其與殘基的化學鍵合可能被樣品或洗脫液的活潑組分所腐蝕。涂有聚合物的吸附劑對于如上所列的所有色譜類別的應用都基本已知，尤其對于疏水性相互作用和尺寸排阻。還已知沒有內部交聯而是作為直鏈或支鏈接枝到支承材料上的聚合物涂覆劑如所謂的觸手樹脂。另一方面，親合色譜已主要用本體凝膠相樹脂實施。卓越的凝膠形成材料是中度交聯的多聚糖、聚丙烯酰胺和聚(環氧乙烷)。這種水凝膠因其柔軟度(構象柔性、彈性模量)、大孔體系、高極性和高水含量以及不存在反應性或變性化學基團而確保能恰好容納活性殘基和與其相互作用的生物分析物的生物相容性界面。它們能夠截留天然態的蛋白質，即保持它們準確折疊的三維結構、締合態和功能整體性。這主要是因為可以避免往往用來從強烈吸附的疏水性介質洗脫蛋白質或肽的有機溶劑。載體缺少的固有吸附強度由此通過引入高特異性的完整生物配體作為恰好容納在水凝膠內的用于分離的結合體而得到彌補。但是，這些介質的耐機械性比無機支承材料弱很多，因為它們在所施加的壓力下可壓縮并且不耐受因攪拌、柱填裝或高的液體流速所致的剪切應力。與嚴格的HPLC工藝條件完全相適應的親合吸附劑因此鮮見。 僅在不久的過去已認識到固定相的耐機械性是吸附劑載體的本體性質,而僅有固定相與移動相之間的界面處的薄層影響傳質和與生物分析物的相互作用。因此已提到結合機械上非常具有剛性且維度上穩定的多孔三維芯和攜有活性殘基用以結合分析物的生物相容性凝膠狀界面層的功能的概念，并且相關的合成問題已在技術上解決。這種雜合材料在低極性的無機氧化物或致密交聯的聚合物的基礎上應用高極性的松散交聯的聚合物。就方法而言，它們可以通過將高極性聚合物施用到芯材料上或通過使極性單體、其前體或預聚物在芯材料和交聯劑的存在下直接聚合來制備。根據后一方法制備的大多數材料在文獻中被描述為具有非孔滲透或孔填充形態。盡管非滲透膜可用于與分析物相互作用的表面積受限，并且因此僅依賴于聚合物膜厚度的結合能力低，但是孔填充膜在與分析物相互作用中利用芯材料的全部內孔體積，這通常導致好的結合能力，但是孔內部的擴散傳質速率和與移動相的交換動力學慢。覆蓋但不是完全填充芯材料內表面的聚合物膜在此方面有益。該整類吸附劑中最好的已知代表是由接枝到多孔二氧化硅支承芯材料上的支化且任選進一步交聯的聚乙烯亞胺組成的體系。已證實這種吸附劑可以進一步衍生化，但它們商業化僅用于離子交換和那些僅需要小標準殘基的基團特異性的親合應用。概念上不同的合成親合介質的生產方法是所謂的分子印跡技術，其基于目標底物與在聚合反應過程中形成的聚合物空穴之間的形狀和官能團互補性，所述聚合反應在目標底物和致孔劑的存在下進行，必須隨后除去致孔劑。就目標底物的暫時固定而言，印跡已經發展用于大多底物包括蛋白質和肽，并且可以分為共價和非共價的方法。但是，它限于一些高交聯類型的聚合物作為固體支承材料的形成，并且一旦達到生產規模，迄今為止就沒有得到廣泛的接受度，尤其對于在監管機構控制下的藥用蛋白質或肽更是沒有。最廣泛用于免疫球蛋白G(IgG)純化的親合介質是載體結合的蛋白質A或G以及蛋白質L,蛋白質A或G 二者是在葡萄球菌(Staphylococci)的細胞壁上天然生成的,但是對于大規模應用所有都要求相當高的資本投入，這根本性地阻礙它們作為一次性產品的用途。已知蛋白質A結合在抗體的恒定Fe段上的特定抗原決定部位。因此它在重組抗體片段或缺少該區域的融合產物的純化中具有有限用途。另一方面，源于蛋白質的吸附劑的重復使用與蛋白質的二級/三級結構和/或化學鍵合對于苛刻的生產條件不穩定的缺點有關，導致尤其在色譜運行之間必須的強堿性衛生處理過程中可能發生失活或滲漏。除了因此減少壽命之外，關于蛋白質A吸附劑在藥物生產中的應用正存在爭議，因為在待純化的產物用于體內藥用時即使微量的滲漏蛋白質A都被懷疑引起人類的免疫紊亂。因此，強制性產品的注冊審批和期待的市場授權是決定技術純化工藝的其它重要因素，因此蛋白質A色譜必須隨后進行額外的色譜步驟以除去滲漏的毒素已成為工業標準。除了嘗試形成這些蛋白質具有改進技術性質的工程化變體之外，還有結果是生產一些僅具有非常短(非天然)的肽抗原決定部位或甚至具有完全合成殘基的吸附劑。那些用作蛋白質A/G/L替代物的可商購合成介質最近在Journal of Chromatography B,第848卷，2007年第一期中已有綜述。
背景技術：
早期已認識到吡啶環和羧基以及它們通過質子化-去質子平衡的可離子化形式 (典型研究用于式I和II原型結構)用作生物色譜吸附劑的殘基，但該認識都是獨立的，并沒有主張它們聯用的益處。然而，就弱陽離子交換劑而言，發現包括羧基的殘基例子比包括吡啶環的殘基更常見于科學和專利文獻中。將羧基引入吸附劑的顯著方式是在存在或不存在額外的連接部分下，將酰胺鍵與天然氨基酸天門冬氨酸或谷氨酸或其保護形式偶聯。使用這兩種氨基酸，通過固相合成技術偶聯到載體上的兩種選擇方案是可行的在氨基處通過酰胺形成偶聯，得到仍包含兩個可分離羧基的結構，或替代地在這兩個羧基的任一個處通過酰胺形成偶聯，得到仍包含可質子化的氨基和一個可分離羧基的結構。所有這些不同的可能方案都已通過實驗實現。下面提供三處代表性的現有技術。在國際專利申請WO 00/69872 (Promega Corporation)中，提供pH依賴型離子交換基質、這種基質的制備方法和使用這種基質分離目標核酸如來自污染物包括蛋白質、月旨質、細胞碎片的質粒DNA、染色體DNA或RNA或其它核酸的方法。該發明的每種pH依賴型離子交換基質包含至少兩個不同的離子交換官能團，一個能夠在第一 PH下充當陰離子交換齊U，另一個能夠在第二更高的pH下充當陽離子交換劑。該基質在第一和第二 pH之間的pH范圍具有整體中性電荷。該發明的PH依賴型離子交換基質設計為在基質的總電荷為正的PH下結合目標核酸，并且隨著周圍溶液的pH升高而釋放目標核酸。國際專利申請WO 98/08603 (Upfront Chromatography A/S)涉及從包含免疫球蛋白的溶液如雜交瘤細胞培養上清液、動物血漿或血清或初乳中分離或純化免疫球蛋白的方法。該方法包括在結合過程中使用最少的鹽如溶致鹽，并且優選還在洗脫過程中使用少量的有機溶劑。固相基質，優選表氯醇活化的瓊脂糖基質被可包括酸性取代基如羧酸的單環-或雙環芳族或雜芳族配體(分子量至多500道爾頓)官能化。德國專利申請DE102008012224(Lanxess Deutschland GmbH)涉及單分散凝膠狀或大孔氨甲基吡啶樹脂、其制備方法及其用途，尤其在濕法冶金和電鍍中的用途，所述樹脂基于至少一種單乙烯基芳族化合物和至少一種聚乙烯基芳族化合物和/或(甲基)丙烯酰基芳族化合物，其可包含任選取代的吡啶甲基自由基的結構中包含叔氮原子作為官能團。據我們所知，在上述專利申請的任一篇以及專利或科學文獻的任一現有技術中都還沒有嘗試制備根據本發明的吸附劑，其包含異煙酰胺和琥珀單酰胺的組合作為分別含吡啶環或羧基的殘基原型，無論是否包含在相同或不同的殘基內。僅在載體不完全衍生化的情況下，才不得不考慮載體(或相應的封端衍生物)的殘基可及官能團可能充當次于如吡啶環結構的另一殘基。但是，這些官能團在化學上通常是簡單的結構部分，因此僅不得不考慮為第二殘基。即使在審查每次呈現每單個殘基其中之一的吸附劑的出版物中，也沒有暗示在同一吸附劑中聯用這兩種殘基的優點。而且，僅非常少的具有任一類型殘基的吸附劑構造成2組分成層復合支承材料。相反，殘基大多數直接或通過低分子量的連接部分固定化在本體載體材料上。發明目的本發明的一個目的是提供用于蛋白質和肽的新純化方法以及用于實施所述方法的吸附劑。
發明內容
本發明涉及包括固體支承材料的吸附劑，所述支承材料的表面包含至少兩種不同的殘基，其中第一殘基包含其氫原子可以被取代的吡啶環，第二殘基包含羧基。任選地，這些至少兩種殘基由覆蓋所述表面的聚合物膜負載。由于所述吸附劑來自完全合成源，其特征在于高的物理(特別是熱)和化學堅固性，但仍允許生物分子在溫和的生理學條件下甚至從不利的樣品基質特異性分離。還提供制備這種吸附劑的替代方法。本發明還提供用于從含蛋白質或肽的混合物中分離蛋白質或肽，或增加它們的濃度和/或純度的方法。所述方法包括使所述混合物與上結合有所期望的蛋白質或肽的根據本發明的吸附劑接觸，隨后從吸附劑上洗脫所述蛋白質或肽，并任選中間沖洗步驟。還公開其中所述吸附劑和/或方法可有益用于的各種分析和制備的生化與醫學應用領域。根據所述方法純化的抗體的特征在于回收率、純度和生物學活性與通過常規生物親合分離技術獲得的那些相當，而且不具有這類技術的缺陷。下面公開本發明的某些具體實施方案，而且各個實施方案的特性特征的組合也是可想象得到的，并因此在本發明的范圍內。根據一般方面，根據本發明的吸附劑包括固體支承材料，所述支承材料的表面包括含其氫原子可以被取代的吡啶環(-C5H4N)的第一殘基和含羧基(-C00H)的第二殘基。在一個實施方案中，第一和第二殘基彼此沒有直接連接，而是分別結合到本體固體支承材料本身上或由其作為載體支承的聚合物膜上。在該實施方案中，吡啶環和羧基沒有通過一個且相同的官能團連接到支承材料的表面上。一方面，本發明涉及包括固體支承材料的吸附劑，所述支承材料的表面包括第一殘基、含羧基(-C00H)的第二殘基和至少兩個彼此可以相同或可以不同的官能團，所述第一殘基包含其氫原子可以被取代的吡啶環(-C5H4N)，并且所述第一殘基和第二殘基經由所述至少兩個官能團連接到支承材料表面上，其中第一殘基和第二殘基沒有通過一個且相同的官能團連接到支承材料的表面上。在一個實施方案中，所述吸附劑的固體支承材料包括其表面覆有包含第一和第二官能團的聚合物膜的載體，所述第一和第二官能團彼此可以相同或可以不同，并又負載所述第一和第二、任選第三和第四殘基。
在一個實施方案中，所述第一和/或第二殘基包含連接部分。在一個實施方案中，所述第一和/或第二殘基包含長度為I至20個原子的共價、構象柔性的連接部分。在一個實施方案中，所述共價、構象柔性的連接部分不含硫。在一個實施方案中，所述連接部分彼此獨立地包含20至300個碳原子。在所述實施方案中，所述連接部分包含聚乙二醇部分或由其組成。在一個實施方案中，其它取代基結合到吡啶環上。在一個實施方案中，所述其它取代基不包含陰離子交換(即帶正電)基團。在一個實施方案中，第一殘基是吡啶-4-酰胺殘基(異煙酰胺殘基)，所述殘基優選經由其酰胺基結合到固體支承材料的表面上。
在一個實施方案中，第二殘基是3-酰胺丙酸殘基(琥珀單酰胺殘基)，所述殘基優選經由其酰胺基結合到固體支承材料的表面上。在一個實施方案中，第一殘基是吡啶-4-酰胺殘基(異煙酰胺殘基)，第二殘基是3-酰胺丙酸殘基(琥珀單酰胺殘基)，這兩個殘基優選經由其酰胺基結合到固體支承材料的表面上。在一個實施方案中，吡啶-4-酰胺殘基和/或3-酰胺丙酸殘基(殘基芯)的一個或多個氫原子被取代基取代。在一個實施方案中,所述取代基不包含疏水基團。在一個實施方案中，所述第一和第二殘基以I : I至2 I的摩爾比，優選以約3 2的比存在。在一個實施方案中，所述第一殘基包括第二殘基。在一個實施方案中，所述固體支承材料的表面另外包含第三殘基和任選第四殘基。在一個實施方案中，所述第三殘基包含胺或酰胺結構，優選伯胺結構。在一個實施方案中，第一殘基以基于吸附劑表面上所存在的所有殘基的總摩爾量在20%和50%之間的摩爾比存在。在一個實施方案中，第二殘基以基于吸附劑表面上所存在的所有殘基的總摩爾量為在20%和40%之間的摩爾比存在。在一個實施方案中，第一和第二殘基以基于吸附劑表面上所存在的所有殘基的總摩爾量在20%和50%之間的第一殘基和在20%和40%之間的第二殘基的摩爾比存在。在一個實施方案中，第一、第二和第三殘基以約35 25 40的摩爾比存在。在另一實施方案中，第一和第二殘基以基于吸附劑表面上所存在的所有殘基的總摩爾量為40%至55%的第一殘基和45%至60%的第二殘基的摩爾比存在。在一個實施方案中，所有殘基的總密度合計為O. Imol · dnT3至I. Omol · dnT3,優選至少為約O. 3mol · dnT3。在一個實施方案中，每種殘基類型均勻和隨機(統計學上)地分布在固體支承材料的表面上。在一個實施方案中，所述固體支承材料由其表面覆有聚合物膜的載體構成，所述聚合物膜具有至少部分被第一和第二、任選第三和第四殘基取代的官能團。
在一個實施方案中，所述聚合物由彼此共價交聯但沒有共價接枝或結合到所述載體表面的各個鏈構成。在一個實施方案中，所述聚合物鏈以基于可用于交聯的官能團數量的2%至20%的范圍彼此共價交聯。
在一個實施方案中，所述聚合物由共價接枝到所述載體表面但沒有彼此共價交聯的各個鏈構成。在一個實施方案中，所述聚合物鏈經由其端官能團共價接枝到所述載體表面上。在一個實施方案中，所述聚合物膜占所述吸附劑總重量的5%至30%，優選15%至 20%。在一個實施方案中，所述聚合物在水性介質或水性-有機的混合介質中可溶脹。在一個實施方案中，所述聚合物是合成的聚電解質。在一個實施方案中，所述聚合物的交聯或接枝連接和/或殘基的鍵合由酰胺、氨基甲酸酯、脲或仲/叔胺鍵構成。在一個實施方案中，所述聚合物是部分衍生化的聚合物，選自聚乙烯醇、聚乙烯胺、聚烯丙胺、聚乙烯亞胺、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸或包括至少一種這些聚合物的任意共聚物或共混聚合物。在一個實施方案中，所述聚合物是聚乙烯胺。在一個實施方案中，所述固體支承材料或至少所述載體是多孔材料，其孔尺寸為IOnm至400nm,或其比表面積為ImiV1至IOOOmiV1,或其孔隙率為30體積％至80體積％。在一個實施方案中,所述固體支承材料是顆粒尺寸為5 μ m至500 μ m的微粒材料。在一個實施方案中，所述固體支承材料是板狀或纖維狀材料如膜。在一個實施方案中，所述載體的制成材料不同于所述聚合物膜的制成材料。在一個實施方案中，所述固體支承材料或至少所述載體由選自常規或表面改性的聚苯乙烯、聚苯乙烯磺酸或聚苯乙烯磺酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、二氧化硅、玻璃、淀粉、纖維素、瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和葡聚糖或其復合材料的材料制成。在一個實施方案中，所述吸附劑還包括可易于檢測的標記物如吸光、發光、放射性、磁性或質量-或射頻-編碼的標記物。本發明還涉及用于制備吸附劑的方法，包括(i)提供具有官能團的聚合物；(ii)將所述聚合物的膜吸附到載體表面上；(iii)使所吸附的聚合物的所述官能團的限定部分與至少一種交聯劑交聯；(iv)用含其氫原子可以被取代的吡啶環(-C5H4N)的第一殘基和含羧基(-C00H)的第二殘基以及任選的其它殘基使交聯聚合物的所述官能團的其它限定部分衍生化。本發明還涉及用于制備吸附劑的方法，包括(i)提供具有官能團的聚合物；(ii)用含其氫原子可以被取代的吡啶環(-C5H4N)的第一殘基和包括含羧基(-C00H)的單核雜芳環結構的第二殘基以及任選的其它殘基使所述官能團的限定部分衍生化；(iii)將所述衍生化的聚合物的膜吸附到載體表面上；
(iv)使所吸附的聚合物的所述官能團的其它限定部分與至少一種交聯劑交聯。本發明還涉及用于制備吸附劑的方法，包括(i)提供具有官能團的聚合物；(ii)將所述聚合物的膜吸附到載體表面上；(iii)使所吸附的聚合物的所述官能團的限定部分接枝到所述載體上；(iv)用含其氫原子可以被取代的吡啶環(-C5H4N)的第一殘基和含羧基(-C00H)的第二殘基以及任選的其它殘基使接枝聚合物的所述官能團的其它限定部分衍生化。本發明還涉及用于制備吸附劑的方法，包括(i)提供具有官能團的聚合物； (ii)用含其氫原子可以被取代的吡啶環(-C5H4N)的第一殘基和含羧基(-C00H)的第二殘基以及任選的其它殘基使所述官能團的限定部分衍生化；(iii)將所述衍生化的聚合物的膜吸附到載體表面上；(iv)使所吸附的聚合物的所述官能團的其它限定部分接枝到所述載體上。在一個用于制備吸附劑的方法實施方案中，所述聚合物可溶于水性介質或水性-有機混合介質中。在一個實施方案中，所述聚合物的官能團是-NH-、-NH2、-OH,-COOH或-C00-基團。在一個實施方案中，所述聚合物的分子量在5000道爾頓和50000道爾頓之間。在一個實施方案中，所述至少一種交聯劑選自二元羧酸、二胺、二醇和雙環氧基化合物。在一個實施方案中，所述至少一種交聯劑是長度在I和20個原子之間的線性構象柔性的分子。在一個實施方案中，所述衍生化步驟通過在所述官能團與所述殘基之間形成酰胺鍵進行。在一個實施方案中，所述衍生化步驟用每種殘基逐步進行。本發明還涉及用于從含所述蛋白質或肽的混合物中分離所述蛋白質或肽，或增加它們的濃度和/或純度的方法，包括(i)使溶解或懸浮在第一液體中的所述混合物與根據本發明的吸附劑或根據本發明的方法制備的吸附劑接觸，并持續足以使所述蛋白質或肽能夠結合到所述吸附劑上的時間；(ii)任選用第二液體沖洗所述吸附劑；(iii)使具有所述結合的蛋白質或肽的所述吸附劑與第三液體接觸，并持續足以使所述蛋白質或肽能夠從所述吸附劑釋放的時間；(iv)任選用第四和/第五液體洗滌和/或再生所述吸附劑。在一個分離蛋白質或肽，或增加它們的濃度和/或純度的方法實施方案中，所述第一液體、第二液體和第三液體是不包含其它有機改性劑的水性緩沖介質。在一個實施方案中,第二液體與第一液體相同。在一個實施方案中，第三液體的pH接近于所結合的蛋白質或肽的等電子點pi。在一個實施方案中，第三液體的pH與第一和任選第二液體的pH不同，尤其是高于第一和任選第二液體的pH。
在一個實施方案中，第一液體的pH在4. O至6. O的范圍內，第三液體的pH在6. 5至8. 5的范圍內。在一個實施方案中，第三液體的離子強度與第一和任選第二液體的離子強度不同，尤其是高于第一和任選第二液體的離子強度。在一個實施方案中，所述方法作為膜-過濾技術、固相萃取技術或中壓至高壓液相色譜技術進行。在一個實施方案中，所述方法還包括在步驟(iii)之后從第三液體中分離所釋放的蛋白質或肽。在一個實施方案中，步驟(iii)所釋放的蛋白質或肽包含低于IOppm浸出的吸附劑或其它可從中浸出的物質。在一個實施方案中，所述方法與其它分離工藝如沉淀、離心、干燥、微_/超-濾、滲 析、離子交換或病毒滅活處理組合。在一個實施方案中，所述蛋白質或肽的等電點PI為從4. 5到8. 5，分子量為從IOODa 到 500000Da。在一個實施方案中，所述蛋白質或肽是天然抗體，特別是免疫球蛋白G、來源于抗體的片段或寡聚締合物、遺傳工程抗體或含抗體或抗體片段的融合蛋白質。在一個實施方案中，包含所述蛋白質或肽的混合物是從微生物或細胞培養物或從作物提取物獲得的生物合成粗產物或部分純化的生物合成產物。本發明還涉及用于液相色譜或固相萃取的柱，其包括根據本發明的吸附劑或根據本發明方法制備的吸附劑作為管狀容器內的固定相和任選其它組分如玻璃料、過濾板、流量分配器、密封件、配件、螺釘、閥或其它流體處理或連接元件。在一個實施方案中，所述柱的特征還在于其耐受高達20巴的施加壓力、高達110°c的施加熱以及普通消毒規程的物理和化學穩定性，因此使得其能夠反復使用高達1000次，優選高達5000次。本發明還涉及多種相同或不同的根據本發明的吸附劑或根據本發明方法制備的吸附劑的集合，或根據本發明的柱呈微孔板或微芯片陣列，或多微毛細管或微流體裝置的集合，從而能夠并行處理。本發明還涉及診斷試劑盒或實驗室純化試劑盒，其包括根據本發明的吸附劑、或根據本發明方法制備的吸附劑、或根據本發明的柱、或根據本發明的吸附劑或柱的集合，以及在同一封裝單元內用于實施根據本發明分離蛋白質或肽的方法或與其不同的分析、診斷或實驗室方法所必需的其它化學或生物試劑和/或一次性物品。本發明還涉及根據本發明的吸附劑或根據本發明方法制備的吸附劑在制備包含至少一種具有診斷、治療、營養或化妝價值的蛋白質或肽的藥物、營養品或化妝品組合物中的用途。本發明還涉及根據本發明的吸附劑或根據本發明方法制備的吸附劑在除去至少一種蛋白質或肽中，以及在醫學預防或治療人類或動物因所述至少一種蛋白質或肽的存在所引起的疾病中的用途。本發明還涉及根據本發明的吸附劑或根據本發明方法制備的吸附劑在標識、表征、量化或實驗室純化至少一種蛋白質或肽中的用途。
本發明還涉及根據本發明的吸附劑或根據本發明方法制備的吸附劑用于可逆固定化至少一種蛋白質或肽并任選測試其它化學或生物結構結合所述蛋白質或肽的用途。根據第一方面，本發明涉及包括固體支承材料的吸附劑，所述支承材料的表面包括-含其氫原子可以被取代的吡啶環(-C5H4N)的第一殘基；和-含羧基(-C00H)的第二殘基；其特征在于第一和第二殘基彼此沒有直接連接，而是分別結合到本體固體支承材料本身上或由其作為載體支承的聚合物膜上。根據第二方面，本發明涉及包括固體支承材料的吸附劑，所述支承材料的表面包括
-第一和第二官能團，它們可以相同或不同；-含其氫原子可以被取代的吡啶環(-C5H4N)的第一殘基；和-含羧基(-C00H)的第二殘基；其特征在于第一殘基與第一官能團結合，第二殘基與第二官能團結合。根據第三方面，本發明涉及包括固體支承材料的吸附劑，所述支承材料的表面包括-第一和第二官能團，它們可以相同或不同；-含其氫原子可以被取代的吡啶環(-C5H4N)的第一殘基；和-含羧基(-C00H)的第二殘基；其特征在于第一殘基與第一官能團結合，第二殘基與第二官能團結合，其中沒有所述官能團既結合所述第一殘基又結合所述第二殘基。根據第四方面，本發明涉及包括固體支承材料的吸附劑，所述支承材料的表面包括-第一和第二官能團，它們可以相同或不同；-含其氫原子可以被取代的吡啶環(-C5H4N)的第一殘基；和-含羧基(-C00H)的第二殘基；其特征在于第一殘基與第一官能團結合，第二殘基與第二官能團結合，其中第一和第二殘基彼此沒有直接連接。在一個實施方案中，第一殘基、或第二殘基、或第一和第二殘基經由連接部分結合所述第一和第二官能團。在一個實施方案中，5至95%、或20至90%、或30至80%、或40至70%、或50至
60%所述第一和第二官能團結合所述第一殘基和第二殘基，其中所述第一殘基和第二殘基以I : I至2 : I的摩爾比存在。在一個實施方案中，固體支承材料的表面覆有包含所述第一和第二官能團的聚合物膜，所述第一和第二官能團又負載所述第一和第二、任選第三和第四殘基。在一個實施方案中，所述第一和第二官能團的第一部分與至少一種交聯劑交聯，其中所述第一和第二官能團的第二部分結合所述第一和第二以及任選其它殘基。就本公開內容而言，如根據本發明一般方面的吸附劑所列的所有實施方案可以與根據本發明第一、第二、第三和第四方面的吸附劑組合。
優選實施方案的詳細描述本發明的根本技術問題可以描述為提供用于蛋白質和肽的純化新方法，所述方法不存在如前面部分已概述的先前已知方法的缺點。這意味著本方法應該允許以高回收率在單個步驟中從樣品基質中分離靶蛋白質或肽而不損害其功能整體性，同時主要避免昂貴的材料但仍足夠通用以致能夠遵守在用設備的標準清洗和衛生規程，并因此確保本方法能被各個監管機構所接受，即以經濟可行的方式提供藥用品質的靶蛋白質或肽。該技術問題現在通過提供要用在待純化蛋白質或肽的固-液平衡分配工藝中的新型吸附劑而得以解決，所述吸附劑與現有技術已知的那些的主要區別在于其被殘基特異性雙重化學衍生化，所述衍生化適合以與常規親合介質相匹配的選擇性和靈敏度從其副產物中分離靶蛋白質或肽，特別是與各種其它蛋白質或肽分離的問題，但具有完全不含可能制備昂貴和/或在嚴苛條件下分解的復雜細微的生物材料的組合物。吸附劑生產中所用的所有材料高度耐用還確保使用該吸附劑的任何分離方法具有長期再現性，這從分析結果不存在漂移效應可顯而易見。
在解決以上給出的技術問題中有幫助的是吸附劑的成層組合體，其包括至少兩種不同材料，其中一種是負載兩種殘基并覆蓋作為固體基材的第二材料的合成或生物合成聚合物膜。該特定組合體的特征在于一方面聚合物膜具有相當高的重量含量和高的物理穩定性，而且仍具有相當高度的鏈柔性，從而導致高的溶解(solvent)和樣品攝取能力和快速擴散交換。該膜因此保持在均勻、生物相容性、柔軟和凝膠狀的狀態。這允許分析物蛋白質或肽以其部分或全部分子體積浸沒到含吸附劑的負責穿過其或沿其表面結合和遷移并同時防止它們變性的那些活性成分的層內。因此它確保形成用于分析物的準三維相互作用空間，并允許在分布于整個蛋白質或肽表面上的抗原決定部位與殘基改性的凝膠相之間多點接觸。樣品組分由此也被聚合物膜有效保護以免與固體支承材料的基本成分發生不期望的相互作用。為了評估本發明的整個范圍并使其變得更精確，首先在下面的段落中定義本發明下文所用許多術語的意思。必須理解，所有給出的實施例僅用于舉例說明，并不表示是排它的一組實施方案。本領域技術人員肯定能想到在不偏離其整體精神下實施本發明的其它和類似方式。圖6的示意性表達又符號化本文所用與吸附劑組成有關的許多不同術語之間的相互關系。術語“吸附劑”表示任何用作樣品固液平衡分配過程中的固定相的合成或生物合成材料，其作為所述樣品中所含的至少一種給定的靶蛋白質或肽的受體表現出選擇性的非共價結合性質，或者其能夠在所述樣品中所含的不同構成的至少兩種給定的靶蛋白質或肽之間區分其非共價結合性質(即高的絕對結合常數或高的結合常數之差)。因此它被特別設計為解決給定的分析或制備檢測、分離、固定化或(生物)化學轉化任務，這種任務往往由至少一種靶蛋白質或肽的獨特組合以及樣品基質組成，所述獨特組合的組成可以是已知的、部分已知的或未知的，所述樣品基質的組成可以類似是已知的、部分已知的或未知的。與類分相(其根據對整個分析物分子基本平均的累積參數如靜電荷、偶極矩或親油性區分分析物)相比，這種吸附劑至少部分通過基團互補性結合到所述至少一種靶蛋白質或肽的三維分子表面上的至少一個結構域(抗原決定部位)。因此該新概念也超出傳統意義上根據兩種標準平均效應的組合分離的所謂混合模式吸附劑的范圍。本發明的吸附劑因此在分子水平設計為僅結合單一蛋白質或肽或一類結構相近的蛋白質或肽，后者在可能包含大范圍不同副產物的環境外具有高的親合性和高的個體或組群選擇性。作為“固體支承材料”，所有本領域技術人員已知的無孔或優選多孔的吸附介質例如各種無機礦物氧化物如二氧化硅、氧化鋁、氧化鎂、氧化鈦、氧化鋯、硅酸鎂載體、磁鐵礦、沸石、硅酸鹽(硅藻土)、云母、羥磷灰石、氟磷灰石、金屬-有機骨架、陶瓷和玻璃如可控孔度玻璃(CPG)、金屬如鋁、硅、鐵、鈦、銅、銀、金以及石墨或無定形碳、紙、(生物)聚合物樹脂如多聚糖、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯如Amberchrom 等都可用于構造吸附劑，無論是球形還是不規則形狀。聚(苯乙烯-共聚-二乙烯苯)(特別是如用在強陽離子交換樹脂中的本體-或表面-磺化的聚(苯乙烯-共聚-二乙烯苯))、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、二氧化硅、玻璃和多聚糖如淀粉、纖維素、纖維素酯、直鏈淀粉、瓊脂糖、瓊脂糖凝膠、甘露聚糖、黃原膠和葡聚糖是優選的固體支承材料。最低剛度和硬度的固體基材引入作為不溶性支承功能體為固定相與移動相之間的界面擴大以及特別在流動和/或加壓條件下增加機械強度和耐磨性提供基礎，所述界面是作為蛋白質或肽在所述相之間分配過程的分 子基礎而與其相互作用的地方。根據本發明的固體支承材料可以具有均相或非均相組成，因此還混有是上述一種或多種材料的復合材料，尤其是多層復合材料。本文中要特別提到磁性顆粒。在與之相關的一個重要實施方案中，固體支承材料的表面可以覆有聚合物膜。這種任選的膜被視為固體支承材料的一部分，因為本文中開發和引入的所有制備和分離方法均依靠單一本體固體支承材料的直接表面上的官能團或殘基，其同樣也與該聚合物覆層的各官能團或殘基一起工作。此外，本體固體支承材料所固有的介孔或大孔形態通常在涂覆過程中得到保留。如果在這樣得到的混合材料中必須將表面聚合物膜與用于本發明目的的所有下方材料進行區別，則后者單獨總稱為“載體”，或換言之，混合固體支承材料包括載體和聚合物膜二者。然而，實際上這種區別只有在吸附劑的制備歷史已知的情況下才是可行的。作為提供吸附劑剛性框架部分的載體近似于固體物理條件并且可由以上列舉的作為固體支承材料的那些材料中的任一種構成，所述材料同樣可以根據本發明用作上方不具有表面聚合物膜的本體固體支承材料或用作這種表面聚合物膜的載體。因此，上述所有的特征、選擇和限制除了用于聚合物吸附的適用性外等同適用于這兩個術語。因此，本發明的中心實施方案是一種吸附劑，其中固體支承材料由載體構成，所述載體表面覆有聚合物膜，上述聚合物具有至少部分被第一和第二以及任選的第三和第四殘基取代的官能團。如果，如優選的那樣，使用多孔材料作為載體，則聚合物膜將通常均勻覆蓋其外表面和其大部分較大的內表面。因而，“表面”是指吸附劑在其制備和作為分離劑應用期間的整個固液相界面，其中發生通過殘基對分析物的識別和結合，并且至少一種溶解的蛋白質或肽可經由(任選加壓的)流體動力流、對流、灌注、擴散或電遷移或其任意組合可達此界面。由于包含軟物質的載體，特別是表面聚合物膜在合適液體中的可能的溶脹，所以不存在清晰的邊界，而是可能涉及中間凝膠相層。吸附劑的表面特性可與所用材料的本體特性不同。特別是在使用兩種不同材料作為載體和聚合物膜并且所用的制備方法得到特別大的比表面積時確是如此。“覆蓋”在技術上可通過技術人員已知的所有涂覆技術實現，其可以在自然驅動力下或手動進行，所述涂覆技術為例如自發吸附、氣相沉積、液相、氣相或等離子體相的聚合、旋涂、表面縮聚、潤濕、浸涂、蘸涂、刷涂、噴涂、壓印、蒸發、施加電場或壓力以及所有基于分子自組裝的方法，例如液晶、Langmuir-Blodgett膜或層疊膜形成。聚合物膜可由此直接涂覆為多層或在彼此上方的各個單層的逐步序列。只要涉及大分子，無論是自發的或人工加速的單點或多點“吸附”，在任何情況下均被認為是從聚合物溶液與固體表面物理接觸開始的任何涂覆過程的第一(不完全)步驟。需要在固體表面和每一單個聚合物鏈之間存在部分至少弱吸引物理作用(范德華力)，或在載體和聚合物上存在互補官能團時存在相當特異性的非共價鍵化學力，并且如果多層被吸附，那么在相同和不同的垂直堆疊層內的聚合物之間也具有上述作用力以形成至少介穩聚集體。相反電荷之間的靜電力經常被用于該目的，載體的表面電荷由此被其z電勢所賦予。初始吸附可以以松散且不規則的形式發生，該形式可能隨后轉變成更大程度的二維-三維序列和/或密度。這可以歸因于表面上的聚合物鏈的部分殘基的遷移性，所述遷移是因為在單獨的表面位點處的吸附和脫附過程之間的穩態平衡所致并且可例如通過退火得到促進。通常有必要通過在鄰近的官能團之間隨后引入共價鍵以及通過鏈的物理纏結的基礎空間排列(熵)穩定化來進一步提高所吸附的聚集體的穩定性。為了實現進一步提高的穩定性，聚合物膜的鏈可進一步共價接枝到下方的載體材料上。 固體支承材料的外表面由此可以是平坦的(板、片、箔、盤、玻片、過濾片、膜、織物或非織物、紙)或彎曲的(凹的或凸的球、珠、顆粒、(中空)纖維、管、毛細管、小瓶、樣品盤的孔)。固體支承材料的內表面的孔結構可特別由規則的、連續的毛細通道或不規則(不規則碎片)幾何形狀的孔腔構成。在微觀上，其可以是光滑或粗糙的，這取決于制造方式。孔體系可連續延伸遍及整個固體支承材料或終止在(分支的)孔腔中。蛋白質或肽在移動相中的溶劑化和在固定相表面上的截留之間的界面平衡的速率以及由此得到的連續流動分離體系的效率主要是通過經由固體支承材料的孔進行擴散的傳質以及由此通過其特征性的顆粒和孔徑分布所決定的。孔徑可任選地表現為不對稱、多模態和/或空間(例如在截面上)不均勻的分布。適合在本發明用作全部固體支承材料或載體的多孔固體的典型孔徑為IOnm至400nm，并且因此可歸類為介孔或大孔；顆粒材料的典型顆粒尺寸為5微米至500微米。合適的固體具有30體積％至80體積％的可接受的孔隙率，典型的比表面積為lm2g 1 至 IOOOm2g 1O作為替代方案，最近推出的固體支承材料是所謂的整體式色譜介質，其被澆注成具有所需形狀(通常棒狀)的單個宏觀實體，該形狀與由松散的微觀顆粒制成的常規可壓縮柱填料不同。整體柱可以由二氧化硅或聚合物材料例如聚甲基丙烯酸酯構成，其微觀結構可以包含纖維狀毛細管或燒結顆粒附聚物。術語“聚合物的膜”或“聚合物膜”是指二維或優選三維的合成或生物合成的具有至少一層的聚合物網絡，通常為幾個或幾十個分子層。這樣的(衍生化或非衍生化)聚合物網絡本身可根據本領域技術人員已知程序進行制備。該聚合物膜可具有均質化學組成，或者其可包括至少兩種不同的互穿聚合物鏈(例如，聚丙烯酸和聚胺)，所述鏈不規則纏結或呈有序方式(層疊)。術語“鏈”一般是指最長的連續主鏈，也可以是指在其上結合有官能團的聚合物支鏈。該術語用來表示在吸附劑制備過程中溶解、吸附或接枝的聚合物的完整主鏈長度，以及表示位于交聯聚合物網格結點之間的鏈段，因為在后一種情況下單個鏈的完整長度難以確定。
在其主鏈或側鏈中包含至少一個官能團的“聚合物”是優選的，因為它們允許在同質或異質介質中在這種官能團處容易地被殘基衍生化。此外，固體狀態或溶解狀態的聚合物的許多特性以及其在給定固體載體上的自發吸附以及永久性結合的趨勢是通過其官能團確定的。在此特別提及的是聚電解質。在這方面，含有官能單元和非官能單元的交替、無規或嵌段序列的共聚物也是可實現的。優選的官能團是伯氨基和仲氨基、羥基以及羧酸或酯基。根據周圍介質的酸堿性，氨基可作為質子化銨離子存在，羧基作為去質子化羧酸根離子存在。如果多孔或非多孔本體聚合物也被用來作為固體支承材料的載體，則應指出其上涂覆的聚合物膜如本文所述會具有不同的化學組成。這些差異可能起因于下列官能團的存在、種類或密度，低分子量或低交聯度。所有這些參數導致增加的親水性、溶劑溶脹性/擴散和生物相容性以及涂覆表面上減少的非特異性吸附。天然和合成聚合物可用于根據本發明的吸附劑中。優選合成聚合物。優選的聚合物膜包括至少一種含有氨基的聚合物。高度優選聚乙烯基胺。其它合適的聚胺可包括聚乙烯亞胺、聚烯丙基胺等。 其它合適的聚合物為除含氨基聚合物外的功能聚合物，如聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、它們的前體聚合物如聚(馬來酸酐)、聚酰胺或多糖(纖維素、葡聚糖、支鏈淀粉等)。如果使用共聚物，則優選的共聚單體是簡單的烯烴單體或極性的惰性單體如乙烯基吡咯烷酮。所用聚合物的優選分子量的范圍為(但不限于)5000道爾頓至50000道爾頓，對于聚乙烯基胺尤其如此。分子量接近上述范圍下限的聚合物表現為甚至滲透載體的窄孔，使得具有高表面積并由此具有良好的傳質動力學、分辨率和結合能力的固態材料可用于根據本發明的吸附劑中。聚合物將在第一和第二殘基衍生化之前或之后或者在第一殘基的衍生化步驟和第二殘基的衍生化步驟之間被吸附并隨后交聯或接枝到合適載體表面上作為薄吸附層(adlayer)。包括殘基衍生化的所得混合材料的膜含量可為約5wt%至約30wt%,優選約15wt%至約20wt%，以吸附劑總重量計。全功能吸附劑的聚合物含量的準確值還取決于衍生化程度、殘基的分子量和選定載體的比重。這些值對應于處于較低納米范圍的膜厚。所涂布的聚合物仍然可以保持其溶脹或收縮的能力，實際的膜厚由此強烈取決于所用溶劑的類型。聚合物膜的交聯度可為2%至20%，分別基于交聯可用官能團的數目。特別優選通過官能團縮聚進行交聯，但高分子化學(包括自由基化學和光化學)中已知的所有其它方法都可以應用。然而，交聯鍵也可以直接形成在所涉及的聚合物的官能團之間，而不加入交聯劑。這尤其在使用共聚物或共混聚合物來提供表現出彼此之間潛在反應性的至少2個不同的官能團，如在活化后可在彼此之間形成酰胺鍵的胺基和羧酸基。優選的交聯涉及形成共價C-N鍵，如酰胺、氨基甲酸酯、脲或仲胺/叔胺鍵，并且可經由活化的羧酸或環氧化物與胺的反應形成。作為替代方案，交聯可以具有非共價性質，利用相反電荷的官能團之間的離子配對或利用多電荷反離子等。如本文所用的“交聯度”是指基于交聯可用官能團總數的在交聯反應中形成的交聯的最大數量。如果，如優選的那樣，使用雙官能試劑進行交聯，則交聯度因此反映了提交到交聯反應中的交聯劑的量和可進行交聯的聚合物官能團的數量(在這種情況下，每形成一個交聯需要兩個官能團)之間的摩爾比，在此認為反應以本文所述比例接近定量地進行。在原理上，可以形成鏈間和鏈內交聯以及非交聯封端側鏈(來自于部分反應的交聯劑)。相反，“接枝”是指單個聚合物鏈共價錨定在固體載體的表面上，優選在其上形成有官能團。如果每個聚合物鏈被錨定在鏈上的至少一個任意位置處就已足夠。更好的膜穩定性可以通過多點接枝實現，使得在表面上形成突出的聚合物環。然而，后一種方法減少聚合物鏈的三維柔性。單點結合優選通過鏈末端實現，可沿著鏈優選結合多個官能團/殘基或可在相對末端上僅結合單個官能團/殘基，使得充分拉長的鏈可從表面向外伸出。盡管接枝聚合物的實際構象可能是無規線圈，但是使用表面上的高接枝密度和適當的溶劑可導致溶脹和在例如在可進一步通過交聯穩定化的聚合物刷的形成中相鄰鏈間經由分散相互作用的取向自組裝現象。優選地，接枝是通過類似于交聯反應的溫和縮合反應實現的，但也可以應用涉及增長自由基、離子或自由基離子的方法，如氧化或輻射引發的方法。選定的方法將取決于容易程度、類型、載體功能化程度。接枝在原理上可通過兩種不同的技術實現第一種技術采用表面結合的單體或引發劑通過從表面開始的原位聚合來建立平行的聚合物鏈，而在第二種技術中，首先在均質介質中(即在不存在表面的情況下)合成全長度的聚合物鏈，隨后僅在額外的步驟中將其接枝到表面上。如果本發明的吸附劑通過接枝程序制 備并且該技術構成本發明的方法實施方案，優選后一種技術。 在本發明的一個優選實施方案中，聚合物膜如果通過共價鍵進行內交聯，則其不接枝(即共價連接)到下方載體材料上，即其僅僅通過物理和/或化學吸附結合在載體材料上。因此，術語“結合”包括物理和/或化學吸附。隨后，由于交聯聚合物膜的載體總體物理纏結實現復合材料的化學和力學穩定性。聚合物膜的厚度和密度仍然足以屏蔽在支承載體表面上的非常極性或反應性的基團，例如在固體聚苯乙烯磺酸酯的情況下的苯基或磺酸酯基，使它們免于進入，而這種進入為試劑分解或與待分離混合物中的靶蛋白質或肽或其伴隨雜質進行未限定的無法重現或不可逆的相互作用。在另一實施方案中，聚合物膜接枝到載體上，但不進行內部交聯。作為第三選擇方案，聚合物膜可以內部交聯并且接枝到載體上。在圖2中示意性示出聚合物膜的所有三種不同的所得網絡形態。圖2的情況A表示優選的吸附劑，其中單獨的聚合物鏈彼此共價交聯而不共價接枝到載體表面。情況B表示一種吸附劑，其中單獨的聚合物鏈共價接枝到載體表面，但彼此不共價交聯。情況C表示一種吸附劑，其中單獨的聚合物鏈既共價接枝到載體表面，又彼此共價交聯，因此是兩種固定技術的組合(可以任何順序進行)。術語“官能團”是指任何簡單獨特的化學部分，其屬于(非衍生化的)固體支承材料或限于在其表面上任選的聚合物膜，或通過膜吸附制備所述表面的過程中的聚合物，其可作為化學結合點或錨點，因此其至少在固體支承材料或其上覆蓋的聚合物膜處于溶脹狀態時適合通過化學加成或取代反應進行液相或固相衍生化以及任選的交聯。因此，官能團通常包含至少一個弱鍵和/或一個雜原子，優選表現為親核或親電的基團。反應性較低的官能團可能需要在衍生化之前進行活化。它們因此可在聚合物鏈和吸附劑殘基之間形成結構連接以及形成交聯網絡的結點。與殘基不同的是，官能團主要不是設計為與分析物進行相互作用(盡管實際上不能嚴格排除它們在分離過程中經由副組分的排斥的確具有相互作用或輔助作用)，而是提供具有限定化學反應性的分子尺寸點的表面覆蓋，其可以轉化成實際的相互作用殘基(衍生化)或用于形成共價連接(聚合物交聯和接枝)。本文所用的術語“連接”或“鍵合”應包括直接形成共價鍵以及通過涉及多個原子的序列的成行的共價鍵擴展系列。在吸附劑或分析物中可能存在并且不具有已知和特異性功能的其它縮減為簡單雙原子分子片段的化學部分被簡稱為“基團”。一組官能團可作為多個分離但相同的單元進行處理，其化學行為主要是僅通過可預測和可重現的基團性質來確定的，基本不受所連接的材料或其在這些材料上的準確位置的影響。這樣的官能團少量提及的有氨基、羥基、巰基、羧酸基或羧酸酯基。官能團表示固體支承材料的組成部分，并且因此均勻分布在其表面的大面積上。合適的官能團經常表現出弱酸或弱堿性，由此賦予成膜聚合物兩性電解質的特性。聚合物中的官能團可以在相應單體的聚合期間引入，或通過在吸附到載體上之前或之后的后續官能團轉化(類似聚合物的反應)而引入。如果不同的單體進行共聚，如果官能團轉化在完成之前停止或如果不同的聚合物彼此層疊或成為互穿網絡，則聚合物膜還可以包含兩個或更多個不同的官能團。優選的官能團是伯氨基和仲氨基。特別優選的是伯氨基。術語“衍生化”是指能夠在吸附劑制備過程中在固體支承材料表面上或在用于覆
蓋所述表面的聚合物中引入特定殘基以制備中間或完全功能化吸附劑的任何化學反應，特別是通過含有所述殘基或其前體的合適的衍生化試劑對其官能團進行加成或取代。官能團向不同但仍具有反應性的官能團的相互轉化也應包括在該術語中。殘基的“前體”可引入被屏蔽或受保護的化學部分，其可以脫保護或以其它方式在與衍生化步驟中的表面或聚合物形成連接之后或與此同時轉化成最終殘基。例如，如果聚合物包含伯氨基或仲氨基官能團并且通過與它們形成酰胺鍵來進行衍生化，則在殘基中待包含的其它伯胺或仲胺部分應該初始保護成例如在衍生化試劑中的Boc-或Fmoc-衍生物。此外，如果在表面或聚合物官能團與衍生化試劑上的反應中心之間的衍生化反應過程中待形成的鍵導致形成具有識別靶蛋白質或肽能力的新化學部分，則相應的殘基將只有在衍生化后完全發展并且只有其一部分或官能改性體被包含作為衍生化試劑的前體。在這種情況下，前體部分的一部分(離去基團)也可以在衍生化反應過程中分裂(例如縮合反應過程中的水分子)。衍生化在至少一個步驟或任選多個步驟的每個步驟中總是在官能團的“限定部位”上進行。考慮到不同官能團和試劑的反應性，這意味著在未衍生化的聚合物或固體支承材料中存在的目標預定百分數的每種給定類型的官能團總是被轉化成用選定的相應殘基衍生化的官能團。為了得到均勻且可重現的衍生化吸附劑，使計算好合適量的衍生化試劑與聚合物反應。也可以嘗試完全衍生化(衍生化程度=100%)，在此衍生化試劑經常過量使用，但這并不是必須的。由于吸附劑的其余材料不應在衍生化步驟中受損，所以經常期望在溫和條件下進行衍生化。因此可能有必要在實際成鍵步驟之前或期間活化官能團或衍生化試劑，以保持在該條件下足夠的反應性。優選地，活化衍生化試劑。優選的衍生化反應涉及含富電子氮官能團例如氨基的親核聚合物和含結合在缺電子碳例如羰基或羧基衍生基上的離去基團的親電試劑，反之亦然。因此，活化可以通過固相或液相肽合成的標準技術例如通過活化酯實現。優選的衍生化反應涉及與官能團形成酰胺、氨基甲酸酯、脲或仲胺和/或叔胺鍵。由于酰胺和氨基甲酸酯鍵相對于羰基碳的不對稱性，它們可分別由氨基或羧基聚合物的任一個方向形成以及由氨基或羥基聚合物的任一個方向形成。吸附劑的親合性和選擇性主要由兩種或更多種不同殘基的組合確定。術語“殘基”是指能夠在納米尺度上(自身或自身部分或相同或不同類型的殘基簇內)組裝成復合物的任何區別的化學部分或明確可識別的、通常重復出現的、相同或不同類型的化學部分的排列，或者對于至少一種蛋白質或肽的至少一個互補結構或表面區域具有高親合力和/或選擇性親合力的位置，只要親合力強于與吸附劑表面上的晶格或聚合物鏈的CH或CH2重復單元的僅范德華接觸即可。這種在固/液界面處的位置類似于涉及生物大分子的特異性相互作用，稱為“結合位點”。由此，殘基可以是完全合成或天然產物或其部分或組合，但其應當適合進行化學合成和/或衍生化。其可包括一種或更多種的不同化學部分(包括化學上不反應的部分，例如烷基或烯基單元，不過它們能夠參加疏水或分散相互作用)。因為兩種或更多種不同殘基以可變比例引入吸附劑中，所以結合位點包括兩種或更多種相同和不同的殘基。形成特定結合位點所涉及的全部殘基位于彼此鄰近的封閉二維或三維空間中并且可以但不必一定涉及相鄰表面官能團或聚合物膜的相鄰重復單元上的殘基。共同結合位點的單獨殘基也可屬于交聯或表面接枝聚合物的不同鏈(相同的原理應用于暴露在相應的蛋白質或肽表面上的結合的對應物)。另一方面，特定殘基可被兩個或更多個相鄰或重疊的結合位點共享。由于交聯鍵和殘基在表面上或聚合物膜內的官能團上的分布的隨機(統計學上)特性，所以可形成類似的但是在結構上和能量上均不相同的結合 位點的所得分布。結果，這些結合位點對于靶蛋白質或肽的尺寸和親合力可在顯著程度上不同，但是這實際上并沒有被證明是缺點。吸附劑的結合位點和靶蛋白質或肽之間的“結合”應該是可逆的并且因此應該通過吸附劑的互補化學部分之間的任何形式的非共價相互作用進行。占優勢的非共價結合模式是離子、氫鍵、給體-受體電荷轉移、n n、陽離子-n、偶極、配位、分散和疏水相互作用，但是經常遇到的是混合且非化學計量的形式，這不允許指明單個結合模式的貢獻。因此，在可能涉及相同或不同殘基的結合伙伴之間可出現單、雙或多重同時接觸。影響分析物在粗糙表面上和在微觀孔隙中移動的物理力和熵力以及溶劑介導的相互作用可以是影響結合的因素。在某些情況下，所得的包含吸附劑和至少一種結合的蛋白質或肽的復合物可被檢測到或甚至可分離，但是更經常的是只具有瞬態特征。結合強度的適用下限沒有限制，這是因為該值不僅是給定的吸附劑-分析物對的內在特性，而且是強烈依賴于溶劑的。此夕卜，甚至小至lkcal/mol的差示Gibbs焓也能被色譜法解析出來，這是由于柱內多個系列平衡所致，柱的理論塔板數可取值為約IO3至約IO4/米色譜床長。在色譜應用中，結合也應該不過強，因為否則難以在環境或生物相容條件下實現可逆性。考慮本發明的吸附劑時，殘基可連接到固體支承材料的表面上的官能團，所述固體支承材料包括覆蓋在所述表面上的任選聚合物膜，并且如果這樣的話，殘基包括從官能團的結合點離開表面的整個部分結構或在不同官能團上以相同方式出現的結構的至少一部分。整個殘基不必直接參與靶蛋白質或肽的結合。殘基也可包含其目的只是使實際的結合結構彼此分離或連接或提供幾何形狀適合結合位點的合適框架以向靶提供結合結構的原子或部分。在固體支承材料上，特別是在其表面上任選的聚合物膜上的官能團與實際的結合結構之間任選的間隔單元、支化單元或其它連接單元，因此正式被指認為它們與其形成至少一個連接的每個殘基的一部分。所述連接通常可通過官能團的至少一個特定衍生化過程來實現，該衍生化過程在以均相或非均相方式將任選的聚合物膜施加在載體介質上之前或之后以隨機(普遍存在)或選擇性方式進行。因此，聚合物溶液或薄膜可與預先合成的已經包含有殘基或其前體的衍生化試劑反應。但是，如果官能團或其結構部分通過用殘基或其前體的衍生化轉化為不同類型的部分，或隨后形成具有所述殘基的額外原子的整體化學單元(例如，-NH2官能團轉化成-NHCO-R殘基中的氮原子)，則它們也可被認為基本失去了其作為官能團的特性，相反被認為是屬于所述殘基的結構部分。如果相同或不同類型的殘基直接或通過共價的構象柔性的連接部分單獨結合到固體支承材料的官能團，則認為它們獨立地適應于其在靶蛋白質或肽表面上的互補對應物，驅動力為總Gibbs焓的最小化。因此，基于本發明的目的，結合位點的殘基安排成正確的三維取向用以優化給定蛋白質或肽抗原決定部位(如在天然抗體中那樣)是沒有必要的；它們只需要能夠通過其構象空間的探索(底物誘導匹配)而采取該取向即可。在許多情況下，特別是如果爭取差異化結合，那么靶蛋白質或肽的兩個或更多個不同的或重疊的抗原決定部位可通過相同吸附劑識別出來。 雖然術語“殘基”在功能上進行了這樣的限定，即限定為從吸附劑表面向外伸出并且在其上相同或相似地多次重復以參與分析物結合的總體單元，但是該殘基可在分子結構水平上由一個或更多個可區別但在其自身內相鄰的子單元構成，僅在形式上殘基可分段成子單元，所謂的“結構”。該術語在本發明中以其最寬泛可能的含義使用。雖然有些武斷，但是將殘基分成不同的結構應該符合化學相似性原理和直覺，由此分子部分或片段應該被有目的地根據常見結構和/或物理性質歸類在一起。與屬于相同殘基的不同結構相關聯的功能可由此同樣是不同的部分結構可涉及分析物結合，而其它的不涉及。鑒于因殘基小的結構變化導致實現根據本發明的吸附劑的無限可能性，可基于此將殘基的必要部分與非必要部分分開。對于那些不主要涉及在分析物結合中的任選結構，“連接部分”是短分子(經常為簡單烴)鏈(tether)的附屬部分，任選地包括在一端或兩端的官能團或不飽和價用以形成必要的連接，和在實際結合結構與相鄰結構和/或吸附劑表面之間形成紐帶。因此，例如可以在本發明的吸附劑中采用幾種不同的殘基，其均包括第一殘基和第二殘基，其中第一殘基包括吡啶環，第二殘基包括羧基，但包括具有不同類型、長度或連接性以及任選的或缺少的其它結構的連接部分。這樣的一組殘基可隨后在分子水平上進行區別，但是它們在功能上將共同定性為本發明含義內的“第一殘基”和“第二殘基”。連接部分的使用在下文中更詳細討論。負責進行靶識別的殘基結構涉及作為第一殘基的“包括其氫原子可被取代的吡啶環的殘基”和作為第二殘基的“包括羧基的殘基”。根據常用命名法，“吡啶基”是指來源于任何單核的由5個碳和一個氮原子并且沒有其它雜原子構成的六元芳香環體系(即吡啶或氮雜苯)的部分結構(基團)，其通過至少一個單鍵連接到殘基的其余部分，但各種取代的吡啶也可能被稱為不同的俗名。不過，其它的芳族環、雜芳族環、脂環族環或雜脂族環或環體系可以經由直接單鍵連接到至少一個環原子，任選經由間隔單元結合到吡啶環上作為取代基。然而，擴展環稠合(兩點取代結合)只可能與脂環或雜脂環形成，使得吡啶的電子體系不擴展到附加環的全長度上，并且避免具有更高核性的環體系。由于殘基片段化成為結構的多種單獨可能性，因此在本文所用的范圍內，如果至少一個可行的第一殘基和第二殘基片段化分別得到吡啶環和羧基就應該足夠了。
“取代基”是被認為是吡啶環的任選部分的有機基團(除氫外)，因此被認為也參與分析物結合。在現有技術中，表現出高親合力和選擇性的吸附劑主要是從其上附加抗體或其它生物來源的高分子量受體的固體支承材料得知。這種抗體首先必須特異性地提高對涉及活組織的生物過程中的靶抗原的抗性，或者靶蛋白質或肽必須可逆地綴合至抗原或僅少數已知的天然親合對的一個組分。本發明的吸附劑可以通過其殘基利用化學合成、利用低分子量和高化學穩定性可進入來與那些進行區分。然而，它們也可以在所有類型的親合色譜方法中用作固定相。術語“蛋白質”和“肽”分別表示聚氨基酸和寡聚氨基酸，其為在化學、生物合成或生物分析方面可明確識別的實體，其可具有合成或生物來源(不論其性質上可能的出現情況)、線性或支化的同質或異質序列，并且對其沒有最小或最大的序列長度或分子量的限制。最低要求是其應該由至少2個氨基酸通過至少一個酰胺鍵連接，這將例如對應于二肽。均能形成肽鍵的非蛋白源或完全非天然的氨基酸、^ -氨基酸、N-烷基氨基酸、其它類肽單元等的存在不應有害。小(寡)肽往往可以通過逐步或收斂方法合成制備；術語肽在這種情況下應另外包括通過不尋常的連通性形成的可得結構，例如縮肽類或類肽。較大的蛋白 質通常具有限定的三維結構，可以采取許多不同的形狀，例如球狀(白蛋白)或絲狀/纖維狀(肌動蛋白、膠原蛋白);它們可以溶解在細胞質、細胞膜(membrane-bound)、部分細胞外基質中或可存在于細胞表面上。由于現代分子生物學方法可以處理極少量的蛋白質，所以不需要知道用以確認它們的其主氨基酸序列；有時甚至不知道它們是否作為勻質組合物存在。結合到(膠體狀)分散載體(納米)顆粒例如病毒、量子點或乳膠球的表面上的蛋白質或肽通常需要首先切斷以暴露出其整個分子表面否則屏蔽的部分，用于在其可用于本發明分離方法之前與吸附劑相互作用。上述術語一方面包括非共價肽聚集體以及同源多聚體蛋白質和異源多聚體蛋白質，但另一方面也包括全部蛋白質的功能性或非功能性亞單元，例如酶消化或二硫鍵還原的產物，而且也包括從頭設計的小型蛋白質，例如affibodies 、anticalins 、nanobodies 或其它人工重組活性位點。在蛋白質中可能包含金屬離子或復合物，通常是在蛋白質的活性位點中。分析物蛋白質可以通過體內翻譯后修飾如磷酸化、硫酸化、糖基化，葡糖醛酸化或泛素化進行修飾。與苷和脂質綴合分別得到糖蛋白和脂蛋白，包括氨基酸以外的其它結構單元。其上調或下調可作為其中產生這種蛋白質的有機體的某些病理狀態的標志物的蛋白修飾因此通常是至關重要的。同樣地，蛋白質表面以及蛋白質的活性或變構位點在體外的生化修飾包括與底物激動劑或拮抗劑以及各種氨基、羧基和側鏈功能的保護基團化學形成可逆或不可逆的復合物。蛋白質或肽可以進一步進行化學或生化標記(例如寡聚組氨酸序列標記物、綴合染料或放射性標簽)或與另一(載體)蛋白融合。目的是增強蛋白質或肽的表達、溶解度、分泌、檢測或分離，由此綴合點可以是可斷開的，但它們也可缺少其天然序列的一部分，例如膜錨定尾段。在使用術語“靶蛋白”，“靶肽”或簡稱“靶”中的一個時，是指為其設計了對其具有特異性殘基的吸附劑的特殊的蛋白質或肽或多種蛋白質或肽(通常通過結構、分類、合成或來源進行關聯)。這通常是分析物或進料混合物的組分，它們表現出對吸附劑的最高親合力。靶蛋白質或靶肽可區別于其潛在的蛋白質類副產物，不僅通過其氨基酸序列(低至單點序列的突變或缺失，包括在基因轉錄過程中因選擇性剪切或SNP變體得到的那些)而且通過其包括存在不同的折疊態(天然、展開或錯誤折疊)的完整的二級和三級結構要素進行區別。靶蛋白質或靶肽通常但不必一定是進料混合物的主要組分(按重量或摩爾計)，甚至不是主要肽組分。不論其在混合物中的豐度如何，靶往往但并不必一定是有價值的混合物組分或需要純化的特定物質，而后者可能是包含在流出級分中。由于許多蛋白質或肽具有明顯的毒性，因此在健康或環境導向的應用中，靶大部分也可以是在其必須從中排出的混合物中顯示出這樣的毒性或其它不必要特性的蛋白質或肽。也有可能靶不是主要產物，而是制備過程中的較少副產物，其需要從混合物的其余部分中分離或移除，由此另一種混合物成分-通常為主要產物_(其本身可能是或可能不是蛋白質或肽)的濃度和純度增加。對于多步血漿分級過程而言，可能有必要進行多次連續分級來精餾在進料混合物中同時存在的大量不同的蛋白質或肽，由此分級的特定階段的流出物可在下一階段吸附，反之亦然。待分離混合物中的所有溶質的集合稱為“分析物”，其中包括能夠與本發明的吸附劑在合適條件下發生至少弱相互作用的靶。大多數的分析物是蛋白質或肽，因為這些是吸附劑所專門設計針對的分析物，但在某些情況下，有可能小的非肽分子可屬于該組別。密切相關的分析物可能一起形成合成或生物合成庫，例如來自胰蛋白酶消化的庫、噬菌體展示 庫或已適當地進行體內或體外轉錄的隨機cDNA庫表達產物。但是，吸附劑的親合力對于結構偏離靶組的分析物通常迅速下降并且如果在結構上與靶不相關則接近零。優選的蛋白質或肽具有從4. 5到8. 5的等電點PI，其分子量可為從IOODa到500000Da。這些PI值大致匹配引入在至少一個第一殘基中的吡啶環的酸度pKa。本發明吸附劑的特別優選的靶蛋白質是“抗體”或其混合物，該術語還應包括抗體片段(輕鏈和重鏈，Fab和Fe區，Sc可變區，等)、該片段得到的人工分子構造(雙抗體、三鏈抗體)、寡聚抗體締合物以及含有抗體或抗體片段的融合蛋白或其它類型的綴合物，如含有可檢測標記物如谷胱甘肽或GFP (也可以彼此化學連接)的那些。它可以是多克隆或單克隆抗體。通常在免疫球蛋白(Ig、Y-球蛋白)中，抗體可能屬于任何同型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM,每一種又可分為若干亞類。抗體可以是人類或其它哺乳動物(典型的是鼠或嚙齒動物(小鼠、大鼠、兔、倉鼠、豚鼠)、山羊、羊、狗、豬、牛、馬)的來源。優選的抗體是人抗體或人源化(嵌合的)抗體。它們的獨特型可以針對所有類型的抗原(其它抗體或其它生物物質、小分子)。“含有蛋白質或肽的混合物”是指可具有各種來源的混合物。本發明對所得混合物的來源沒有嚴格限制。唯一的要求是，它包含至少一種蛋白質或肽，其可定性為本發明吸附劑對其表現出至少弱受體特性的分析物。該混合物由此可包含兩種或更多種不同的蛋白質或肽，意圖將其與混合物的其余部分集體分離(即它們所有都是分離靶)或彼此分離(即只有其中之一或極少部分是分離靶)。混合物中至少兩種蛋白質或肽的通過吸附劑殘基識別的結構基序(抗原決定部位)可以是相同的、類似的或部分相同的或不同的。假定后者將在許多情況下導致與吸附劑的不同類型的相互作用，由此得到結合強度方面的較大差異，前提是所述至少兩種蛋白質或肽具有相當的分子量并且包含大約相同數量的可識別抗原決定部位。如果蛋白質或肽是天然產生的或重組產生的物質，則它可從液體或固體生物材料如動物、植物、微生物或病毒(包括過量產生產物的育成或轉基因物種)的新鮮或干燥提取物、細胞培養物或細胞培養介質的提取物，微生物(細菌或真菌)或酶發酵液，商業原料或其任何組合得到。另外，含有蛋白質或肽的混合物可以是化學合成或部分合成的初級產物。這尤其包括手動或自動方式實施的標準溶液和固相肽合成方法。如對于任何純化技術，尤其是任何色譜技術典型的，所用的確切條件不僅取決于靶蛋白質或肽的構成，而且取決于樣本基質的構成。“基質”是用于混合物中所有活性和非活性成分的集體的術語，不包括靶但包括其分散在其中的介質。這是因為分離過程通常利用的不是靶蛋白質或肽的絕對物理或化學性質，而是利用在靶蛋白質或肽與所有或少數具體基質成分之間的所述性質的差異。通常，基質的組成至多只是部分已知的(定性和定量)，因為一種單一的分析方法往往不能夠檢測所有成分，至少不具有同等的敏感性。在化學或生物材料的下游分離純化過程中的不同過程階段獲得的中間產物代表本發明上下文的含義中的不同基質。待測試其在吸附劑上的吸附行為的整個混合物(靶和基質的組合)在分析范圍內也常被稱為“樣本”。用本發明吸附劑進行處理之前，化學或生物原材料可以通過其它預處理進行部分純化，所述其它預處理通過其它非破壞性的單元操作，特別是常規分離過程的任意組合進行，其可包括過濾(包括微濾或超濾)、透析和電滲析、洗滌、離心、沉淀、離子交換、凝膠過濾、溶解、蒸發、結晶、干燥、粉碎、任何方式的病毒減少處理和常規色譜(在低特異性吸附劑上色譜或常規利用生物殘基的親合色譜)以便從化學或生物材料中移除盡可能多的廢料(例如，不溶物和大多數蛋白質、核酸、碳水化合物、脂質和在生物材料情況下的無機物，只留下有價值的物質)，有害或腐蝕性物質或懷疑可能使吸附劑劣化或降低其分離能力的那些物質，從而在其與吸附劑接觸之前增加靶的濃度。在本文中，參考LC/LC偶聯技術。干混合物例如凍干材料需要在用吸附劑處理之前溶解在合適的進料溶劑中。期望溶解的混合物是均勻的并且不含懸浮或膠體顆粒。同樣地，本發明分離方法也可以隨后與上述類型的一個或更多個步驟進行組合。許多蛋白質或肽已經以工業規模生產并已發現在醫藥、營養品(如膳食補充劑)、化妝品或農業上的應用。其中大部分的大規模生產到目前為止可以經濟地并且在合理的時間段內只通過提取生物質，即例如從藥用植物、利用原核或真核微生物的微生物發酵或直到昆蟲或哺乳動物細胞(如常用的CHO、NSO、BHK或永生化HeLa細胞)的較高級生物體的細胞培養物得到的生物材料來實現。總之，根據本發明混合物的經常來源因此是生物合成產物，例如從微生物或細胞培養物或從作物提取物得到的那些。微生物發酵包括細菌或真菌(如酵母)菌株的浸沒培養或漂浮培養。產物可從整個生物體收獲物或從分離部分如菌絲體和/或相應的可在其中分泌的培養介質上清液得至IJ。半合成程序包括天然產物或中間體的下游化學修飾和合成原料的生物轉化。在所有情況下，副產物往往包括蛋白亞型、截斷形式和積累的中間體或沿得到靶蛋白質或肽的生物合成途徑的后續產物。這些可還伴有普遍分泌的抗生素、內毒素、真菌毒素、熱原、細胞增殖的促進劑或抑制劑、蛋白酶抑制劑、消泡劑，未完全消化養分的殘余物、部分降解的產物以及高分子量和部分不溶性組分(如細胞碎片)，因為它們可由生產生物體的最后階段細胞溶解得到。細胞溶解產物往往由于釋放額外的物質類如核酸和大量所謂的宿主細胞蛋白質到可提取介質中而進一步增加混合物的復雜性。與本發明的分離方法相關的術語“分離”包括將混合物分離或分割(split)成其部分的所有類型，特別是分開一種或更多種分子程度上溶解在液體中的結構不同的組分并且將它們分成不同的液體級分。混合物中一種突出的組分總是應該與至少一種其它混合物組分分離的靶蛋白質或肽。因此，是否將靶分離在一個級分中并且將副產物集體分離在另一(共同)級分中，或者是否將每一單獨的混合物組分與任何其它組分分離在其自己的級分中，或者是否該方法得到在這些極限情況之間的任何情況都是不重要的。只要在實施該方法之后得到的至少一種液體級分中觀察到在原(進料)混合物中已存在的至少一種溶解的蛋白質或肽富集就已足夠。分離的副產物不必一定作為分離的液體級分回收；它們也可例如與吸附劑結合而直接拋棄。分離過程保持未完成導致含有所需有價值產物的級分中產率損失是常見的。避免重疊的洗脫帶的清晰分級會提高分離質量(即純度)但會進一步產生產率損失。術語“濃度”和“純度”涉及混合物中各物質的給定或可實現的級分含量，由此術語濃度是指在總參比量的混合物中包含的溶劑量的溶液，而術語純度是指(有時假設)不考慮溶劑(包括殘余水)的干混合物。它們往往表示為重量分數或摩爾分數(重量/重量，重量/體積，摩爾/摩爾，摩爾/體積)。更高的純度因此可以更高的稀釋(即低濃度)為代價實現，或反之亦然，這取決于在特定體系中待實現的更重要的目的。用于確定本文所用 這些指標的實際值的測量是HPLC峰面積，在此必須注意的是除重量外的每一種定量方法顯示出可檢測性好的混合物組分對可檢測性差的混合物組分的某些偏差，并且還可能產生非線性校準曲線。不溶材料例如無法通過HPLC進行量化。根據其來源、分離和預處理的方式，該混合物可通常包含(合并)純度為I %至99%，優選至少10%，更優選至少50%的靶蛋白質或肽，其余為副產物或結構和功能與靶無關的化合物如殘留溶劑、試劑等。根據實際純化任務，本發明的分離方法可因此用作從極稀或粗混合物中初始捕獲或分離的步驟，或作為含有幾乎純的靶蛋白質或肽的已預純化混合物的最后拋光步驟。混合物的副產物或其它成分的數目可為I (如單點序列突變或缺失)到基本無限數目(例如未經處理的生理樣本)。副產物的類型還取決于原料來源和之前的加工過程。術語“接觸”是指利用作為固(固定)相的吸附劑對液(移動)相中存在的初始(進料)混合物通過在現象學(潤濕)以及分子(表面或孔隙擴散)尺度上在兩相間建立物理接觸所進行的任何適當的處理。所形成的接觸的強度應該足以使混合物中所有可能在分子水平上分散的組分(但至少是靶蛋白質或肽)能到達其上具有殘基的吸附劑的所有外部表面和可選的內部表面并隨后與它們相互作用。接觸的形成可在靜態或(柱塞流、層流、湍流等)流動條件下發生，例如在吸附劑粒子的固定床或流化(擴張)床上進行。由于混合物將溶解在第一液體(進料液或吸附液)中，所以這將是異質過程并且接觸形成可在宏觀上通過攪拌或振蕩所得混懸液得到加速，但對于終止該操作步驟沒有時間限制，除非靶蛋白質或肽和可選的副產物與吸附劑的穩態結合平衡已經建立。本文所使用的術語“液體”是指任何溶劑(包括作為最重要溶劑的水)或溶劑混合物，其具有對于待分離的一種或更多種混合物組分的至少弱溶解性能。不同組成的液體可以用于在方法的不同步驟中處理吸附劑，這是因為在每一步中所用的相應液體必須完成特定的任務，應實現諸如靶吸附(結合)、靶脫附(釋放)或吸附劑清洗。在色譜環境中，能夠實現混合物的一種或更多種組分與吸附劑的動態平衡交換的液體通常也被稱為移動相。由于在本發明吸附劑上的色譜分離主要取決于強極性和疏水相互作用，所以可以使用對各個混合物組分具有不同的溶劑化能力的多種液體組合物，這取決于應該有利的相互作用的類型。為了進一步調節任意或所有這些相互作用隨分離方法的任意步驟的時間進程的強度，有時也可能有利的是逐步改變所述步驟中所用液體的組成，例如通過梯度混合。因此，用于完成特定任務的液體的組成不需要在所采用的工藝步驟的全時間段內保持不變。在選擇合適的吸附和洗脫液體時，也必須考慮靶蛋白質或肽的比溶解度。蛋白質(除了膜結合蛋白質外)如果必須保持其天然狀態并且必須防止聚集則通常需要使用高含水量的液體。許多蛋白質或肽也耐受低至中等百分數的二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、乙腈或低級醇和丙二醇。由于本發明的吸附劑對幾乎所有的質子和非質子有機溶劑是化學耐受的，即使載體中所含的本體固體支承材料通過作為與液體(優選是促進吸附劑或位于其上的至少所述任選的聚合物膜溶脹的那些主要的極性溶劑)直接接觸的唯一材料的表面聚合物膜而受到屏蔽的情況下也是如此。相容性液體混合物的確切極性由此從而可以很容易地通過其組成進行微調。此外，在這樣的液體或液體混合物中可有利地添加少量助劑物質-優選揮發性的-酸、堿或緩沖液，從而通過調節所施用液體的PH (或在部分有機洗脫液中為表觀pH)并 由此調節選定的或全部分析物和/或選定的或全部吸附劑殘基的質子化程度和/或非質子化程度來實現在不同的溶劑化能力之間的切換。在這方面有用的物質是例如甲酸、乙酸、三氟乙酸和它們的鹽類。添加高濃度惰性的有機或無機鹽也可以用于改變液體的離子強度，從而通過競爭性相互作用來選擇性地破壞分析物和吸附劑之間的離子對。然而，在制備性應用中，如果靶蛋白質或肽意圖通過結晶進一步純化，則這樣的非揮發性鹽添加劑難以隨后從回收的洗脫液中移除。在某些情況下，將其它有機改性劑與吸附劑聯用可能對于蛋白質或肽的混合物的分辨率是有利的，這是通過一種超越單純調節液體PH或離子強度的機制實現的。至于“改性劑”，是小分子或大分子或其混合物的總稱，其不是自身具有溶劑化特性的液體，但其可少量溶解或懸浮在本發明的分離方法所用的一種或更多種的不同液體中，用以幫助或防止待分離的混合物的某些組分在該方法的特定步驟過程中溶解/洗脫，或出于一些次要(技術)原因，例如，溶劑的長期穩定和貯存，防止吸附劑生物淤積，保護分析物不發生化學或生物降解或凝聚，提高溶劑的混溶性，吸附劑溶脹，改善分析物的檢測，破壞水的結構，控制蛋白質展開或再折疊等，這取決于個別的分離問題。有機改性劑的特定實例是離子對試劑、表面活性劑(去污劑)和離液劑。“沖洗”、“洗滌”和“再生”是用于更好地區別用不同液體逐步處理相同吸附劑的不同表達。液體由此通過所執行的任務而不是其組分進行區分。實際處理過程可因此非常相似，有時區別只在于根據處理后溶解在其中的物質來決定是否液體必須進一步提純、分級、重收集或丟棄。沖洗涉及用液體進行處理，理想的是溶解并從吸附劑中釋放任何混合物組分，除了可能已被吸附劑非特異性結合的靶。洗滌涉及目的是溶解并從吸附劑中釋放出所有剩余結合的混合物組分甚至可以是比靶的結合更強結合的那些的處理。再生涉及使用能夠移除痕量洗滌液的液體并且涉及使在該方法的下一輪開始用于吸附步驟的干凈吸附劑恢復理想的物理和化學性質。“固定”是指消除或基本延緩蛋白質或肽在吸附劑表面上的遠程橫向和/或縱向移動的過程，否則這樣的移動可能由于統計學上的擴散遷移(布朗運動)或直接的物理或化學力(如滲透壓、剪切流動)造成。因此，固定化的蛋白質或肽在表面的吸附部位上的宏觀二維或三維位置可以被視為在短時間尺度內被固定。圍繞固定中心的納米級的不可避免的小波動例如構象變化、分子旋轉或振動，相鄰結合位點之間的跳躍或蛋白質或肽本身和所結合的殘基以及由于將相應結合位點殘基固定至表面的(任選聚合物的)鏈的聯合半徑內的任何平移運動保持不受影響。通過在大的時間尺度上使結合表面層交叉來緩慢釋放結合的蛋白質或肽也可以是期望的性質。在一個限定物質組成的中心實施方案中，本發明涉及新吸附劑的靶向特異性設計。具有官能團的固體支承材料已被用于隨后的表面衍生化，產生多個殘基的二維或三維排列，其適用于與包括在其中的靶蛋白質或肽的多價和/或多官能空間相互作用。本發明的一般方面因此可以描述為一種包括固體支承材料的吸附劑，所述吸附劑的表面包含包括吡啶環的第一殘基和包括羧基的第二殘基，所述吡啶環的氫原子可被取代。本發明的更具體方面可描述為根據“發明內容”章節中規定的第一、第二、第三和 第四方面的吸附劑。術語“其中所述官能團不包括所述第一殘基和第二殘基”用來描述根據第三和第五方面的吸附劑，是指載體表面的小于5 %，優選小于I %，更優選小于0. I %的可用官能團，更優選沒有官能團具有第一和第二殘基。在一個具體實施方案中，常用分析方法如光譜方法無法檢測具有第一和第二殘基的官能團。所述吸附劑的固體支承材料可以選自包括聚苯乙烯、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、二氧化硅、玻璃、淀粉、纖維素、瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和葡聚糖或其任意組合的組別。固體支承材料可屬于通用本體或其它表面改性材料，如引入表面官能團或增加水潤濕性。在一個特殊的實施方案中，吸附劑還可包括容易檢測的標記物，如光吸收、光發射、放射性或質量或射頻編碼的標記物。該標記物可用來識別在吸附劑混合物中具有其獨特殘基組合的特殊吸附劑或促進蛋白質或肽結合的檢測。標記物可以被引入固體支承材料的核心或者與殘基一起引入其表面上。特別屬于如上所述包括吡啶環的殘基在經常以有機小分子的化學結構出現的部分，如圖3所列舉的那些。吸附劑對于給定的特定蛋白質或肽的特異性親合力的微調通過仔細選擇在吡啶環上對應的取代基，第一和第二殘基的摩爾比以及任選其它殘基來實現。因此，清楚的是不可能窮盡處理全部的變化；相反將提供建立根據現有需求的吸附劑的概念框架。為了簡單起見，在圖3中只示出每個結構的一個內消旋化學式。此外，根據本發明的目的，如果存在該結構的雜芳族吡啶特征的至少一個合理的內消旋或互變異構的化學式，甚至存在可能的其它非雜芳族化學式，仍在足以滿足術語“批啶環”的含義內。環體系和殘基其余部分之間的連接以及與最終的固體支承材料的連接可通過包括自由價的雜原子的任意的環原子作為結合點來進行。吡啶環和羧基都是離化的，這是指電中性原子或含有其的任何基團可以在進行分離的條件(即，通常是不影響吸附劑或分析物的結構完整性的溫和或環境條件)下可逆地轉化(如通過質子化或去質子化)成在環境條件下穩定或與不帶電形式平衡的條件下的陽離子或陰離子。更具體而言，吸附劑的第一殘基至少部分地可接受質子化作用，因此至少部分地以其質子化形式存在。雖然帶電形式在圖中沒有明確顯示，但是在給定條件下可在兩側實際達到幾乎完全的平衡，并且在帶電和不帶電形式之間仍然可存在可測量的相互之間的轉化。質子化取決于環境pH，但在大部分非質子有機溶劑中也是占優勢的，使得難以區分是否兩種形式或只有一種形式對吸附劑表現出的親合力負責。各個殘基的準確的質子化程度將取決于在移動相上的它的堿度、濃度和酸的類型以及吸附劑預處理的方式。根據特定的分離任務，用表現出殘基的吸附劑來處理待分離的混合物因而可能是有利的，所述殘基已經調節為主要是非帶電狀態或主要是帶電狀態或者甚至可在分離過程中改變帶電狀態一次或更多次(如通過弱離子交換中已知的緩沖交換)。如可以很容易地想象的如果分離是在其PH接近相應結構pK值的環境中進行，吸附劑的離化吡啶環和/或羧基部分電離的條件也是可能的。也可能有必要生產或儲存非帶電狀態的吸附劑而同時在帶電狀態下進行分離，反之亦然。優選涉及pH為約5的水性緩沖體系的吸附劑的預處理，特別是在存在含有胺結構 的其它(第三)殘基(見下文)的情況下。這種處理將建立屬于每一種銨結構或其它離化殘基的反離子的均勻分布。殘基對于分析物表現出的氫鍵強度也受到反離子性質，其堿度和/或其《硬》與《軟》極化行為的影響，該反離子預期將保持在周圍的溶劑化物殼中并形成與質子化殘基的尚子對。其它取代基可以與吡啶環結合，并可以獨立地選擇每個環。如圖3所示的示例性結構，取代基R1 ,R1’…R4獨立地表示氫(H)、有機基團基。不希望被限制在特定的環幾何構型或取代模式中，合適的取代基可尤其包括由一個或更多個的下述簡單的有機基團組成的那些=C1-C2tl線性或支化的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、燒氧基、稀氧基、塊氧基、環燒氧基、芳氧基、芳燒氧基、燒硫基、稀硫基、塊硫基、環燒硫基、芳硫基、芳燒硫基、齒燒基、齒稀基、齒塊基、齒環燒基、齒芳基、齒芳燒基、齒燒氧基、齒芳氧基、齒芳燒氧基、齒燒硫基、齒芳硫基或齒芳燒硫基。本發明的全合成吸附劑必須與常規親合介質進一步區分，在常規親合介質中表面結合殘基本身往往是蛋白質或肽或其部分，并且其密切模仿已知的生物配體-受體的相互作用。一般來說，這樣的介質具有本文開頭所述的缺點。每種殘基的衍生化程度優選為其中第一和第二殘基的摩爾比為約3 2，在更寬泛的意義為至少I : I至2 : I。第一和第二殘基組合的總衍生化程度優選接近至少50%(根據可進行衍生化的官能團的數量)以促進形成混合組合物的多價相互作用位點，同時仍保持吸附劑對靶蛋白質或肽的高結合能力。第一和第二殘基隨后可分別以例如接近35 %和25%的衍生化程度存在。優選的第三殘基(見下文)包括胺或酰胺，更優選是伯胺結構。在這種情況下，第一、第二和第三殘基的摩爾比分別為約3 : 2 : 3。這些值周圍約10%的相對偏差是可以接受:的。在一個實施方案中，5至95%的官能團連接至所述第一和第二殘基的相互作用結構(分別為吡啶環和羧基)，優選20至90%，更優選30至80%，更優選40至70%，再優選50至60%。由于第一與第二殘基的摩爾比可自由選擇，所以有可能將吸附劑最優調節到特異性分離問題的所述給定范圍內，例如蛋白質或肽與包含所述肽或蛋白質的混合物的分離，或調節吸附劑以優化來自包含肽或蛋白質的混合物的所述肽或蛋白質的濃度和/或純度的增加。這種變化性使根據本發明的吸附劑特別適合用于上述分離或增加濃度和/或純度的問題。因此，在一個實施方案中，5至95%的官能團連接至所述第一和第二殘基的相互作用結構(分別為吡啶環和羧基)，優選20至90 %，更優選30至80 %，更優選40至70 %，再優選50至60% ;其中第一和第二殘基的摩爾比為I : I至2 : I。殘基連接的類型可以是共價鍵的任何變型(同原子或雜原子，可變鍵序)并且可以直接利用在固體支承材料的表面上或覆蓋所述表面的任選聚合物膜上的官能團形成，是否結合至其主鏈或其懸掛的線性或支化側鏈或任選通過端基或雙官能連接部分進行偶聯。除了作為第一殘基與靶蛋白質或肽進行選擇性相互作用的指定部分的吡啶環外，這些殘基因而還可包括共價連接部分。這種雙官能連接部分因為它們長度和化學組成存在很大可能的變化性而沒有特意在附圖中示出，但它們由標準固相合成或生物綴合法(如琥珀酰基)已知；最簡單的雙官能連接部分是預定數為I至約20個原子的烯基鏈。最適合的連接部分 是構象柔性的部分。將這個殘基連接至聚合物膜的優選共價鍵合將再次由酰胺、氨基甲酸酯、脲或仲胺/叔胺鍵形成。在本文中，已經提及了特別是長烯基鏈或聚乙二醇部分用作連接部分可以對所述蛋白質或肽施加額外的主要是非特異性的疏水力，分別疊加或放大第一、第二殘基的主要作用。但是，前述很容易合成并連接到活化表面上的含硫的連接部分不是本發明的重點，因為公知硫原子或含硫基團與分析物的分子表面上的相同類型的對應基團發生良好的相互作用，存在可能能夠將主動引入特殊的選擇性使得可能會干擾吸附劑的結合機制的事實。因此不可排除在這樣的任選連接部分和固體支承材料的官能團和/或殘基的相互作用結構之間通過它們的結合形成的可能的附加化學結構也可進入各種分析物并且因而可以有助于靶蛋白質或肽的選擇性保留。對于設置在作為對應殘基的一部分的雜原子結構和固體支承材料表面之間的附加結構實體的化學組成的唯一實際限制是需要在吸附劑的制造、貯存和使用過程中施加的條件下具有化學穩定性和相容性。因此，也有可能是各殘基通過特定的結合點作為亞結構被引入更高復雜性的支架(包括聚合物)中，其可包括相同和/或不同類型的額外殘基。殘基可直接偶聯到本體固體支承材料的表面上，特別是通過與所述表面上的官能團形成共價鍵。例如，選擇與二氧化硅的表面硅醇基團偶聯的殘基的方法是利用氯硅烷或烷氧硅烷封端的連接部分來實施的，而與碳水化合物支承體的羥基的偶聯可通過例如經典的溴化氰活化等各種方法實現。這些方法為本領域技術人員所充分知曉。然而，在優選的實施方案中，本體固體支承材料只代表其直接表面覆蓋有具有官能團的聚合物膜的載體，該官能團進而至少部分地被懸掛的第一和第二以及任選的其它殘基所取代。因此，形成薄中間層，其使吸附劑的宏觀形狀確定的且與分析物相互作用的部分彼此移動分開，但并不顯著改變整體的基本表面形態，因此被視為該表面的組成部分。殘基可以結合到所述聚合物官能團，其將使所用的基礎聚合物轉變成至少部分衍生化的共聚物。合適的具有官能團的基礎聚合物是例如聚乙烯醇、聚乙烯基胺、聚烯丙基胺、聚乙烯亞胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸以及包含這些聚合物中至少其一的任何共聚物或聚合物共混物。特別是如果固體支承材料由本體聚合物材料作為載體構成，在該載體的表面上再覆蓋聚合物膜，而且如果使用非聚合物載體，則制備載體的材料可以不同于制備聚合物膜的材料。這種差異可以例如自身體現在不同的單體組成、聚合的區域或立體化學、立構規整度、分子量分布、交聯度或其組合。聚合物膜的確切厚度以及吸附劑的分離動力學和能力由此取決于聚合物的溶脹狀態，其自身將總是移動相組成的函數，因此可以在不同的外部條件下發生變化。對于在水性介質或水性-有機混合介質中進行蛋白質和肽的分離，優選聚合物在該介質中是可溶脹的。這在聚合物是合成聚電解質的情況下是最容易實現的。如上所述，任何可能的離化殘基的電荷性質也影響聚合物膜的溶脹性，其在一定程度上也是溶劑依賴的。本文所用術語“含水”是指含有50體積％以上的水的液體，其 余的是其它水可混溶的溶劑或添加劑，例如無機或有機緩沖液、鹽類等。這種形態設計用于在移動相和固定相之間通過孔隙擴散保持非常高的傳質速率。線性或支化聚合物本身已被牢固地固定在剛性堅固的載體表面，用于使聚合物膜耐受制備所用的分離過程的條件，并在整個過程中保留在原位上。固定可以通過單個聚合物鏈內部交聯而形成連續聚合物網絡，或通過將單個聚合物鏈在沿所述鏈的一個或更多個的位置處接枝到載體固體來進行。交聯以及接枝可以容易地分別在聚合物的相同或不同的官能團之間或在聚合物中任意位置處存在的官能團和未涂覆的載體的表面上存在的官能團之間實現。優選聚合物的交聯或接枝連接由酰胺、氨基甲酸酯、脲或仲胺/叔胺鍵形成。單個聚合物鏈的端基官能團對于接枝是最好的，這將得到賦予最高鏈柔性的端基構型。雖然兩種技術的組合肯定是可行的，但是通常其中之一就足夠了。優選的固定方法是交聯(無接枝)。聚合物鏈由此可以彼此共價交聯的程度為1%至20%，基于可用于交聯的官能團數目計。如果交聯劑含有適合與一種或更多種的分析物相互作用的化學結構，則額外補充的殘基因而可在原理上是由于在聚合物膜中引入交聯造成的。由于聚合物的交聯度優選保持在相當低的百分數，因此它們的貢獻被認為是相當微不足道的。同樣認為額外的酰胺(如甲酰胺)或氨基甲酸酯基團的貢獻也是如此，所述基團可以保持為變化量，但通常不超過I %，它們是因為含氨基官能團的聚合物膜通過不完全水解反應合成導致的，得到無規的胺/酰胺或胺/氨基甲酸酯共聚物。然而，可以利用兩種或更多種不同的第一殘基和/或兩種或更多種不同的第二殘基根據其相應的部分結構的定義來衍生化固體支承材料。這些可隨后在其相互作用結構(取代的吡啶環和/或羧基)或在其將這些結構與固體支承材料表面連接的方式或二者方面彼此區別。在優選的實施方案中，第一殘基的總數和第二殘基的總數(或其等同物各自的衍生化程度)處于同一數量級，以在提供隨機(無規)空間殘基分布的情況下實現包括所有不同的第一和第二殘基的最大數量的混合組成結合位點。通常，在優選的實施方案中，第一和第二殘基不直接彼此連接，但是分別結合到本體固體支承材料本身或其支承的作為載體的聚合物膜上。因此，吡啶環和羧基不通過一個官能團或相同的官能團連接到支承材料表面。另一方面，相同或不同類型的兩種或更多種的殘基也可以直接彼此通過共價鍵連接，而不涉及聚合物膜的主鏈或以任何其它方式涉及固體支承材料的表面。在這種情況下，各殘基之間的界限開始模糊并變得任意，因為它們可能只有在吸附劑的衍生化歷史(即衍生化步驟的次序和類型)已知的情況下才有意義。如圖I的示意圖A-H所示例性示出的，在固體支承材料表面上的兩個側官能團可以用多種方式利用兩種不同的殘基進行衍生化(長的水平波形線在此是指表面的一部分，其自身可包含其它殘基)。除了上述平均分配的情況(其中每個單個官能團負載一個殘基(式A或B))夕卜，它們也可以例如在相同的官能團上順序排列成“行”(式C、D)或平行(式E、G)。這樣的構型可以通過特別是實驗實現，其中殘基自身包含與聚合物或表面官能團相同或不同的官能團，并且在聚合物或表面官能團用所述第一殘基衍生化后，其用第二殘基(情況C)進行自身衍生化(任選在去保護和/或活化后)，或其中一個官能團衍生化至少兩次(在單一步驟或多個連續步驟中)，使得具有支化結構的共同官能團(情況G)或連接部分(情況E)被兩個殘基共用(一個適當的例子是伯氨基進行兩次或三次烷基化以得到叔氨基或季銨部分)。但是，由此產生的構型C、D、E、F也可以通過替代路徑實現，其中具有官能團的表面或聚合物與被具有正確相互排列的第一和第二殘基的單一衍生化試劑所衍生化。兩個殘基的更復雜的相互排列例如大環或多環體系(情況F和H)當然也是可想象的。在除A和B外的所有情況下，用第一殘基衍生化的官能團的第一部分總是等于用第二殘基衍生化的官能團的第二相同部分。 所有上述情況在統一的觀點下也可以被視為其中單個殘基排列成等級次序的更普遍情況下中的邊緣情況。如果鑒于這種普遍的表示情況復查一個給定的實施例，則這樣的構型尤其可以實現，其中兩個不同的結構共有共同的連接部分或其一部分，通過所述連接部分或其一部分所述兩個不同的結構結合至固體支承材料本身的表面上。這兩個結構可以由此線性排列在相同支鏈或不同支鏈上，如果連接部分具有支鏈結構的話。整個殘基，即最大可能的是統一結構單元(包括終止在表面官能團中的可能的連接部分和所有其它與其相連的亞結構)，然后只是在形式上正式歸因于第一殘基，同時第二殘基會在形式上再次在這種構型中只包括相應的羧基結構和其可能的與整個(第一)殘基的其余部分直接連接的單元。已經出乎意料地發現，任何具有上述兩個結構特征的組合的吸附劑允許容易地回收大量的蛋白質或肽，在某些情況下，在以僅部分純化的混合物起始的單一步驟中，純度高于98%或各種雜質的最終濃度低于1%。因此，可以獲得制藥等級而無需費力或繁瑣的程序。在例如直接從工業規模制造得到的粗原料中的蛋白質或肽的濃度也可在單一步驟中富集到高水平。適用的效價范圍在混合物中為約1%至約90%。所述步驟的回收產率由此至少與常規純化方法一樣高并且可達到95%的值。用于本發明給定目的的包括兩類殘基的吸附的顯著優良的性能甚至更令人出乎意料，因為表明包括具有緊密相關結構或兩種必須結構中的僅一種的殘基的吸附劑僅表現出至多中等的分離效率。不希望受限于理論，與涂覆有簡單且未衍生化的聚合胺的膜的吸附劑相比，這種特殊吸附劑的高效能可歸因于存在額外的且結構新穎的多價結合位點。負責產生這樣的新結合位點的結構可主要歸因于聚合物的部分無規改性。在這些結構中，特別要注意的是在所述結合位點內潛在存在的擴展的富電子或貧電子31 -體系和/或弱堿性或酸性的綴合體系。基本的相互作用模式被認為既涉及屬于極性/偶極組別的相互作用，例如靜電力、電荷轉移和氫鍵，以及屬于非極性組別的那些，例如疏水相互作用和H堆疊。H體系的雜原子預期是偶極力和氫鍵的潛在位點，無論是通過電子H體系本身或通過額外的孤對電子。然而，并沒有對給定分離中的實際運行機制以及每種殘基對總體結合強度的部分貢獻進行調查，不能對任何這樣的結構預先得出明確的結論，部分是因為與溶劑分子形成競爭的氫鍵也可能使情況復雜化。空間因素可能對所設計的吸附劑的選擇性有額外的貢獻。至少，來自第一或第二殘基的純離子貢獻是不太可能的。此外，在測試大量不同衍生化的吸附劑之后，出乎意料地發現，就本發明的給定分離目的而言，除了固體支承材料表面上的官能團的第一和第二部分被第一和第二殘基衍生化之外，第三殘基的存在產生甚至更優異的結果。固體支承材料可因此進一步被補充的第三、第四和第五殘基等衍生化。包括固體支承材料，并且其表面除上述第一和第二殘基外還包含第三殘基的吸附劑因此是本發明的進一步實施方案。吡啶環和羧基被排除作為第三殘基以及每個進一步的殘基的結構構建單元。除了這種排除外，關于兩種殘基之間的可能結構關系的所有選項，如圖I中針對第一和第二殘基所示例性示出的，同樣適用于第三殘基與第一殘基以及第三殘基與第二殘基之間以及在任何額外的殘基之間的相互關系。每一個 不同類型的額外殘基促進吸附劑產生對于給定蛋白質或肽的非常特異性的結合位點的潛力，并且促進其與其密切相關的副產物進行區別。然而，每一類殘基應具有至少約20%的衍生化程度，因為顯著較低的衍生化程度在大多數情況下基于統計的原因是可以忽略不計的。對于大多數應用，因此在大約相等的衍生化程度下，足以使殘基類別<5。無論不同殘基的數量和相互比例，每種類型的殘基仍應是均勻和隨機(無規)分布在固體支承材料的表面上。雖然官能團的第一部分由此可包括官能團的所述第二部分或可與其不同，第三殘基也可由所述固體支承材料的表面官能團被部分第一和第二殘基的不完全衍生化所產生。根據所用的試劑和合成條件，衍生化反應往往是不完全的。因此，在待衍生化的包括任選其上覆蓋基礎聚合物(即，引入至少一個相應的單體或重復單元的那些)的固體支承材料的表面上共有的一定數量的非衍生化官能團可有意地或因技術原因而保存下來。這些仍然可以進入各種分析物，可以作為結合位點的補充部分，協助結合靶蛋白質或肽，從而增加了吸附劑的分離能力。這意味著所述官能團本身的第三(剩下的)部分可代表所述第三殘基的類型。在本發明中，優選采用覆蓋聚胺膜特別是聚乙烯基胺膜的固體支承材料。因此，優選的官能團是伯氨基和任選的仲氨基結構，它們可因此被視為補充的第三殘基。在特殊實施例中示出，衍生化官能團分數達到100%導致對于給定分離對象的選擇性下降。這一事實可被視為在包括第一和第二殘基以及在空間上緊密相鄰的未衍生化官能團的吸附劑內產生新型多官能結合位點的指標。通過這種經設計的三級衍生化或不完全的一級和二級衍生化，對于給定的蛋白質或肽的選擇性可以在許多情況下進一步增加，并且作為伴隨的實際益處，經常觀察到作為覆蓋固體支承材料的表面的任選聚合物膜獲得額外的化學穩定性和較好的溶劑相容性或溶脹特性，這取決于第一和第二殘基以及所涉及的官能團的相對極性。然而，可以說，第一和第二殘基是用于實現基本分離目的的在特異性方面最重要的殘基，因為完全未衍生化的聚合物如交聯聚乙烯胺(僅向分析物提供主鏈的伯氨基官能團)的膜并沒有令人滿意地實現本發明的分離目的。在理想情況下，殘基(包括作為補充殘基的未衍生化官能團)的總密度為 0. Imol dnT3 至 I. Omol dnT3,但優選至少為約 0. 3mol dnT3。另一方面，固體支承材料或其上任選的聚合物膜的未衍生化反應性官能團，更具體的是氨基基團，還可以表現出對于待分離的混合物中靶或可能的反應性副產物具有相當大的可逆或不可逆的反應性，這可能導致牢固捕獲這些物質(即使它們只以低濃度存在)并且在反復使用后，吸附劑緩慢劣化并失去結合能力。為了避免這種不必要的相互作用，一般做法是在制備色譜固定相時使這種殘余官能團通過所述基團的“封端”而失活。因此，額外的(第三或第四)殘基在此可通過原游離官能團至少部分轉換為結構不同的封端官能團而產生。以這種方式，封端可被視為 衍生化反應的一種特殊情況，用以根據相應的分析物、基質和移動相的要求建立改善的固/液界面相容性，但不能產生額外的結合強度，因此沒有額外的選擇性。然而，部分或全部封端的殘余官能團可最終證明在長期過程穩定性方面是有利的，盡管在固定相制備中需要更多的努力。優選地，封端親核官能團如氨基是通過減少官能團的親核性的反應實現的。封端基團被設計成具有簡單的分子結構，所以沒有表現出與寬范圍的分析物的相互作用或至少只有低強度的非共價和非特異性的相互作用，并且沒有顯著改變固定相的總體極性。但是，可以設想，它們可在高衍生化程度下有助于第一和第二殘基與底物的多價相互作用。盡管由于不完全或混合封端導致在吸附劑上存在多于兩倍混合的三級衍生化的可能性，但是已經證明，優選旨在整個吸附劑上實現均勻封端(即程度> 95% )，或根本沒有封端。根據封端基團的結構，如果經形式處理的話，其因而可以或不可以潛在地作為三級殘基。在第一方法實施方案中，本發明涉及用于制備具有上述特征的本發明吸附劑的方法。該方法將得到特殊類型的吸附劑，其中固體支承材料由載體構成，載體表面上覆蓋有聚合物膜，所述聚合物具有至少部分被殘基取代的官能團。該優選類別的吸附劑的特殊特征已經廣泛列舉如上。現在，所述制備方法至少包括以下步驟(i)提供具有官能團的聚合物；(a)將聚合物膜吸附在載體的表面上(“吸附步驟”)；(b-I)利用至少一種交聯劑交聯被吸附的聚合物的官能團的限定部分(“交聯步驟，，);或:(b-II)將被吸附的聚合物的官能團的限定部分接枝到載體上(“接枝步驟”);(C)用包括其氫原子可被取代的吡啶環的第一殘基和用包括羧基的第二殘基以及用任選的其它殘基來衍生化聚合物的官能團的限定部分。涉及上述制備方法的具體布局的幾個變化方案設想如下。首先，步驟(b-I)和(b-II)即分別交聯和接枝被視為等同替代，這些步驟中的任一步驟足以實施該方法以建立根據本發明的吸附劑，其將表現出以上進一步描述的特征。兩種替代方案用作在進一步處理和使用吸附劑的條件下完成被吸附的聚合物牢固固定在載體上的任務的手段，即使用強溶解性的溶劑進行處理也是如此。這是通過在所有聚合物鏈之間形成附加共價鍵的連續網絡并因此物理纏結載體(交聯)，或通過在每一單個聚合物鏈與載體之間形成共價鍵(接枝)來實現。當然，兩種用于固定的替代過程也可以在本方法內進行組合，或者同時組合在單個步驟中或連續作為兩個可區別的子步驟進行，沒有吸附劑穩定性方面的缺點。其次，另一變化方案可能涉及與吸附步驟(a)相關的衍生化步驟(C)的相對時間順序。因此可以想到，首先在均相溶液中用殘基衍生化聚合物，然后將已含有殘基的衍生化聚合物膜吸附到合適的載體上。這種程序將需要研究和優化每種不同衍生化的聚合物的涂覆步驟的實驗條件。因此，優選的變化方案是首先將未衍生化的聚合物吸附到載體上，如在與衍生化步驟(C)并行或之前的吸附步驟(a)中進行，以獲得薄且均勻的層。交聯步驟(b-I)或接枝步驟(b-II)在任何情況下均分別立即在吸附步驟(a)之后進行，因為一旦交聯，聚合物就難以被吸附成膜。另一步的邊界條件是步驟(i)總是序列的第一步驟。放在一起考慮，所述兩種獨立的步驟變化方案的以下四種組合是可能的(步驟b-I或b-II與步驟(a)和(C)的相對順序的組合選擇)第一方法根據本發明的吸附劑的制備方法，包括順序如下的步驟(i)提供具有官能團的聚合物；(ii)吸附步驟(a);(iii)交聯步驟(b_I)；
(iv)衍生化步驟(C)。第二方法根據本發明的吸附劑的制備方法，包括順序如下的步驟(i)提供具有官能團的聚合物；(ii)衍生化步驟(C)；(iii)吸附步驟(a);(iv)交聯步驟(b-I)。第三方法根據本發明的吸附劑的制備方法，包括順序如下的步驟(i)提供具有官能團的聚合物；(ii)吸附步驟(a);(iii)接枝步驟(b_II)；(iv)衍生化步驟(C)。第四種方法根據本發明的吸附劑的制備方法，包括下列順序的步驟⑴提供具有官能團的聚合物；(ii)衍生化步驟(C)；(iii)吸附步驟(a)；(iv)接枝步驟(b-II)。序列的每一步驟是指利用在緊接著的前一步驟完成后得到的其狀態下的聚合物進行，即交聯或接枝步驟后的衍生化步驟將利用已交聯或接枝的聚合物進行，而在吸附步驟之前的衍生化步驟將利用游離的非吸附聚合物進行。如果聚合物官能團的限定部分在特定步驟中反應并且類似部分已經在前一步驟中反應，則意味著該特定步驟中的限定部分將來自于前一步驟留下的并且預先沒有反應的那些官能團的全部(免除二價或多價官能團)。雖然所有四種方法原則上產生相當的結果，但是第一方法因其實施簡單而是優選的。在其它目前尚未明確提及的變化方案中，聚合物官能團的第一部分可以在溶液中衍生化，然后吸附部分衍生化的聚合物，并且在所得被吸附的聚合物上的前述相同或不同官能團的第二部分用前述相同或不同的殘基進行衍生化。或者，聚合物官能團可首先通過溶液衍生化而轉化成不同的官能團或殘基前體，在吸附后轉化成最終殘基。通過這種混合組合制備步驟引入單個殘基的最合理順序由此在很大程度上取決于特定類型的載體材料和特定的部分衍生化的聚合物在載體上的吸附容易性。層的分子內和分子間交聯將形成穩定的二維或優選的三維聚合物網絡并防止其從“包覆”的載體介質上解吸附。雖然交聯可以根據現有技術中已知的所有程序進行，但也包括基于在聚合物鏈上的任何位置處產生自由基的非選擇性方法，如電化學、光或(電離)輻射引發方法，交聯步驟優選只在聚合物的官能團之間利用交聯劑進行，例如設計為進行與所述官能團進行縮合反應。交聯優選長度在I和20個原子之間的線性且構象柔性的分子如a，Co-雙官能縮合試劑。而且，可采用兩種或更多種的不同長度和/或不同反應性和/或不同鏈剛性的交聯試劑，優選用于連續步驟中。交聯不會以耗盡的方式進行，這會得到剛性材料，但總是只進行到預定的程度，即與聚合物官能團的限定部分交聯，這可容易地通過相對于所加入交聯劑的可用聚合物官能團的化學計量分數進行控制。在這方面，合適的交聯劑包括二羧酸、二胺、二醇和二環氧化物，例如1，10-癸二酸或乙二醇二縮水甘油醚(E⑶GE)。4，4'-聯苯二甲酸可用作剛性交聯劑。交聯劑優選選擇為與聚合物官能團具體反應，但不與模板或基本載體材料反應，例如只在聚合物膜內實現穩定交聯，但在聚合物膜與載體表面不形成穩定交聯。無論如何，建立適度數目的后一類型的額外交聯肯定不會顯著改變吸附劑的性質。如果需要額外的封端基團，通常在過程最后被引入(在最后的特定殘基衍生化之后)，如果在前的衍生化尚未完成的話。封端原則上可以類似于上述特定衍生化步驟進行。 然而，得到高反應性試劑的活化方法在封端反應中是常見的，因為它們需要與在在前的衍生化步驟中被證明反應性最低的那些官能團進行反應。優選的是酰基酐、酰基氯化物，特別是乙酸的酰基酐、酰基氯化物或異氰酸酯和異硫氰酸酯或環氧化物。此外，可以采用兩種或更多種不同的封端試劑或包含兩種或更多種不同的封端基團的試劑，例如混合酸酐。也可以想到，使用其它具有良好的離去基團的典型烷基化試劑如甲基碘化物、硫酸二甲酯或重氮甲烷。現有技術中已知的適合用于聚合物或非聚合物固定相的其它封端方法可以類推使用。通常，盡可能多的殘留官能團的完全封端是期望的，但是該過程也可控制為根據需要在基本任何任意的封端程度上停止。也可暫時用保護基團來衍生化聚合物膜的官能團或殘基的取代基。所述官能團或取代基可以因此在引入一個或更多個的其它殘基組期間受到保護，免于有時與對應的衍生化試劑發生不期望的反應，否則可能導致不可控的殘基累積或高階取代模式如支化。一旦額外的殘基組處于合適位置后，保護基團通常被再次移除。待吸附到載體表面上成膜的聚合物的優選官能團是伯氨基或仲氨基、羥基和羧酸或羧酸酯基團。這些基團具有易衍生性、生物相容性并增加聚合物的水溶性。因此在該方法中也優選采用溶于水性介質或水性-有機混合介質中的聚合物，這是因為吸附步驟優選從該介質進行到懸浮在其中的載體材料上。雖然吸附步驟本身在原理上可以在每一步驟中使用不同聚合物逐步進行，但是優選只使用單一類型的聚合物進行(即，具有相同類型的官能團或帶有相同符號的電荷的官能團的聚合物)。特別優選聚合物的分子量為5000道爾頓至50000道爾頓。一般來說，針對本發明吸附劑的組成和性質的上述所有其它優選實施方案也適用于其制備方法以及在上述方法中以類似方式使用的材料，因此不需要在本文中重復說明。錨定基團，即衍生化步驟中所用的衍生化試劑的活化位點可接近待形成的結合位點或與上述結合位點的距離近或遠，這主要取決于結構、功能或合成的要求，即可以在形成結合位點和活化位點的結構之間引入間隔基團。這種間隔基團可以是剛性或柔性并且具有不同長度，由此較長的間隔基團經常轉化成增加的構象柔性，這有時可能是在吸附劑結合位點和靶蛋白質或肽之間的復合物所需要的，以采取有利的幾何形狀。間隔基團可以首先分別與對應的吡啶環結構和羧基結構偶聯，在單獨的(可以是均相的)反應中形成結合位點，所形成的類似于完整殘基的綴合物與聚合物偶聯，或間隔基團可首先與聚合物然后與所形成的綴合物偶聯，然后在任選的去保護之后，分別與對應的吡啶環結構和羧基結構偶聯以形成完整的殘基。兩種偶聯反應可由此具有相同或不同的類型。一般來說，如果含有伯氨基官能團的聚合物被用作成膜聚合物，則功能性氨基的氮原子可以直接引入殘基中。優選的衍生化試劑包括胺、環氧化物、羧酸或酯以及異(硫)氰酸酯，導致與優選的聚合物官能團形成酰胺、氨基甲酸酯或(硫)脲鍵合。出于結構、穩定性和便利的原因，最優選的是，衍生化步驟通過在官能團和殘基之間形成酰胺鍵進行，即在含氨基聚合物和羧基封端的衍生化試劑之間或在含羧基聚合物和氨基封端的衍生化試劑之間形成酰胺鍵。對于氨基聚合物而言，特別優選的衍生化試劑是活化羧酸衍生物。如果在衍生化之前必須進行化學活化，則其可以在衍生化步驟之前的額外步驟中進行或與衍生化步驟同時進行。聚合物官能團或優選衍生化試劑可以被活化。例如，羧基的活化可以通過固相肽合成的標準技術，例如通過活化酯如OBt (苯并三唑氧)或0NB(降 冰片烯二肟基氧)酯進行。羥基可以類似處理。在一個經濟并因此特別優選的實施方案中，活化將在衍生化步驟期間利用肽化學中已知的方法原位進行，即作為一鍋法反應，其中活化物質的穩態濃度持續產生而不是會分離出來。這兩種殘基均可以在單個的衍生化步驟中引入聚合物。任選地，在此使用單一衍生化試劑，其已包含兩個殘基(或分別是其前體)或包含含有第二殘基的第一殘基(或反之亦然)。或者，至少兩種不同的衍生化試劑作為混合物使用，其中每一種包含至少一種但不同的殘基。衍生化步驟可以利用每種殘基逐步交替進行。然后，在第一衍生化步驟中采用的衍生化試劑包含第一殘基并且在第二衍生化步驟中采用的衍生化試劑包含第二殘基，反之亦然。在一個制備方法的變化方案中，衍生化步驟(C)可以利用每種殘基逐步進行或作為單個步驟進行。該實施方案考慮到在聚合物官能團的衍生化反應中，第一和第二殘基可以很容易地同時引入。其實現方式可以是，使用至少兩種衍生化試劑的混合物，第一衍生化試劑包含第一殘基，第二衍生化試劑包含第二殘基。雖然隨后得到兩種殘基沿聚合物主鏈的隨機不規則分布，但是衍生化聚合物可通過第一和第二殘基的統計比例來表征，其基本上是通過至少兩種衍生化試劑的相對量和反應性來確定的。作為替代方案，如果該衍生化試劑已經包含第一和第二殘基(或如果第一殘基包含第二殘基，或反之亦然)，則僅適用一種衍生化試劑也是可行的。當然，兩種殘基隨后在所得衍生化聚合物中的比例為I : 1，并且具有預先限定的相互區域和立體化學性質。與兩種完全發展的殘基不同的是，也可以是至少一種殘基在衍生化試劑中作為前體存在。在本發明制備方法的相同變化方案的范圍內，可以實現多種構型，其中使用衍生化試劑的混合物，每一種衍生化試劑包含第一和第二殘基二者。特別的，在這種混合物中，第一殘基(或其前體)的部分結構可以在衍生化試劑中變化，而第二殘基(或其前體)可保持相同，反之亦然。非常特別地，在尋求制備方法時，衍生化試劑可以相互組合，限定量的衍生化試劑可包含第一和第二殘基二者，而另一限定量的衍生化試劑可只包含第一殘基或只包含第二殘基。如果試劑的量和反應性相當，則所得產物隨后表現為一種殘基相對于另一種殘基過量。這樣，尤其可以實現第一和第二殘基在聚合物官能團中的定制的但仍然均勻和隨機(統計學上)的分布。如果將額外的第三、第四…等殘基引入聚合物，則衍生化步驟可以任選逐步重復多次，因此采用包括所需結構序列的其它殘基。經濟上可行的是至多約四個重復步驟。優選地，每個衍生化步驟總是進行到大致相同的衍生化程度，每種殘基的程度由此約占25%。本發明的吸附劑可主要應用于含蛋白質或肽的混合物的純化。在第二方法實施方案中，本發明因此涉及使用上述靶向特異性設計的吸附劑從含有一種或更多種蛋白質或肽以及任選的副產物的混合物中分離所述蛋白質或肽的方法或增加所述蛋白質或肽的濃度和/或純度的方法。該方法至少包括以下步驟(i)使溶解或懸浮在第一液體中的所述混合物與本發明的吸附劑接觸，并持續足以使所述蛋白質或肽能夠結合到所述吸附劑上的時間段；
(iii)使具有所述結合的蛋白質或肽的所述吸附劑與第三液體接觸，并持續足以使所述蛋白質或肽能夠從所述吸附劑中釋放的時間段。在上述方法的第一變化方案中，在步驟(i)和步驟(iii)之間可包括利用第二(洗滌)液體的單獨沖洗步驟，該步驟理想的是不顯著破壞在吸附劑殘基與待純化的蛋白質或肽之間的非共價鍵或否則用于釋放所述吸附劑結合的蛋白質或肽。根據混合物中副產物和其它成分的種類和數目，在分離過程中液體的這種變化有時可以增加分離效率。第二液體主要具有低洗脫強度并且將非特異性洗脫。該方法然后包括可選的中間步驟(ii)利用第二液體沖洗所述吸附劑；在步驟⑴中靶蛋白質或肽和副產物的混合物與吸附劑接觸之后，吸附有蛋白質或肽的吸附劑還可以再與第一液體中所含的剩余混合物進行分離，然后在步驟(ii)中用第二液體沖洗。如果剩余的混合物包含有價值的副產物，則其自身可回收。后一變化方案也可用作極稀原料的捕獲手段，也是在快速間歇過程中移除潛在副產物的可行方式，其被懷疑干擾后續的完整的和更復雜的色譜分離。其中，這些可能的副產物可能導致吸附劑通過不可逆的物理或化學吸附發生緩慢劣化并因此縮短柱的耐久性。在實踐中特殊但重要的情況下，第二液體可選擇為與第一(進料，吸附)液體相同。這意味著在步驟(ii)中利用與在步驟(i)中將其作為混合物施用于吸附劑時從其中吸附所述靶蛋白質或肽的液體相同的液體來沖洗該吸附劑。這往往是可能的，因為第一液體通常選擇為使得它對于靶蛋白質或肽只有中到差的溶解特性，原因在于只有在靶蛋白質或肽與液體之間的相互作用焓小于靶蛋白質或肽與吸附劑之間的相互作用焓的情況下，有效吸附才有可能。另一方面，如果這種液體對于應該在步驟(ii)中從吸附劑上洗脫的副產物具有良好的溶解性能，則它也可以用于沖洗吸附劑，而靶蛋白質或肽仍將結合其上不被同時釋放。同樣地，第二液體可以選擇為與第三(解吸附，洗脫液)液體相同。如果第三液體對于靶蛋白質或肽與副產物的溶解性能的差異程度足夠大而其在吸附劑上的吸附焓相當，則可以將相同的液體用來沖洗吸附劑。這基本上意味著，該方法的步驟(ii)和步驟(iii)可以在這些情況下合并成一個步驟。在連續流動系統中，更好溶解的副產物將隨后被首先沖洗掉，接著是在相同液體的后續洗脫部分中釋放靶蛋白質或肽。當然，這個序列之后可以再是含有溶解度較低應因此洗脫較慢的其他副產物的第三液體的額外部分。
甚至所有三種液體都可以是相同的。然而，即使兩種或三種液體都選擇為相同的，但它們仍然可以在該方法的不同步驟中以不同的流量施用于吸附劑。色譜中的體積流量一般是所施加壓力范圍、柱尺寸和液體粘度的函數。HPLC中移動相的對應一維速度通常為約Imm s—1至5mm s'編號第一、第二、第三、…液體因而用于限定完成不同任務的施用液體的相對順序，但不意味著限定相應液體的必然特定的組成。與不連續地或逐步(即，作為階梯梯度(st印-gradient))地交換液體類型或其施用流量不同的是，可以使用其它連續梯度形狀，特別是線性梯度來在不同的液體和/或流量之間緩慢轉換。這分別需要液體至少部分相互混溶和建立逐步將增加的后續液體部分混入在前液體中的機制。在本發明的一個實施方案中，第三液體在pH值方面不同于第一液體和任選的第二液體。在一個特定的實施方案中，第三液體的PH高于第一液體和任選的第二液體的pH。更優選地，第三液體的pH接近于(即在±1單位內大致匹配)靶蛋白或肽的等電點PI，而 第一液體和任選的第二液體的pH顯著不同于該等電點，至少相差約兩個pH單位，特別是低于該等電點。第一液體的PH可有利地在從4. 0至6. 0的范圍內，而第三液體的所得pH在從6.5至8.5的范圍內。該實施方案涉及的情況是，吸附劑和靶蛋白質或肽之間的結合焓大部分被涉及在任一結合伙伴上的一個或更多個可離化殘基(如氨基、含氮吡啶環或含氧羧基)的靜電或其它極性相互作用(偶極力、氫鍵)支配。特別地，當接近PH范圍的兩端極值(例如，在低PH下的質子化氮與高pH下的去質子化的氧之間)時，疏水性和極性相互作用預計將主要接近中性，而離子排斥預計將部分替代相同且迄今不帶電的殘基的吸引極性力。該作用可顯著削弱結合焓，并因此從吸附劑上釋放結合的蛋白質或肽或阻礙副產物與其結合。以相反的方式，在由于pH變動使得任一結合方失去點電荷后，吸引的離子相互作用也被削弱。在這方面特別重要的是，含氮雜芳族化合物如吡啶作為吸附劑上的殘基，這是因為這些殘基能夠表現出疏水以及極性/離子相互作用。這種吡啶環用于本發明分離方法的吸引力來自于其結合行為可在非常接近生理條件的pH值下切換，由此準確的切換pH值范圍取決于特定殘基的等電點，因而可通過其結構和含有至少兩種不同的離化殘基的吸附劑的相對組成來進行微調。另一方面，結合焓的PH依賴性也可適用于在吸附劑和至少一種待分離的副產物之間的相互作用。這可能例如是由于靶和副產物的不同等電點或由于疏水/極性相對于靜電相互作用的定量上不同的相對貢獻所致。在本發明的另一實施方案中，第三液體在離子強度方面不同于第一液體，任選地也不同于第二液體。在一個特定的實施方案中，第三液體的離子強度高于第一液體和任選的第二液體的離子強度。該實施方案涉及的情況是，吸附劑和靶蛋白質或肽之間的結合焓大部分被一種或更多種離子或可離化的殘基參與的靜電相互作用所支配，而這種參與在吸附劑和待分離的至少一種副產物之間的靜電相互作用中是不同的，特別是較不突出的。另一方面，疏水性對結合焓的貢獻將在離子強度增加后得到增強，如果所有其它參數保持不變的話。優選地，分離方法的吸附步驟(i)在第一液體中的低鹽條件下(0至0. 2M氯化鈉)進行，而釋放步驟(iii)可以在第三液體中至多IM氯化鈉的條件下進行。雖然本發明的吸附劑對高鹽條件的耐受性非常好，但是大多數情況下不必要也不建議在步驟(iii)的第三液體中添加高鹽濃度以脫附吸附劑結合的蛋白質或肽。相反，吸附劑對許多蛋白質或肽的親合力可隨著鹽濃度變化而在很大程度上不可變。因此，鹽梯度在只靠自身來釋放所吸附的蛋白質或肽時可能是無效的，但它們在與輔助的PH梯度結合時可能是有效的。
靶蛋白或肽從吸附劑上的釋放因此可以通過增加第三液體對于靶相比于第一和第二液體的溶劑化強度來實現。作為替代方案，它可以通過利用溶解在第三液體中的置換試劑使靶蛋白質或肽相對于吸附劑的結合位點發生位移來實現。位移作用(優選是吸附劑而非競爭的靶與置換試劑結合)可以在置換試劑相對于靶蛋白質或肽摩爾過量或置換試劑對吸附劑的結合強度甚至高于靶蛋白質或肽對吸附劑的結合強度的情況下實現。置換試劑本身可以是具有類似靶的特性的蛋白質或肽或其片段，而且是對吡啶基殘基和羧基殘基具有高親合力的合成小分子。在靶蛋白質或肽已完全從吸附劑中釋放后，另一洗脫劑變化可同樣在經濟方面是有用的，從而以色譜分辨率為代價加速色譜運行或如果其它有價值的產物被后續洗脫也是有用的。在第二變化方案中，該方法中增加了任選的最終步驟
(iv)利用第四和/或第五液體洗滌和/或再生吸附劑；其在步驟(iii)之后引入。在此，作為第四(清潔)液體使用的液體大部分具有高洗脫強度，可含有上述類型的添加劑并且非特異性地洗脫。如果吸附劑以色譜柱的形式使用，則第四液體可以高體積流量應用在正常或相反方向上，因為其任務是清潔吸附劑并永久移除強吸附的或以其它方式干擾化學或生物雜質的殘余物特別是顆粒物質的任何積聚，以防止逐步積垢、堵塞或柱容量下降。對于醫療衛生和安全領域，就此而言也可以將用于消除微生物污染的典型消毒或滅菌方案(例如，堿性(I. OM氫氧化鈉)、酸性(0. 4M醋酸)、氧化性(次氯酸鹽)和/或熱處理)應用于吸附劑。在用侵蝕性或強溶劑化液體進行預先處理后，使用第五(重調節)液體來調節吸附劑、其溶脹程度和其所結合的殘基的溶劑化，使得吸附劑的原始狀態得到恢復并保持恒定，在每個分離運行開始時建立平衡條件。除了移除痕量的洗脫液或清潔液外，離子殘基的反離子(如果存在的話)將由此被替代成原來的均勻分布，以保持恒定的吸附劑的酸堿性質。第五液體可與第一或第二液體相同，并且通常會以相同的流量施用。它也可以從每次運行后的快速簡單的清洗/再生程序切換到每五次、十次等運行后的更復雜的程序，例如，取決于這些污染物的實際負載量，這對于達到所嘗試的產品品質規格而言是關鍵的。實施分離方法的優選方式是作為中-高壓液相色譜技術。由于其操作簡單，并通過上述多種變化中的任一種，該方法也可以以間歇純化方式不連續地用作親合性(膜)過濾或固相萃取技術或連續地用作模擬移動床(SMB)技術。所有的變化也可以彼此組合。吸附劑的強化學穩定性以及靜態和動態結合能力(分別高達約0. 31進料負載量或每升吸附劑約20g蛋白質或肽是可能的)允許用于該方法的所有5種液體的獨立變化具有大自由度。而且，與常規親合色譜不相容的強溶劑化洗脫劑體系現在可實現，使得液體性質具有充足的優化空間，例如溶解力、低成本、低毒性、低廢料產生。與實施本發明相容的液體體系基本上包括對于分離方法的底物，即特別是蛋白質或肽以及優選也針對副產物，具有至少弱溶解性的任何液體或液體混合物，后者對于第二液體特別重要。由于在本發明的吸附劑上的色譜分離通常在生物相容性限制下進行，因此經常使用水性緩沖介質作為第一、第二和第三液體。對于保存蛋白質功能重要的除緩沖液或金屬鹽以外的有機改性劑(例如去污劑、離液添加劑、抗氧化劑、消泡劑)可假設也被添加到液體中，但為了保持待純化的蛋白質或肽具有盡可能高的生物活性，這些試劑最好完全避免。少量易揮發性有機酸可在實際分離過程之前或之后添加，用以提高某些分析物的可檢測性。然而，如果使用其它添加劑，則它們通常都必須隨后即在該方法完成后從在步驟(iii)中得到的含有靶蛋白質或肽的液體中移除，特別是在需要獲得結晶形式的該蛋白質或肽的情況下。為達到這一目的，范圍廣泛的這種潛在額外步驟為本領域技術人員所公知。為了移除添加劑，本發明的方法可因此也隨后與任何其它類型的普通分離過程組合。雖然實際將包括超臨界流體的任何有機或水性液體或液體混合物應用于本發明的吸附劑是可行的，但是優選有利于聚合物膜(如果在固體支承材料表面上存在的話)溶脹的那些極性液體。液體混合物的確切極性可以很容易地通過其組成進行微調。由于被吸附的靶蛋白質或肽(以及副產物)往往不是在本方法的步驟(iii)中瞬間釋放(如開關狀態)，而是相當緩慢和逐步地進行，步驟(iii)本身可有利地逐步進行，即作為分級，用于提高整體分離過程的分辨率。隨后在吸附劑與第三液體接觸足夠長時間后，手動或自動收集相同或不同尺寸的兩種或更多種的體積固定的第三液體的級分。接著，重復步驟(iii)并使吸附劑再次接觸新鮮的第三液體(具有改變的組成，如果有必要的話) 直到所有結合的靶蛋白質或肽被釋放為止。在級分收集過程中，連續供應第三液體也是可實現的。隨后確定每種級分中釋放的靶蛋白質或肽的純度和回收率，只有在品質和經濟性方面滿足預設接受規格的那些級分進行進一步處理，而所有其它級分可被丟棄或回收進入給料。可以采用fronal以及zonal洗脫技術。經常利用梯度洗脫，特別是利用在第二和/第三液體中逐漸增加極性有機溶劑(低級醇、乙腈、丙酮)含量來實現最佳的性能和生產率。但是，如果用于過程色譜或一般制造環境，則為了操作簡單和技術可靠，可優選等度洗脫或簡單梯度形狀如階梯梯度。PH梯度和鹽梯度也可以成功實施。根據吸附劑的特定殘基，就吸附劑的化學穩定性而言對于短持續時間PH值在I和14之間的范圍內，對于連續運行PH值在2和13之間是可能的。相應的最優液體組成也將取決于吸附劑的實際衍生化程度并且必須針對不同情況進行實驗測定。該方法與常規離子交換吸附的明顯區別在于，它也可以特別是應用于分離任務，其中蛋白質或肽不含任何凈離子電荷，即溶解介質的PH非常接近其等電點。雖然由于吸附劑的可質子化含氮殘基和可去質子化含氧殘基的含量使得任何符號的離子電荷均可以增加對本發明吸附劑的結合強度，它們的存在對于成功完成該方法不是強制性的。對于副產物和混合物中的其它組分也是如此。電荷相互作用能夠影響化合物在吸附劑上的吸附或分離的程度也取決于周圍介質的偶極性質和鹽濃度。以上對于相反電荷的吸附劑和分析物的解釋也適用于相同符號的電荷。它們在某些情況下可導致排斥和排除出吸附劑而不是額外的吸引力。該方法還可包括在步驟(iii)之后，從蛋白質或肽已被釋放到其中的第三液體的至少一個級分中分離出蛋白質或肽。在制備應用中，可以從第三液體的溶液中分離出富集的或甚至純粹形式的蛋白質或肽，用于表征和/或后續處理。在最簡單的方法中，它可以從步驟(iii)的液體中通過溫和的溶劑蒸發方法(包括凍干、冷凍干燥)進行回收。然而，溶劑蒸發也會富集來自第三液體的可能含有的低蒸氣壓物質。這種物質可包括添加劑如緩沖鹽或穩定劑或污染物如高沸點溶劑同源物和/或降解產物，其通常在商購品質的溶劑中含有痕量。但是，由于吸附劑具有高物理和化學穩定性，所以在步驟(ii)到步驟(iv)中實際上沒有發生來自固定相的浸出，使得步驟(iii)的釋放的蛋白質或肽通常會包含少于IOppm的浸出吸附劑或其它可從中浸出的物質(即，其成分(聚合物、殘基)或分解產物)。優選的分離方法包括含純化的蛋白質或肽或所述蒸發殘余物的第三液體的結晶步驟，如有必要，重新溶解后進行。在該結晶步驟中，可例如通過改變溫度和/或液體組成來引發的，由于低蒸汽壓污染物通常保持在溶液中并因而易于與靶產物晶體中分離，所以可以實現甚至更高的純化程度。干燥后，晶體往往被準備用于配料和配制過程。如果干貯存是不必要的或不可能的，則作為替代方案可有必要將純化產物轉移到不同組成的溶液，即通過標準操作如透析，離子交換等將第三液體與儲液進行交換。如色譜中通常那樣，運行色譜的方法和相關設備也可有利地輔以合適的檢測技術，該檢測技術允許定性、半定量或定量測量用于清晰和精細分級的洗脫液中的靶蛋白質或肽和/或副產物或混合物的其它組分的濃度。優選的檢測方法包括物理或光譜性質的在線流通池檢測器，如折射計、偏振計、電導計、紫外/可見吸光度或熒光分光計、紅外光譜儀、質譜儀和核磁共振譜儀。在柱前或柱后衍生化或降解單元也可以添加到系統中，以將待分離混合物的所有或特定組分轉化成具有提高的可檢測性的衍生物或片段，或加速或延緩 其洗脫。常用的蛋白質或肽的無損檢測方法是280nm波長下的紫外吸光分光計。在大規模上，吸附劑以及采用該吸附劑的本發明的分離方法可以有利地用于制造人或獸醫使用的藥物或營養組合物(如抗血清或疫苗)，前提是這種組合物包含可與吸附劑結合的具有診斷、治療或營養價值的至少一種蛋白質或肽。本發明的益處主要源于以下事實，即這些應用經常要求有價值的活性成分的純度> 99%或甚至> 99. 9%，這通過常規方法只有在冗長和昂貴的程序下才可實現，這甚至可能使某些應用在經濟性觀點上被禁止。在小規模上，作為替代方案，它們可以用于至少一種蛋白質或肽的識別、表征、定量或實驗室純化。為了這個目的，該目的涉及定性和定量分析，分離方法很可能輔以特定生物測試或通過光譜方法如聯用技術來完成，但也可以通過與純且真實的樣品或肽標準品進行保留體積的比較來完成。在微型規格中，它們可能關注蛋白質的應用，即同時識別或量化多種不同蛋白質在細胞或有機體中的表達水平和修飾。作為醫療設備的一部分，它們還可以用于從生物流體中移除至少一種蛋白質或肽，其包括由于在所述生物流體中存在所述至少一種蛋白質或肽而導致的醫療預防或疾病治療。在其中患者已經攝入或即將攝入有害或傳染性的蛋白質或肽如病原體分泌的所有情況下，而且在患者自身身體產生這種有害或傳染性的蛋白質如在自身免疫性疾病案例中所常見的那些情況下，該設備可應用作為解毒或凈化單元。潛在的攝入源包括食物、水、空氣、接觸受感染的人、輸血等。在一個專門的應用中，該醫療設備可以構造為血液分離置換或血漿分離置換單元。這種設備主要在離體或體外操作，但構建為小型可植入裝置也似乎是可以想到的。患者的生物流體可(連續或間歇地)自患者采集，通過利用吸附劑處理使污染物耗盡，再返回到患者。來自外部來源的生物液體(其它的人、動物)也可以在該流體或其部分或由其制成的組合物被施用于有需要的患者之前利用吸附劑進行處理以減少傳染病的傳播風險。在這種情況下，本發明的分離方法將被用來減少“有價值”級分中的靶蛋白質或肽的濃度/純度(由此提高其中有價值的靶蛋白質或肽的純度)，而其將富集在“廢棄物”級分中。
最后，它們可用于將至少一種蛋白質或肽固定在吸附劑上。由于吸附劑和靶蛋白質或肽之間的相互作用的非共價性質，所以這種固定將是可逆的。在諸如可過濾試劑或催化劑的制備、細胞的表面結合培養、藥物遞送裝置(如藥物洗脫或治療支架)或藥物發現篩選的應用中，這可能是潛在的優勢。在后一種情況下，本發明的分離方法可以輔以其它化學或生物結構與被固定的蛋白質或肽的結合的測試方法。這種次級結合的檢測可以作為任一結合伙伴可能的生理作用的第一指標。如果使用聚合物涂層，則被固定的蛋白質或肽可被周圍的凝膠形成物質物理包埋并因此額外地經歷高生物相容性的環境。在本文所述的吸附劑和至少一種蛋白質或肽之間形成的表達不同且非共價的可分離復合物因而也具體體現在本發明中。這樣的含有抗體的作為本發明優選蛋白質的復合物可用于免疫吸附技術。可從以上說明中立刻得出的本發明的另一目的是一種預填充柱，其在管狀容器內包含本發明的吸附劑。這種柱可以被用作液相色譜或固相萃取應用中的固定所需尺寸(長X直徑)的固定相。除了管狀容器外，該柱可任選地包括其它組件例如玻璃料、濾板、流動分布器、密封件、接頭、螺釘、閥門或其它流體處理或連接元件，其為本技術領域已知的。該吸附劑可作為漿料在重力或離心力作用下、在外部施加的液壓壓力下或在活塞的額外軸向壓縮下填充入所述柱并以該預填充柱規格商用制造。為了增加用戶的便利，因此可確保 更加可重現的填充并且固定相可以在不使用時很容易地貯存并且在色譜系統中快速更換。容器的材料(化學和生物惰性材料如不銹鋼、硼硅玻璃，塑料如PEEK等)通常選擇為不犧牲吸附劑自身的高穩定性，這意味著整個柱應具有的理想特征在于耐受所施加壓力為至多20巴或耐受所施加的熱為至多110°C以及耐受常用消毒方案包括高溫滅菌的物理和化學抗性。在有利的情況下，將實現柱重復使用至多1000次，優選至多5000次，并增加整體經濟性。然而，它也可以是一次性或可焚燒裝置。另一種選擇是只設計廉價且一次性的吸附劑中間管狀殼體并將其放入由長壽命耐用材料制成的第二外殼內，其也包含所有可重復使用的補充組分(藥筒設計)。柱可以是完整色譜系統的一部分。除了上述檢測系統外，色譜系統的其它相關組件包括泵、流量調節器、液體儲庫、脫氣裝置、注射端口、柱切換閥、壓力和流量表、溫控室、出口收集托盤(圓盤傳送帶)和機器人分餾器。本發明的另一目的是多種相同或不同的本發明吸附劑作為松散材料(顆粒或塊(整體)設計)或作為預填充柱或筒(見上文)或膜的集合(或“庫”)，亦即單個吸附劑可能相同或不同。不同吸附劑的集合可用于例如合適的吸附劑的初步篩選，其計劃用于后續更復雜的制備色譜裝置，而相同吸附劑的集合體例如可以用于具有相似基質的大量樣本的多種醫療診斷檢測或半連續過程監測中。這種集合體的優點在于其并行處理能力，無論是手動或自動方式。這種并行處理除了與串行處理相比更高的樣品吞吐量而節省時間外允許在標準的或至少相同(可再現)的條件下比較不同的吸附劑或其它工藝參數的條件。這種優點尤其可用于以標準格式或可位置編碼格式排列的單個集合成員的情況，優選與機器人工作站相兼容的二維矩形網格，例如微孔板陣列或微芯片陣列，或作為多毛細管或微流體裝置。就考慮微型規格的讀出而言，再次參考蛋白質技術。開始于上述制備方法的交聯/接枝步驟的所有中間產物對儲存用于未來使用是足夠穩定的。隨后這種產物可以分成對其用單獨的衍生化試劑實施衍生化步驟的多個子集。以這種方式，可以根據需要形成不同吸附劑(即用不同殘基或它們的組合或以不同殘基比率或不同衍生化程度衍生化的吸附劑)的庫。如果衍生化步驟在全部子集上并行實施，則容易在短時間形成這種庫以便對用于給定應用最好的吸附劑實施初步篩查，這允許快速反應來改變分離目的。除了不同的衍生化，在吸附劑庫的形成中還可以應用不同固體支承材料包括不同聚合物膜、載體和/或活化化學的可能性。隨機或靶向庫篩選是有時可以補充或甚至替代理性的吸附劑設計的手段。它尤其用在來自于吸附劑上的不同殘基和/或靶蛋白質或肽上的對應物的貢獻的相對重要性不明顯的情況，前提是缺少結構信息或應用額外嚴格的邊界，例如關于相容性液相的選擇。針對給定分離對象的該庫的篩選可以采取連續或全庫并行或其一個或多個子集并行測量表征特定吸附劑性能(親合力、選擇性、容量、回收、穩定性等)的一個或多個參數方式實施。最突出的特征是針對形成在吸附劑和蛋白質或肽靶之間的復合物的與親合力和選擇性相關的熱力學和動力學參數。適合引入庫中的吸附劑的預選擇可以采取計算方法進行。一種可行的篩選方法例如包括在合適的間歇條件下利用相應的本發明吸附劑處理的含有至少一種蛋白質或肽以及副產物和/或化合物的其它組分的混合物，并且測量在吸附劑和靶蛋白質或肽之間形成的復合物的單個平衡吉布斯焓。另一種替代方法包括一方 面測量吸附劑與靶蛋白質或肽的復合物形成之間的差示吉布斯焓，另一方面測量吸附劑與適當選擇的副產物的復合物形成之間的差示吉布斯焓。測量可以利用本領域技術人員已知的所有熱力學/動力學方法直接進行，例如量熱法。測量也可以利用對瞬態形成該復合物的設想應用的類工程條件下的色譜運行來間接進行，由此得到的結果可能對洗脫液的貢獻進行校正。在色譜環境中，k’和a值可以在一級近似下分別用作吉布斯焓或差分吉布斯焓的指標。本發明的另一目的是一種診斷或實驗室純化試劑盒，除了本發明的吸附劑(或吸附劑集合或含有吸附劑的柱)外，在同一封裝單元中它還包括一組其它(或甚至全部)生物或化學試劑和/或實施本發明的分離方法或其中可采用上述吸附劑的不同的分析、診斷或實驗室方法所必需的一次性用品。具有正確的數目、量或濃度的材料的預填充集合旨在增加用戶的便利性，前提是在實施分離方法時必須遵循標準化實驗方案，特別是吸附劑或柱作為一次性裝置使用。上述方案可與安全性數據表等一起引入用戶指南中，該指南可任選伴隨上述試劑盒。
圖I :由用一個第一殘基和一個第二殘基衍生化的兩個相鄰表面官能團(FG)的所得的不同的個體構型A-H和一個通用表示I。圖2 :包括載體的固體支承材料的不同示意性形態A-C，在載體表面上覆蓋有聚合物膜(在此例示出繪制為灰球的無孔顆粒載體;圭按比例繪制)。圖3 :包含其氫原子被取代的吡啶環的第一殘基的可能取代模式的選擇。圖4 :用于表征分析物相互作用的吸附劑表面的術語的象征性示意圖(未按比例繪制)。并不是所有示出的項目都是實施本發明所必需的。圖5 :根據本發明的包含聚合物的吸附劑的象征性示意圖，所述聚合物為聚乙烯基胺，其被如所述附圖中限定的第一殘基和第二殘基部分衍生化，其中I、m和n表示彼此獨立的數字，分別指示重復單元。實施例材料與方法對于所有的色譜試驗，將吸附劑用于40X4毫米的實際柱床尺寸(實施例2)的標準不銹鋼HPLC柱或250X16毫米的實際柱床尺寸(實施例3)的G6tec玻璃柱中。通過水-甲醇(I I)懸浮液在20巴的壓力下流動沉淀來填充所述柱。Dionex (原Gynkotek)的HPLC系統包括四通道低壓梯度泵(LPG 580，LPG 680或LPG 3400)、自動采樣器(Gina 50，ASI-100或WPS-300)、6通道柱切換閥(Besta)、柱溫箱和二極管陣列紫外檢測器(UVD 170U，UVD 340S或VWD 3400)。對于制備運行，可使用入ktaPurifier 10 (GE Healthcare)單兀。免疫球蛋白G (Octapharma (Gammanorm ),來源人血衆)具有144kDa的分子量和
6.4的等電點PI。人血清白蛋白(Octapharma(Octalbin ]。1^溶液)，來源人血衆)具有 66kDa的分子量和4. 6的等電點PI。使用的所有其它試劑具有標準實驗室等級品質。實施例I :吸附劑的制備首先將商業聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物球狀樹脂珠(Rohm & Haas Company Amberchrom CG1000S)在濃硫酸中過度磺化,然后在該多孔珠上吸附商業聚乙烯基胺-聚乙烯基甲酰胺共聚物溶液(BASF Lupamin )并且利用二環氧化物進行輕度化學交聯。對于含有約0. 35mmol/ml至約0. 45mmol/ml的游離氨基并在二甲基甲酰胺中預溶脹的該未衍生化的中間體，通過標準固相酰胺偶聯方案，將相對于衍生化靶向程度對應的預定量略微過量的原位活化的異煙酸偶聯至氨基。在第二步驟中，將也略微過量的琥珀酸酐添加到相懸浮液中以獲得酰胺基連接羧酸的特定等級的衍生化。該吸附劑經洗去過量的試劑并干燥至恒重。在每個衍生化步驟后，通過水解斷裂和利用HPLC定量分析裂解殘基來確定衍生度。衍生度定義為裂解基團相比于未衍生化中間體的可測量氨基量的比例。根據該一般程序，制備表I所列的吸附劑。衍生化精確度為約±2%。合并取代程度與100%之間的差等于殘余氨基的含量。實施例2 :含IgG和HAS的標準化測試混合物的色譜分析將125 ii L的商業可得的人免疫球蛋白(IgG)和人血清白蛋白(HSA)的混合物以5 I的比例注射到所述柱上。這涉及的負載量為7. 2mg總蛋白質/mL吸附材料，分別為每mL吸附劑負載約6mg/mL的IgG和I. 2mg/mL的HSA。對未與吸附劑結合的蛋白質的比例進行收集(流動物(flow))并通過凝膠滲透色譜法進行分析和量化。利用標準化的IgG和HSA，可確認在流動物中存在HSA (部分未能結合)，相應地不存在(結合)IgG。通過凝膠滲透色譜柱上的HSA校正功能，可以確認在流動物中沒有結合的HSA。在所有測試的吸附劑中，IgG均完全結合。HSA在流動物中量化為50至90%的進料量。在表I中，該分析中發現的兩種蛋白質的量和比例的數據與相應的吸附劑的結構組成相反。表I :實施例I和2的結果
權利要求
1.一種包括固體支承材料的吸附劑，所述吸附劑的表面包含第一殘基和第二殘基，其中所述第一殘基包括吡啶環(-C5H4N)并且所述吡啶環的氫原子可被取代，所述第二殘基包括羧基(-COOH)。
2.根據權利要求I所述的吸附劑，其中所述第一殘基和/或第二殘基通過長度在I和20個原子之間的共價鍵合的連接部分結合到所述表面。
3.根據權利要求2所述的吸附劑，其中所述連接部分是構象柔性的。
4.根據前述權利要求中任一項所述的吸附劑，其中所述第一殘基為具有式I結構的吡啶-4-酰胺(異煙酰胺)殘基，并且所述第二殘基為具有式II結構的3-酰胺丙酸(琥珀酸單酰胺)殘基，其中這兩個殘基均通過如式I和II中所示的其酰胺基團結合至所述固體支承材料的表面。
5.根據前述權利要求中任一項所述的吸附劑，其中所述固體支承材料的表面還包含第三殘基和任選的第四殘基。
6.根據權利要求5所述的吸附劑，其中所述第三殘基包括胺或酰胺結構，優選伯胺結構。
7.根據前述權利要求中任一項所述的吸附劑，其中所述第一殘基和第二殘基的含量摩爾百分數為2511101%和7511101%之間的第一殘基和在2011101%和60mol %之間的第二殘基，其中所述摩爾百分數之和為100%,優選以25mol%至60mol%的第一殘基和2011101%至5OmoI %的第二殘基存在，更優選以25mol %至40mol %的第一殘基和20mol %至30mol %的第二殘基存在。
8.根據前述權利要求中任一項所述的吸附劑，其中所述固體支承材料包括載體，所述載體的表面上覆有具有官能團的聚合物膜，所述官能團至少部分地被所述第一殘基和第二 殘基以及任選的所述第三殘基和第四殘基取代。
9.根據權利要求8所述的吸附劑，其中所述載體為聚苯乙烯磺酸酯或包括聚苯乙烯磺酸酯。
10.根據權利要求8或9所述的吸附劑，其中所述聚合物包含彼此共價交聯的單個鏈，但是所述鏈沒有共價接枝到所述載體的表面。
11.根據權利要求8或10中任一項所述的吸附劑，其中所述聚合物是部分衍生化的聚胺，所述聚胺優選為聚乙烯基胺，或含有聚胺的任何部分衍生化的共聚物或聚合物共混物。
12.根據權利要求11所述的吸附劑，其中所述聚合物為被具有如權利要求4中所限定的式I和II的所述第一和第二殘基取代的聚乙烯基胺，其中所述式中的NH基團來自所述聚乙烯基胺。
13.一種制備根據權利要求8 12中任一項所述的吸附劑的方法，所述方法包括 (i)提供具有官能團的聚合物； (ii)將所述聚合物的膜吸附到載體的表面上； (iii)利用至少一種交聯劑交聯被吸附的聚合物的所述官能團的限定部分； (iv)利用包括其氫原子可被取代的吡啶環(-C5H4N)的第一殘基和包括羧基(-COOH)的第二殘基以及任選的其它殘基來衍生化被交聯的聚合物的所述官能團的其它限定部分。
14.一種從含有蛋白質或肽的混合物中分離所述蛋白質或肽或增加所述蛋白質或肽的濃度和/或純度的方法，所述方法包括 (i)使溶解或懸浮在第一液體中的所述混合物與根據權利要求I 12中任一項所述的吸附劑或與根據權利要求13所述制備的吸附劑接觸，并持續足以使所述蛋白質或肽能夠結合至所述吸附劑的時間段； (ii)任選地使用第二液體沖洗所述吸附劑； (iii)使含有所述結合的蛋白質或肽的所述吸附劑與第三液體接觸，并持續足以使所述蛋白質或肽能夠從所述吸附劑上釋放的時間段； (iv)任選地利用第四和/或第五液體洗滌和/或再生所述吸附劑。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述第三液體的pH接近于待分離的所述蛋白質或肽的等電點PI。
16.根據權利要求14或15所述的方法，其中所述第一液體的pH在從4.O到6. O的范圍內，并且所述第三液體的PH在從6. 5到8. 5的范圍內。
17.根據權利要求14 16中任一項所述的方法，其中所述蛋白質或肽具有從4.5到8. 5的等電點PI和從IOODa到500000Da的分子量。
18.根據權利要求14 17中任一項所述的方法，其中所述蛋白質或肽為天然抗體(特別是免疫球蛋白G)、來源于天然抗體的片段或寡聚締合物、基因工程抗體、或含抗體或抗體片段的融合蛋白質。
19.根據權利要求14 18中任一項所述的方法，其中含有所述蛋白質或肽的所述混合物為人血或來源于人血的中間物或最終產物，特別是血漿或通過血漿分級法得到的任何蛋白質的沉淀物。
全文摘要
一種吸附劑，包括固體支承材料，所述固體支承材料的表面包括具有其氫原子可被取代的吡啶環的第一殘基和具有羧基的第二殘基。
文檔編號B01J20/32GK102811805SQ201080057914
公開日2012年12月5日 申請日期2010年12月17日 優先權日2009年12月17日
發明者克勞斯·戈特沙爾, 馬庫斯·阿倫特, 安德列亞斯·基施費爾德, 克里斯蒂安·邁耶, 馬庫斯·韋斯, 馬丁·維爾特, 洛塔爾·齊澤 申請人:尹思琪愛克什有限公司