分離方法

專利名稱：分離方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從樣品溶液中選擇性地分離磷脂的方法。
背景技術：
磷脂是在其構造中具有磷酸酯部位的脂質(zhì)，由其具有兩親性形成脂質(zhì)雙層。因此， 磷脂除了與糖脂和膽固醇一起成為細胞膜的主要構成成分以外，還成為生物體內(nèi)與信號傳遞相關的成分。因而，利用其相關的性質(zhì)，已經(jīng)有人研究將磷脂用于補充劑以及化妝品的有效成分，或藥物傳遞系統(tǒng)(DDS)，其使用用途正在擴大。這樣的磷脂在卵黃或大豆等中含量很多。近年，在尋求一種更有效地從其中分離 /精制磷脂的方法。作為其分離方法，柱色譜法被關注。例如，嘗試使用硅膠色譜法分離/ 精制磷脂(例如，參見非專利文獻1)。然而，在硅膠色譜法中，硅膠載體表面的官能團、以及載體表面殘留的硅醇基可能對磷脂的吸附/洗脫產(chǎn)生不好的影響。另外，通常使用的洗脫液是氯仿、甲醇以及己烷等的混合物，其制備復雜。而且，由于磷脂對硅膠載體的吸附強，為了除去吸附的磷脂而洗凈柱有困難。因而，具有硅膠載體重復使用困難的問題。所以，作為硅膠色譜法的取代方法，也研究了使用羥磷灰石色譜法?？墒?，實際上對使磷脂吸附于由羥磷灰石構成的填充劑(載體)的方法、使吸附的磷脂洗脫于洗出液中的方法、進一步地，檢測出洗出液中洗脫的磷脂的方法等還沒有被充分地進行研究。現(xiàn)有技術文獻非專利文獻非專利文獻1 伊原博隆，「高分子被覆〉'J力O機能設計i高選択性O発現(xiàn)」，第 14回吸著力 > 水?！鄙譑熊本。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概要發(fā)明要解決的課題本發(fā)明的目的是提供通過簡單的操作，從含有磷脂的樣品溶液中選擇性地分離得到磷脂的分離方法。解決課題的方法通過下述的(I)-(Il)記載的本發(fā)明實現(xiàn)這樣的目的。(1)從含有磷脂的樣品溶液中選擇性地分離上述磷脂的分離方法，其特征在于所述分離方法具有以下工序使鈣離子吸附于至少表面由磷酸鈣類化合物構成的填充劑上的鈣離子吸附工序; 和向填充空間中填充有上述填充劑構成的裝置內(nèi)供給上述樣品溶液的供給工序；和
向上述裝置的上述填充空間內(nèi)供給有機溶劑類的洗脫液，獲得從上述裝置內(nèi)流出的洗出液的工序；和以每個確定的量分級分離上述洗出液，在該被分級分離的各分離組分的上述洗出液中，分離上述磷脂的分級分離工序。由此，能夠通過簡單地操作，從含有磷脂的樣品溶液中選擇性地分離磷脂。(2)根據(jù)上述(1)中所述的分離方法，其中通過含有上述鈣離子的鈣含有液與上述填充劑接觸進行上述鈣離子吸附工序。根據(jù)相關的方法，通過向上述裝置內(nèi)供給鈣含有液的簡單地操作，能夠確實地使鈣離子吸附于填充劑。(3)根據(jù)上述O)中所述的分離方法，其中上述鈣含有液包括氯化鈣水溶液。由此，對磷酸鈣類化合物沒有不好的影響，能夠確實地使鈣離子吸附。(4)根據(jù)上述(1)至( 任一項所述的分離方法，其中上述磷脂含有形成脂質(zhì)體的磷脂脂質(zhì)體。由此，在向上述裝置內(nèi)供給樣品溶液時，由于磷脂所具有的磷酸基成為露出于脂質(zhì)體外側(cè)的狀態(tài)，因此作為磷脂脂質(zhì)體存在的磷脂能夠被確實地吸附于填充劑。(5)根據(jù)上述(1)至(4)任一項所述的分離方法，其中獲得上述洗出液的工序中， 上述洗脫液含有異丙醇。由此，在能夠確實地從填充劑洗脫出填充劑上吸附的磷脂的同時，還能夠確實地使磷脂以與其以外的雜質(zhì)呈分離的狀態(tài)被洗脫至各分級分離組分內(nèi)。(6)根據(jù)上述(5)中所述的分離方法，其中在獲得上述洗出液的工序中，上述洗脫液是上述異丙醇的含量從0至80%增加的線性梯度溶液。由此，能夠?qū)⒘字耘c磷脂以外的雜質(zhì)呈分離的狀態(tài)更加確實地洗脫至各分級分離組分內(nèi)。(7)根據(jù)上述(1)至(4)任一項所述的分離方法，其中獲得上述洗出液的工序中， 上述洗脫液的流速是0. 1至IOmL/分鐘。通過以這樣的流速，進行磷脂的分離，分離操作中不需要長的時間，而能夠確實地分離作為目標的磷脂，即，能夠得到高純度的磷脂。(8)根據(jù)上述(1)至(7)任一項所述的分離方法，其中在上述分級分離工序中，通過觀察上述各分離組分的190至230nm波長的吸光度檢測出上述磷脂。由于相關范圍的波長是能夠識別磷脂中所含磷酸基引起的吸收的范圍，通過觀察相關范圍的波長中的吸光度，能夠確實地檢測出洗出液中的磷脂。(9)根據(jù)上述(8)中所述的分離方法，其進一步具有預先獲得上述洗脫液的吸光度的工序，在上述分級分離工序中，從觀察到的上述各分離組分的吸光度中減去上述預先獲得的上述洗脫液的上述吸光度而檢測出上述磷脂。由此，可以抵消由洗脫液引起的吸光度。S卩，由于可以去除由洗脫液引起的干擾， 因此能夠以較高的靈敏度檢測出洗出液中的磷脂。(10)根據(jù)上述(1)至(9)任一項所述的分離方法，其中上述磷酸鈣類化合物是以羥磷灰石為主要成分的物質(zhì)。由于羥磷灰石，特別地與構成生物體的成分接近，因此在吸附、分離磷脂時，可適當?shù)胤乐勾肆字冑|(zhì)(變性)。(11)根據(jù)上述(1)至(10)任一項所述的分離方法，其進一步具有預先制備上述裝置的工序。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，將樣品溶液中含有的磷脂吸附于填充劑，進一步，由于能夠選擇性地將吸附的磷脂洗脫于洗出液中，因此能夠從含有磷脂的樣品溶液中高純度地分離磷脂。而且，通過適當?shù)卦O定含有磷脂的洗出液的觀察條件，能夠高靈敏度地檢測出洗出液中的磷脂。


[圖1]圖1是表示本發(fā)明中使用的吸附裝置的一個例子的縱剖面圖。[圖2]圖2表示卵磷脂脂質(zhì)體含有液中包含的卵磷脂脂質(zhì)體的粒度分布的頻率分布曲線。[圖3]圖3是向吸附裝置供給含有磷脂的樣品溶液后，使用其洗出液得到的吸光度曲線。[圖4]圖4是向吸附裝置供給含有磷脂的樣品溶液后，使用其洗出液得到的吸光度曲線。[圖5]圖5是表示使用具有吸附磷脂脂質(zhì)體的填充劑的吸附裝置，使4STD樣品中含有的蛋白質(zhì)處于分離狀態(tài)的吸光度曲線。[圖6]圖6是表示使用具有用各種溶劑洗滌后的填充劑的吸附裝置，使4STD試料中含有的蛋白質(zhì)處于分離狀態(tài)的吸光度曲線。[圖7]圖7是表示用各種溶劑洗滌后在填充劑中殘留的殘留有機物的量的圖。[圖8]圖8是表示使用吸附裝置，使樣品溶液中含有的卵磷脂處于分離狀態(tài)的吸光度曲線。[圖9]圖9是表示使用吸附裝置，使樣品溶液中含有的卵磷脂處于分離狀態(tài)的吸光度曲線。[圖10]圖10是表示使用吸附裝置，使樣品溶液中含有的卵黃來源的磷脂處于分離狀態(tài)的吸光度曲線。[圖11]圖11是表示使用吸附裝置，使樣品溶液中含有的紅細胞膜來源的磷脂處于分離狀態(tài)的吸光度曲線。[圖12]圖12是表示使用吸附裝置，使樣品溶液中含有的內(nèi)毒素處于分離狀態(tài)的吸光度曲線。
具體實施例方式下面，根據(jù)附圖中表示的優(yōu)選的實施方式詳細地說明本發(fā)明的分離方法。首先，為了說明本發(fā)明的分離方法，首先，說明書本發(fā)明使用的吸附裝置分離裝置的一個例子。圖1是表示本發(fā)明中使用的吸附裝置的一個例子的縱剖面圖。另外，在以下的說明中，圖1中的上側(cè)稱為[流入側(cè)]、下側(cè)稱為[流出側(cè)]。
此處，流入側(cè)為在分離(精制)目標磷脂時，向吸附裝置內(nèi)供給例如，樣品溶液 (含有樣品的液體)、有機溶劑類的洗脫液等液體的一側(cè)。另一方面，流出側(cè)為與上述流入側(cè)相反的一側(cè)，即，上述液體作為洗出液從吸附裝置內(nèi)流出的一側(cè)。另外，下面，說明使用吸附裝置1，從來源于卵黃的樣品中選擇性地分離其中所含的磷脂的情況。圖1所示的從樣品溶液中分離磷脂的吸附裝置1具有柱2、粒狀填充劑(吸附劑)3、以及2張過濾構件4、5。柱2由柱本體21、分別安裝在柱本體21的流入側(cè)端及流出側(cè)端上的蓋(蓋體)22 和23構成。柱本體21例如由圓筒狀的構件構成。構成含有柱本體21的柱2的各個部分(各個構件)的構成材料例舉為，例如各種玻璃材料、各種樹脂材料、各種金屬材料、各種陶瓷材料等。在柱本體21中，為了分別塞住其流入側(cè)開口和流出側(cè)開口，配置了過濾構件4、5， 在此狀態(tài)下，在其流入側(cè)端和流出側(cè)端分別通過螺釘安裝了蓋22和23。在這樣構成的柱2中，通過柱本體21和各個過濾構件4、5劃分出填充劑的填充空間20。于是，此填充劑的填充空間20的至少一部分(本實施方式中基本上全部)填充填充劑3。根據(jù)樣品溶液的體積適當?shù)卦O定填充劑的填充空間20的容積，盡管沒有特別的限定，但是相對于ImL樣品溶液，優(yōu)選為大約0. 1 lOOmL，更優(yōu)選為大約1 50mL。如上所述設定填充劑的填充空間20的尺寸，且根據(jù)如下所述設定后面所述的填充劑3的尺寸，根據(jù)以上設定可以從樣品溶液中選擇性地分離(精制)目標磷脂。S卩，可以確實地將磷脂與樣品溶液中所含的磷脂以外的雜質(zhì)分離。而且，在柱本體21中安裝有各個蓋22和23的狀態(tài)下，為了保證其之間的液體密閉性而構成柱2。在這些蓋22和23的基本上中間，分別液體密封地固定有流入管M和流出管25。 經(jīng)由此流入管M以及過濾構件4向填充劑3中供給上述樣品溶液(液體)。而且，向填充劑3供給的樣品溶液流經(jīng)填充劑3的填充劑間(間隙)，經(jīng)由過濾構件5和流出管25，向柱 2外流出。此時，如后面詳述，根據(jù)其對吸附有鈣離子的填充劑3的吸附性的不同以及其對有機溶劑類洗脫液的親和性的不同，分離樣品溶液(樣品)中含有的磷脂與磷脂以外的雜質(zhì)。各過濾構件4和5是分別具有防止填充劑3從填充劑的填充空間20流出的功能的物質(zhì)。這些過濾構件4和5分別由例如以下物質(zhì)構成，聚氨酯、聚乙烯醇、聚丙烯、聚醚聚酰胺、聚對苯二甲酸乙酯、聚對苯二甲酸丁酯等合成樹脂形成的無紡纖維、膨脹體(具有連通孔的海綿狀多孔體)、針織纖維、網(wǎng)等。填充劑3，至少其表面由磷酸鈣類化合物構成。如后面詳述，相關的填充劑3中吸附鈣離子。吸附此鈣離子的填充劑3中，磷脂由其固有的吸附(負載)力被特異地吸附。于是，根據(jù)磷脂的吸附力與磷脂以外的雜質(zhì)的吸附力的差異，將磷脂與磷脂以外的雜質(zhì)分離、 精制。作為磷酸鈣類化合物，沒有特別地限制，可以舉例為，例如羥磷灰石(Ca10 (PO4) 6 (OH) 2)、TCP (Ca3 (PO4) 2)、Ca2P2O7, Ca (PO3) 2、DCPD (CaHPO4 · 2H20)、Ca4O (PO4) 2、或其一部分被其他原子或原子團置換的物質(zhì)等，這些物質(zhì)中的一種或2種以上可以組合使用。其中，磷酸鈣類化合物優(yōu)選以羥磷灰石為主要成分。特別地，由于羥磷灰石與構成生物體的成分接近，在吸附、分離磷脂時，能夠適當?shù)胤乐乖摿字冑|(zhì)(變性)。另外，如圖1所示，上述填充劑3的形態(tài)(形狀)，雖然優(yōu)選為粒狀(顆粒狀)、但也可以是其他形狀，如小球狀(小塊狀)、塊狀(例如，相鄰空孔之間互相聯(lián)通的多孔體、蜂巢形狀)等。另外，通過使填充劑3形成粒狀，能夠增加其表面積，能夠謀求磷脂的分離特性的提高。粒狀填充劑3的平均粒徑，沒有特別地限制，優(yōu)選大約0. 5 150 μ m、更優(yōu)選大約 10 80 μ m。通過使用這樣的平均粒徑的填充劑3，將確實地防止上述過濾構件5的網(wǎng)眼堵塞，同時能夠充分地確保填充劑3的表面積。另外，填充劑3可以是其全部均由磷酸鈣類化合物構成，也可以是載體(基體)的表面由磷酸鈣類化合物覆蓋，但是，優(yōu)選其全部均由磷酸鈣類化合物構成。由此，能夠進一步提高填充劑3的強度，能夠得到分離大量磷脂的合適的柱2。另外，其全部均由磷酸鈣類化合物構成的填充劑3，可以通過如下方式得到，例如， 使用濕式合成法或干式合成法，得到磷酸鈣類化合物粒子(初級粒子)，通過干燥或造粒含有相關磷酸鈣類化合物粒子的漿體，得到干燥粒子，進一步，燒制干燥粒子等。另一方面，可通過例如，向樹脂等構成的載體上，沖擊(雜合)上述干燥粒子等方法，得到載體表面被覆磷酸鈣類化合物的填充劑3。另外，如本實施方式，在向填充劑的填充空間20基本上全部地填充填充劑3的情況下，優(yōu)選在填充劑的填充空間20的各部分中，填充劑3基本上由同樣的組成構成。由此， 吸附裝置1的磷脂分離(精制)能力特別地出色。另外，也可以在填充劑的填充空間20的一部分(例如流入管M側(cè)的一部分)中填充填充劑3，在其他部分中填充其他的填充劑。下面，說明使用這樣的吸附裝置1的磷脂的分離方法(本發(fā)明的分離方法)。[1]樣品溶液的制備工序首先，準備作為樣品的卵黃，例如，制備提取該卵黃中含有的總脂質(zhì)的樣品溶液。作為從卵黃提取總脂質(zhì)的方法，沒有特別的限制，適當?shù)乜梢允褂脩糜袡C溶劑的各種提取方法，例如，舉例為使用氯仿和甲醇的Bligh-Dyer法或R)lch法等。此處，總脂質(zhì)中含有單純脂質(zhì)和復合脂質(zhì)，進一步，復合脂質(zhì)中含有磷脂和糖脂。那么，在本實施方式中準備的卵黃中，作為磷脂，包含磷脂酰膽堿(卵磷脂)、溶血磷脂膽堿、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、磷脂酰肌醇、縮醛磷脂等。通過使用吸附裝置1的磷脂的分離方法，從含有總脂質(zhì)的樣品溶液中分離(分離)這些磷脂。另外，雖然向吸附裝置1供給的樣品溶液，只要包含從卵黃提取的磷脂，無論怎樣生成都可以，但本發(fā)明樣品溶液中的磷脂優(yōu)選含有形成脂質(zhì)體的磷脂脂質(zhì)體。由此，在后面的工序[3]中，在向吸附裝置1中供給樣品溶液時，磷脂所具有的磷酸基處于向脂質(zhì)體外側(cè)暴露的狀態(tài)。即，磷脂所具有的疏水性脂肪酸酯部位相互集合形成球狀的集合體，磷脂所具有的親水性磷酸基處于暴露的狀態(tài)。因此，使作為磷脂脂質(zhì)體存在的磷脂能夠確實地吸附于填充劑3。
可以通過例如，向含有從卵黃提取的總脂質(zhì)的提取液中添加水、并劇烈地攪拌而得到含有這樣的磷脂脂質(zhì)體的樣品溶液。另外，樣品溶液中包含的磷脂脂質(zhì)體的平均粒徑，沒有特別的限制，優(yōu)選大約 10 lOOOnm、更優(yōu)選大約50 200nm。在向吸附裝置1內(nèi)供給樣品溶液時，平均粒徑在上述范圍內(nèi)的磷脂脂質(zhì)體能夠確實地吸附于填充劑3而得到的物質(zhì)。[2]鈣離子吸附工序下面，使填充劑3上吸附鈣離子。此處，磷脂具有甘油或神經(jīng)鞘氨醇作為中心骨架，具有在這些骨架上結(jié)合脂肪酸和磷酸的結(jié)構。而且，在磷酸中具有醇與酯結(jié)合的結(jié)構。在相關構造的磷脂中，磷酸的3個羥基中的2個分別與中心骨架及醇結(jié)合，剩余的1個通過電離形成帶負電的磷酸位點。另外，填充劑3的磷酸鈣類化合物使用以Caltl(PO4)3X2表示的，Ca/P的比值為 1. O 2. O的物質(zhì)。此磷酸鈣類化合物具有帶正電的鈣離子(鈣位點)和帶負電的磷酸基 (磷酸位點)高密度規(guī)則地排列的結(jié)構，具有基于作為兩性離子交換體的靜電相互作用的吸附能力。因此，磷酸鈣類化合物基于鈣位點中的靜電相互作用，對具有磷酸位點的磷脂發(fā)揮吸附能力。另一方面，對于磷酸位點，由于磷脂的磷酸位點和磷酸鈣類化合物的磷酸位點都帶有負電，發(fā)生相互排斥。這樣，磷酸鈣類化合物吸附帶負電的磷脂時，由于該磷酸鈣類化合物基于其作為帶有正電和負電兩者的兩性離子交換體的靜電相互作用而具有吸附能力，所以磷脂不能被填充劑3充分吸附。對此，在本發(fā)明中，由于填充劑3中吸附了鈣離子，磷酸鈣類化合物具有的磷酸位點與鈣離子結(jié)合。因為如此，在填充劑3中鈣位點增加，且，磷酸位點減少。其結(jié)果，帶負電的磷脂的填充劑3的吸附能力更加增加。另外，雖然磷酸鈣類化合物優(yōu)選實質(zhì)上所有的磷酸位點上結(jié)合鈣離子，但至少填充劑3的外表面的磷酸位點上結(jié)合鈣離子也可以。填充劑3外表面上磷酸位點與鈣離子結(jié)合的比率，優(yōu)選大約5 100%、更優(yōu)選大約10 100%、進一步優(yōu)選大約20 100%。填充磷酸鈣類化合物的吸附裝置1的填充劑的填充空間20中，流出磷酸位點中吸附的蛋白質(zhì)，可通過此蛋白質(zhì)的吸附量判斷鈣離子對磷酸位點的結(jié)合比率。磷酸位點中鈣離子100% 結(jié)合的情況中，磷酸位點中吸附的蛋白質(zhì)順利通過填充劑的充填空間20而沒有停頓。作為填充劑3中吸附鈣離子的方法，沒有特別的限定，但是例如，可舉例為使含有鈣離子的鈣含有液與填充劑3接觸的方法。通過相關的方法，使鈣含有液與填充劑3接觸， 即，通過向吸附裝置1供給鈣含有液的簡單的操作，能夠確實地使填充劑3吸附鈣離子。另外，作為鈣含有液，沒有特別的限定，但是例如，可舉例為氯化鈣水溶液、乳酸鈣水溶液以及硝酸鈣水溶液等，其中，優(yōu)選氯化鈣水溶液。如果使用上述水溶液，則對磷酸鈣類化合物沒有不好的影響，能夠?qū)⑩}離子確實地吸附于磷酸鈣化合物的磷酸位點。在氯化鈣水溶液中的氯化鈣含量沒有特別的限定，但是優(yōu)選大約0. 5 10mM，更優(yōu)選大約1 3mM。另外，氯化鈣水溶液的PH值沒有特別的限定，但是優(yōu)選大約5. O 9. O、更優(yōu)選大約 6. O 8. O。如果根據(jù)上面所述的設定氯化鈣水溶液的條件，則能夠被確實地將氯化鈣水溶液中含有的鈣離子吸附于填充劑3。[3]供給工序接下來，將上述工序[1]中制備的樣品溶液經(jīng)由流入管M及過濾構件4供給于填充劑的填充空間20的填充劑3。于是，通過使樣品溶液通過柱2 (吸附裝置1)內(nèi)，使其與在上述工序[2]中吸附鈣離子的填充劑3接觸。此處，本發(fā)明中，如上述工序[2]所說明的，由于填充劑3上吸附了鈣離子，對吸附鈣離子的填充劑3具有高吸附能力的磷脂、或吸附能力比較高的磷脂以外的雜質(zhì)(例如，單純脂質(zhì)或糖脂)，保留于柱2內(nèi)。于是，對填充劑3的吸附能力低的雜質(zhì)，經(jīng)由過濾構件5和流出管25從柱2內(nèi)流出。[4]分級分離工序接下來，從流入管M向柱2內(nèi)供給為了洗脫磷脂的有機溶劑類的洗脫液。之后， 以每個確定的量分級分離(采集)從柱2經(jīng)由流出管25流出的洗出液。這樣，在本發(fā)明中，作為使磷脂洗脫的洗脫液，使用有機溶劑類的洗脫液。如果使用上述有機溶劑類的溶劑，通過本發(fā)明人的研究，知道能夠確實地使對吸附鈣離子的填充劑3以高吸附能力吸附的磷脂洗脫于洗脫液中而獲得。因此，通過適當?shù)卦O定有機溶劑類洗脫液的種類、洗脫液中有機溶劑的含量等，根據(jù)這些化合物(磷脂或雜質(zhì))分別具有的對填充劑3的吸附能力的差別，能夠在各個分離組分中回收(分離)填充劑3上吸附的來源于卵黃的磷脂以及其以外的雜質(zhì)。作為有機溶劑類的洗脫液，適合地使用含有水溶性有機溶劑的水溶液。另外，作為水溶性的有機溶劑，沒有特別的限定，例如，可舉例為，異丙醇、丁醇、乙腈、吡啶以及N， N-二甲基甲酰胺等，可以使用其中的1種或2種以上的組合。其中，優(yōu)選使用異丙醇。由此，可以從填充劑3確實地洗脫出填充劑3上吸附的磷脂，同時，能夠確實地在各個分級分離組分中洗脫出與磷脂以外的雜質(zhì)處于分離狀態(tài)的磷脂。另外，作為水溶性的有機溶劑，使用異丙醇的情況下，作為洗脫液，優(yōu)選使用洗脫液中的異丙醇含量遞增的線性梯度溶液。此種情況下，優(yōu)選使用異丙醇含量從O至80%增加的線性梯度溶液。由此，能夠在各個分級分離組分內(nèi)更確實地以與磷脂外雜質(zhì)呈分離狀態(tài)洗脫出磷脂。洗脫液的pH值沒有特別的限定，優(yōu)選大約6 8，更優(yōu)選大約6. 5 7. 5。由此， 能夠防止分離磷脂的變質(zhì)(變成)，并能夠防止其特性改變。另外，可以適當?shù)胤乐固畛鋭?3的變質(zhì)(溶解等)，能夠防止吸附裝置1分離能力的變化。該洗脫液的溫度也沒有特別的限定，優(yōu)選大約30 50°C，更優(yōu)選大約35 45°C。 由此，可以防止分離磷脂的變質(zhì)(變成)。從而，通過使用上述pH范圍和溫度范圍的洗脫液，能夠謀求目標磷脂的回收率的增加。而且，洗脫液的流速優(yōu)選大約0. 1 IOmL/分，更優(yōu)選大約1 5mL/分。在這樣的流速下，通過進行磷脂的分離，分離操作中不需要長的時間，而能夠確實地分離目標磷脂。 即，能夠得到高純度的磷脂。另外，哪一個分級分離組分中洗脫出磷脂的驗證，S卩，各分級分離組分中磷脂的檢測可以使用任何方法，但優(yōu)選通過觀察各分級分離組分中的洗出液的吸光度進行。由此，通過經(jīng)時觀察各分級分離組分中洗出液的吸光度的比較簡單操作，能夠知道哪一個分級分離組分中洗脫出了磷脂。在通過觀察各分級分離組分中洗出液的吸光度進行各分級分離組分中磷脂的檢測的情況下，檢測波長優(yōu)選為大約190 230nm、更優(yōu)選為200 210nm。由于上述范圍的波長是能夠確認磷脂中含有的磷酸基引起的吸收的范圍，因此通過在上述范圍的波長下觀察吸光度，能夠確實地檢測出洗出液中的磷脂。而且，這種情況下，優(yōu)選，事先測定洗脫液(空白)的吸光度，從被觀察的各分級分離組分中洗出液的吸光度，減去測定的洗脫液(空白)的吸光度，觀察各分級分離組分的吸光度。由此，能夠抵消洗脫液引起的吸光度。即，由于能夠排除洗脫液引起的吸光度的干擾， 能夠以較高靈敏度檢測出洗出液中的磷脂。如上所述，根據(jù)本發(fā)明，使鈣離子吸附于由磷酸鈣類化合物構成的填充劑，使含有磷脂的樣品溶液與該填充劑接觸后，通過供給有機溶劑類的洗脫液的比較簡單的操作，能夠在確定的分離組分中，高純度地分離(回收)卵黃來源的磷脂。在以上的說明中，是以從總脂質(zhì)中提取卵黃來源的磷脂的情況作為一個例子說明的，本發(fā)明并不限定于上述情況。根據(jù)本發(fā)明，也可以容易地并高純度的分離例如，如大豆的豆類、紅細胞、如革蘭氏陰性菌的各種細胞以及病毒等含有的磷脂。以上說明了本發(fā)明的分離方法，可是，本發(fā)明并不限定于此。例如，可以根據(jù)任何目的，追加1個以上的工序。實施例下面，說明本發(fā)明的具體實施例。1、制備磷脂脂質(zhì)體(卵磷脂脂質(zhì)體含有液)-IA-首先，準備卵黃來源的卵磷脂(和光純藥工業(yè)社制造、LotNo. 1沈_00812)，攪拌。之后，將60yL該卵磷脂加入1.94mL乙醇中，得到卵磷脂/乙醇添加物。然后，使用旋轉(zhuǎn)器(TAITEC社制造，[RT-50])，在30rpmX 15分鐘(室溫)的條件下，攪拌該卵磷脂/乙醇添加物。-2A-然后，在SOOOrpmX 5分鐘(室溫)的條件下離心分離攪拌后的卵磷脂/乙醇添加物，得到上清液。-3A-然后，一邊攪拌30mL水，一邊使用色譜注射用500 μ L微注射器(Ito社制造、 [MS-R500])分3次快速向其中注入上述工序-2Α-得到的上清液(乙醇可溶性的分級分離組分)1. 5mL，得到混合液。然后，攪拌該混合液大約3分鐘左右，制備卵磷脂脂質(zhì)體含有液。對于如上得到的卵磷脂脂質(zhì)體含有液，使用動態(tài)散射顆粒性分布裝置 (Beckmancoulter社制造、[N5])、共3次測定卵磷脂脂質(zhì)體含有液中含有的卵磷脂脂質(zhì)體的大小。其結(jié)果在圖2以及表1中表示。[表1]
權利要求
1.一種分離方法，其為從含有磷脂的樣品溶液中選擇性地分離上述磷脂，其特征在于， 所述分離方法具有以下工序使鈣離子吸附于至少表面由磷酸鈣類化合物構成的填充劑上的鈣離子吸附工序；和向填充空間中填充有上述填充劑構成的裝置內(nèi)供給上述樣品溶液的供給工序；和向上述裝置的上述填充空間內(nèi)供給有機溶劑類的洗脫液，獲得從上述裝置內(nèi)流出的洗出液的工序；和通過以每個確定的量分級分離上述洗出液，在該被分級分離的各分離組分的上述洗出液中，分離上述磷脂的分級分離工序。
2.根據(jù)權利要求1所述的分離方法，其中通過使含有上述鈣離子的鈣含有液與上述填充劑接觸進行上述鈣離子吸附工序。
3.根據(jù)權利要求2所述的分離方法，其中上述鈣含有液包括氯化鈣水溶液。
4.根據(jù)權利要求1至3任一項所述的分離方法，其中上述磷脂含有形成脂質(zhì)體的磷脂脂質(zhì)體。
5.根據(jù)權利要求1至4任一項所述的分離方法，其中在獲得上述洗出液的工序中，上述洗脫液含有異丙醇。
6.根據(jù)權利要求5所述的分離方法，其中在獲得上述洗出液的工序中，上述洗脫液是上述異丙醇的含量從0至80%增加的線性梯度溶液。
7.根據(jù)權利要求1至4任一項所述的分離方法，其中在獲得上述洗出液的工序中，上述洗脫液的流速是0. 1至IOmL/分鐘。
8.根據(jù)權利要求1至7任一項所述的分離方法，其中在上述分級分離工序中，通過觀察上述各分離組分的190至230nm波長的吸光度檢測出上述磷脂。
9.根據(jù)權利要求8所述的分離方法，其進一步具有預先獲得上述洗脫液的吸光度的工序，在上述分級分離工序中，通過從觀察到的上述各分離組分的吸光度減去上述預先獲得的上述洗脫液的上述吸光度，檢測出上述磷脂。
10.根據(jù)權利要求1至9任一項所述的分離方法，其中上述磷酸鈣類化合物是以羥磷灰石為主要成分的物質(zhì)。
11.根據(jù)權利要求1至10任一項所述的分離方法，其進一步具有預先制備上述裝置的工序。
全文摘要
本發(fā)明的分離方法涉及從含有磷脂的樣品溶液中選擇性地分離上述磷脂的方法，其特征在于，其具有以下工序吸附鈣離子于至少表面由磷酸鈣類化合物構成的填充劑的鈣離子吸附工序；和，向至少一部分填充空間中填充有上述填充劑構成的裝置內(nèi)，供給上述樣品溶液的供給工序；和，向上述裝置內(nèi)，供給有機溶劑類的洗脫液，并以每個確定的量分級分離從上述裝置內(nèi)流出的洗出液，在該被分級分離的各分離組分的洗出液中，分級分離上述磷脂的分級分離工序。根據(jù)本發(fā)明，能夠以簡單的操作，從含有磷脂的樣品溶液中選擇性地分離磷脂。
文檔編號B01J20/34GK102510896SQ20108004182
公開日2012年6月20日 申請日期2010年9月17日 優(yōu)先權日2009年9月25日
發(fā)明者菅生健 申請人:Hoya株式會社