專利名稱：一種新型親和介質的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物化學領域，具體地，涉及一種新型親和介質的制備方法及其應用。
背景技術：
親和層析法是分離蛋白質等生物活性物質最有效的純化方法，是利用生物分子間 所具有的專一親和力而設計的層析技術。利用親和層析載體固相化配基與親和互補物之間 通過范德華力、疏水力、靜電力、氫鍵等作用發(fā)生專一性的結合而進行分離。這種有選擇性 地結合主要歸結于固相化配基與親和互補物二者之間的生物學特性和特異的化學結構以 及空間構象。在親和層析過程中，被純化的生物分子在一定的條件下，選擇性地結合到被共 價偶聯(lián)到不溶性載體上的配基上，然后改變原有的條件，如洗脫液PH值、離子強度、有機溶 劑的濃度等，有選擇性地從載體上把被分離物洗脫下來。通過親和層析法分離的物質，其純 度、活性回收率及純化倍數(shù)均較高。親和層析的載體必須具備以下幾個特點①不溶于水，但高度親水；②惰性物質， 非特異性吸附少；③具有相當量的化學基團可供活化；④理化性質穩(wěn)定；⑤機械性能好，具 有一定的顆粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好為多孔的網狀結構，使大分子能自 由通過；⑦能抵抗微生物和醇的作用。目前常用的載體是瓊脂糖膠粒。它具有機械強度高、 透性好、載體本身非特異性吸附少等優(yōu)點。如Pharmacia公司的S印haroSe-4B、6B是目前 應用較多的基質。但是，由于這些載體技術掌握在國外一些大公司的手中，價格十分昂貴， 機械強度不夠高，難以實現(xiàn)大規(guī)模蛋白質純化。玻璃具有理化性質穩(wěn)定、非特異性吸附少、機械強度高、材料易得、易制備等特性。 目前，玻璃板作為DNA和蛋白質的固定基質應用于生化和生物芯片領域；玻璃粉具有價格 低廉，通透性好，難與其他物質發(fā)生反應等特點，但其僅用于食品、建筑、工業(yè)等領域，未用 于生物化學領域。本發(fā)明將玻璃粉經過表面處理，偶聯(lián)上特殊物質，制作成層析介質用于生 物物質的分離，為玻璃粉的應用開辟了一條嶄新的途徑，也為生物物質的分離提供了一種 有效、價廉的方法。
發(fā)明內容
本發(fā)明利用玻璃粉價格低廉，流通性好，難與其他物質發(fā)生反應等特點，將其直接 用作親和介質，可以避免許多其他介質如需添加溴化氰等劇毒物的缺點，更加環(huán)保，便于操 作，保障了科研人員的身體健康。因此，本發(fā)明的目的是提供一種新型親和介質。本發(fā)明的另一目的是提供上述新型親和介質的應用。根據(jù)本發(fā)明的新型親和介質，其中所述親和介質的固相載體為玻璃粉。根據(jù)本發(fā)明的親和介質，其中，所述玻璃粉的粒徑范圍為0. 1-lOOOym、優(yōu)選 1 li m、10 li m、50 li m、或 200 u m。玻璃粉的表面必須經過修飾處理才能夠結合上蛋白質。這種修飾處理是指在玻璃粉表面鏈接上不同的活性基團，從而進一步形成具有不同活性的基團，來固定各種生物大 分子如蛋白質、多肽、酶、抗原、抗體、DNA甚至細胞。玻璃粉的修飾處理主要包括清洗和活 化兩部分，清洗的同時可以使玻璃粉帶上富含羥基的活性表面?；罨噭┬揎椀玫胶邪?基、巰基或羥基的活化表面，這種表面即可直接與生物大分子連接?；罨蟮牟ＡХ郾砻娓?據(jù)所連接的基團的不同分為氨基玻璃粉，環(huán)氧基玻璃粉，醛基玻璃粉，巰基玻璃粉等。當使用本發(fā)明的親和介質固定不同的生物大分子或細胞時，根據(jù)分離物的特性， 本領域普通技術人員基于公知常識和現(xiàn)有技術可以選擇適當?shù)幕罨噭┨幚聿ＡХ郾砻妫?以使其表面連接合適的活性基團，從而制備得到氨基玻璃粉，環(huán)氧基玻璃粉，醛基玻璃粉， 巰基玻璃粉等。例如一、制備氨基玻璃粉 1、將玻璃粉用IM的NaOH浸泡2小時；2、將玻璃粉浸泡于3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇中，搖床上室溫搖1小時；3、95%乙醇清洗兩次，離心甩干；4、150°C 真空烘干；二、制備醛基玻璃粉1、將上述氨基玻璃粉放入到含有12. 5%的戊二醛磷酸緩沖液中室溫搖3小時，洗 凈；2、150°C 真空烘干；使用這種方法固定的醛基可與蛋白質的氨基通過形成碳-氮鍵結合，從而實現(xiàn)與 蛋白質相連。三、環(huán)氧基玻璃粉1、將玻璃粉用IM的NaOH浸泡2小時；2、將玻璃粉浸泡于3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷[3-Glycidoxypropy ltrimethoxysilane, GPTMS]的甲醇中，搖床上室溫搖1小時；3、95%甲醇清洗兩次，離心甩干；4、150°C 真空烘干。使用這種方法在玻璃表面引入環(huán)氧乙烷基團，最后與氨基發(fā)生反應生成仲胺，從 而實現(xiàn)與蛋白質相連。四、制備巰基玻璃粉1、將玻璃粉在鉻酸中浸泡過夜，并且清洗干凈；2、配 3-巰基丙基乙氧基硅烷[3-Mercaptopropyltrimethoxysilane，MPS]的 乙醇溶液(PH4. 5用乙酸調pH值)；3、用上述溶液浸泡玻璃粉30分；4、用pH4. 5的乙醇-乙酸混合液清洗玻璃粉；5、150°C 真空烘干。使用這種方法可使帶有巰基的玻璃粉直接與蛋白質中的二硫鍵反應而使蛋白質 固定在玻璃粉上。由于二硫鍵與巰基的特異性結合，可以有效的避免生物分子中其他基團 非特異的與巰基結合。本發(fā)明還提供了上述新型親和介質的應用，其可以用于分離蛋白、核酸、或細胞。
在使用本發(fā)明的親和介質時，根據(jù)分離物的特性，本領域普通技術人員可以根據(jù) 本領域的公知常識和現(xiàn)有技術確定具體的分離純化條件，如蛋白偶聯(lián)PH的選擇、硅烷化玻 璃粉與BSA飽和偶聯(lián)量的確定、硅烷化玻璃粉封閉液的選擇等。本發(fā)明提供了一種價格低廉、性能優(yōu)良的新型親和介質，將其直接用作親和介質， 可以避免了許多其他介質如需添加溴化氰等劇毒物的缺點，更加環(huán)保，便于操作，保障了科 研人員的身體健康。
圖1顯示硅烷化玻璃粉封閉條件選擇，1 乙酰胺；2 甲酰胺；3 :Tween-20 ；4 TritonX-IOO ；5 =(NH4)2SO4 ；6 甘氨酸；7 過硫氨酸；8 三乙醇胺；9 =NH4CL ；10 =Tris0圖2顯示BSA偶聯(lián)的玻璃粉提取BSA抗體的結果，1 蛋白質Marker ；2 抗體標準； 3 含抗BSA抗體的血清；4 結合后上清；5 =PB洗；6 =NaCl洗脫；7 洗脫下BSA抗體。
圖3顯示c-myc多肽偶聯(lián)的玻璃粉提取ciyc抗體的結果，1 抗體標準；2 :c-myc 腹水；3 結合后上清；4 =NaCl洗脫；5、6 洗脫下c-myc抗體；7、8 洗脫下的TCA沉淀的 c-myc 抗體；9 :BSA。
具體實施例方式制備實施例1、制備氨基玻璃粉1、將玻璃粉(粒徑為 0. 1 μ mU μ mUO μ m,50 μ m,200 μ m, 1000 μ m)用 IM 的 NaOH 浸泡2小時；2、將玻璃粉浸泡于3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇中，搖床上室溫搖1小時；3、95%乙醇清洗兩次，離心甩干；4、150°C 真空烘干；制備實施例2使用玻璃粉的粒徑為1200 μ m,以與制備實施例1相同的方法制備氨基玻璃粉。制備實施例3、制備醛基玻璃粉1、將上述制備實施例1制備的氨基玻璃粉放入到含有12. 5%的戊二醛磷酸緩沖 液中室溫搖3小時，洗凈；2、150°C 真空烘干。制備實施例4、環(huán)氧基玻璃粉1、將玻璃粉(粒徑為 0. 1 μ mUO μ m,50 μ m,200 μ m, 1000 μ m)用 IM 的 NaOH 浸泡 2小時；2、將玻璃粉浸泡于3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷[3-Glycidoxypropyltr imethoxysilane, GPTMS]的甲醇中，搖床上室溫搖1小時3、95%甲醇清洗兩次，離心甩干；4、150°C 真空烘干。制備實施例5、制備巰基玻璃粉1、將玻璃粉(粒徑為0. 1 μ mUO μ m,50 μ m,200 μ m, 1000 μ m)在鉻酸中浸泡過夜，
并且清洗干凈；
2、配 3-巰基丙基乙氧基硅烷[3-Mercaptopropyltrimethoxysilane，MPS]的 乙醇溶液(PH4. 5用乙酸調pH值)；3、用上述溶液浸泡玻璃粉30分；4、用pH4. 5的乙醇-乙酸混合液清洗玻璃粉；5、150°C 真空烘干。應用實施例1、分離牛血清白蛋白(BSA)抗體1、玻璃粉的硅烷化修飾1)將玻璃粉(粒徑為 0. lumUOu m、50 u m、200 u m 1000 u m)浸泡于 lMNaOH 溶液 中，震蕩2小時；2)蒸餾水洗滌5次，每次3000r/min離心4分鐘，去除洗液；3)無水甲醇洗滌2次，每次3000r/min離心4分鐘，去除洗液；4)用氨丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液硅烷化反應，震搖2小時；5)用無水甲醇洗滌一次，用濾紙過濾除去甲醇，倒扣于硫酸紙上，真空150°C烘箱 內烘烤過夜。2、不同半徑的玻璃粉與BSA偶聯(lián)量的對比使用制備實施例1-2制備的氨基玻璃粉，分別取40mg的玻璃粉與200 y g的BSA 在PH9.0的磷酸緩沖液中過夜反應，離心后測上清。通過上清殘留的BSA量換算出每毫克 玻璃粉與BSA的偶聯(lián)量。每毫克制備實施例1-2制備的氨基玻璃粉與BSA的偶聯(lián)量如下表所示表1 由表1可以看出，隨著玻璃粉顆粒的減小，與BSA的偶聯(lián)量逐步上升，但玻璃粉的 顆粒太小會增加離心沉淀的難度和降低流速，所以通常選用50i!m的玻璃粉。3、硅烷化玻璃粉封閉液選擇1)分別配置乙醇胺，甲酰胺，tween-20，tritonX-100，硫酸胺，甘氨酸，過硫酸
6銨，三乙醇胺，氯化銨，Tris溶于pH7. 4的TBS溶液中；2) 40mg玻璃粉(粒徑1 μ m)與100 μ gBSA偶聯(lián)過夜，并用PBS洗一次；3)分別用上述封閉液封閉過夜；4)將25 μ 1的血清加入到玻璃粉中，反應1小時，并用PBS洗4次；5)用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結果顯示tween-20的封閉效果最好(如圖1所示)°4、用BSA偶聯(lián)的玻璃粉提取BSA抗體 1) IOOmg的硅烷化玻璃粉(粒徑50 μ m)與280 μ g的BSA在pH9. 0的磷酸緩沖液 中偶聯(lián)過夜，并用PBS洗一次；2) 1 % tween-20 的 TBS 溶液封閉，PBS 洗 2 次；3)向玻璃粉中加入800 μ 1的PBS和200 μ 1的含有羊抗BSA的血清，反應1小時， 并用PBS清洗3次；4)用 Iml 0. 3Μ NaCl/0. 1% tritonX_100/pH7. 4Tris 溶液洗滌 3 次；5)用pHll. 5的三乙醇胺溶液洗脫；并用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗，結果表明用此 法可以提取較純的BSA抗體，每毫克玻璃粉大約能夠提取1 μ g的抗體(結果如圖2所示)。應用實施例2、用c-myc多肽偶聯(lián)的玻璃粉提取c-myc抗體1) IOOmg的硅烷化玻璃粉(粒徑100 μ m)與100 μ g的c_myc多肽在pH pH9. 0的 磷酸緩沖液中偶聯(lián)過夜，并用PBS洗一次；2) 1 % tween-20 的 TBS 溶液封閉，PBS 洗 2 次；3)向玻璃粉中加入900 μ 1的PBS和100 μ 1的含有c_myc抗體的腹水，反應1小 時，并用PBS清洗3次；4)用 Iml 0. 3M NaCl/0. 1% tritonX_100/pH7. 4Tris 溶液洗滌 3 次；5)用pHll. 5的三乙醇胺溶液洗脫，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗，結果表明用此 法可以提取很純的c-myc抗體(結果如圖3所示)。
權利要求
一種新型親和介質，其特征在于，所述親和介質的固相載體為玻璃粉。
2.根據(jù)權利要求1所述的親和介質，其特征在于，所述玻璃粉的粒徑范圍為 0.1-1000 μ m。
3.根據(jù)權利要求2所述的親和介質，其特征在于，所述玻璃粉的粒徑范圍為1μ m、 10 μ m、50 μ m、或 200 μ m。
4.根據(jù)權利要求1所述的親和介質，其特征在于，所述玻璃粉表面連接有活化基團。
5.根據(jù)權利要求4所述的親和介質，其特征在于，所述活化基團為氨基、巰基、環(huán)氧基、或酸基。
6.權利要求1所述的新型親和介質的應用。
7.權利要求1所述新型親和介質用于分離小分子化合物、蛋白、核酸、或細胞的應用。
8.玻璃粉作為親和介質的固相載體的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物化學領域，具體地，涉及一種新型親和介質的制備方法及其應用。根據(jù)本發(fā)明的親和介質，其中，所述玻璃粉的粒徑范圍為0.1-1000μm。本發(fā)明將玻璃粉經過表面處理，偶聯(lián)上特殊物質，制作成層析介質用于生物物質的分離，為玻璃粉的應用開辟了一條嶄新的途徑，也為生物物質的分離提供了一種有效、價廉的方法。本發(fā)明提供了一種價格低廉、性能優(yōu)良的新型親和介質，將其直接用作親和介質，可以避免了許多其他介質如需添加溴化氰等劇毒物的缺點，更加環(huán)保，便于操作，保障了科研人員的身體健康。
文檔編號B01J20/281GK101869827SQ20101016488
公開日2010年10月27日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權日2010年4月30日
發(fā)明者劉治平, 李瑩, 欒升 申請人:北京九州泰康生物科技有限責任公司