專利名稱：多肽的逆流提純的制作方法
技術領域：
本發明涉及使用逆流色譜法提純蛋白質或肽的方法。本發明特別涉及逆流色譜法用于提純蛋白質或肽(包括合成、半重組體或重組體多肽，比如重組體GLP-1)的用途。
背景技術：
逆流提純系統是固相或者物理地和流體流的流動反向移動，或者通過改變該系統的不同分離床的定位而進行模擬以使該移動相對于流體流逆流的提純系統。逆流提純系統包括例如模擬移動床色譜(SMB)和多柱逆流溶劑梯度提純(MCSGP)。模擬移動床色譜(SMB)首次描述于US 2，985，589。該說明書公開了分成許多單獨的互連分離床的分離塔，所述分離床含有固相色譜吸附劑。塔底部的管道泵連接從底部到頂部的流，從而提供連續環路。進料(F)和解吸劑(D)的入口及提余液(R)和提取物(E) 的出口位于分離床串列的特定點。按限定的間隔，床的位置在流的相反方向上切換，產生固相床相對于流體流的逆流移動。引入第一床的進料(F)開始分離成其中所含的各種組分， 保留較少的物種沿著流體流的方向遷移并在提余液口得到收集。保留較多的物種保持優先和固相關聯并在提取物口得到收集。通過調節切換次數和F、D、R及E的流率，建立循環穩定狀態，可從所述系統得到連續的提純產品流。近來，SMB已被用于分離糖異構體、碳氫化合物、溶劑和其它工業應用。這些工業裝置中的許多(像原來的'589裝置)采用機械旋轉閥的變化進行柱切換。所述閥組件排列成在任何給定的閥位，將多個入口和出口流導向預定的柱子，并通過各個旋轉步驟相應地推進一個位置。這樣的旋轉閥公開于US 6，719，001、4，574，840和4，614，205。為了強調這些裝置中的一些的預期規模，參見US 3，040, 777，它描述了占64平方英尺面積和重10 噸的閥。其它SMB 系統公開于 US 4，434，051 和 US 5，635，072。另一個專利 US 6，544，413 公開了多重閥裝置，它具有四個閥的成簇閥總成，所述閥用于近似于對各個色譜床控制輸入/輸出。它對于小規模SMB系統具有減少液體體積的優勢。US6，979，402公開了一裝置， 其中跨接(cross-over)導管完全被連接通道代替，所述連接通道用機器制成旋轉閥體的頂板和底板并和柱口對準以制造SMB流體環路，從而減小空隙體積。將SMB用于提純藥物活性非對映體和對映體的若干新近應用已公開于US 6，462，221,6, 461，858,6, 458，995和6，455，736。在用于這樣的分子的二元分離的SMB中使用新的手性樹脂正在變得常見。SMB也被考慮用于從復雜混合物提純生物分子。例如，使用SMB提純單克隆抗體已被Gottschlich等人報道(J. Chromatogr. A, 765 (1997) 201)并公開于WO 2004/024284o SMB提純之前已被公開用于胰島素提純，如WO 2001/0879 所公開的。WO 2008/048395公開了小規模模擬移動床色譜法。胰高血糖素樣肽_1 (GLP-I)是在血糖水平低時釋放的激素。GLP-I增大胰島素生產從而降低血糖水平。GLP-I和GLP-I 類似物用于治療II型糖尿病。對用于提純流體混合物的提純系統仍然存在需求，所述流體混合物包括一種或多種雜質和關注的蛋白質或肽(比如GLP-I肽)，其中雜質的濃度比關注的蛋白質或肽的濃度
小得多。發明目的本發明的目的在于提供改進的多肽提純方法，所述多肽包括合成式、半重組體式或重組體式生產的多肽，比如重組體GLP-1。本發明的發明人顯示了逆流提純系統(比如 SMB)特別適合于提純重組體蛋白質，特別是GLP-1。
發明概要發明人已發現，逆流色譜法特別適合于提純蛋白質或肽，包括合成式、半重組體式或重組體式生產的蛋白質或肽，比如GLP-I肽。公眾和藥物批準機關對更純和更同質的治療蛋白質制品存在越來越大的需求。成本也得低。因此，為了滿足這些期望，生產成本是在工業過程中必須最佳化的問題。因此，在第一寬泛方面，本發明涉及通過逆流色譜法提純肽、多肽或蛋白質的方法。在另一方面，本發明涉及將流體混合物中的關注的多肽和至少一種其它組分色譜分離的方法，所述方法包括a)提供逆流提純系統，所述系統包括流體連接的多個部分，所述部分包括至少一個固相和第一解吸劑流；b)將所述流體混合物作為進料流引入所述逆流提純系統，其中所述流體混合物以逆流方式和所述固相接觸；c)通過調節進料流中的至少一種調節劑的濃度而控制等溫線，使得把mm和A作為(/或α的函數繪圖時，等溫線的初始斜率A和操作線的斜率大約平行；d)進行關注的多肽和至少一種其它組分的分離；和e)收集所述關注的多肽以提供它的提純組合物。
圖1 產品(-—)和雜質(-·-·)的色譜圖。從圖中看到，兩個峰之間存在大的重疊。 必須采取折中。從2CV收集的產品將得到大的產率，但純度低；而從2. 5CV收集的產品將得到高純度，但產率低。圖2 純弱結合組分·(-·--)、純強結合組分(一)的等溫線和這兩個等溫線的初始斜率。如果流(stream)含有8g/L強組分(產品)且弱結合的雜質是它的5%，它相當于 0. 4g/L。該圖顯示在低濃度，初始斜率是雜質等溫線的合理近似，而對于較強結合的組分， 情況則不同。圖3 帶再循環的SMB設備。SMB由I-IV四個部分組成，每個部分帶有兩個柱。解吸劑泵之后的部分稱為部分I。來自部分IV的排出物(outlet)再循環至部分I。液體流向右而柱移動向左。圖4 一個真實移動床(TMB)中的穩定狀態濃度分布。較強結合組分沿著樹脂方向移動到提取物口，而較弱結合組分隨著洗脫劑移動到提余液口。所有流如圖3所示進入和離開TMB。
圖5 帶有八個柱子、再生及平衡的開放環路SMB設備的布局。柱子可以在SMB設備(Abel 2004)中再生和平衡。由于提余液流僅含有弱結合組分，部分III的出口可以作為代替用作平衡柱的入口。圖6 離子交換色譜法(IEX)中的線性等溫線的鹽依賴性。理論保留將是
為In(Cs)的函數的雙對數圖中的直線。較弱結合組分的實驗數據通過(+)顯示而較強結合組分通過(ο)顯示。對于較弱結合組分，實驗數據的擬合線為(-…_)，而對較強結合組分為(一)。圖7 反相色譜法(RP)中的線性等溫線的乙醇依賴性。理論保留將是Vk-Vnk作為有機相濃度Cm的函數的半對數圖中的直線。較弱結合組分為(-·-·-)而較強結合組分為(一)。圖8 等度溶液。較強結合組分的吸附Aa，及較弱結合組分的吸附Ab，連同部分III 中的無因次(dimensionless)流率m111。在等度溶液中，進料流中的調節劑的濃度將會等于部分II中的濃度。因此部分III中的濃度將會和這些相同且不會取決于進料流(水平線)。因此，較弱和較強結合組分的等溫線的初始斜率將會恒定。因此僅5和7.5之間的進料流量會滿足保留較強結合組分并洗提較弱結合組分的要求。圖9 梯度溶液。在SMB設備中使用梯度將導致等溫線初始斜率的變化，這取決于調節劑的濃度(不再是水平線，參見圖8)。然而使用梯度并不總會保證調節劑的無因次流率mm會位于較弱和較強結合組分的初始斜率之間。圖10 進料和洗脫劑中的調節劑濃度的吸引人的組合。可以看到對于所有進料流量，操作線HIm位于較弱和較強結合組分的初始斜率之間。圖11 脈沖實驗的范·德姆特(van Deemter)圖。范·德姆特圖顯示減小的塔板高度作為流率的函數。圖12 線性等溫線的完全分離區域。最佳操作點在m11的最小值和mm的最大值， 相當于W點。圖13 等度條件下非線性等溫線的完全分離區域。W點下移且設備中生產率減小。圖14:具有鹽/有機溶劑和pH梯度的完全分離區域。可以看到最佳操作點W由于梯度而上移。這允許較高的進料流，因此得到較高的生產率。圖15 用于SMB實驗II的解吸劑I和解吸劑II (也參見圖18)的試驗。保留體積可由擬合EMG函數而計算。指數修正高斯(EMG)函數的描述可見于Jeansorme (1991)。圖16 等溫線的計算的初始斜率A，和部分III中的無因次流量m，以及進料流中的最佳鹽濃度。無因次流量具有和較弱結合組分的斜率Ab相同的斜率。圖17 等溫線的計算的初始斜率A，和部分III中的無因次流量m，以及進料流中的實際鹽濃度。無因次流具有比較弱結合組分的斜率Ab小的斜率。圖18 用于II號SMB實驗的設備的結構。部分I和部分II之間的連接被切斷以便能在這兩個部分中使用兩種不同的鹽濃度(也參見圖5用于比較)。圖19 來自實驗II的提取物流紫外信號。初始將進料流設置為lAml/min直至達到循環穩定狀態。取樣分析并將流量增大l/2ml/min并達到新的循環穩定狀態。圖20 進料流量為2ml/min且獲得了循環穩定狀態后的來自實驗II的提余液口紫外信號。經過再生和平衡區后，將柱子移入區域II，因此紫外信號初始為零。當組分被洗提時，紫外信號增大。在紫外信號開始再次增大之前看到曲線平穩段。
圖21 來自實驗III的區域III中的弱結合(-·-·-)和強結合(一_)組分的計算的初始斜率A，連同操作線(一)和操作點(黑點)。可以看到操作線具有和較弱結合組分無限稀釋時的等溫線的初始斜率大約相同的斜率。圖22 進料流為2ml/min且獲得了循環穩定狀態后的來自實驗III的提余液口紫外信號。經過再生和平衡區后，將柱子移入區域II，因此紫外信號初始為零。當組分被洗提時，紫外信號增大。看到和圖20相比非常不同的峰。圖23 對于較弱結合組分⑴和較強結合組分(ο)，在反相色譜法(RP)中的線性等溫線的測量的乙醇依賴性，連同對實驗的擬合。理論保留在Vk-Vnk作為Cis函數的半對數圖中將是直線。圖M 區域III中的較弱(-·-·-)和較強結合(一)組分的計算的初始斜率A，連同操作線(一)和操作點(黑點)。可以看到操作線具有和等溫線初始斜率在無限稀釋時的變化大約相同的斜率。圖25 來自實驗IV中的提取物流的測量的紫外信號。為每個循環(8個柱子，3min 轉換時間)將數據繪圖。起初，紫外信號因SMB設備的啟動而增大。圖沈獲得了循環穩定狀態后的實驗IV的提余液口紫外信號。經過再生和平衡區后，將柱子移入區域II，因此紫外信號初始為零。當組分被洗提時，紫外信號增大。進料流含有許多弱結合的雜質，且沒有看到像在圖22中那樣的清晰的峰。發明詳細內容肽(比如GLP-I肽)可例如在發酵方法中通過重組生產或者在固相上通過合成生產。不管生產方式如何，除關注的多肽外還產生許多雜質。例如當通過重組生產時，除了生產關注的多肽，細胞也生產許多其它物質比如高分子量蛋白質(HMWP)和小分子(例如草酸鹽)。由于缺乏和關注的多肽的相似性，這些通常十分易于和關注的多肽分離。另外，細胞生產和關注的多肽非常相似的組分，例如糖基化、脫酰胺、截斷、聚集、二聚、氧化的雜質等， 因此產生幾乎和關注的多肽相同的蛋白質或肽。由于雜質和關注的多肽之間的高相似度， 這些雜質和關注的多肽分離要難得多。因此，在色譜法中，關注的多肽和這些雜質的保留體積彼此非常接近。在等度模式中，這會對進料流和解吸劑流的要求產生狹窄的約束。適合于分離對映體的提純系統已被描述。當對映體通過所述提純系統分離時，被分離的組分通常以相等或接近相等的濃度存在。與此相反，關注的多肽在例如發酵肉湯中的濃度可能顯著高于類似雜質的濃度，這常常使得難以將所述雜質和關注的多肽分離同時也實現關注的多肽的高產率。圖2說明了被提純的流體混合物包括關注的多肽以及相似雜質的情形。此處，兩個等溫線顯示于圖形中，其中被吸附的濃度按液相濃度而繪制。產品的濃度是8g/L，以低得多的濃度存在的雜質的濃度是0.4g/L。從圖中看出，等溫線的初始斜率是較弱結合組分的等溫線的良好近似，而較強結合組分的近似不那么好。在本發明的一方面，將較弱結合組分的等溫線的初始斜率用于選擇逆流方法中的調節劑濃度。作為一個說明性實例，可以考慮如圖5所示的逆流方法具有和圖2給出的等溫線相似的等溫線的情況。這導致與雜質(以低濃度存在)相比，產品(以高濃度存在)對樹脂的更強吸附。在此情況下，雜質在例如提余液流中的洗提可因以下而發生
1.產品在區域III中的替換效應2.雜質本身的等溫線的向下彎曲，或3.等溫線的初始斜率足夠低到可以洗提。在情況1中，例如弱結合雜質會被產品替換，產品會在提余液流中損失。雜質正好在產品之前因替換效應而洗提。在情況2中，弱結合雜質不能在區域III的條件下以低濃度洗提。在此情況下，弱結合組分既不會在提取物流中也不會在提余液流中被洗出(wash out)，而只是在設備中積聚。弱結合雜質的濃度會累積直至濃度對于雜質足夠高以由于等溫線的彎曲而洗提。在此情況下的劣勢是雜質在設備中的累積。這個增大量的雜質會減少空閑配體的量，從而減少產品的結合容量，且增大量的雜質需要在區域II中被洗提以免它最終在提余液流中。情況3是此處覆蓋的情形，其中將調節劑在進料流和解吸劑流中的濃度選為使得弱結合雜質總能洗提至提余液流。在此情況下，雜質的積聚得以避免。這可通過此處建議的適當選擇解吸劑和進料流中的調節劑濃度而完成。發明人在本發明提供了用于將有關雜質和關注的多肽分離的特別有效的提純方法。因此，所述提純方法中的等溫線的初始斜率對于提純關注的多肽是最佳的，其中，肽產品和有關雜質存在于待被提純的流體混合物(比如從發酵過程獲得的流體混合物)中。在本發明的一方面，等溫線的最佳初始斜率通過選擇逆流提純系統(比如SMB設備)中的調節劑梯度而獲得，其中，以低濃度存在的較弱結合組分(即弱結合雜質)在提余液流中洗提。一方面，根據本發明方法的較弱結合的雜質的洗提防止所述雜質在所述設備中的積聚。 在本發明的一方面，調節劑梯度是鹽梯度。一方面，根據本發明的逆流提純系統用于提純發酵肉湯，其中獲得GLP-I和它的雜質的分離。一方面，根據本發明將逆流提純系統用于提純包括合成式生產的蛋白質或肽產品的流體混合物，其中獲得GLP-I肽和它的雜質的分離。一方面，根據本發明將逆流提純系統用于提純包括胰島素肽(比如人胰島素、 desB30人胰島素或AspB^人胰島素)的流體混合物，其中獲得胰島素和它的雜質的分離。一方面，根據本發明將逆流提純系統用于將包括蛋白質或肽的流體混合物從它的雜質提純，其中使用的柱子是RP HPLC柱。理解平衡對各個組分(比如關注的多肽和它的有關雜質)的保留的影響也將允許使用通常不用于逆流分離系統的梯度，例如IEX中的pH梯度。因此，一方面，根據本發明將逆流提純系統用于將包括蛋白質或肽的流體混合物從它的雜質提純，其中使用的調節劑是 PH且使用的柱子是IEX柱。有機組分的濃度也會影響IEX中的平衡，因此也可使用例如IEX中的有機組分。因此，一方面，根據本發明將逆流提純系統用于將包括蛋白質或肽的流體混合物從它的雜質提純，其中使用的第二調節劑是有機組分且使用的柱子是IEX柱。等溫線經常是凸的，且被吸附組分的濃度q和液相中的濃度c之間的比率，即q/c， 在濃度增大時減小(Guiochon 2006)。這也可在圖2中看到。在本發明的一方面，等溫線接近于較弱結合組分的操作線。這樣的優勢在于部分III中的穿透(breakthrough)得以避免。另外，在負載部分II時，可用配體的減少降低在提取物中具有較弱結合組分的風險。本發明發明人發現，針對上述困難的提純問題的解決方案是在SMB方法中使用梯度。之前已顯示，梯度在困難的分離問題中有效，然而沒有像本發明建議的那樣使用，在本發明中，進料流中產品和雜質之間的濃度差大。在本發明的一方面，提供了進料流和部分II中的不同調節劑濃度，其中在設備的部分III中的平衡是進料流量的函數。對于波動和方法變化的一定的魯棒性是需要的。圖9繪制了梯度情形下的初始斜率連同無因次流量m111。一方面，mm在兩個組分各自的等溫線的初始斜率A之間。這具有將所述組分分離的效果。從圖9看出，進料流量在此情況下僅可在約3. 3和6. 6之間變化。發明人在本發明提供了通過以新的創造性方式結合熱力學知識和逆流提純技術知識(比如SMB)而提純關注的多肽的吸引人的方法。固定床色譜法固定床(FB)色譜法目前在藥物工業中廣泛用于提純組分。在固定床色譜法中，將與雜質混合的所需產品施加于柱子，然后從柱子將它洗提。在柱出口，可從雜質中收集產
P
ΡΠ O在關注的多肽和有關雜質的這種流體混合物的FB色譜圖中，常觀察到兩個峰的重疊(圖1)。在此情況下，在柱出口，產品不完全和雜質分離，且不能獲得高純度和高產率兩者。SMB為了克服FB色譜法的局限，可以使用逆流色譜法。廣泛使用的方法是模擬移動床(SMB)，這在之前已顯示就純度、生產率和溶劑消耗而言都對提純蛋白質有效 (Schulte(2000))ο在SMB設備中，柱子以特定的轉換時間相對于流動方向逆流地移動。因此所述方法就時間和位置兩者而言都變化。SMB也被考慮用于胰島素的提純(JensenOOOO))，其中對分離由lg/Ι牛胰島素和 l/2g/l豬胰島素組成的進料流進行了理論研究。顯示，通過在反相色譜方法中施加乙腈梯度，消耗數值可以減小。胰島素提純已由Wang在EP1349866B1中通過實驗驗證。在他的實驗中，將胰島素和ZnCl2及HMWP分離。SMB方法是非連續方法，因為柱子以特定時間tsft轉換。這產生一組帶有時間和位置這兩者的導數的等式。為了簡化等式的分析，經常代之研究真實移動床(TMB) (Guiochon, 2006，780頁)。 TMB也稱作真實逆流(TCC) (Ruthven和Ching 1989)或連續移動床(CMB) (Ma和Wang 1997)。在TMB中，認為樹脂流沿著液體流的相反方向連續移動，在此情況下該過程變成穩定狀態，且僅剩位置的導數。從這些等式獲得的濃度分布常稱為穩態濃度分布(Ruthven和 Ching 1989)，或駐波濃度分布(Ma和Wang 1997)。之前已顯示，在理想情形下，這兩種方法相同(Guiochon 2006)。完全分離區域用于測定SMB設備中的操作點的廣泛應用的方法是三角形理論(Storti 1989)。 該方法可衍生于用于TMB的理想色譜法。在理想情況下，對傳質和軸向分散的抗性被忽略。逆流方法中的控制參數是和兩相中的濃度相比的兩相的流率之間的比率(Ruthven 1989)。在三角形理論中，流量的比率定為
權利要求
1.將流體混合物中的關注的多肽與至少一種其它組分色譜分離的方法，所述方法包括a)提供逆流提純系統，所述系統包括流體連接的多個部分，所述部分包括至少一個固相和第一解吸劑流；b)將所述流體混合物作為進料流引入所述逆流提純系統，其中所述流體混合物以逆流方式和所述固相接觸；c)通過調節進料流中的至少一種調節劑的濃度而控制等溫線，使得把mm和A作為Qf 或α的函數繪圖時，等溫線的初始斜率和操作線的斜率大約平行；d)進行關注的多肽和至少一種其它組分的分離；和e)收集所述關注的多肽以提供它的提純組合物。
2.根據權利要求1的方法，其中將所述進料流中的至少一種調節劑的濃度控制成不同于所述進料流之前的所述部分，比如所述解吸劑流，中的相同調節劑的濃度。
3.根據權利要求1或2任意一項的方法，其中所述關注的多肽是胰高血糖素樣肽或 GLP-I激動劑。
4.根據權利要求1-3任意一項的方法，其中所述逆流提純系統是離子交換色譜系統。
5.根據權利要求1-4任意一項的方法，其中所述等溫線通過控制所述進料流中的鹽濃度。而控制。
6.根據權利要求1-5任意一項的方法，其中所述進料流中的鹽濃度相對于所述進料流之前的所述部分中的流中的鹽濃度在下列范圍內
7.根據權利要求1-6任意一項的方法，其中所述進料流中的鹽濃度cf在約17.5mmol/kg到約36mmol/kg的范圍內，且所述進料流之前的所述部分中的流中的氯離子濃度約為 45mmol/kg0
8.根據權利要求1-7任意一項的方法，其中所述解吸劑包括選自任何有機或無機鹽和它們的混合物的鹽，比如NaCl、KCl、NH4Cl、CaCl2、乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸銨、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸銨、乙酸鈣或它們的混合物。
9.根據權利要求1-3任意一項的方法，其中所述逆流提純系統是反相色譜(RPC)系統。
10.根據權利要求1-3任意一項的方法，其中所述逆流提純系統是疏水交互作用色譜 (HIC)系統。
11.根據權利要求9的方法，其中所述等溫線通過控制所述進料流中的有機調節劑的濃度而控制。
12.根據權利要求1-3或9-11任意一項的方法，其中所述進料流和所述進料流之前的所述部分中的流中的調節劑之間的差異在下列范圍內
13.根據權利要求1-3或9-12任意一項的方法，其中所述進料流中的調節劑以約27.3 重量％到約四.4重量％的范圍存在，且所述進料流之前的所述部分中的流中的乙醇以約 30. 8重量％存在。
14.根據權利要求1-13任意一項的方法，其中所述逆流提純系統是模擬移動床(SMB) 提純系統。
15.根據權利要求1-13任意一項的方法，其中所述逆流提純系統是多柱逆流溶劑梯度提純(MCSGP)系統。
全文摘要
本發明涉及使用逆流色譜法提純多肽的方法。本發明特別涉及逆流色譜法用于提純重組體GLP-1的用途。
文檔編號B01D15/18GK102271775SQ200980150176
公開日2011年12月7日 申請日期2009年12月8日 優先權日2008年12月8日
發明者S·S·弗雷德里克森 申請人:諾沃-諾迪斯克有限公司