含有甲酰基的多孔性載體、使用該多孔性載體的吸附體以及它們的制造方法

專利名稱：含有甲酰基的多孔性載體、使用該多孔性載體的吸附體以及它們的制造方法
技術領域：
本發明涉及各種吸附體，特別是治療用(醫療用)吸附體和抗體醫藥品精制用吸附體。
背景技術：
多孔性載體已被廣泛用作各種吸附體，例如各種色譜法用吸附體及親和吸附體。 其中，親和吸附體可以高效率地精制目標物，并且能夠降低無用物的濃度，因此已越來越多地被用作醫療用吸附體和抗體醫藥品精制用吸附體。特別是，作為用于治療風濕、血友病、 擴張型心肌病的治療用(醫療用)吸附體，受到關注的是將作為親和配位體的蛋白質A固定化于多孔性載體而得到的吸附體(例如，非專利文獻1、非專利文獻2)。另一方面，作為能夠特異性地吸附、洗脫免疫球蛋白(IgG)的吸附體，備受矚目的是將作為親和配位體的蛋白質A固定化于多孔性載體而得到的吸附體(抗體醫藥品精制用吸附體)。作為將以蛋白質A為代表的各種親和配位體固定化于多孔性載體的方法，可以從例如非專利文獻3的表8. 1和圖8. 15中所示的溴化氰法、三氯三嗪法、環氧法、三氟乙烷磺酰氯法等各種固定化方法中選擇。其中，從安全性的觀點、以及固定化反應的容易程度、能夠使用可通過較容易的方法生產的蛋白質、肽等理由來看，工業上優選將多孔性載體的甲酰基與親和配位體的氨基之間的反應應用于固定化。作為向多孔性載體導入甲酰基的方法，可以列舉通過過碘酸氧化法使具有連位 (m t > )羥基的多糖凝膠氧化、從而在糖鏈上生成甲酰基的方法(以下簡稱為糖鏈開裂型)(例如非專利文獻4)。通過該方法得到的吸附體具有配位體洗脫少的優點。此外，還可以列舉如非專利文獻3的圖8. 15、或非專利文獻5所示地，介由通過使戊二醛發生作用的方法、使環氧基開環得到的甘油基與過碘酸鹽作用的方法等得到的各種間隔團導入甲酰基的方法(以下簡稱為間隔團型)。使用了上述含有間隔團型甲酰基的多孔性載體的吸附體，具有目標物吸附量較大的傾向。此外，在專利文獻1中公開了下述制造方法向多孔性粒子的環氧基中導入氨基糖，并在該氨基糖部分經氧化開裂而生成的甲酰基上固定化含有氨基的配位體。現有技術文獻專利文獻專利文獻1 日本特開昭62-15300非專利文獻非專利文獻 1 =Annals of the New York Academy of Sciences,2005,Vol. 1051， P635-646 非專利文獻 2 =American Heart Journal, Vol. 152(4), 2006非專利文獻3 :親和色譜法，笠井獻一等著，東京化學同人，1991年非專利文獻4 Jmmunology, Vol. 20，pl061,1971
非專利文獻5 !Immobilized Affinity Ligand Techniques,Greg Τ. Hermanson et al. , Academic Press,199
發明內容
發明要解決的問題然而，對于含有糖鏈開裂型甲酰基的多孔性載體而言，糖鏈會因強氧化反應而開裂，導致多孔性載體的強度變弱，可能難以在高線速下使用。另外，就抗體醫藥品精制用吸附體而言，具有對目標物抗體的吸附量小的傾向，難以高速地進行抗體精制。另一方面，對于含有間隔團型甲酰基的多孔性載體而言，如果甲酰基的導入量少，則在治療過程中及精制目標物的過程中，可能發生親和配位體洗脫而混入到患者血液或精制產品的情況，因此從安全性和純度的觀點來看不優選。此外，雖然在通常的親和色譜領域的文獻(例如非專利文獻3和非專利文獻5) 及活性化載體的產品目錄中沒有明確記載，但本發明人等發現在專利文獻1所述方法中， 對多孔性粒子進行環氧化時，無論如何都會發生環氧基自動開環而副產甘油基的情況。這樣，在使氨基糖發生氧化開裂而導入甲酰基時，由所述環氧基開環得到的甘油基也同時被氧化，從而會導入與間隔團型相同的甲酰基，可能使親和配位體變得容易洗脫。本發明是鑒于現有技術存在的上述問題而完成的，目的在于提供可以提高治療和精制的安全性、實現高速化、并進一步提高精制產品的純度的含有甲酰基的多孔性載體、使用該多孔性載體的吸附體、它們的制造方法、以及使用它們的精制方法。解決問題的方法為了解決上述問題，本發明人等進行深入地研究，結果完成了本發明。S卩，本發明涉及含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其包括向具有甲酰基的多孔性粒子中導入間隔團，然后利用過碘酸和/或過碘酸鹽對上述間隔團部分進行氧化，使其轉變為甲酰基，其中，導入間隔團后，多孔性粒子的甲酰基含量為每ImL多孔性粒子中的甲酰基含量為3 μ mol以下。此外，本發明涉及含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其包括在加入酸而將 PH調節至1 6范圍的液體中，使過碘酸或其鹽與多孔性載體或與導入了間隔團的多孔性載體發生作用。此外，本發明涉及含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其包括使過碘酸和/或過碘酸鹽與多孔性載體或與導入了間隔團的多孔性載體在0°c以上且10°C以下的溫度下發生作用。此外，本發明涉及通過上述任意一種含有甲酰基的多孔性載體的制造方法得到的含有甲酰基的多孔性載體。此外，本發明涉及吸附體的制造方法，其包括將含有氨基的配位體固定化于所述的含有甲酰基的多孔性載體上。此外，本發明涉及吸附體的制造方法，其中，在含有下述水溶液的反應液中，將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體，所述水溶液包含選自羧酸鹽、金屬鹵化物及硫酸鹽中的1種以上化合物，且以羧酸鹽為必要成分。此外，本發明涉及吸附體的制造方法，其中，在含有檸檬酸鹽和/或硫酸鹽的反應液中，將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體。此外，本發明涉及吸附體的制造方法，其包括通過亞氨基化及其還原反應這兩步反應來進行將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體，并在亞氨基化反應之后實施穩定化操作。此外，本發明涉及吸附體的制造方法，其中，在將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體時，通過有機硼烷絡合物，使配位體的固定化鍵穩定化并同時使其余的甲酰基鈍化。此外，本發明涉及吸附體，其中，含有氨基的配位體的導入量為每ImL多孔性載體中導入含有氨基的配位體Img以上且500mg以下。此外，本發明涉及吸附體，其中，含有氨基的配位體的導入量為每ImL多孔性載體中導入含有氨基的配位體0. 01 μ mol以上且15 μ mol以下。此外，本發明涉及吸附體的制造方法，其中，所述含有氨基的配位體是蛋白質A。此外，本發明涉及吸附體，其中，從吸附體洗脫到目標物中的配位體濃度的第一次精制 第三次精制的平均值為50ppm以下。此外，本發明涉及吸附體，其在壓縮5%時的壓縮應力為0. OlMPa以上且IMPa以下，壓縮10%時的壓縮應力為0. 03MPa以上且3MPa以下，以及壓縮15%時的壓縮應力為 0. 06MPa以上且5MPa以下。此外，本發明涉及吸附體的制造方法、按照上述制造方法得到的吸附體以及使用上述吸附體的精制方法。此外，本發明涉及精制方法，其中，使用直徑為0.5cm以上且高度為3cm以上的柱。此外，本發明涉及精制方法，其包括以lOOcm/h以上且lOOOcm/h以下的線速進行通液的工序。發明的效果根據本發明，可以提供高強度的含有甲酰基的多孔性載體。本發明的含有甲酰基的多孔性載體可以適用于吸附體，可以得到目標物吸附量大、且配位體的泄漏少的吸附體。 此外，通過本發明的吸附體，可以提高治療和精制的安全性，并提供治療和精制的高速化及
高純度化。發明的
具體實施例方式本發明的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法中，向具有甲酰基的多孔性粒子中導入間隔團，然后利用過碘酸和/或過碘酸鹽對上述間隔團部分進行氧化，使其轉變為甲酰基，其中，導入間隔團后，多孔性粒子的甲酰基含量為每ImL多孔性粒子中的甲酰基含量為3μπι01以下。通過該方法，在導入親和配位體后的吸附體中，配位體的洗脫量少，且可以抑制批次間偏差，并且，可以得到目標物吸附量大的吸附體。為了抑制配位體的泄漏，通常會針對配位體固定化后的還原反應加以研究，而除此之外，本發明人還著眼于在用于導入配位體的含有甲酰基多孔性載體的前驅體階段，即在向具有甲酰基的多孔性粒子導入間隔團之后，對于反應中未使用的多孔性粒子的甲酰基的處理。即，本發明人猜測，未經處理而殘留的多孔性粒子的甲酰基可能是導致洗脫(溶出)發生的原因。對于向具有甲酰基的多孔性粒子中導入間隔團后，對間隔團導入反應中未使用的多孔性粒子的甲酰基的處理方法進行了研究，結果發現在導入間隔團后，得到的多孔性載體中不存在甲酰基、或者存在下述含量的甲酰基每ImL載體中的甲酰基含量為3 μ mol以下。而使用這樣的導入了間隔團的多孔性載體制造含有甲酰基的多孔性載體時，獲得了出乎意料的結果在導入親和配位體后的吸附體中，配位體的洗脫量少，且批次間偏差得到了抑制。由此，可以減輕精制后工序的繁瑣程度，此外，在用于精制抗體醫藥品的情況下，可以提高抗體醫藥品的安全性。導入了間隔團的載體中的甲酰基的含量優選為每ImL載體中的甲酰基含量為
0μ mol以上且3 μ mol以下，進一步優選0 μ mol以上且2 μ mol以下，更優選0 μ mol以上且
1μ mol以下，特別優選0 μ mol以上且0. 5 μ mol以下，最優選0 μ mol以上且0. 3 μ mol以下。可以作為間隔團被導入至本發明的多孔性載體及吸附體的化合物，可以沒有特別限定地使用，為了進一步減少配位體的洗脫量，優選具有環結構的化合物。作為具有環結構的化合物，沒有特別限定，可以列舉例如以環戊烷或環己烷等為代表的僅由碳構成的5元環或6元環，以呋喃糖或吡喃糖等為代表的糖或糖類似物。其中，基于容易獲得等理由，優選糖或糖類似物。此外，從多孔性載體和親和配位體的之間的成鍵更加堅固和/或親和配位體難以解離的觀點來看，更加優選上述糖為還原糖。本發明的多孔性載體中，作為間隔團而被導入的化合物可以沒有特別限定地使用，采用過碘酸氧化法等作為導入甲酰基的方法的情況下，優選具有平伏位具有羥基的碳原子連續存在的部分，所述平伏位具有羥基的碳原子的連續個數為2或3。作為向本發明的多孔性載體中導入間隔團的方法，優選利用含有甲酰基的多孔性粒子和作為間隔團而被導入的化合物的官能團之間的反應。對于含有甲酰基的多孔性粒子的官能團以及作為間隔團而被導入的化合物的官能團，各自并無特別限定，優選采用適于相互反應的組合，也優選使二者之間經由其它其它化合物進行反應。利用含有甲酰基的多孔性粒子的甲酰基的情況下，作為間隔團而被導入的化合物優選具有能夠與甲酰基反應的官能團。作為與甲酰基反應的官能團，只要能夠與甲酰基反應即可，沒有特別限定，通常優選氨基。即，作為間隔團而被導入到本發明的多孔性載體中的化合物含有氨基；作為間隔團被導入的化合物是糖的情況下，更加優選為氨基糖。此外，本發明人等發現在pH 7 11的范圍使具有1，2-二醇結構的伯胺或仲胺與含有甲酰基的多孔性粒子縮合，和任選地，通過對形成的鍵實施還原反應使其穩定化時， 出乎意料的是，可以高效率地將1，2_ 二醇結構導入至載體。上述pH的范圍更優選為8 10，PH特別優選8. 5 9. 5。作為可作為間隔團而被導入到本發明的多孔性粒子中的含有氨基的糖(氨基糖)，并無特別限定，可以列舉選自下組中的一種以上或者它們的鹽酸鹽等鹽等葡糖胺、 半乳糖胺、r y/ ^ >、乳糖胺、巖藻糖胺、甘露糖胺、葡甲胺、阿洛糖胺、阿卓糖胺、核糖胺、阿拉伯糖胺、古洛糖胺、艾杜糖胺、塔羅糖胺、木糖胺、來蘇糖胺、山梨糖胺、塔格糖胺、阿洛酮糖胺、果糖胺、亞氨基環多醇(iminocyclitol)、黏多醣類、糖蛋白類、透明質酸、肝素、 軟骨素、4-硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、以及它們的D構型體、L構型體、消旋體等、含有這些糖作為構成成分的多糖、聚合物、糖脂等。其中，作為間隔團而被導入到本發明的多孔性載體中的糖，更優選為葡糖胺及其衍生物。
作為可作為間隔團而被導入到本發明的多孔性載體中的葡糖胺，并無特別限定， 更優選為D構型體。此外，對于可用于本發明的葡糖胺的制造方法，并無特別限定，可以通過將葡萄糖等進行化學修飾而得到，也可以使用甲殼類等的甲殼、幾丁質、殼聚糖等來源的物質；用于精制抗體醫藥品時，優選為能夠由植物性化合物等獲得的葡糖胺，例如，協和發酵公司制造的被稱作發酵葡糖胺的公知的物質等。此外，從溶解性的觀點來看，可用于本發明的葡糖胺還優選為鹽酸鹽等鹽。此外，作為可作為間隔團而被導入到本發明的多孔性載體中的糖或糖類似物的導入量，優選每ImL多孔性載體中，糖或糖類似物的導入量為1 μ mol以上且500ymol以下。 若每ImL多孔性載體中糖或糖類似物的導入量為1 μ mol以上，則將該多孔性載體用于吸附體時，目標物的吸附量變大，因此優選；若每ImL多孔性載體中糖或糖類似物的導入量為 500 μ mol以下，則可以抑制本發明的多孔性載體的制造成本，因此優選。進一步優選每ImL 多孔性載體中糖或糖類似物的導入量為2 μ mol以上且250 μ mol以下，更優選4 μ mol以上且125 μ mol以下，特別優選6 μ mol以上且50 μ mol以下，最優選8 μ mol以上且25 μ mol以下。可以通過在導入反應終止后對反應溶液中的糖或糖類似物的減少量進行測定的方法、 對反應后的多孔性載體進行滴定的方法(非水滴定等)、元素分析法等求出糖或糖類似物的導入量。此外，向含有甲酰基的多孔性粒子中導入可以作為間隔團而被導入的化合物時， 對于作為間隔團而被導入的化合物的用量并無特別限定，為了達到更適合的導入量，優選為多孔性載體中該官能團含量的0.01摩爾倍以上，和/或，從廢液處理和效率的觀點來看， 優選100摩爾倍以下；進一步優選0. 1摩爾倍以上且50摩爾倍以下；更優選0. 5摩爾倍以上且20摩爾倍以下；特別優選1摩爾倍以上且10摩爾倍以下。對于向多孔性粒子中導入作為間隔團而被導入的化合物時的溶劑，并無特別限定，可以使用水、二甲亞砜、二甲基甲酰胺、二氧雜戊環等常用的有機溶劑，乙醇、甲醇、丙醇等醇，以及選自上述中的2種以上的混合溶劑。此外，對反應液的pH并無特別限定，從反應效率的觀點來看，優選在pH 3以上進行反應，基于官能團的失活、對多孔性載體的損害少的理由，優選PH為13以下，進一步優選 PH為4以上且12以下，特別優選pH為6以上且11以下，最優選pH為7以上且11以下。此外，對導入可以作為間隔團而被導入的化合物時的溫度并無特別限定，基于對反應速度有利的理由，優選為0°c以上，從安全性和對載體的損害的觀點來看，優選為 100°C以下，基于官能團不易失活的理由，進一步優選70°C以下，進一步優選4°C以上且 500C以下，更優選4°C以上且30°C以下，特別優選10°C以上且25°C以下，最優選12°C以上且 18°C以下。此外，優選一邊攪拌或振動一邊進行導入反應，對于每1分鐘的轉速或次數并無特別限定，基于可以均勻攪拌且不對載體產生物理損害的理由，優選1次以上且1000次以下，進一步優選10次以上且500次以下，更優選30次以上且300次以下，特別優選50次以上且200次以下，最優選75次以上且150次以下，特別優選結合各原料的比重之差及載體的強度進行適當調節。對于向多孔性載體中導入可作為間隔團而被導入的化合物的反應時間并無特別限定，基于反應性和對載體的損害較少的理由，優選0. 2小時以上且100小時以下，進一步
9優選0. 5小時以上且50小時以下，更優選1小時以上且M小時以下，特別優選2小時以上且15小時以下，最優選3小時以上且10小時以下，優選結合反應性、pH及反應溫度進行調節。此外，通過向具有甲酰基的多孔性粒子中導入間隔團后對反應中未使用的多孔性粒子的甲酰基進行處理，可以得到本發明的多孔性載體。作為向具有甲酰基的多孔性粒子中導入間隔團后對反應中未使用的多孔性粒子的甲酰基進行處理的方法，并無特別限定，可以列舉使用還原劑進行處理的方法、熱處理方法、使用堿進行處理的方法、使用抗粘連劑進行處理的方法等。作為使用還原劑進行處理的方法，并無特別限定，優選使四氫硼酸鈉等四氫硼酸鹽發揮作用從而進行處理的方法。作為進行還原處理時的溶劑，并無特別限定，可以使用水、二甲亞砜、二甲基甲酰胺、二氧雜戊環等常用的有機溶劑，乙醇、甲醇、丙醇等醇，以及選自上述中的2種以上的混合溶劑。對于進行還原處理時的pH并無特別限定，從安全性的問題來看，優選PH為7以上。此外，為了減輕對載體及間隔團的損害，優選PH為12以下，進一步優選pH為9以上且 12以下，更優選pH為11以上且12以下。此外，對于還原處理溫度并無特別限定，從有利于反應速度的觀點來看，優選為 0°C以上，從安全性以及對載體和間隔團的損害的觀點來看，優選為100°C以下。更優選4°C 以上且70°C以下，特別優選10°C以上且50°C以下，最優選10°C以上且40°C以下。對于還原處理的時間并無特別限定，基于官能團的失活和載體的損害少的理由， 優選0. 01小時以上且50小時以下，進一步優選0. 1小時以上且25小時以下，更優選0. 25 小時以上且10小時以下，特別優選0. 25小時以上且5小時以下，最優選0. 5小時以上且2 小時以下，優選結合反應性、PH及反應溫度進行調節。對于還原次數并無特別限定，從向具有甲酰基的多孔性粒子中導入間隔團后對反應中未使用的多孔性粒子的甲酰基進行完全處理的觀點來看，優選1次以上。此外，在20 次以下時，可減輕對載體和間隔團的損害。進一步優選2次以上且15次以下，更優選2次以上且10次以下，最優選3次以上且7次以下。對還原劑的濃度并無特別限定，從對甲酰基的處理效率的觀點來看，優選0. 0001M 以上，從安全性的問題來看，優選2M以下，進一步優選0. 00IM以上且IM以下，更優選0. 0IM 以上且0. 5M以下，特別優選0. 02M以上且0. 25M以下，最優選0. 05M以上且0. IM以下。作為向具有甲酰基的多孔性粒子中導入間隔團后對反應中未使用的多孔性粒子的甲酰基進行熱處理的方法，并無特別限定，從對反應速度有利的觀點來看，優選50°C以上，從對載體和間隔團的損害的觀點來看，優選150°C以下，進一步優選50°C以上且130°C 以下，更優選80°C以上且130°C以下。作為向具有甲酰基的多孔性粒子中導入間隔團后利用堿對反應中未使用的多孔性粒子的甲酰基進行處理的方法，對于PH并無特別限定，由于當pH為10以上時可實現高效率地處理，因此優選。為了減輕對載體和間隔團的損害，PH優選為13以下。更優選pH為 10以上且12以下，特別優選PH為11以上且12以下。作為向具有甲酰基的多孔性粒子中導入間隔團后利用封閉劑(封止剤)對反應中未使用的多孔性粒子的甲酰基進行處理的方法，并無特別限定，但優選封閉劑為含有與多孔性載體上的活性基團反應的官能團的低分子化合物。越是低分子化合物，則空間位阻越小，因此可以高效率地進行封閉反應(封止反応)。其中，優選使用含有氨基的低分子化合物，作為這類低分子化合物的一例，可以列舉賴氨酸、甘氨酸、單乙醇胺和三(羥甲基)氨基甲烷等。作為向本發明的多孔性粒子中導入間隔團后向所述間隔團上導入甲酰基的方法， 可以列舉過碘酸氧化法。對于可用于本發明的過碘酸和/或過碘酸鹽等并無特別限定，優選使過碘酸鈉或過碘酸鉀等過碘酸鹽發揮作用，從而導入甲酰基。此外，作為本發明的多孔性載體的甲酰基含量，每ImL多孔性載體中的甲酰基含量優選0. 5μπιο1以上且IOOymol以下。每ImL多孔性載體中的甲酰基含量為0. 5 μ mol以上時，可以高效率地將親和配位體固定化，將其用作吸附體的情況下，對目標物的吸附量變大，因此優選。此外，盡管理由還不明確，令人意料之外的是，每ImL多孔性載體中的甲酰基含量為ΙΟΟμπιοΙ以下時，對目標物的吸附量較易變大，因此優選。此外，采用使過碘酸和/ 或過碘酸鹽發揮作用而導入甲酰基的方法的情況下，每ImL多孔性載體中的甲酰基含量為 100 μ mol以下時，多孔性載體的強度較易變大，因此優選。每ImL多孔性載體中的甲酰基含量的更為優選的范圍是Iymol以上且50 μ mol 以下，更優選ι μ mol以上且25 μ mol以下，特別優選1 μ mol以上且10 μ mol以下，最優選 2 μ mol以上且7μπι01以下。甲酰基含量并無特別限定，例如，可根據導入甲酰基反應的時間、溫度、過碘酸和/或過碘酸鹽等的甲酰化劑的濃度等，來調節甲酰基的含量。甲酰基含量的測定可通過下述方法進行向含有甲酰基多孔性載體中加入苯胼溶液，在40°C下攪拌1小時，通過UV測定反應后的上清液的吸收光譜，由苯胼的校正曲線測定苯胼的減少量，從而可求出甲酰基的含量。盡管理由還不確定，本發明人等經過深入研究后發現了下述結果，并基于該結果完成了本發明在加入酸而將PH調節至1 6范圍的液體中，使過碘酸或其鹽發揮作用而得到含有甲酰基的多孔性載體，并將含有氨基的配位體固定化于所得含有甲酰基的多孔性載體來獲得吸附體時，令人感到意外的是，目標物的吸附量變大，此外，含有氨基的配位體的泄漏量變小。S卩，本發明提供吸附體的制造方法，該方法包括在加入酸而將pH調節至1 6范圍的液體中，使過碘酸或其鹽發揮作用而得到含有甲酰基的多孔性載體，在將含有氨基的配位體固定化于上述得到的含有甲酰基的多孔性載體。作為上述過碘酸的鹽，并無特別限定，優選使用過碘酸鈉或過碘酸鉀等。此外，對于可用于本發明的上述酸并無特別限定，可以使用鹽酸、硫酸、硝酸等無機酸或其鹽等。此外，使用檸檬酸、乙酸、酒石酸、鄰苯二甲酸、富馬酸、油酸、乳酸、月桂酸等有機酸或其鹽時，可以獲得反應液的PH緩沖效果，因此更加優選。上述使過碘酸或其鹽發揮作用的pH的范圍優選為2 5。進一步優選為pH 2 4. 5，特別優選為pH 2 4。上述過碘酸或其鹽的濃度優選為5mM以上且300mM以下。濃度在5mM以上時，較容易向載體中導入甲酰基，此外，濃度在300mM以下時，多孔性載體的強度不易減小，因此優選。上述過碘酸或其鹽的濃度進一步優選為5mM以上且250mM以下，更優選為5mM以上且150mM以下。盡管理由還不確定，本發明人等經過深入研究后發現了下述令人意外的結果通過使過碘酸和/或過碘酸鹽在o°c以上且10°C以下的溫度發揮作用而得到含有甲酰基的多孔性載體，并將含有氨基的配位體固定化于所得含有甲酰基的多孔性載體來制造吸附體， 利用該制造方法制造的吸附體對目標物的吸附量變大。上述溫度進一步優選為o°c以上且 8°C以下。本發明的多孔性載體的材質并無特別限定，可以列舉例如多糖類、聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、以及它們的衍生物等。上述材質還可以涂層，所述涂層為甲基丙烯酸羥乙酯等具有羥基的高分子材料或由具有聚氧乙烯鏈的單體與其它聚合性單體形成的共聚物這樣的接枝共聚物等。其中，由于容易向載體表面導入活性基團，因此優選使用多糖類、聚乙烯醇等。其中，本發明的多孔性載體進一步優選含有多糖類。多糖類容易在工業中獲得，另外，對生物體的安全性高，因此優選。對于可用于本發明的多孔性載體的多糖類并無特別限定，可以列舉例如瓊脂糖、纖維素、糊精、殼聚糖、幾丁質、以及它們的衍生物等。此外，本發明的多孔性載體進一步優選含有纖維素和/或纖維素衍生物。由于含有纖維素或纖維素衍生物的多孔性載體的機械強度較高且堅韌，因此被破壞而生成微粒等的情況較少，將其填充至柱中時，即使以高線速流通液體，也比較不易發生壓緊化，因此優選。此外，從強度和成本的觀點來看，本發明的多孔性載體的最優選材質為纖維素。多孔性載體被廣泛用作以治療用(醫療用)吸附體為首的各種色譜法用吸附體和親和吸附體，特別是在抗體醫藥品精制領域，伴隨著抗體醫藥品市場的不斷擴張，精制的大規模化以及高線速化正積極展開。而伴隨著精制的大規模化以及高線速化，有時需要增加精制所使用的吸附體、即多孔性載體(或多孔性粒子)的強度。作為增加多孔性載體(或多孔性粒子)強度的方法，并無特別限定，優選增加多孔性載體(或多孔性粒子)的基質含量(例如樹脂含量)的方法等，從多孔性載體(或多孔性粒子)的細孔徑不易變小的優點來看，進一步優選使交聯劑發揮作用，以增大多孔性載體(或多孔性粒子)的強度。換言之， 本發明的多孔性載體(或多孔性粒子)優選經過交聯。交聯劑和交聯反應條件并無特別限定，可以使用公知的技術進行交聯。例如，可以通過使環氧氯丙烷、環氧溴丙烷、二氯丙醇等鹵代醇，間苯二酚二縮水甘油醚、新戊二醇二縮水甘油醚、1，6_己二醇二縮水甘油醚、氫化雙酚A 二縮水甘油醚、甘油二縮水甘油醚、三羥甲基丙烷二縮水甘油醚、對苯二甲酸二縮水甘油酯、鄰苯二甲酸二縮水甘油酯、乙二醇二縮水甘油醚、二乙二醇二縮水甘油醚、丙二醇二縮水甘油醚等雙官能以上的環氧化合物發揮作用來進行交聯。使用上述交聯劑增加多孔性載體(或多孔性粒子)的強度的方法并無特別限定， 從反應效率的觀點來看，優選在堿性條件下，使上述交聯劑對載體發揮作用。交聯劑的投料方法并無特別限定，可以在反應初期就投入全部用量，也可以將其分為數次重復反應，此外，還可以使用滴液漏斗等一點點地投入交聯劑，或者將多孔性載體投入添加了交聯劑的反應容器中。對交聯反應的溶劑并無特別限定，可以使用水、二甲亞砜、二甲基甲酰胺、二氧雜戊環等常用的有機溶劑，乙醇、甲醇、1-丙醇等醇類，或者上述中2種以上的混合溶劑。此外，為了提高反應效率，進一步優選與硼氫化鈉等還原劑共存。對交聯反應時的溫度并無特別限定，基于對反應速度有利的理由，優選0°C以上， 和/或，從安全性以及對多孔性載體(或多孔性粒子)的損害的觀點來看，優選100°c以下， 基于官能團不易失活的理由，進一步優選70°C以下。優選一邊攪拌或振動一邊進行交聯反應，對于其每1分鐘的轉速或次數并無特別限定，基于可以均勻攪拌且不對多孔性載體(或多孔性粒子)產生物理損害的理由，優選每 1分鐘1次以上且1000次以下，進一步優選10次以上且500次以下，更優選30次以上且 300次以下，特別優選50次以上且200次以下，最優選75次以上且150次以下，優選結合各原料的比重之差及多孔性載體(或多孔性粒子)的強度進行調節。對交聯反應的時間并無特別限定，基于官能團失活以及對載體損害少的理由，使用鹵代醇的情況下，優選1小時以上且8小時以下，使用雙官能以上的環氧化合物的情況下，優選1小時以上且低于15小時，進一步優選結合交聯劑的反應性、PH及反應溫度進行調節。此外，本發明優選在下述水溶液中，將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體，所述水溶液包含選自羧酸鹽、金屬鹵化物及硫酸鹽中的1種以上化合物，且以羧酸鹽為必要成分。作為上述羧酸鹽并無特別限定，可以使用例如乙酸鈉、乳酸鈉、乳酸鈣、檸檬酸鈉、 酒石酸氫鉀、油酸鉀、月桂酸鈉、苯二甲酸鈉、苯二甲酸鉀、富馬酸鈉、富馬酸鉀、酒石酸鈉、 酒石酸鉀等，特別優選檸檬酸鈉。上述羧酸鹽在水溶液中的濃度并無特別限定，優選0. OlM以上且5M以下。若在 0. OlM以上，則容易增大配位體的固定化量，因此優選；從制造成本的觀點來看，優選5M以下。上述羧酸鹽水溶液的濃度進一步優選0. 05M以上且3M以下，更優選0. IM以上且1. 5M 以下，特別優選0. 25M以上且IM以下，最優選0. 4M以上且0. 8M以下。對上述金屬鹵化物并無特別限定，優選使用例如氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、 氯化鎂等。此外，對上述金屬鹵化物在水溶液中的濃度并無特別限定，優選0. 00IM以上且 IM以下。若在0. 005M以上，則目標物的吸附量變大，因此優選；從成本的觀點來看，優選在 IM以下。上述金屬鹵化物在水溶液中的濃度進一步優選為0. OlM以上且0. 75M以下，更優選0. 05M以上且0. 5M以下，特別優選0. 075M以上且0. 5M以下。此外，本發明人等發現作為更優選的實施方式，在含有檸檬酸鹽和/或硫酸鹽的反應液中，將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體上時，與使用不含有檸檬酸鹽和/或硫酸鹽的反應液的情況相比，含有氨基的配位體的固定化量和/或固定化率變大。這一點可適用于本發明。對于可用于本發明的檸檬酸鹽或硫酸鹽并無特別限定，作為檸檬酸鹽，可以列舉例如檸檬酸單鈉、檸檬酸單鉀等檸檬酸單堿金屬鹽，檸檬酸二鈉、檸檬酸二鉀等檸檬酸二堿金屬鹽，檸檬酸三鈉、檸檬酸三鉀等檸檬酸三堿金屬鹽，檸檬酸單鐵鈉、檸檬酸鐵、檸檬酸鐵銨、檸檬酸鉀、異檸檬酸或其鹽等，其中，上述化合物可以單獨使用1種，也可以使用2種以上，此外，還可以使用其水合物、酸酐。作為硫酸鹽，可以使用例如硫酸鋰、硫酸鈉、硫酸鉀等堿金屬硫酸鹽，此外，還可以使用其水合物、酸酐。此外，在含有上述檸檬酸鹽和/或硫酸鹽的反應液中，還可以其它包含其它物質， 作為其它物質，可以列舉例如氯化鈉、氯化鉀、碳酸鹽、磷酸鹽、乙酸、乙酸鈉等乙酸鹽、三乙胺等胺類等。此外，在本發明的制造方法中，對上述反應液中的檸檬酸和/或硫酸鹽的濃度沒有特別限定，優選為0. 01 2M。檸檬酸和/或硫酸鹽的濃度在0. OlM以上時，配位體的固定化量和/或固定化率變大，因此優選。此外，檸檬酸和/或硫酸鹽的濃度在2M以下時，可縮減成本并且使反應液的粘度降低，因此優選。檸檬酸和/或硫酸鹽的濃度進一步優選為 0. 05 1. 9M,更優選0. 1 1. 7M,特別優選0. 25 1. 5M,最優選0. 4 1M。此外，對上述含有檸檬酸鹽和/或硫酸鹽的反應液中可以含有的其它所述其它物質的濃度并無特別限定，優選為0. 001 1M。上述其它物質的濃度在0. OOlM以上時，吸附體的各種性能均改善，因此優選。此外，上述其它物質的濃度在IM以下，可縮減成本并且使反應液的粘度降低，另外還容易顯示出檸檬酸和/或硫酸鹽所帶來的效果，因此優選。上述其它物質的濃度進一步優選為0. 005 0. 7M，更優選0. 01 0. 5M，特別優選0. 05 0. 5M， 最優選0. 1 0. 25M。此外，在本發明的制造方法中，上述反應液的PH并無特別限定，優選為7 13。上述反應液的PH為7以上時，配位體的固定化量和/或固定化率增大，因此優選。此外，上述反應液的PH在13以下時，對吸附體的基體材料及配位體的損害較少，因此優選。此外，在pH為11. 5以上且低于13. 0的反應液中將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體時，可使含有氨基的配位體的固定化量和/或固定化率變大，因此進一步優選。PH更優選為11. 5以上且低于12. 6，特別優選11. 5以上且低于12. 3，最優選 11. 6以上且低于12. 1。可以使用由pH為3 5、6 7、9 10的標準溶液進行3點校正的PH計來進行pH的測定。此外，本發明人等經過深入研究，還發現了下述的令人意外的結果在通過亞氨基化及其還原反應這兩步反應來進行將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體時，與未實施穩定化操作的情況相比，在亞氨基化反應之后實施穩定化操作的情況下，在用作吸附體時能夠增大對目標物的吸附量。S卩，本發明還提供一種吸附體的制造方法，其包括通過亞氨基化及其還原反應這兩步反應來進行將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體，并在亞氨基化反應之后實施穩定化操作。本發明中的亞氨基化反應之后的穩定化操作，是指在亞氨基化反應之后，將反應液的PH調節為還原反應的pH士 1以內，并在不加入還原劑的情況下進行攪拌、振蕩或放置。此外，對上述穩定化操作的時間并無特別限定，優選為1小時以上且48小時以內。 穩定化時間在1小時以上時，可進一步增大吸附體對目標物的吸附量，因此優選；穩定化時間在48小時以內時，從制造成本的觀點考慮更為優選。穩定化時間進一步優選在1小時以上且M小時以內，更優選1小時以上且15小時以內，特別優選2小時以上且15小時以內。此外，所述亞氨基化反應后的穩定化操作，優選在pH為2 10的條件下實施。穩定化操作的PH為2以上時，從制造裝置的耐久性和安全性的觀點來看優選，pH為10以下時，可進一步增大吸附體對目標物的吸附量，因此優選。穩定化操作的PH進一步優選為2 9，更優選2 8。此外，從pH穩定性的觀點來看，本發明的亞氨基化反應、穩定化操作、還原反應優選在緩沖液中進行。對可以在本發明中使用的緩沖液并無特別限定，優選使用現有公知的緩沖液。此外，上述緩沖液優選含有至少1種以上能夠具有二價以上陰離子的鹽。盡管理由還不確定，但令人感到意外的是，當本發明的亞氨基化反應、穩定化操作、還原反應在含有至少1種以上能夠具有二價以上陰離子的鹽的緩沖液中進行時，可使含有氨基的配位體的固定化量進一步增加，因此優選。作為能夠具有二價以上陰離子的鹽，并無特別限定，可以使用例如檸檬酸鹽、草酸鹽、苯二甲酸鹽、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、乙二胺四乙酸鹽等多元羧酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽等。對緩沖液中能夠具有二價以上陰離子的鹽的濃度并無特別限定，優選0. OlM以上且5M以下。當其濃度在0. OlM以上時，容易增大配位體的固定化量，因此優選；當其濃度在 5M以下，從制造成本的觀點來看優選。上述羧酸鹽在水溶液中的濃度進一步優選為0. 05M 以上且3M以下，更優選0. IM以上且1. 5M以下，特別優選0. 25M以上且IM以下，最優選0. 4M 以上且0. 8M以下。此外，上述緩沖液進一步優選含有多元羧酸鹽和/或中性鹽。作為中性鹽，沒有特別限定，可以列舉例如硫酸鈉、氯化鈉、硝酸鈉、氯化鉀、氯化鋰、氯化鎂、氯化鈣等。此外，上述緩沖液更優選含有檸檬酸鹽。作為檸檬酸鹽，并無特別限定，可以列舉例如檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸鋰等。此外，上述含有檸檬酸鹽的緩沖液優選含有金屬鹵化物和硫酸鹽中的至少一種以上。對上述金屬鹵化物并無特別限定，優選使用例如氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂等。此外，對上述金屬鹵化物和/或硫酸鹽在緩沖液中的濃度并無特別限定，優選0. OOlM 以上且IM以下。當濃度為0.005M以上時，對目標物的吸附量增大，因此優選，當濃度為IM 以下時，從成本的觀點來看優選。進一步優選為0. OlM以上且0. 5M以下，更優選0. 05M以上且0. 75M以下，特別優選0. 075M以上且0. 5M以下，最優選0. IM以上且0. 3M以下。此外，本發明人等還發現了下述令人意外的結果在將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體時，如果通過有機硼烷絡合物使配位體的固定化鍵穩定化并同時使其余的甲酰基鈍化，則吸附體對目標物的吸附量增大。即，本發明還涉及吸附體的制造方法，其中，在將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體時，通過有機硼烷絡合物，使配位體的固定化鍵穩定化并同時使其余的甲酰基鈍化。這里，所述其余的甲酰基，是指多孔性載體上的甲酰基中，在固定化含有氨基的配位體時未被使用的殘留的甲酰基。若所述其余的甲酰基未被鈍化，則在將多孔性載體用作吸附體時，可能會引起非特異吸附。盡管本發明中使用了通常作為較弱還原劑使用的有機硼烷絡合物，但本發明的特征在于即使未使用在使用弱還原劑時通常被用作鈍化劑的含有氨基的低分子量化合物 (例如，單乙醇胺、甘氨酸、三(羥甲基)氨基甲烷等)、所謂的抗粘連劑，也能夠使其余的甲
酰基鈍化。此外，在含有羧酸鹽的反應液中實施通過上述有機硼烷絡合物使配位體的固定化鍵穩定化并同時使其余的甲酰基鈍化的操作時，能夠進一步促進配位體的固定化鍵的穩定化以及其余的甲酰基的鈍化，因此優選。對于可用于本發明的羧酸鹽并無特別限定，可以列舉例如乙酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽、苯二甲酸鹽、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、乙二胺四乙酸鹽等，作為這些羧酸鹽的陽離子種類，并無特別限定，可以使用例如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣等。其中，從成本的觀點來看， 可優選使用檸檬酸鹽，特別是檸檬酸的堿金屬鹽。此外，對羧酸鹽在反應液中的濃度并無特別限定，當其濃度在0. OlM以上時，可以進一步促進配位體的固定化鍵的穩定化以及其余的甲酰基的鈍化，因此優選。此外，當羧酸鹽的濃度在2M以下時，不僅可以降低成本，而且可以降低反應液的粘度，此外，從操作性方面來看，也更為優選。羧酸鹽的濃度進一步優選為0. 05 1. 9M,更優選0. 1 1. 7M,特別優選0. 25 1. 5M,最優選0. 4 IM0此外，上述應液中可以含有除羧酸鹽以外的其它物質，例如，優選含有金屬鹵化物和硫酸鹽中的至少一種以上。對上述金屬鹵化物并無特別限定，可優選使用例如氯化鋰、 氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂等。此外，對上述金屬鹵化物和/或硫酸鹽在緩沖液中的濃度并無特別限定，優選為0. OOlM以上且IM以下。當其濃度在0. 005M以上時，對目標物的吸附量變大，因此優選，當其濃度在IM以下時，從成本的觀點來看優選。其濃度進一步優選為0. OlM以上且0. 5M以下，更優選為0. 05M以上且0. 75M以下，特別優選為0. 075M以上且 0. 5M以下，最優選為0. IM以上且0. 3M以下。此外，通過上述有機硼烷絡合物使配位體的固定化鍵穩定化并同時使其余的甲酰基鈍化的操作，優選實施1小時以上且48小時以下。上述操作實施1小時以上時，可進一步促進配位體的固定化鍵穩定化以及其余的甲酰基的鈍化，因此優選；從制造成本的觀點來看，上述操作優選實施48小時以下。上述操作時間進一步優選為2小時以上且M小時以下，更優選3小時以上且20小時以下，特別優選4小時以上且15小時以下，最優選5小時以上且10小時以下。此外，作為可用于本發明的上述有機硼烷絡合物，并無特別限定，盡管理由尚不明確，令人感到意外的是上述有機硼烷絡合物為胺合硼烷絡合物(包括氨基硼烷)時，更容易促進其余的甲酰基鈍化，因此優選。作為可用于本發明的氨基硼烷絡合物，并無特別限定，可以列舉例如4-( 二甲基氨基)吡啶硼烷、N-乙基二異丙基胺合硼烷、N-乙基嗎啉硼烷、N-甲基嗎啉硼烷、N-苯基嗎啉硼烷、二甲基吡啶硼烷、三乙胺硼烷、或三甲基胺合硼烷、 4-( 二甲基胺)吡啶硼烷、N-乙基二異丙基胺合硼烷、N-乙基嗎啉硼烷、N-甲基嗎啉硼烷、 N-苯基嗎啉硼烷、二甲基吡啶硼烷、硼烷氨、二甲胺硼烷、吡啶硼烷、4-甲基吡啶硼烷、N’， N-二乙基苯胺硼烷、N’，N-二異丙基乙基胺硼烷、2，6_ 二甲基吡啶硼烷、硼烷合胺、三(二甲基氨基)硼烷、三甲基氨基硼烷、環硼氮烷、1，3，5_三甲基環硼氮烷、2，4，6_三甲基環硼氮烷、六甲基環硼氮烷等。其中，從在反應液中的溶解性和安全性的觀點來看，特別優選二甲胺硼烷。此外，本發明的亞氨基化反應、穩定化操作、還原反應的操作溫度優選為-10 40°C。上述操作溫度在-10°C以上時，從反應液的流動性的觀點來看進一步優選；上述操作溫度在40°C以下時，親和配位體和多孔性載體的甲酰基不易失活，因此進一步優選。操作溫度進一步優選為-5 35°C，更優選為0 30°C。此外，每ImL多孔性載體中，本發明吸附體中的親和配位體的導入量優選為Img以上且500mg以下。每ImL多孔性載體的親和配位體的導入量為Img以上時，對目標物的吸
16附量增大，因此優選；在500mg以下時，可使生產成本得到抑制，因此優選。每ImL多孔性載體的親和配位體的導入量進一步優選為ang以上且120mg以下，更優選為:3mg以上且60mg 以下，特別優選為^ig以上且30mg以下，最優選為^ig以上且15mg以下。此外，每ImL多孔性載體中，本發明吸附體中的親和配位體的導入量優選為 0. 01 μ mol以上且15 μ mol以下。每ImL多孔性載體的親和配位體的導入量為0. 01 μ mol 以上時，對精制目標物的吸附量增大，因此優選；在15 μ mol以下時，可使生產成本得到抑制，因此優選。每ImL多孔性載體的親和配位體的導入量進一步優選為0. 03 μ mol以上且 5 μ mol以下，更優選0. 05 μ mol以上且2 μ mol以下，特別優選0. 1 μ mol以上且0. 75 μ mol 以下，最優選0. 1 μ mol以上且0. 5 μ mol以下。通過測定固定化反應后的反應液上清液中來自親和配位體的吸光度，可以求出親和配位體的導入量。此外，可以采用元素分析法求出親和配位體的導入量。例如，對于含有氨基的親和配位體而言，通過對吸附體進行N含量分析，可以測定親和配位體的導入量。作為用于治療用(醫療用)吸附體或抗體醫藥品精制用吸附體等情況下的親和配位體，并無特別限定，可以列舉例如對抗體顯示高度特異性的抗原或蛋白質、蛋白質G、L 或其變異體、具有抗體結合活性的肽等。特別是，作為可以特異性地吸附、洗脫免疫球蛋白 (IgG)等的吸附體，受到關注的是將蛋白質A作為親和配位體固定化于載體而得到的吸附體。備受關注的是將固定化有蛋白質A的吸附體用作風濕病、血友病、擴張型心肌病的治療用吸附體。此外，在抗體醫藥精制領域，期待一種能夠以大規模、高速以及低成本實現對IgG 等抗體的精制的吸附體。由上述觀點來看，本發明的吸附體優選為導入了作為親和配位體的蛋白質A的吸附體。對于可用于本發明的蛋白質A并無特別限定。可以不受限制地使用天然物、基因重組物等。此外，還可以使用含有抗體結合位點及其變異體、融合蛋白等。此外，也可以使用由菌體提取物或培養上清液、通過組合使用和/或重復進行下述精制法而之比的蛋白質 A，所述精制法選自利用了下述技術的分子量分級、分級沉淀法等方法離子交換色譜法、疏水性相互作用色譜法、凝膠過濾色譜法、羥基磷灰石層析法等各種色譜法以及膜分離技術。 特別優選通過國際公開專利公報W02006/004067、美國專利公報US5151350中所述方法得到的蛋白質A。此外，使用本發明的吸附體進行精制時，從吸附體洗脫到目標物中的配位體濃度的第一次精制 第三次精制的平均值優選為50ppm以下。當洗脫到目標物中的配位體濃度的第一次精制 第三次精制的平均值在50ppm以下時，可以提高治療和精制的安全性，還可以提高目標物的純度，而且可以減輕精制中后續工序的繁瑣程度，因此優選。洗脫到目標物中的配位體濃度進一步優選為Oppm以上且40ppm以下，更優選Oppm以上且30ppm以下， 特別優選Oppm以上且25ppm以下，最優選Oppm以上且20ppm以下。洗脫到目標物中的配位體濃度可以按照Steindl F. et al. ,Journal of Immunological Methods,Vol. 235(2000), 61-69中記載的方法求出。為了進一步減少本發明的吸附體中含有氨基的配位體的泄漏量，優選對吸附體進行清洗。對清洗劑和清洗方法并無特別限定，優選使用含有選自水、乙酸、醇、各種有機溶劑、pH2 5的液體、pH8 13的液體、氯化鈉、氯化鉀、乙酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、緩沖劑、表面活性劑、尿素、胍、胍鹽酸鹽、其它再生劑等中的至少1種溶液等進行通液，或者投入上述溶液等并進行攪拌。此外，使用同種或者不同溶液進行數次清洗時，可以進一步減少配位體的泄漏量，因此優選。此外，每ImL吸附體中，本發明吸附體對目標物的吸附量優選為Img以上。若每 ImL吸附體對目標物的吸附量在Img以上，則可以實現高效率的精制，因此優選。此外，若每ImL吸附體對目標物的吸附量在IOOmg以下，則吸附的目標物容易從吸附體上洗脫，因此優選。每ImL吸附體中，吸附體對目標物的吸附量進一步優選為5mg以上且90mg以下，更優選IOmg以上且80mg以下，特別優選20mg以上且70mg以下，最優選30mg以上且60mg以下。可以按照下述方法求出目標物的吸附量。作為求算目標物吸附量的方法，并無特別限定，可以通過靜態吸附量或動態吸附量求出。例如，測定靜態吸附量的情況下，對于以 PH7. 4的磷酸緩沖液(Sigma公司制造)置換的吸附體0. 5mL,使其與將70mg的目標物溶解于35mL的pH7. 4的磷酸緩沖液(Sigma公司制造)中而得到的溶液接觸，并在25°C攪拌2 小時，然后通過測定上清液中目標物的減少量來求算目標物的吸附量。優選本發明的吸附體在壓縮5%時的壓縮應力為0. OlMPa以上且IMPa以下、壓縮 10%時的壓縮應力為0. 03MPa以上且3MPa以下、壓縮15%時的壓縮應力為0. 06MPa以上且 5MPa以下。當吸附體壓縮5%時的壓縮應力為0. OlMPa以上、壓縮10%時的壓縮應力為 0. 03MPa以上、以及壓縮15%時的壓縮應力為0. 06MPa以上時，容易獲得在高線速進行通液時也不會產生壓緊化的吸附體，因此優選。此外，若吸附體壓縮5%時的壓縮應力為IMPa以下、壓縮10%時的壓縮應力為3MPa以下、以及壓縮15%時的壓縮應力為5MPa以下，則其脆性提高，可以抑制微粒子的產生，因此優選。此外，壓縮應力進一步優選為壓縮5%時的壓縮應力為0. 02MPa以上且IMPa以下、壓縮10%時的壓縮應力為0. 06MPa以上且3MPa以下、以及壓縮15%時的壓縮應力為 0. 09MPa以上且5MPa以下。壓縮應力最優選為壓縮5%時的壓縮應力為0. 04MPa以上且 IMPa以下、壓縮10%時的壓縮應力為0. 08MPa以上且3MPa以下、壓縮15%時的壓縮應力為 0. IlMPa以上且5MPa以下。這里，所述壓縮5%時的壓縮應力，是指吸附體被壓縮至體積較初始體積減少5% 時的應力；所述壓縮10%時的壓縮應力，是指吸附體被壓縮至體積較初始體積減少10%時的應力；所述壓縮15%時的壓縮應力，是指吸附體被壓縮至體積較初始體積減少15%時的應力。所述初始體積是指，對含有吸附體的漿料施以振動的同時，使其發生沉降填充，直至達到吸附體的體積不再減少的狀態時的體積。此外，對于本發明吸附體的單位填充體積中的樹脂含量并無特別限定，優選2%以上且50%以下。當單位填充體積的樹脂含量為2%以上時，可以得到即使以大規模、高線速進行精制也不會產生壓緊化的吸附體，因此優選。此外，單位填充體積的樹脂含量在50%以下時，可以確保能夠使精制目標物通過的充分的孔，因此優選。此外，單位填充體積的樹脂含量進一步優選的范圍是3%以上且25%以下，更優選4%以上且15%以下。對于單位填充體積的樹脂含量而言，通過調節多孔性載體的量，使其沉降并填充直至多孔性載體的體積不再減少時，多孔性載體的體積為lmL。將該載體在105°C干燥12 小時，可以由ImL凝膠的干燥重量(g)求出ImL凝膠的干燥重量百分比，即樹脂含量。
此外，對于本發明的吸附體，其體積平均粒徑優選為20μπι以上且ΙΟΟΟμπι以下。 多孔性載體的體積平均粒徑在20 μ m以上時，不易產生壓緊化，因此優選，體積平均粒徑在 ΙΟΟΟμπι以下時，用于吸附體時對目標物的吸附量變大，因此優選。多孔性載體的體積平均粒徑進一步優選的范圍是30 μ m以上且250 μ m以下，更優選40 μ m以上且125 μ m以下，特別優選50 μ m以上且100 μ m以下，最優選60 μ m以上且85 μ m以下。可以通過測定隨機選取的100個多孔性載體的粒徑來求算體積平均粒徑。各個多孔性載體的粒徑，可以通過下述方法測定拍攝各個多孔性載體的顯微鏡照片，以電子數據的形式保存，并利用粒徑測定軟件(Media Cybernetics公司制造的Image-Pro Plus)進行測定。通過本發明的吸附體和/或本發明的制造方法制造的吸附體，可以用于使用親和色譜法對各種目標物進行的精制、非專利文獻3中公開的各種精制方法、以及治療用(醫療用)吸附體。精制方法和治療方法并無特別限定，優選使用非專利文獻1、2、3以及其它公知方法。此外，本發明的吸附體可實現對目標物的大規模、高速且低成本地精制。因此，使用本發明的吸附體進行精制或治療時，優選使用直徑為0. 5cm以上且高度為3cm以上的柱。 柱的直徑為0. 5cm以上且高度為3cm以上時，可以高效率地進行精制或治療。此外，從精制或治療的精度和效率的觀點來看，柱的大小優選直徑為2000cm以下且高度為5000cm以下。柱的大小進一步優選直徑為2cm以上且200cm以下、高度為5cm以上且300cm以下，更優選直徑為5cm以上且100cm以下以及高度為8cm以上且150cm以下，特別優選直徑為IOcm以上且85cm以下以及高度為12cm以上且85cm以下，最優選直徑為20cm以上且 85cm以下以及高度為14cm以上且:35cm以下。此外，使用本發明的吸附體進行治療或精制時，優選包括以lOOcm/h以上的線速進行通液的工序。若具有以lOOcm/h以上的線速進行通液的工序，則可以高效率地進行治療或精制，因此優選。此外，從治療或精制的精度和裝置的耐久性的觀點來看，使用本發明的吸附體進行治療或精制時，優選以lOOOcm/h以下的線速進行。精制的線速進一步優選為 150cm/h以上且800cm/h以下，更優選250cm/h以上且750cm/h以下，特別優選300cm/h以上且700cm/h以下，最優選:350cm/h以上且700cm/h以下。與未使用本發明技術方案的情況相比，本發明的多孔性載體、使用該多孔性載體的吸附體、它們的制造方法以及使用它們的精制方法，可以實現高速的精制，提供純度高且安全性高的精制產品。
實施例以下，針對本發明的實施例進行說明，但本發明并不限定于這些實施例。需要說明的是，對于反應投料時的多孔性粒子以及多孔性載體的體積，若無特別記載，是指自然沉降體積。自然沉降體積是指，將由多孔性載體和RO水形成的漿料投入計量容器中，在無振動的狀態下靜置2小時以上，直至體積不再減少時的體積。此外，對于官能團含量中的多孔性載體的體積，若無特別記載，是指將由多孔性載體和RO水形成的漿料投入計量容器中，施以振動的同時使其沉降，直至體積不再減少時的狀態下的體積。(甲酰基含量的測定)甲酰基含量是指，使以pH 8的0. IM磷酸緩沖液置換后的多孔性載體(或多孔性粒子)2mL與溶解了苯胼的pH 8的0. IM磷酸緩沖液溶液2mL接觸，在40°C攪拌1小時，通過UV測定對反應液的上清液在278nm附近最大吸收處的吸光度進行測定，由此可估算出苯胼在多孔性載體(或多孔性粒子)的吸附量。此時，使苯胼的投料量為預想的甲酰基含量的 3摩爾倍，而在多孔性載體(或多孔性粒子)中的吸附量為苯胼投料量的15%以下或45% 以上的情況下，要重新調整苯胼的投料量，再次進行測定。(壓縮應力的測定)向內徑為15mm的玻璃制量筒中投料多孔性粒子或吸附體占50Vol%的漿料。對多孔性粒子或吸附體的量進行調節，使得在邊對玻璃制量筒施以振動邊使漿料發生沉降填充直至多孔性粒子或吸附體的體積不再減少時，多孔性粒子或吸附體的體積達到4mL。將此時的體積視為初始體積。將金屬制活塞(加工成不會與量筒的內壁發生摩擦、且不會使多孔性粒子或吸附體洗脫的形態)安裝在裝載有20N用負載傳感器的自動繪圖儀(SHIMADZU制 EZ-TEST)上。使活塞的底面與相當于多孔性粒子或吸附體的120vOl%的位置對齊。為了不產生氣泡，以5mm/min的試驗速度使活塞下降，壓縮多孔性粒子或吸附體使其體積減少， 以測定任意點的壓縮應力。(葡糖胺固定化量的定量)將多孔性載體ImL轉移至玻璃過濾器(TOP公司制造的3G4)，使用凝膠3倍量的 0. OlN氫氧化鈉溶液置換3次，使用凝膠3倍量的RO水清洗6次。然后，進行5分鐘抽吸過濾(抽吸干燥)，用乙酸(和光純藥工業制造)進行置換。使用非水滴定用乙酸(和光純藥工業制造)將置換后的凝膠轉移至50mL燒杯中，并稀釋、“r"、至30mL。使用電位差自動滴定裝置(KEM公司制造AT-610)，以0. 004N高氯酸/乙酸(使用非水滴定用乙酸對 0. IM高氯酸/乙酸溶劑進行稀釋和光純藥工業制造)對其滴定，求出葡糖胺固定化量。(動態吸附量、以及泄漏到目標物中的配位體濃度的測定)(1)制備溶液以pH7. 4的磷酸緩沖液(Sigma公司制造)作為A液、以pH3. 5的35mM乙酸鈉作為B液(使用和光純藥工業公司制造的乙酸、乙酸鈉和RO水配制而成)、以IM乙酸(使用和光純藥工業公司制造的乙酸和RO水配制而成)作為C液、以lmg/mL的人多克隆IgG溶液(使用Baxter公司制造的Gammagard與A液配制而成)作為D液、以6M尿素作為E液、 以添加了相對于A液為0. 2Vol%的表面活性劑(和光純藥工業公司制造的聚氧乙烯00) 失水山梨醇單月桂酸酯)的溶液作為F液、制備2M的三(羥甲基)氨基甲烷(使用Sigma 公司制造的三(羥甲基)氨基甲烷和RO水配制而成)作為中和液，并在使用前對各溶液實施脫泡。(2)填充、準備使用AKTAexplorer 100 (GE Healthcare Bioscienc 公司制造)作為柱色譜法用裝置，在直徑0. 5cm、高度15cm的柱中安裝22 μ m的網篩，分別裝入本發明的吸附體3mL，以 450cm/h的線速通液20%的乙醇水溶液(使用和光純藥工業公司制造的乙酸和RO水配制而成)1小時進行填充。在餾分收集器中設置15mL的采樣用試管，預先在溶出液的采樣用試管中裝入中和液。(3) IgG 的精制以300cm/h的線速通液A液9mL，然后，邊監測UV邊以300cm/h的線速通液D液，
20直至10%的IgG穿透(破過)。然后，以300cm/h的線速通液A液30mL，以300cm/h的線速通液B液30mL，使IgG洗脫。然后以300cm/h的線速通液C液9mL，并以300cm/h的線速通液E液9mL。繼續重復進行2次吸附體填充終止后的操作2次，由此求出溶出液中的IgG 量和向IgG中泄漏的配位體濃度。(制造例1)使用90 μ m的網篩(NONAKA RIKAKI制，線徑63 μ m)和分級機(筒井理化學器械公司制造的300-MM)，對體積平均粒徑為92 μ m、樹脂含量為6%、分子量排阻極限為5000萬的多孔性纖維素粒子(Chisso公司制造的CK-A)進行濕式分級2小時，得到體積平均粒徑為83 μ m的多孔性粒子A。向2. 3L的多孔性粒子A中加入RO水，使其體積為2. 78L，再將其轉移至可拆卸式燒瓶中。向其中加入4N NaOH(使用和光純藥工業公司制造和RO水進行調整)0. 246L。此外，加入硼氫化鈉3. 3g，并在水槽中升溫至40°C。向其中加入含有作為交聯劑的丙三醇多縮水甘油醚的Denacol EX314(Nagase Chemtex公司制造)1. 64L，在40°C攪拌5小時。反應終止后，一邊在玻璃過濾器(TOP公司制造的^G-幻上進行抽濾，一邊用多孔性粒子20 倍體積量的RO水清洗，得到交聯多孔性粒子。該交聯多孔性粒子在壓縮5%時的壓縮應力為0. 020MPa、壓縮10%時的壓縮應力為0. 049MPa、壓縮15%時的壓縮應力為0. 080MPa。向得到的交聯多孔性粒子中加入RO 7jC,使其總量為交聯多孔性粒子的2倍體積量，加入到玻璃制燒杯(IL)中，以2片鋁箔封口，使用高壓釜(Mkura公司制造的高壓滅菌器Neoclave)在120°C加溫40分鐘。自然冷卻至室溫后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的 ^GD上以多孔性粒子5倍體積量的RO水進行清洗，得到環氧基轉變成了甘油基的交聯多孔性粒子。然后，向上述經過高壓釜加溫后的多孔性粒子2. 3L中加入RO水至體積為2. 78L， 將其轉移至可拆卸式燒瓶中。向其中加入4N-NaOH (使用和光純藥工業公司制造與RO水進行調整)0. 246L。此外，加入硼氫化鈉3. 3g，在水槽中升溫至40°C。向其中加入Denacol EX314 (Nagase Chemtex公司制造)1. 64L，在40°C攪拌5小時。反應終止后，一邊在玻璃過濾器(TOP公司制造^GD上進行抽濾，一邊用多孔性粒子20倍體積量的RO水清洗，得到交聯多孔性粒子。該交聯多孔性粒子在壓縮5%時的壓縮應力為0. 020MPa、壓縮10%時的壓縮應力為0. 049MPa、壓縮15%時的壓縮應力為0. 080MPa。向得到的交聯多孔性粒子中加入RO水，使其總量為交聯多孔性粒子的2倍體積量，加入到玻璃制燒杯(IL)中，以2片鋁箔封口，使用高壓釜(Mkura公司制造的高壓滅菌器Neoclave)在120°C加溫40分鐘。自然冷卻至室溫后，在玻璃過濾器(TOP公司制造 26G-2)所以多孔性粒子5倍體積量的RO水進行清洗，得到多孔性粒子B。(實施例1)向制造例1的多孔性粒子B 523mL中加入RO水，使其總量為784. 5mL,加入到2L 的可拆卸式燒瓶中，并將該燒瓶安裝在25°C的恒溫槽(Tomas科學公司制造的恒溫水浴鍋 T-2S)中。然后，將過碘酸鈉(和光純藥工業制造)溶解于RO水中，制備11.5mg/mL的過碘酸鈉水溶液523mL，將該溶液加入可拆卸式燒瓶中，在25°C以120rpm的轉速攪拌1小時。反應后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的^GD上以RO水進行清洗，直至濾液的電導率達到 5μ S/cm以下。隨后向得到的多孔性粒子中加入RO水，使其總量為784. 5mL，將其加入到可拆卸式燒瓶中，并將該可拆卸式燒瓶安裝在25°C恒溫槽(Tomas科學公司制造的恒溫水浴鍋T-2Q中。然后，將過碘酸鈉(和光純藥工業制造)溶解在RO水中，制備11. 5mg/mL的過碘酸鈉水溶液，將523mL該溶液加入到可拆卸式燒瓶中，在25°C以120rpm的轉速攪拌1小時(Mazela Z)。反應后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的^Gj)上進行清洗，直至清洗濾液的電導率達到5 μ S/cm以下，從而得到多孔性粒子C。使用電導率計(EUTECH INSTRUMENTS 制造的ECTestrlO pure+)測定清洗濾液的電導率。利用上述方法測定所得多孔性粒子C 的甲酰基含量，結果顯示每ImL多孔性粒子C中的甲酰基含量為68μπι01。然后，在可拆卸式燒瓶的1042mL處做標記，并使用RO水將所得多孔性粒子C 521mL轉移。將其安裝在15°C的恒溫槽(Tomas科學公司制造恒溫水浴鍋T-2S、投入冷卻裝置ADVANTEC TBC120DA)中，放置反應溶液直至達到15°C。確認反應液到達15°C后，向其中加入多孔性粒子C的甲酰基含量的10摩爾倍的發酵葡糖胺K (協和發酵公司制造)，并加入氫氧化鈉溶液使其PH達到11。然后，一邊使用4N氫氧化鈉微調pH至11，一邊加入RO水， 使反應液的總體積達到1042mL，在15°C以120rpm的轉速攪拌5小時。隨后，加入2. 96g硼氫化鈉(和光純藥工業公司制造)，攪拌1小時同時使其反應。 反應后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的^GD上以多孔性粒子20倍體積量的RO水進行清洗。將清洗后的凝膠加入可拆卸式燒瓶中，補足RO水直至達到可拆卸式燒瓶的1042mL 標記處，加入2. 96g硼氫化鈉，在25°C攪拌1小時。反應后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的 26G-2)上以凝膠的20倍體積量的RO水進行清洗。然后，再重復進行2次在25°C下進行的 1小時的硼氫化鈉的反應，并使用RO水進行清洗，直至最后清洗時玻璃過濾器(TOP公司制造的^G-2)中的濾液的電導率達到5 μ S/cm以下，從而得到葡糖胺化多孔性載體。該多孔性載體中的葡糖胺導入量為每ImL多孔性載體中導入了 17μπι01葡糖胺。此外，未經還原劑處理完全的葡糖胺固定化后的甲酰基量為每ImL多孔性載體中為 0 μ mol ο向所得葡糖胺化多孔性載體109mL中加入RO水直至體積為163. 5mL,并轉移至 500mL的可拆卸式燒瓶中。然后，制備11. 5mg/mL的過碘酸鈉水溶液，并將109mL的該過碘酸鈉水溶液加入到可拆卸式燒瓶中，在25°C以120rpm的轉速攪拌1小時。反應后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的^G-2)上以RO水進行清洗，直至濾液的電導率達到5μ S/cm以下，從而得到含有甲酰基的多孔性載體D。對于得到的含有甲酰基的多孔性載體D，壓縮5% 時的壓縮應力為0. (^8MPa、壓縮10%時的壓縮應力為0. 067MPa、壓縮15%時的壓縮應力為 0. 109MPa。每ImL多孔性載體D中的甲酰基含量為6. 2 μ mol。(實施例2)向制造例1的多孔性粒子B 435mL中加入RO水，使其總量為652mL，加入到2L的可拆卸式燒瓶中，并將該燒瓶安裝在25°C的恒溫槽(Tomas科學公司制造的恒溫水浴鍋T-2S) 中。然后，將過碘酸鈉(和光純藥工業制造)溶解在RO水中，制備46. 0mg/mL的過碘酸鈉 (和光純藥工業制造)，將217. 5mL該溶液加入可拆卸式燒瓶中，在25°C以120rpm的轉速攪拌15分鐘。反應后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的^GD上以RO水進行清洗，直至濾液的電導率為5 μ S/cm以下，得到多孔性粒子D。測定所得多孔性粒子D的甲酰基含量，結果顯示每ImL多孔性粒子E中甲酰基含量為45. 6 μ mol。然后，在可拆卸式燒瓶的820mL處做標記，并使用RO水將所得多孔性粒子E 410mL轉移。將其安裝在15°C的恒溫槽(Tomas科學公司制造的恒溫水浴鍋T-2S、投入冷卻裝置 ADVANTEC TBC120DA)中，放置反應溶液直至達到15°C。確認反應液到達15°C后，向其中加入多孔性粒子D的甲酰基含量的10摩爾倍的發酵葡糖胺K(協和發酵公司制造)，并加入 4N氫氧化鈉溶液(使用和光純藥工業公司制造的鹽酸和RO水進行調整)使其pH達到11。 然后，一邊使用4N氫氧化鈉微調pH至11，一邊加入RO水，使反應液的總體積達到1042mL， 在15°C以120rpm的轉速攪拌5小時。隨后，加入2. 33g硼氫化鈉(和光純藥工業公司制造)，攪拌1小時同時使其反應。 反應后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的^GD上以多孔性粒子20倍體積量的RO水進行清洗。將清洗后的凝膠加入可拆卸式燒瓶中，補足RO水直至達到可拆卸式燒瓶的1042mL 標記處，加入2. 33g硼氫化鈉，在25°C攪拌1小時。反應后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的 26G-2)上以凝膠的20倍體積量的RO水進行清洗。然后，再重復進行5次在25°C下進行的 1小時的硼氫化鈉的反應，并使用RO水進行清洗，直至最后清洗時玻璃過濾器(TOP公司制造的^G-2)中的濾液的電導率達到5 μ S/cm以下，從而得到葡糖胺化多孔性載體。該多孔性載體中的葡糖胺導入量為每ImL多孔性載體中導入了 ΙΙ.ΟμπιοΙ/mL葡糖胺。此外，未經還原劑處理完全的葡糖胺固定化后的甲酰基量為每ImL多孔性載體中為 0. 4 μ moL·向所得葡糖胺化多孔性載體80mL中加入RO水直至體積為120mL，并轉移至可拆卸式燒瓶中。然后，制備11. 5mg/mL的過碘酸鈉水溶液，并將40mL的該水溶液加入到可拆卸式燒瓶中，在25°C以150rpm的轉速攪拌30分鐘(Mazela Z)。反應后，在玻璃過濾器(TOP 公司制造的^G-2)上以RO水進行清洗，直至濾液的電導率達到5 μ S/cm以下，從而得到含有甲酰基的多孔性載體。每ImL多孔性載體中的甲酰基含量為3.4μπι01。(實施例3)在葡糖胺固定化后的還原反應中，將在15°C、1小時的反應進行1次、在25°C、1 小時的反應進行6次變更為在15°C、1小時的反應進行1次、在37°C、1小時的反應進行 2次，除此之外，按照與實施例2相同的方法得到了葡糖胺化多孔性載體，隨后得到了含有甲酰基的多孔性載體。需要說明的是，每ImL葡糖胺化多孔性載體中，葡糖胺的導入量為 9.6ymol/mL。此外，未經還原劑處理完全的葡糖胺固定化后的甲酰基量為每ImL多孔性載體中為0. 3 μ mo 1。此外，每ImL含有甲酰基的多孔性載體中，甲酰基含量為4. 3 μ mo 1。(實施例4)在葡糖胺固定化后的還原反應中，將在15°C、1小時的反應進行1次、在25°C、1小時的反應進行6次變更為在15°C、1小時的反應進行1次、在50°C、1小時的反應進行1 次，除此之外，按照與實施例2相同的方法得到了葡糖胺化多孔性載體和含有甲酰基的多孔性載體。需要說明的是，每ImL葡糖胺化多孔性載體中，葡糖胺的導入量為8. 7 μ mol/ mL。此外，未經還原劑處理完全的葡糖胺固定化后的甲酰基量為每ImL多孔性載體中為 0. 4 μ mol。此外，每ImL含有甲酰基的多孔性載體中，甲酰基含量為4. 3 μ mol。(實施例5)利用pHll的0. 5M檸檬酸鈉(和光純藥工業制造)+0. 15M食鹽(和光純藥工業制造)的緩沖液327mL，置換實施例1中得到的甲酰基多孔性載體109mL。使用pH 11的 0. 5M檸檬酸鈉+0. 15M食鹽緩沖液將置換后的含有甲酰基的多孔性載體轉移至在197. 6mL處做了標記的可拆卸式燒瓶中。向其中加入含有蛋白質A的溶液(鐘化公司制造的 PNXL30) 16. 5mL，該含有蛋白質A的溶液中的蛋白質A的濃度為52. 85mg/mL，且其中的蛋白質A根據國際公開專利公報W02006/004067中所述方法制備得到。使用4N NaOH(使用和光純藥工業公司制造和RO水進行調整)調節pH至11，使反應液面與197. 6mL處標記對齊， 在恒溫槽中(Tomas科學公司制造的恒溫水浴鍋T-2S、投入冷卻裝置ADVANTEC TBC120DA)， 于4°C下、以150rpm的轉速進行12小時攪拌以使其反應(Mazela Z)。反應后，使用4M鹽酸(使用和光純藥工業公司制造的鹽酸和RO水進行調整)調節反應液的PH至6. 8，然后加入硼氫化鈉(和光純藥工業制造)0. 309g，在4°C緩慢攪拌1 小時以使其反應。反應后，測定反應液在277nm附近最大吸收處的吸光度，由此可知每ImL 多孔性載體中，親和配位體即蛋白質A的導入量為7. 2mgo在玻璃過濾器(TOP公司制造的^GD上，以多孔性載體20倍體積量的RO水對反應后的多孔性載體進行清洗，將清洗后的載體加入到可拆卸式燒瓶中，向其中加入RO水直至到達197. 6mL標記處，加入0. 309g硼氫化鈉，在25°C攪拌1小時。反應后，以20倍量的RO水進行清洗。然后，用3倍體積量的0. OlM鹽酸(使用和光純藥工業公司制造鹽酸和 RO水進行調整)置換，向置換后的多孔性載體中加入0. OlM鹽酸使其總量達到220mL，并將該溶液加入至可拆卸式燒瓶中，在室溫下攪拌30分鐘的同時實施酸清洗。酸清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的^GD上，以多孔性載體20倍體積量的RO水進行清洗，然后，用3倍體積量的0. 05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液(使用和光純藥工業公司制造的氫氧化鈉、硫酸鈉和RO水配制而成)置換。然后，向置換后的多孔性載體中加入0. 05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液使其總量達到220mL，并將該溶液加入至可拆卸式燒瓶中，在室溫下攪拌20分鐘的同時實施堿清洗。堿清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造^GD上，以多孔性載體20倍體積量的 RO水對多孔性載體進行清洗。然后，使用多孔性載體3倍量的pH 7. 4的PBS (SIGMA公司制造)進行置換，然后使用RO水進行清洗，直至清洗濾液的電導率達到5 μ S/cm以下，得到固定化了目標蛋白質A的吸附體。使用電導率計(EUTECH INSTRUMENTS制造的ECTestrlO pure+)測定清洗濾液的電導率。選擇人多克隆IgG(BaXter公司制造的Gammagard)作為所得吸附體的目標物，求出動態吸附量和洗脫至目標物中的配位體的量，結果顯示，IgG動態吸附量(5% Dynamic binding capacity)為第1次37mg、第2次37mg、第3次38mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體在IgG中所占的濃度為第1次38ppm、第2次20ppm、第3次19ppm。(實施例6)使用實施例2中得到的甲酰基多孔性載體，按照與實施例5相同的方法，得到固定化了蛋白質A的吸附體。求出所得吸附體的動態吸附量和洗脫至目標物中的配位體的量， 結果顯示，IgG動態吸附量(5% Dynamic binding capacity)為第 1 次 37mg、第 2 次 38mg、 第3次39mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體在IgG中所占的濃度為第1次23ppm、第 2 次 19ppm、第 3 次 19ppm。(實施例7)使用實施例3中得到的甲酰基多孔性載體，按照與實施例5相同的方法，得到固定化了蛋白質A的吸附體。求出所得吸附體的動態吸附量和洗脫至目標物中的配位體的量，結果顯示，IgG動態吸附量(5% Dynamic binding capacity)為第 1 次；Mmg、第 2 次 35mg、 第3次36mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體在IgG中所占的濃度為第1次27ppm、第 2 次 24ppm、第 3 次 16ppm。(實施例8)使用實施例4中得到的甲酰基多孔性載體，按照與實施例5相同的方法，得到固定化了蛋白質A的吸附體。求出所得吸附體的動態吸附量和洗脫至目標物中的配位體的量， 結果顯示，IgG動態吸附量(5% Dynamic binding capacity)為第 1 次 31mg、第 2 次 32mg、 第3次32mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體在IgG中所占的濃度為第1次16ppm、第
2次 16ppm、第 3 次 8ppm。(實施例9)除了將蛋白質A的固定化溫度由4°C改變為21°C以外，按照與實施例7相同的方法得到吸附體。求出所得吸附體的動態吸附量和洗脫至目標物中的配位體的量，結果顯示， IgG 動態吸附量(5% Dynamic binding capacity)為 34mg。(實施例10)在固定化蛋白質A后加入硼氫化鈉時，不直接加入其粉末，而是變更為將同量的硼氫化鈉溶解于RO水中，制備17mg/mL的硼氫化鈉溶液12. 4mL,在1小時內分25次將其總量加入，除此以外，按照與實施例7相同的方法得到吸附體。求出所得吸附體的動態吸附量，結果顯示，IgG動態吸附量(5% Dynamic binding capacity)為第1次39mg、第2次 38mg、第 3 次 39mg。(實施例11)在固定化蛋白質A后加入硼氫化鈉時，不直接加入其粉末，而是變更為加入17mg/ mL的硼氫化鈉溶液0. 5mL,除此以外，按照與實施例7相同的方法得到吸附體。求出所得吸附體的動態吸附量和洗脫至目標物中的配位體的量，結果顯示，IgG動態吸附量(5% Dynamic binding capacity)為第 2 次 39mg、第 3 次 39mg。(實施例12)在固定化蛋白質A后，不是一次性加入硼氫化鈉，而是加入與硼氫化鈉等摩爾量的二甲胺硼烷粉末，除此以外，按照與實施例7相同的方法得到吸附體。求出所得吸附體的動態吸附量，結果顯示，IgG動態吸附量(5% Dynamic binding capacity)為第1次36mg、 第3次38mg。(比較例1)除了在固定化葡糖胺后未進行還原反應以外，按照與實施例1相同的方法，得到葡糖胺化多孔性載體和含有甲酰基的多孔性載體F。每ImL多孔性載體中的葡糖胺導入量為20.2μπιΟ1。此外，未經還原劑處理完全的葡糖胺固定化后的甲酰基量為7μπι01。此外， 每ImL多孔性載體F中，含有甲酰基的多孔性載體中甲酰基的含量為14. δμπιο 。使用所得甲酰基多孔性載體，按照與實施例5相同的方法，得到固定化了蛋白質A 的吸附體。求出所得吸附體的動態吸附量和洗脫至目標物中的配位體的量，結果顯示，IgG 動態吸附量(5% Dynamic binding capacity)為第 1 次 37mg、第 2 次 38mg、第 3 次 38mg。 此外，泄漏至精制IgG中的配位體在IgG中所占的濃度為第1次87ppm、第2次47ppm、第
3次 56ppm。
(比較例2)向制造例1的多孔性粒子B 64mL中加入RO水，使其總量為96mL，加入到可拆卸式燒瓶中，并將該燒瓶安裝在25°C的恒溫槽(Tomas科學公司制造的恒溫水浴鍋T-2S)中。然后，將過碘酸鈉(和光純藥工業制造)溶解在RO水中，制備1. 44mg/mL的過碘酸鈉水溶液， 將64mL該溶液加入可拆卸式燒瓶中，在25°C以120rpm的轉速攪拌1小時(Mazela Z)。反應后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的^GD上以RO水進行清洗，直至濾液的電導率達到 5μ S/cm以下，得到含有甲酰基的多孔性載體G。測定所得含有甲酰基的多孔性載體G的甲酰基含量，結果顯示每ImL多孔性載體中的甲酰基含量為5. 9μπι01。在玻璃過濾器(TOP公司制造的25G-2)上，以pH為11的0. 5M磷酸(和光純藥工業制造)+0. 15M食鹽(和光純藥工業制造)的緩沖液165mL，置換上述酰基多孔性載體 54. 5mL。向置換后的含有甲酰基的多孔性載體中加入pHll的0. 5M磷酸(和光純藥工業制造)+0. 15M食鹽(和光純藥工業制造)的緩沖液，使其總量達到90. 5mL，并轉移至可拆卸式燒瓶中，向其中加入含有蛋白質A的溶液(鐘化公司制造的PNXL30)8. 25mL，該含有蛋白質A的溶液中的蛋白質A的濃度為52. 85mg/mL，且其中的蛋白質A根據國際公開專利公報 W02006/004067中所述方法制備得到，在恒溫槽中(Tomas科學公司制造恒溫水浴鍋T-2S、 投入冷卻裝置ADVANTEC TBC120DA)，于4°C下、以150rpm的轉速使進行12小時攪拌以使其反應(Mazela Ζ)。反應后，使用4Μ鹽酸(使用和光純藥工業公司制造鹽酸和RO水進行調整)將反應液的PH調節為8，然后加入硼氫化鈉(和光純藥工業制造)0. 155g，于4°C緩慢攪拌1小時以使其反應。反應后，測定反應液在276nm附近最大吸收處的吸光度，由此可知每ImL 多孔性載體中，親和配位體即蛋白質A的導入量為6. 7mg。在玻璃過濾器(TOP公司制造的^GD上，以多孔性載體20倍體積量的RO水對反應后的多孔性載體進行清洗，向清洗后的載體加入RO水至達到109mL，并轉移到可拆卸式燒瓶中，加入0. 155g硼氫化鈉，在25°C攪拌1小時。反應后，以20倍量的RO水進行清洗。 然后，用3倍體積量的0. OlM鹽酸(使用和光純藥工業公司制造鹽酸和RO水進行調整)置換，向置換后的多孔性載體中加入0. OlM鹽酸使其總量達到109mL，并將該溶液加入至可拆卸式燒瓶中，在室溫下攪拌30分鐘的同時實施酸清洗。酸清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的^GD上，以多孔性載體20倍體積量的RO水進行清洗，然后，用3倍體積量的0. 05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液(使用和光純藥工業公司制造的氫氧化鈉、硫酸鈉和RO水配制而成)置換。然后，向置換后的多孔性載體中加入0. 05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液使其總量達到109mL，并將該溶液加入至可拆卸式燒瓶中，在室溫下攪拌20分鐘的同時實施堿清洗。堿清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的^GD上，以多孔性載體20倍體積量的RO水對多孔性載體進行清洗。然后，使用多孔性載體3倍量的pH 7. 4的PBS (SIGMA公司制造)進行置換，然后使用RO水進行清洗，直至清洗濾液的電導率達到5 μ S/cm以下， 得到固定化了目標蛋白質A的吸附體。使用電導率計(EUTECH INSTRUMENTS制ECTestrlO pure+)測定清洗濾液的電導率。求出所得吸附體的動態吸附量和洗脫至目標物中的配位體的量，結果顯示，IgG動態吸附量(5% Dynamic binding capacity)為第 1 次!35mg、第 2 次!35mg、第 3 次!35mg。此
26外，泄漏至精制IgG中的配位體在IgG中所占的濃度為第1次> lOOppm、第2次> lOOppm、 第 3 次> lOOppm。(比較例3)除了未對Chisso公司制造的CK-A分級以外，按照與制造例1相同的方法制得交聯多孔性粒子。然后，向該交聯多孔性粒子IlmL中加入RO水使其總量達到12. 6mL，將其加入離心沉降管(巖城硝子公司制造50mL)，再向其中加入2M氫氧化鈉水溶液(使用和光純藥工業公司制造的氫氧化鈉和RO水配制而成)3. 7mL,在40°C加溫30分鐘。將液溫加溫至 40°C后，加入環氧氯丙烷(和光純藥工業公司制造)1. 3mL，使用恒溫振蕩機(Tomas科學公司制造的恒溫水浴鍋T-25)，在40°C以100次/分振蕩2小時以使其反應。反應終止后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的17G-2)上，以多孔性粒子20倍體積量的RO水進行清洗，得到每ImL多孔性粒子中環氧基含量為5. 7 μ mol的環氧化多孔性粒子。在玻璃過濾器(TOP公司制造的17G-2)上，使用pH為10的0. 5M碳酸緩沖液(使用和光純藥工業公司制造的碳酸氫鈉、碳酸鈉和RO水配制而成)30mL，將上述環氧化多孔性粒子9. 5mL置換。向置換后的環氧化多孔性粒子中加入pH為10的0. 5M碳酸緩沖液，使其總量為19mL，將其加入離心沉降管(巖城硝子公司制造50mL)中，再向其中加入D (+)-葡糖胺鹽酸鹽(和光純藥工業公司制造)0. 18g，使用恒溫振蕩機(Tomas科學公司制造的恒溫水浴鍋T-25)，在50°C以100次/分振蕩一晚上以使其反應。反應后，在玻璃過濾器(TOP公司制造17G-2)上，以多孔性載體20倍體積量的RO 水進行清洗，得到每ImL多孔性載體中的葡糖胺含量為1.4 μ mol的葡糖胺化多孔性載體。 向所得葡糖胺化多孔性載體IOmL中加入RO水，使其總量達到15mL，并將其裝入離心沉降管(巖城硝子公司制造50mL)中。然后，將115mg過碘酸鈉(和光純藥工業公司制造)溶解于IOmL RO水中，將所述過碘酸鈉水溶液加入離心沉降管中，在恒溫箱(巖城玻璃公司制造的恒溫箱LOW-TEMP ICB-151L)中，使用混合轉子(井內盛榮堂公司制造的Variable Mix Rotor VMR-5)，在25°C以100次/分振蕩1小時，使其反應。反應后，在玻璃過濾器(TOP公司制造17G-2)上，以多孔性載體20倍體積量的RO 水進行清洗，得到含有甲酰基的多孔性載體。按照上述方法，對得到的含有甲酰基的多孔性載體的甲酰基含量進行測定，結果為每ImL多孔性載體中的甲酰基含量為5. 9 μ mol。在玻璃過濾器(TOP公司制造17GD上，以pH為10的0. 5M磷酸+0. 15M食鹽的緩沖液(使用和光純藥工業公司制造的磷酸氫二鈉、氯化鈉、氫氧化鈉和RO水配制而成)30mL，對上述含有甲酰基的多孔性載體7. ImL進行置換。向置換后的含有甲酰基的多孔性載體中加入PH為10的0. 5M磷酸+0. 15M食鹽的緩沖液，使其總量達到11. 8mL，并轉移至離心沉降管(巖城硝子公司制造50mL)中，向其中加入含有蛋白質A的溶液(鐘化公司制造的PNXL30) 1. 08mL，該含有蛋白質A的溶液中的蛋白質A的濃度為52. 6mg/mL,且其中的蛋白質A根據國際公開專利公報W02006/004067中所述方法制備得到，在恒溫箱(巖城玻璃公司制造的恒溫箱L0W-TEMPICB-151L)，使用混合轉子(井內盛榮堂公司制造的Variable Mix Rotor VMR-5)，于4°C下、以100次/分振蕩12小時，以使其反應。使用4M鹽酸(使用和光純藥工業公司制造的鹽酸和RO水進行調整)調節反應后的反應液的PH至8，然后加入硼氫化鈉0. 02g，在4°C緩慢振蕩1小時以使其反應。反應后， 測定反應液在277nm附近最大吸收處的吸光度，結果可知每ImL多孔性載體中，親和配位體即蛋白質A的導入量為4. 7mg。在玻璃過濾器(TOP公司制造的17G-2)上，用RO水清洗反應后的多孔性載體，直至清洗濾液的電導率達到5 μ S/cm以下，得到固定化了目標蛋白質A的吸附體。選擇人多克隆IgG(BaXter公司制造的Gammagard)作為所得吸附體的目標物，按照下述方法求出動態吸附量和洗脫至目標物中的配位體的量，結果顯示，IgG動態吸附量 (5% Dynamic binding capacity)為第 1 次 22mg、第 2 次 23mg、第 3 次 27mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體在IgG中所占的濃度為第1次^7ppm、第2次214ppm、第3次 198ppm。(制造例2)按照與制造例1相同的方法制備多孔性粒子B，并向該多孔性粒子BlOOmL中加入 RO水，使其總量為150mL，加入到可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中。然后，將2. 30g 的過碘酸鈉(和光純藥工業公司制造)溶解于50mL RO水中，將該過碘酸鈉水溶液加入可拆卸式燒瓶中，在25°C、以150次/分攪拌15分鐘的同時使其反應。反應后，在玻璃過濾器(TOP公司制造^GD上，以多孔性粒子20倍體積量的RO水進行清洗，得到多孔性粒子 H。按照上述方法對得到的含有甲酰基的多孔性粒子的甲酰基含量進行測定，結果顯示每 ImL多孔性粒子中的甲酰基含量為57 μ mo 1。(實施例13)按照與制造例2相同的方法制備多孔性粒子H，并將99mL的該多孔性粒子H與 99mL的RO水以1 1制備漿料，將該漿料調節至15°C，然后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的^G-2)上抽濾(抽吸干燥)15分鐘。將得到的抽吸干燥后的多孔性粒子I全部投入到玻璃制可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中。然后，向該可拆卸式燒瓶中加入3. 3g葡糖胺鹽酸鹽(協和發酵公司制造的發酵葡糖胺K)。隨后，一邊使葡糖胺鹽酸鹽溶解，一邊加入 15°C的RO水，調節溶解后的反應液總量為180mL。將反應液調節至15°C后，使用4N的氫氧化鈉水溶液和RO水，調節至pH為10、反應液的總量為198mL。接著，在15°C以150次/分攪拌5小時。然后，添加硼氫化鈉(和光純藥工業公司制造)0.56g，在15°C以150次/分攪拌60分鐘。反應后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的^GD上，以多孔性載體40倍體積量的RO水進行清洗。將下述“，，內的操作共進行2次，得到目標多孔性載體“接著，將清洗后的多孔性載體全部投入到玻璃制可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中，加入RO水，調節其總量至 198mL。然后，添加硼氫化鈉(和光純藥工業公司制造)0. 56g，在15°C以150次/分攪拌60 分鐘。反應后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的^GD上，以多孔性載體40倍體積量的RO 水進行清洗。”。通過非水滴定測定該多孔性載體中的葡糖胺固定化量，結果顯示每ImL載體中的葡糖胺固定化量為ΙΟμπιοΙ。(實施例14)除了在添加葡糖胺鹽酸鹽后實施pH調節時，將pH設定為9以外，按照與實施例13 相同的方法制備了目標多孔性載體。每ImL載體中的葡糖胺固定化量為ΙΟμπιοΙ。(實施例15)除了在添加葡糖胺鹽酸鹽后實施pH調節時，將pH設定為8以外，按照與實施例13 相同的方法制備了目標多孔性載體。每ImL載體中的葡糖胺固定化量為ΙΟμπιοΙ。
(實施例16)使用pH 3的0. OlM檸檬酸緩沖液(使用和光純藥工業公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸一水合物、RO水配制而成)280mL對實施例13中制備的多孔性載體94mL進行置換，加入該緩沖液，使其總量為141mL，并加入至可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL) 中。然后，將0.54g過碘酸鈉(和光純藥工業公司制造)溶解在94mL RO水中，并將該過碘酸鈉水溶液加入可拆卸式燒瓶中，在5°C以150次/分使其攪拌40分鐘以使其反應。反應后，在玻璃過濾器(TOP公司制造^G-幻上，以多孔性載體40倍體積量的RO水進行清洗， 得到含有甲酰基的多孔性載體。按照上述方法測定制得的載體的甲酰基含量，結果顯示每 ImL多孔性載體中的甲酰基含量為4 μ mol。在玻璃過濾器(TOP公司制造的^G-2)上，以0. 6M檸檬酸三鈉+0. 2M食鹽的緩沖液(使用和光純藥工業公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、氯化鈉和RO水制備)280mL對 92. SmL的上述含有甲酰基的多孔性載體進行置換。向置換后的該多孔性載體中加入0. 6M 檸檬酸三鈉+0. 2M食鹽的緩沖液，使其總量為132mL，并將其加入可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中。向其中加入含有蛋白質A的溶液(鐘化公司制造的PNXL30) 14.06mL，該含有蛋白質A的溶液中的蛋白質A的濃度為52. 8mg/mL，且其中的蛋白質A根據國際公開專利公報W02006/004067中記載的方法制備得到，加入0. 08M的氫氧化鈉水溶液(使用和光純藥工業公司制造的氫氧化鈉和RO水配制而成)，調節反應液的pH至12，在4°C以150次/分攪拌4小時以使其反應。使用0. IM檸檬酸(使用和光純藥工業公司制造的檸檬酸一水合物與RO水配制而成)調節反應后的反應液PH至7，然后加入二甲胺硼烷408mg，以150次/分，分別在40°C 攪拌1小時、然后在25°C攪拌8小時，以使其反應。反應后，測定反應液在277nm附近最大吸收處的吸光度，結果可知每ImL多孔性載體中，親和配位體即蛋白質A的固定化量為 7. 6mg0在玻璃過濾器(TOP公司制造^G-2)上，以多孔性載體10倍體積量的RO水對反應后的多孔性載體進行清洗，然后，用3倍體積量的0. IM檸檬酸(使用和光純藥工業公司制造的檸檬酸一水合物和RO水配制而成)置換。然后向置換后的多孔性載體中加入0. IM 檸檬酸，使其總量為186mL，并加入至可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中，以150次/分在25°C振蕩30分鐘的同時實施酸清洗。酸清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造^GD上，以3倍體積量的0. 05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液(使用和光純藥工業公司制造的氫氧化鈉、硫酸鈉和RO水配制而成) 置換多孔性載體。然后，向置換后的多孔性載體中加入0.05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液， 使其總量為186mL，將其全部加入至可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中，以150次/分在25°C振蕩20分鐘的同時實施堿清洗。堿清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造^G-2)上，以pH為6的0. 5M檸檬酸緩沖液(使用和光純藥工業公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸一水合物和RO水配制而成)278mL置換多孔性載體，然后使用RO水進行清洗，直至清洗濾液的電導率為5 μ S/cm以下。接著，使用20%乙醇水溶液(使用日本藥局方的乙醇和RO水配制而成)置換多孔性載體，然后，使用20%乙醇水溶液將其加入到250mL的塑料容器(f 'J容器)(Sanplatec公司制造)中，得到固定化了目標蛋白質A的吸附體。使用電導率計(EUTECH INSTRUMENTS 制造的ECTestrlO pure+)測定清洗濾液的電導率。選擇人多克隆IgG(Baxter公司制造的Gammagard)作為所得吸附體的目標物，按照下述方法求出動態吸附量和洗脫至目標物中的配位體的量，結果顯示，IgG動態吸附量 (5% Dynamic binding capacity)為每ImL載體中37mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為Mppm。按照上述方法測定所得吸附體中甲酰基的含量，結果顯示每ImL多孔性載體中為0. 2μπιο1。(實施例17)除了使用實施例14中制備的多孔性載體以外，按照與實施例16相同的操作，得到目標吸附體。該IgG動態吸附量為每ImL載體中為37mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為22ppm。(實施例I8)除了使用實施例15中制備的多孔性載體以外，按照與實施例16相同的操作，得到目標吸附體。該IgG動態吸附量為每ImL載體中為37mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為26ppm。(實施例I9)除了使用pH為2的檸檬酸緩沖液(使用和光純藥工業公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸一水合物和RO水配制而成)來代替pH為3的檸檬酸緩沖液以外，按照與實施例17相同的操作來制備吸附體。此時，含有甲酰基的多孔性載體的甲酰基含量為每 ImL多孔性載體中為6 μ mol，親和配位體即蛋白質A的固定化量為每ImL多孔性載體中為 7. 2mgo此外，IgG動態吸附量為35mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為38ppm。(實施例2O)除了使用pH為5的檸檬酸緩沖液(使用和光純藥工業公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸一水合物和RO水配制而成)來代替pH為3的檸檬酸緩沖液以外，按照與實施例17相同的操作來制備吸附體。此時，含有甲酰基的多孔性載體的甲酰基含量為每 ImL多孔性載體中為4μπι01，親和配位體即蛋白質A的固定化量為每ImL多孔性載體中為 6. 5mg。此外，IgG動態吸附量為35mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為42ppm。(實施例21)在玻璃過濾器(TOP公司制造的^G-2)上，以0. 5M檸檬酸三鈉+0. 15M食鹽的緩沖液(使用和光純藥工業公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、氯化鈉和RO水配制而成)278mL, 置換按照與實施例1相同的方法制備的92. SmL的含有甲酰基的多孔性載體。向置換后的含有甲酰基的多孔性載體中加入0. 5M檸檬酸三鈉+0. 15M食鹽的緩沖液，使其總量為130mL， 并將其加入可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中。向其中加入含有蛋白質A的溶液(鐘化公司制造的PNXL30) 14. 04mL,該含有蛋白質A的溶液中的蛋白質A的濃度為52. 85mg/ mL，且其中的蛋白質A根據國際公開專利公報W02006/004067中記載的方法制備得到，加入 4M的氫氧化鈉水溶液(使用和光純藥工業公司制造的氫氧化鈉和RO水配制而成)，調節反應液的PH至11。然后，使用pH為11的0. 5M檸檬酸三鈉+0. 15M食鹽的緩沖液(使用和光純藥工業公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、氯化鈉、氫氧化鈉和RO水配制而成)調節反應液的總量為168mL，在4°C以150次/分攪拌12小時以使其反應。
反應后，使用4M鹽酸(使用和光純藥工業公司制造的鹽酸和RO水配制而成)調節反應液的PH至6. 8，然后加入硼氫化鈉^^mg，在4°C以150次/分攪拌1小時以使其反應。反應后，測定反應液在277nm附近最大吸收處的吸光度，由此可知每ImL多孔性載體中，親和配位體即蛋白質A的導入量為7. 2mgo在玻璃過濾器(TOP公司制造的^G-2)上，以多孔性載體10倍體積量的RO水對反應后的多孔性載體進行清洗，然后將其全部裝入可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中， 向其中加入RO水調節反應液總量為168mL，然后，加入的硼氫化鈉，在25°C以150次 /分攪拌1小時以使其反應。反應后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的^G-2)上，以多孔性載體10倍體積量的RO水進行清洗，然后，用3倍體積量的0. OlM鹽酸(使用和光純藥工業公司制造鹽酸和RO水配制而成)置換，然后，向置換后的多孔性載體中加入0. OlM鹽酸使其總量為168mL，將其加入至可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中，在25°C以150次/分振蕩30分鐘的同時實施酸清洗。酸清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造^GD上，以多孔性載體10倍體積量的 RO水對多孔性載體進行清洗，然后，用3倍體積量的0. 05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液(使用和光純藥工業公司制造的氫氧化鈉、硫酸鈉和RO水配制而成)置換。然后，向置換后的多孔性載體中加入0. 05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液使其總量為168mL，將其全部加入至可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中，在25°C以150次/分振蕩20分鐘的同時實施堿清洗。堿清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的^G-2)上，以pH為6的0. OlM檸檬酸緩沖液(使用和光純藥工業公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸一水合物和RO水配制而成)278mL對多孔性載體進行置換，然后，使用RO水進行清洗，直至清洗濾液的電導率達到5yS/cm以下。接著，使用20%乙醇水溶液(使用日本藥局方的乙醇和RO水配制而成) 置換多孔性載體，然后，使用20%乙醇水溶液將其加入至250mL的塑料容器(Sanplatec公司制造)中，得到固定化了目標蛋白質A的吸附體。使用電導率計(EUTECH INSTRUMENTS 制造的ECTestrlO pure+)測定清洗濾液的電導率。選擇人多克隆IgG(Baxter公司制造的Gammagard)作為所得吸附體的目標物，求出動態吸附量和洗脫至目標物中的配位體的量，結果顯示，IgG動態吸附量(5% Dynamic binding capacity)為第1次36mg、第2次36mg、第3次37mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為第1次69ppm、第2次47ppm、第3次36ppm。(實施例22)除了使用0. 025M磷酸+1. 5M硫酸鈉的緩沖液(使用和光純藥工業公司制造的12 水合磷酸氫二鈉、硫酸鈉和RO水配制而成)來代替0. 5M檸檬酸三鈉+0. 15M食鹽的緩沖液， 并使用PH為11的0. 025M磷酸+1. 5M硫酸鈉的緩沖液(使用和光純藥工業公司制造的12 水合磷酸氫二鈉、硫酸鈉、氫氧化鈉和RO水配制而成)來代替pH為11的0. 5M檸檬酸三鈉 +0. 15M食鹽的緩沖液以外，按照與實施例21相同的操作來制備吸附體。按照與實施例2相同的方法求出親和配位體即蛋白質A的固定化量，結果為每ImL多孔性載體中為7. 4mgo(實施例烈)除了在實施例21中調節pH為11的操作中，將pH 11改變為pH 12. 5以外，按照與實施例21相同的方法來制備吸附體。蛋白質A的固定化量為每ImL多孔性載體中6. Omg,IgG 動態吸附量(5% Dynamic binding capacity)為第 1 次 33mg、第 2 次 33mg、第 3 次 33mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體的濃度為第1次35ppm。(實施例除了在實施例21中調節pH為11的操作中，將pH 11改變為pH 13以外，按照與實施例21相同的方法來制備吸附體。蛋白質A的固定化量為每ImL多孔性載體中4. Omg, IgG 動態吸附量(5% Dynamic binding capacity)為第 1 次 ^mg、第 2 次 33mg、第 3 次 33mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體的濃度為第1次23ppm。(實施例25)除了將實施例21中的調節pH為11的操作改變為pH 10以外，按照與實施例21 相同的方法來制備吸附體。蛋白質A的固定化量為每ImL多孔性載體中4. Omg, IgG動態吸附量(5% Dynamic binding capacity)為 29mg。(實施例沈)在玻璃過濾器(TOP公司制造的^G-2)上，以0. 6M檸檬酸三鈉+0. 2M食鹽的緩沖液(使用和光純藥工業公司制造檸檬酸三鈉二水合物、氯化鈉和RO水配制而成)280mL,置換按照與實施例1相同的方法制備的92. SmL的含有甲酰基的多孔性載體。向置換后的多孔性載體F中加入0. 6M檸檬酸三鈉+0. 2M食鹽的緩沖液，使其總量為132mL，并加入到可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中。向其中加入含有蛋白質A的溶液(鐘化公司制造的 PNXL30) 14. 06mL，該含有蛋白質A的溶液中的蛋白質A的濃度為52. 8mg/mL，且其中的蛋白質A根據國際公開專利公報W02006/004067中記載的方法制備得到，加入0. 08M的氫氧化鈉水溶液(使用和光純藥工業公司制造的氫氧化鈉和RO水配制而成)，調節反應后的反應液pH至12，在4°C以150次/分攪拌4小時以使其反應。使用0. IM檸檬酸(使用和光純藥工業公司制造檸檬酸一水合物和RO水配制而成)調節反應后的反應液pH至7。在同溫度下繼續攪拌1小時后，加入二甲胺硼烷408mg，然后以150次/分分別在4°C攪拌1小時、 然后在25°C攪拌5小時，同時使其反應。在玻璃過濾器(TOP公司制造的^G-2)上，以多孔性載體10倍體積量的RO水對反應后的多孔性載體進行清洗，然后，用3倍體積量的0. IM檸檬酸(使用和光純藥工業公司制造的檸檬酸一水合物和RO水配制而成)置換，然后，向置換后的多孔性載體中加入0. IM 檸檬酸使其總量為186mL，將其加入可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中，以150次/分在25°C振蕩30分鐘的同時實施酸清洗。酸清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的^G-2)上，以3倍體積量的0. 05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液(使用和光純藥工業公司制造氫氧化鈉、硫酸鈉和RO水配制而成) 置換多孔性載體。然后，向置換后的多孔性載體中加入0. 05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液使其總量為186mL，將其全部加入至可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中，以150次/分在25°C振蕩20分鐘的同時實施堿清洗。堿清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造^G-2)上，以pH為6的0. 5M檸檬酸緩沖液(使用和光純藥工業公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸一水合物和RO水配制而成)278mL置換多孔性載體。然后，使用RO水進行清洗，直至清洗濾液的電導率達到5 μ S/ cm以下。接著，使用20%乙醇水溶液(使用日本藥局方的乙醇和RO水配制而成)置換多孔性載體，然后，使用20%乙醇水溶液將其加入到250mL的塑料容器(Sanplatec公司制造)
32中，得到固定化了目標蛋白質A的吸附體。使用RO水進行清洗，直至清洗濾液的電導率達到5yS/cm以下。接著，使用20%乙醇水溶液(使用日本藥局方的乙醇和RO水配制而成) 置換多孔性載體，然后，使用20%乙醇水溶液將其加入到250mL的塑料容器(Sanplatec公司制造)中，得到固定化了目標蛋白質A的吸附體。使用電導率計(EUTECH INSTRUMENTS 制造的ECTestrlO pure+)測定清洗濾液的電導率。選擇人多克隆IgG(Baxter公司制造的Gammagard)作為所得吸附體的目標物，求出動態吸附量和洗脫至目標物中的配位體的量，結果顯示，IgG動態吸附量(5% Dynamic binding capacity)為每ImL載體中為3%ig。此外，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為 30ppmo(實施例27)除了在使用0. IM檸檬酸調節pH至7后，將在同溫度下繼續攪拌的時間設定為2 小時以外，按照與實施例26相同的操作得到吸附體。所得吸附體的IgG動態吸附量為每 ImL載體中為36mg。(實施例觀)除了在使用0. IM檸檬酸調節pH至7后，將在同溫度下繼續攪拌的時間設定為4 小時以外，按照與實施例26相同的操作得到吸附體。所得吸附體的IgG動態吸附量為每 ImL載體中為37mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為22ppm。(實施例四)除了在使用0. IM檸檬酸調節pH至7后，將在同溫度下繼續攪拌的時間設定為6 小時以外，按照與實施例26相同的操作得到吸附體。所得吸附體的IgG動態吸附量為每 ImL載體中為36mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為45ppm。(實施例30)除了使用0. IM檸檬酸調節pH至7后，將在同溫度下繼續攪拌的時間設定為15小時以外，按照與實施例26相同的操作得到吸附體。所得吸附體的IgG動態吸附量為每ImL 載體中為37mg。(實施例31)在pH 12的條件下使蛋白質A反應后，使用1. 6M檸檬酸將pH調節為3，然后將在同溫度下繼續攪拌的時間設定為4小時，除此之外，按照與實施例沈相同的操作得到吸附體。所得吸附體的IgG動態吸附量為每ImL載體中為36mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為30ppm。(實施例32)除了在剛剛使用0. IM檸檬酸調節pH至7之后加入二甲胺硼烷以外，按照與實施例26相同的操作得到吸附體。所得吸附體的IgG動態吸附量為每ImL載體中31mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為22ppm。(實施例33)使用pH為3的檸檬酸緩沖液(使用和光純藥工業公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸一水合物和RO水配制而成)282mL，對在制造例1中制備的多孔性粒子B進行置換，使用該緩沖液調節液體量，此外，將過碘酸鈉設定為0. 16g，除此之外，按照與實施例 32相同的操作得到吸附體。此時，多孔性載體E中甲酰基的含量為每ImL多孔性載體中7 μ mol，親和配位體即蛋白質A的固定化量為每ImL多孔性載體中為5. Omg。此外，IgG的動態吸附量為31mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為36ppm。所得吸附體中甲酰基的含量為每ImL多孔性載體中為0. 2 μ mol。(比較例4)不使用二甲胺硼烷，按照與實施例16相同的操作得到吸附體。所得吸附體中甲酰基的含量為每ImL多孔性載體中為2 μ mol。此外，IgG的動態吸附量為每ImL載體中為 27mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為615ppm。
權利要求
1.一種含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其包括向具有甲酰基的多孔性粒子中導入間隔團，然后利用過碘酸和/或過碘酸鹽對上述間隔團部分進行氧化，使其轉變為甲酰基，其中，導入間隔團后，多孔性粒子的甲酰基含量為每ImL多孔性粒子中的甲酰基含量為 3ymol以下。
2.權利要求1所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其中，導入的間隔團是糖或糖類似物。
3.權利要求1或2中任一項所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其中，導入的間隔團具有碳原子連續存在的部分，該碳原子在平伏位具有羥基，所述在平伏位具有羥基的碳原子的連續個數為2或3。
4.權利要求1 3中任一項所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其中，導入的間隔團含有氨基。
5.權利要求1 4中任一項所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其包括在pH7 11的范圍內，使作為間隔團的具有1，2_ 二醇結構的伯胺或仲胺與具有甲酰基的多孔性粒子縮合；和任選地通過還原反應使形成的鍵穩定化。
6.權利要求5所述的多孔性載體的制造方法，其中，pH的范圍為8 10。
7.權利要求1 6中任一項所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其中，導入的間隔團為葡糖胺。
8.權利要求7所述的多孔性載體的制造方法，其中，以鹽酸鹽的狀態使用所述葡糖胺。
9.權利要求1 8中任一項所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其中，間隔團的導入量為每ImL載體中導入間隔團1 μ mol以上。
10.權利要求1 9中任一項所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其中，向具有甲酰基的多孔性粒子中導入間隔團，然后對反應中未使用的多孔性粒子的甲酰基進行處理。
11.權利要求1 10中任一項所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其中，所述含有甲酰基的多孔性載體是使過碘酸鹽發生作用而得到的。
12.權利要求1 11中任一項所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其中，甲酰基的導入量為每ImL載體中導入甲酰基0.5 μ mol以上且IOOymol以下。
13.一種含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其包括在加入酸而將PH調節至1 6范圍的液體中，使過碘酸或其鹽與多孔性載體或與導入了間隔團的多孔性載體發生作用。
14.權利要求13所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其中，所述酸為有機酸。
15.權利要求1 14中任一項所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其中，使過碘酸或其鹽發生作用的PH范圍為2 5。
16.權利要求1 15中任一項所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其中，過碘酸或其鹽的濃度為5mM以上且300mM以下。
17.一種含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其包括使過碘酸和/或過碘酸鹽與多孔性載體或與導入了間隔團的多孔性載體在0°C以上且10°C以下的溫度發生作用。
18.權利要求1 17中任一項所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其為使過碘酸和/或過碘酸鹽在0°C以上且8°C以下的溫度發生作用而得到。
19.權利要求1 18中任一項所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其中，多孔性粒子含有多糖。
20.權利要求19所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其中，多糖為纖維素和/ 或纖維素衍生物。
21.權利要求1 20中任一項所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其中，多孔性粒子經過了交聯。
22.—種含有甲酰基的多孔性載體，其通過權利要求1 21中任一項所述的含有甲酰基的多孔性載體的制造方法而制得。
23.一種吸附體的制造方法，其包括將含有氨基的配位體固定化于權利要求22所述的含有甲酰基的多孔性載體。
24.權利要求23所述的吸附體的制造方法，其中，在含有下述水溶液的反應液中，將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體，所述水溶液包含選自羧酸鹽、金屬鹵化物及硫酸鹽中的1種以上化合物，且以羧酸鹽為必要成分。
25.權利要求23或M所述的吸附體的制造方法，其中，在含有檸檬酸鹽和/或硫酸鹽的反應液中，將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體。
26.權利要求25所述的吸附體的制造方法，其中，所述反應液中的檸檬酸和/或硫酸鹽的濃度為0.0IM 2M。
27.權利要求23 沈中任一項所述的吸附體的制造方法，其中，所述反應液的pH為 7 13。
28.權利要求23 27中任一項所述的吸附體的制造方法，其中，所述反應液的pH為 11. 5以上且低于13. 0。
29.權利要求23 28中任一項所述的吸附體的制造方法，其中，所述反應液的pH為 11. 5以上且低于12. 6。
30.一種吸附體的制造方法，其包括通過亞氨基化及其還原反應這兩步反應來進行，將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體，并在亞氨基化反應之后實施穩定化操作。
31.權利要求30所述的吸附體的制造方法，其中，亞氨基化反應之后的穩定化操作實施1小時以上。
32.權利要求30或31所述的吸附體的制造方法，其中，亞氨基化反應之后的穩定化操作在pH 2 10條件下實施。
33.權利要求30 32中任一項所述的吸附體的制造方法，其中，亞氨基化反應之后的穩定化操作在緩沖液中實施。
34.權利要求33所述的吸附體的制造方法，其中，緩沖液中含有至少一種以上的能具有二價以上陰離子的鹽。
35.權利要求33或34所述的吸附體的制造方法，其中，緩沖液中含有多元羧酸鹽和/ 或中性鹽。
36.權利要求33 35中任一項所述的吸附體的制造方法，其中，緩沖液中含有檸檬酸Τττ . ο
37.權利要求33 36中任一項所述的吸附體的制造方法，其中，緩沖液中含有選自金屬鹵化物和硫酸鹽中的至少1種以上。
38.權利要求23 37中任一項所述的吸附體的制造方法，其中，在將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體時，通過有機硼烷絡合物，使配位體的固定化鍵穩定化并同時使其余的甲酰基鈍化。
39.權利要求38所述的吸附體的制造方法，其在含有緩沖液的溶劑中實施。
40.權利要求38或39所述的吸附體的制造方法，其中，上述通過有機硼烷絡合物使配位體的固定化鍵穩定化并同時使其余的甲酰基鈍化的操作，實施1小時以上且48小時以下。
41.權利要求38 40中任一項所述的吸附體的制造方法，其中，有機硼烷絡合物是硼烷-胺絡合物。
42.權利要求23 41中任一項所述的吸附體的制造方法，其中，操作溫度為-10 40 "C。
43.一種吸附體，其通過權利要求23 42中任一項所述的制造方法制得。
44.權利要求43所述的吸附體，其中，含有氨基的配位體的導入量為每ImL多孔性載體中導入含有氨基的配位體Img以上且500mg以下。
45.權利要求43或44所述的吸附體，其中，含有氨基的配位體的導入量為每ImL多孔性載體中導入含有氨基的配位體0. 01 μ mol以上且15 μ mol以下。
46.權利要求43 45中任一項所述的吸附體，其中，所述含有氨基的配位體是蛋白質A0
47.權利要求43 46中任一項所述的吸附體，其中，從吸附體洗脫到目標物中的配位體濃度的第一次精制 第三次精制的平均值為50ppm以下。
48.權利要求43 47中任一項所述的吸附體，其中，精制目標物的吸附量為每ImL吸附體中精制目標物的吸附量為Img以上且IOOmg以下。
49.權利要求43 48中任一項所述的吸附體，其在壓縮5%時的壓縮應力為0.OlMPa 以上且IMPa以下，壓縮10%時的壓縮應力為0. 03MPa以上且3MPa以下，以及壓縮15%時的壓縮應力為0. 06MPa以上且5MPa以下。
50.權利要求43 49中任一項所述的吸附體，其在壓縮5%時的壓縮應力為0.02MPa 以上且IMPa以下，壓縮10%時的壓縮應力為0. 06MPa以上且3MPa以下，以及壓縮15%時的壓縮應力為0. 09MPa以上且5MPa以下。
51.權利要求43 50中任一項所述的吸附體，其樹脂含量為2%以上且50%以下。
52.權利要求43 51中任一項所述的吸附體，其體積平均粒徑為20μπι以上且 1000 μ m 以下。
53.一種精制方法，其中使用了權利要求43 51中任一項所述的吸附體。
54.權利要求53所述的精制方法，其中，使用直徑為0.5cm以上且高度為3cm以上的柱。
55.權利要求53或M所述的精制方法，其包括以lOOcm/h以上且lOOOcm/h以下的線速進行通液的工序。
全文摘要
本發明涉及含有甲酰基的多孔性載體的制造方法，其包括向具有甲酰基的多孔性粒子中導入間隔團，然后利用過碘酸和/或過碘酸鹽對上述間隔團部分進行氧化，使其轉變為甲酰基，其中，導入間隔團后的多孔性粒子的甲酰基含量為每1mL多孔性粒子中的甲酰基含量為3μmol以下。此外，本發明還涉及吸附體的制造方法，其包括將含有氨基的配位體固定化于所述含有甲酰基的多孔性載體上。根據本發明，可以提供吸附量大、強度高且配位體洗脫少的含有甲酰基的多孔性載體，以及提供使用上述多孔性載體的吸附體。
文檔編號B01J20/24GK102239001SQ20098014850
公開日2011年11月9日 申請日期2009年12月3日 優先權日2008年12月3日
發明者川原直美, 川嵜宏明, 河井義和 申請人:Jnc株式會社, 株式會社鐘化